КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭКСТРАКТ ВОДОРОСЛЕВОГО ПРОТЕОГЛИКАНА, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2020 года по МПК A61K36/02 A61P25/04 A61P29/00 A61P35/00 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящая заявка относится к композиции, содержащей водорослевый экстракт, и к ее применению. В частности, настоящая заявка относится к композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, и к применению композиции в лечении или предупреждении опухоли, боли, воспаления или заболеваний, опосредованных воспалительными факторами.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Злокачественная опухоль поджелудочной железы представляет собой злокачественную опухоль органов желудочно-кишечного тракта (GI) с высокой степенью злокачественности, которая характеризуется очень неблагоприятным прогнозом. Сложной является как диагностика, так и лечение злокачественной опухоли поджелудочной железы. Практически 90% случаев злокачественной опухоли поджелудочной железы составляет протоковая аденокарцинома, происходящая из железистого эпителия. В последние годы заболеваемость и смертность от злокачественной опухоли поджелудочной железы значительно возрастает, причем показатель пятилетней выживаемости составляет <1%. Она является одной из злокачественных опухолей, характеризующихся наиболее неблагоприятным прогнозом. Злокачественная опухоль поджелудочной железы характеризуется низким показателем эффективности диагностики на ранних стадиях, высокой смертностью при хирургическом вмешательстве и низким показателем излечения. В последние годы заболеваемость и смертность от других злокачественных опухолей также постоянно растет.

Ключом к лечению злокачественных опухолей, в особенности, злокачественной опухоли поджелудочной железы, является поиск эффективного противоопухолевого средства, на чем также фокусируются недавние исследования.

С 1970-х годов исследователи уделяли все большее внимание водорослям, в особенности, сине-зеленым водорослям. Вначале исследователи преимущественно фокусировались на питательной ценности и вирулентности водорослей. На собрании Продовольственной и сельскохозяйственной организации при Организации Объединенных Наций в 1974 году спирулина рассматривалась как отличный пищевой ресурс для людей в будущем. Фармацевтические применения водорослей оценивали с 1980-х годов, и изучение преимущественно фокусировалось на функции различных водорослевых экстрактов. Изучение экстракта сине-зеленых водорослей, в особенности, экстракта спирулины, представляло особенный интерес. Авторы настоящей заявки получили экстракт водорослевого протеогликана из водорослей (см. патент Китая CN1098707C). В настоящей заявке авторы настоящего изобретения изучали терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении злокачественных опухолей (в особенности, злокачественной опухоли поджелудочной железы), а также в отношении боли (как например, боли, ассоциированной с опухолями) и воспаления (как например, воспаления, ассоциированного с опухолями).

Краткое раскрытие настоящего изобретения

В соответствии с одним аспектом настоящим изобретением предполагается применение экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в производстве лекарственного препарата для лечения или предупреждения злокачественной опухоли поджелудочной железы у субъекта. Злокачественная опухоль поджелудочной железы представляет собой первичную злокачественную опухоль или метастатическую злокачественную опухоль.

В настоящей заявке дополнительно предполагается применение экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в производстве лекарственного препарата для лечения или предупреждения воспаления или боли. В соответствии с определенными вариантами осуществления вышеуказанное воспаление представляет собой воспаление, ассоциированное с опухолью, и вышеуказанная боль представляет собой боль, ассоциированную с опухолью.

В соответствии с еще одним аспектом в данной заявке предполагается способ лечения или предупреждения злокачественной опухоли поджелудочной железы у субъекта, который предусматривает введение субъекту эффективного терапевтического или профилактического количества экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана. В данной заявке дополнительно предполагается способ лечения или предупреждения воспаления или боли у субъекта, который предусматривает введение субъекту эффективного терапевтического или профилактического количества экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана.

В соответствии с одним аспектом в данной заявке представлен экстракт водорослевого протеогликана или фармацевтическая композиция, содержащая экстракт водорослевого протеогликана, для применения в лечении или предупреждении злокачественной опухоли поджелудочной железы, боли или воспаления у субъекта.

В соответствии с определенными вариантами осуществления экстракт водорослевого протеогликана и/или экстракт вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями могут быть составлены в фармацевтически приемлемые лекарственные формы, предпочтительно, могут быть составлены в жидкие продукты для перорального применения, таблетки, гранулы, капсулы, порошки, пилюли, сиропы и инъекционные растворы и т.п.

В соответствии с определенными вариантами осуществления экстракт водорослевого протеогликана вводят перорально, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления экстракт водорослевого протеогликана вводят перорально.

В соответствии с определенным вариантом осуществления доза экстракта водорослевого протеогликана, вводимого субъекту, составляет 5-500 мг/кг массы тела в сутки. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления доза составляет 10-150 мг/кг массы тела в сутки. В соответствии с более предпочтительными вариантами осуществления доза составляет 20-120 мг/кг массы тела в сутки.

В соответствии с дополнительным аспектом в настоящей заявке предполагается применение экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в производстве лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболеваний, опосредованных воспалительными факторами.

В соответствии с дополнительным аспектом в настоящей заявке предполагается фармацевтическая композиция, содержащая экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическую композицию, содержащую экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств, применяют для лечения или предупреждения опухоли у субъекта, причем опухоль предпочтительно представляет собой злокачественную опухоль поджелудочной железы, меланому или саркому. Экстракт водорослевого протеогликана и другие противоопухолевые средства характеризуются синергическим эффектом в отношении лечения опухолей и значительно улучшают терапевтическую эффективность в отношении опухолей.

В соответствии с дополнительным аспектом в настоящей заявке дополнительно предполагается применение фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств, в производстве лекарственного препарата для лечения или предупреждения опухоли у субъекта.

В соответствии с дополнительным аспектом в данной заявке дополнительно предполагается способ лечения или предупреждения опухоли у субъекта, предусматривающий введение субъекту эффективного терапевтического или профилактического количества экстракта водорослевого протеогликана или фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств.

В соответствии с определенными вариантами осуществления опухоль представляет собой первичную опухоль или метастатическую опухоль. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления опухоль является выбранной из злокачественной опухоли поджелудочной железы, меланомы, саркомы, лейкоза, злокачественной опухоли легкого, злокачественной опухоли пищевода, лимфомы, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли толстой кишки, плоскоклеточной карциномы кожи или их метастатических опухолей.

В настоящей заявке дополнительно представлены эффекты противоопухолевой композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в отношении противоопухолевого иммунитета.

Вышеуказанный экстракт водорослевого протеогликана получают в соответствии со способом, описанным в патенте Китая CN1098707C, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В частности, способ получения экстракта водорослевого протеогликана предусматривает следующие стадии:

a. растворение порошка сине-зеленых водорослей в 5-20-кратном объеме воды и разрушение клеточной стенки;

b. нагревание полученной в результате смеси до 60-100°С и осуществление разделения твердых веществ и жидкости после охлаждения;

c. доведение рН полученной в результате жидкости до значения менее 7 и повторное осуществление разделения твердых веществ и жидкости;

d. доведение рН полученной в результате жидкости до нейтрального, концентрирование и сушка, если это необходимо.

Количество протеогликана, содержащегося в полученном экстракте водорослевого протеогликана, составляет более чем приблизительно 50% по массе, например, более чем приблизительно 60%, более чем приблизительно 65%, более чем приблизительно 70%, более чем приблизительно 75% и т.п. В соответствии с определенными вариантами осуществления количество протеогликана, содержащегося в экстракте водорослевого протеогликана, составляет приблизительно 70-75% по массе.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан протокол MTS анализа, применяемого для выявления пролиферации клеточной линии PANC-1.

На фиг. 2 показана выраженная в процентах пролиферация PANC-1 клеток после обработки различными концентрациями экстракта водорослевого протеогликана в День 1(D1), День 2(D2), День 3(D3), День 4(D4) и День 6(D6) по сравнению с контролем.

На фиг. 3 показаны обнаруженные при визуализации методом КТ(компьютерная томография) изменения поджелудочной железы у пациента с запущенной злокачественной опухолью поджелудочной железы после приема экстракта водорослевого протеогликана в течение 3 месяцев.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

В настоящей заявке предполагается применение экстракта водорослевого протеогликана или фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в производстве лекарственного препарата для лечения или предупреждения опухоли, такой как злокачественная опухоль поджелудочной железы, воспаления, боли или заболеваний, опосредованных воспалительными факторами.

«Фармацевтически приемлемый носитель», раскрытый в данном документе, относится к носителю, который не препятствует биологической доступности активных ингредиентов, в том числе обычно применяемых в области фармацевтики. Фармацевтически приемлемый носитель, раскрытый в данном документе, может представлять собой твердое вещество или жидкость, в том числе фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, буферы, эмульгаторы, стабилизаторы, консерванты, разбавители, инкапсулирующие вещества, наполнители и т.п. Например, фармацевтически приемлемый буфер дополнительно содержит фосфаты, ацетаты, цитраты, бораты, карбонаты и т.п.

Фармацевтическая композиция, раскрытая в данном документе, может присутствовать в форме стандартной дозы, и ее можно получить с помощью любого способа, хорошо известного в области фармацевтики. Все из способов предусматривают стадию объединения активных ингредиентов, раскрытых в данном документе, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. В целом, композицию получают посредством объединения активных ингредиентов с жидким носителем или твердым носителем или ими обоими с последующим приданием формы полученному в результате продукту, если это требуется.

В соответствии с определенными вариантами осуществления экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, и/или экстракт вместе с фармацевтически приемлемым носителем могут быть составлены в фармацевтически приемлемые лекарственные формы, например, жидкий продукт для перорального применения, капсулу, порошок, таблетку, гранулу, пилюлю, сироп, инъекционный раствор, суппозиторий и т.п.

Экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, получают в соответствии со способом, описанным в патенте Китая CN1098707C, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В соответствии с определенными вариантами осуществления экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, вводят в дозе, составляющей 5-500 мг/кг массы тела в сутки, предпочтительно, 20-150 мг/кг массы тела в сутки, более предпочтительно, 20-120 мг/кг массы тела в сутки, например, 20 мг/кг массы тела в сутки, 30 мг/кг массы тела в сутки, 60 мг/кг массы тела в сутки, 120 мг/кг массы тела в сутки и т.п.

В соответствии с еще одним аспектом предполагается способ лечения или предупреждения опухолей, таких как злокачественная опухоль поджелудочной железы, воспаления, боли или заболеваний, опосредованных воспалительными факторами, у субъекта, который предусматривает введение субъекту эффективного терапевтического или профилактического количества экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана.

В соответствии с дополнительным аспектом предполагается применение эффективного терапевтического или профилактического количества экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в лечении или предупреждении злокачественной опухоли, воспаления, боли или заболеваний, опосредованных воспалительными факторами, у субъекта.

Термин «осуществление лечения» или «лечение», используемый в данном документе, включает в себя ингибирование, излечение, облегчение или ослабление злокачественной опухоли, боли (такой как боль, ассоциированная с опухолью), или воспаления (такого как воспаление, ассоциированное с опухолью), или заболеваний, опосредованных воспалительными факторами, а также предупреждение или задержку метастазирования первичной злокачественной опухоли.

В соответствии с определенными вариантами осуществления злокачественная опухоль может представлять собой первичную злокачественную опухоль, и она также может представлять собой метастатическую злокачественную опухоль. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления злокачественная опухоль может представлять собой злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль толстой кишки, злокачественную опухоль желудка, меланому, саркому, лейкоз, злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль молочной железы, плоскоклеточную карциному кожи, злокачественную опухоль пищевода, лимфому и т.п.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления воспалительные факторы, раскрытые в данном документе, включают в себя, без ограничения, гистаминовый рецептор Н3, калликреин-связанную пептидазу 3, калликреин-связанную пептидазу 13, инсулиноподобный фактор роста 2, фактор некроза опухолей, рецептор 2 лейкотриена В4, лиганд 4 хемокина (С-С мотив), колонне стимулирующий фактор 3 (гранулоцитарный), дофаминовый рецептор 4, β-полипептид фактора роста тромбоцитов, калликреин-связанную пептидазу 11, калликреин-связанную пептидазу 15, рецептор лейкотриена В4, синтазу лейкотриена С4, лиганд 2 хемокина (С-С мотив), интерлейкин 6, интерлейкин 10, рецептор 2 интерферона α, фактор роста тромбоцитов А, фактор роста тромбоцитов С, фактор роста тромбоцитов D, С-реактивный белок, калликреин-связанную пептидазу 14, брадикининовый рецептор В2, член 11 суперсемейства факторов некроза опухолей (лиганд), лиганд 3 хемокина (С-С мотив), лиганд 7 хемокина (С-С мотив), лиганд 20 хемокина (С-С мотив), лиганд 2 хемокина (С-Х-С мотив), β-полипептид фактора роста тромбоцитов, рецептор 1 интерферона (α, β и Ω), интерлейкин 3, интерлейкин 9, интерлейкин 17В, интерлейкин 20, дифференцировочный фактор роста 2, дифференцировочный фактор роста 3, фактор ингибирования миграции макрофагов (фактор, ингибирующий гликозилирование), дифференцировочный фактор роста 11, костный морфогенетический белок 2, костный морфогенетический белок 4, тромбопоэтин, калликреин-связанную пептидазу 4, калликреин-связанную пептидазу 5, брадикининовый рецептор В1, интерферон α6 и т.п.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления заболевания или нарушения, опосредованные воспалительными факторами, включают в себя, без ограничения, хроническое воспаление мочевого пузыря, уретрит, вестибулярное головокружение, анафилаксию, астму (бронхиальную астму, детскую астму), злокачественную опухоль печени (печеночно-клеточную карциному человека, первичную злокачественную опухоль печени и т.п.), злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль шейки матки, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль яичка, злокачественную опухоль толстой и прямой кишки, остеоартрит, первичную артериальную гипертензию, инфаркт миокарда, инфаркт миокарда при болезни Паркинсона, болезнь Альцгеймера, наследственный ангионевротический отек, гемангиому (младенческую), сердечно-сосудистое заболевание, злокачественную опухоль толстой и прямой кишки, гнойный менингит, злокачественную опухоль эндометрия, самопроизвольный аборт, злокачественную опухоль мочевого пузыря, глиому, печеночный фиброз, внугримозговое кровоизлияние, немелкоклеточный рак легкого, острый миелоцитарный лейкоз, церебральный инфаркт, гипертрофию носоглоточной миндалины, гепатит С, множественную миелому, системную красную волчанку, пневмонию (бронхопневмонию, детскую пневмонию, негоспитальную пневмонию), язвенный колит, хроническое обструктивное заболевание легких, туберкулез легких, болезнь Паркинсона, неалкогольную жировую болезнь печени, гипертензию (гипертензию, связанную с ожирением, первичную гипертензию), аутоиммунный гепатит, склерозирующий холангит, синдром ожирения при нормальной массе, диабетическую ретинопатию, воспалительное заболевание кишечника, гиперсомнию, болезнь Бехчета, гигантоклеточный артериит, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, синдром кожно-слизистых лимфоузлов, колит, аллергическое заболевание, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль желудка, инсульт (апоплексический инсульт, ишемический инсульт), острое повреждение печени, вызванное действием лекарственных средств, хронический нейтрофильный лейкоз, шизофрению, папиллярную карциному щитовидной железы, менингиомы, сахарный диабет (сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа), легочную тромбоэмболию, тиреоидит, заболевание кости при множественной миеломе, хронический лимфоцитарный лейкоз, хондросаркому, лейкоплакию ротовой полости и плоскоклеточные карциномы, аллергический ринит, хронический назосинусит, инфекцию листерией, миокардит, рассеянный склероз, множественную миелому, карциному гортани, IgA-нефропатию, вирусный миокардит, злокачественную опухоль толстой и прямой кишки, псориаз, дискогенную боль в пояснично-бедренной области, гепатит В, злокачественную опухоль легкого, пульпит, тиреоидит Хашимото, папиллярную карциному щитовидной железы, туберкулез легких, лейкоз, болезнь Кавасаки, апластическую анемию, полимиозит, болезнь Ходжкина, миелоидный лейкоз, анкилозирующий спондилит, хронический назальный риносинусит с носовыми полипами, диффузную В-крупноклеточную лимфому, атопический дерматит, хроническое легочное сердце на фоне пребывания в условиях высокогорья, артрит (остеоартрит, ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, спондилоартрит), немелкоклеточный рак легкого, аллергический ринит, красный плоский лишай, нестабильную стенокардию, острый коронарный синдром, пародонтит, коронарную болезнь сердца, атеросклероз, тератокарциному, эмбриональную карциному, атопический дерматит, злокачественную опухоль эндометрия, острый панкреатит, плоскоклеточную карциному шейки матки, плоскоклеточную карциному ротовой полости, носоглоточную карциному, плоскоклеточную карциному пищевода, миелодиспластический синдром, глиому головного мозга, первичный синдром Шегрена, анемию (апластическую анемию у детей, апластическую анемию), церебральный паралич, неонатальную гипоксически-ишемическую энцефалопатию, воспаление дыхательных путей, синдром обструктивного апноэ-гипопноэ сна, подагру, амигдалит, острый респираторный дистресс-синдром, обсессивно-компульсивное расстройство, неалкогольную жировую болезнь печени, метаболический синдром, сепсис новорожденных, синдром «рука-нога-рот», дерматомиозит, сепсис, энцефалит, эклампсию, злокачественную опухоль желчного протока (хилярную холангиокарциному, диабетическое макрососудистое осложнение карциномы желчного протока), системную склеродермию, злокачественную опухоль толстой кишки, синдром поликистоза яичников, синдром Незертона, целиакии, диабетическую нефропатию и т.п.

«Эффективное терапевтическое количество» или «эффективное профилактическое количество», используемое в данном документе, может быть определено в зависимости от обстоятельств и может легко использоваться квалифицированным специалистом в данной области техники, исходя из дозы, которая фактически требуется, например, его определяют, исходя из массы тела, возраста и состояния пациента. Поскольку все из ингредиентов, содержащихся в экстракте, являются нетоксичными, экстракт сам по себе можно вводить напрямую в случае, когда композиция не содержит фармацевтически приемлемый носитель. В случае когда композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, экстракт и носитель могут быть смешаны с помощью традиционных способов в области фармацевтики для производства необходимого лекарственного препарата.

В соответствии с определенными вариантами осуществления экстракт водорослевого протеогликана или композицию, содержащую экстракт водорослевого протеогликана, вводят перорально, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления экстракт водорослевого протеогликана или композицию, содержащую экстракт водорослевого протеогликана, вводят перорально.

В настоящей заявке дополнительно представлена фармацевтическая композиция, содержащая экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств.

Вышеуказанные противоопухолевые средства включают в себя применяемые в клинических условиях для лечения опухолей, например, ингибиторы синтеза нуклеотидов (например, 5-фторурацил (5-FU)); противоопухолевые антибиотики (например, адриамицин (ADM)); соединения платины (например, карбоплатин); алкилирующие средства (например, циклофосфамид и нитрозомочевина, такая как кармустин); ингибиторы ДНК-полимеразы (например, гемцитабин); средства, препятствующие синтезу белка (например, этопозид (VP-16)); и т.п.

В случае когда экстракт водорослевого протеогликана вводят в комбинации с одним или несколькими из других противоопухолевых средств, противоопухолевый эффект значительно усиливается, проявляя синергический эффект. Синергический эффект комбинированной терапии (например, комбинации экстракта водорослевого протеогликана и одного или нескольких из других противоопухолевых средств) обеспечивает возможность введения субъекту, страдающему от определенного нарушения (такого как злокачественная опухоль или ассоциированные с ней симптомы), более низкой дозы, чем для каждой терапии отдельно, и/или уменьшенную частоту введения для терапии.

Термин «субъект», используемый в данном документе, относится к млекопитающему, в том числе, без ограничения, приматам, коровам, лошадям, свиньям, овцам, козам, собакам, кошкам и грызунам, таким как крысы и мыши.

В данном описании и формуле изобретения термины «содержат/содержит/содержащий», «включают в себя/включает в себя/включающий в себя» и «содержат/содержит/содержащий» означают «включающий в себя, без ограничения», и не предполагается, что они исключают другие части, добавки, компоненты или стадии.

Следует понимать, что признаки, характеристики, компоненты или стадии, описанные в конкретных аспектах, вариантах осуществления или примерах в настоящей заявке, могут быть применены к любым другим аспектам, вариантам осуществления или примерам, описанным в данном документе, если не указано противоположное.

Вышеуказанные раскрытия описывают настоящее изобретение в целом, и следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Эти описываемые примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, но не рассматриваются как какое-либо ограничение настоящего изобретения. Несмотря на то что конкретные термины и значения используются в данном документе, эти термины и значения также следует интерпретировать как иллюстративные, и они не ограничивают объем настоящего изобретения. Если не указано специально, экспериментальные методы и методики в данном описании представляют собой методы и методики, хорошо известные квалифицированному специалисту в данной области техники.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Ингибирующий эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении карцинома поджелудочной железы

Пример 1.1. Экстракт водорослевого протеогликана ингибировал пролиферацию PANC-1 клеток карциномы поджелудочной железы

Клеточная линия и культура клеток

В этом исследовании авторы настоящего изобретения использовали клеточную линию карциномы поджелудочной железы, PANC-1. Эта клеточная линия культивируется AnyGenes®. Несколько пассажей осуществляли, чтобы подтвердить жизнеспособность клеток и обеспечить необходимое количество клеток для проведения различных экспериментов (MTS-тесты и анализы SignArrays®). Информация, касающаяся клеточной линии PANC-1, была описана в таблице 1.

PANC-1 клетки выращивали в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко; Gibco® от Life Technologies™), дополненной 10% FBS (фетальная бычья сыворотка; Gibco® от Life Technologies™), 1% L-глутамина (200 мМ; Gibco® от Life Technologies™), 1% пирувата натрия (100 мМ; Gibco® от Life Technologies™), 1% стрептомицина-пенициллина (10000 Ед./мл пенициллина и 10000 мкг/мл стрептомицина; Gibco® от Life Technologies™) и инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Жизнеспособность клеток будут определять с помощью анализа исключения трипанового синего.

Получение экстракта водорослевого протеогликана

3 кг высушенного порошка спирулины промывали 3 литрами воды и фильтровали с отсасыванием. Затем 30 литров воды добавляли к полученному в результате остатку и смесь перемешивали. Смесь нагревали до 88°С в течение 1 часа, охлаждали, а затем фильтровали при пониженном давлении. Фильтрат доводили соляной кислотой до рН 3,8, затем отставляли на ночь для разделения центрифугированием. рН супернатанта доводили с использованием раствора Na₂CO₃ до рН 7, а затем подвергали распылительной сушке с получением 0,599 кг экстракта водорослевого протеогликана. По результатам анализа содержание протеогликана в экстракте составляло 72,3%.

Экстракт водорослевого протеогликана отвешивают в стерильных условиях и растворяют в 50 мг/мл PBS с получением маточного раствора. После центрифугирования при 2500 g в течение 30 минут супернатант фильтровали через фильтр с размером ячеек 0,2 мкм. В MTS-анализе раствор разводили в среде для обработки клеток. В последующих частях экстракт водорослевого протеогликана также называют «экстрактом K».

MTS-анализ

Исследование клеточной пролиферации проводили с применением нерадиоактивного анализа жизнеспособности клеток в водной среде CellTiter 96® AQueous None Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS; Promega), основанного на колориметрическом методе определения количества жизнеспособных пролиферирующих клеток.

Этот набор для анализа состоит из растворов соли тетразолия (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий); MTS) и связывающего электроны реактива (феназин-метосульфата; PMS) для повышения химической стабильности соединения. MTS восстанавливается ферментами-дегидрогеназами, находящимися в метаболически активных клетках, до окрашенного продукта, растворимого в среде культивирования - формазана. Количество продукта-формазана измеряют после 2 часов инкубирования при 37°С по величине оптического поглощения при 490 нм, прямо пропорциональной количеству живых клеток в культуре. Наконец, концентрацию полумаксимального ингибирования (IC50) для экстракта водорослевого протеогликана определяли с использованием экспериментальной модели на PANC-1 клетках. Все процедуры культивирования клеток осуществляют в трех параллелях.

Клетки высевали на 96-луночные планшеты для культивирования (Microtest 96®; Falcon) в День 1 (D1) (1500 клеток на лунку в 100 мкл среды), затем обрабатывали в предварительно выбранном диапазоне концентраций. В частности, 10 различных концентраций выбирают для экстракта водорослевого протеогликана, по три лунки для каждой концентрации. Не содержащие клеток лунки без добавления экстракта водорослевого протеогликана используют в качестве контрольных лунок.

Непосредственно перед добавлением раствора MTS среду культивирования клеток с обработкой или без обработки удаляли во избежание создания экстрактом водорослевого протеогликана помех для этого анализа и 100 мкл среды добавляли в каждую лунку. Затем 20 мкл раствора MTS добавляли в каждую лунку и измерение оптического поглощения при 490 нм осуществляли после 4 часов инкубирования при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Среду культивирования клеток с экстрактом водорослевого протеогликана или без него меняли в дни D2 (День 2) и D4 (День 4). Значения OD при 490 нм измеряли в дни D0, D1, D2, D3, D4 и D6, что соответствует общему анализу 6×96-луночных планшетов (один раз в сутки), как иллюстрируется на фиг. 1.

Результаты анализа пролиферации клеток на клеточной линии PANC-1

Результаты MTS в DO

Значения OD в DO измеряли для исследования того, правильно ли был выполнен посев клеток в предыдущие сутки, и работает ли адаптированный протокол на этой клеточной линии. В таблице 2 приведены значения OD в DO. Авторы данного изобретения могли наблюдать, что не присутствовало статистически значимого различия между значениями OD, это указывало на то, что посев клеток был правильным, а результаты были воспроизводимыми.

Антипролиферативный эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении клеточной линии PANC-1

Значения OD, соответствующие различным концентрациям экстракта водорослевого протеогликана, представлены в таблице 3.

После подсчета определяли процент пролиферирующих клеток в сравнении с контролем (без экстракта K). После обработки различными концентрациями экстракта водорослевого протеогликана каждые сутки выраженная в процентах пролиферация клеток клеточной линии PANC-1 в сравнении с контролем представлена в таблице 4 и на фиг. 2. Таблица 5 демонстрировала ингибирующий эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении пролиферации PANC-1 клеток. Процентное ингибирование рассчитывали посредством сравнения количества выживших клеток после обработки экстрактом K с количеством выживших клеток без обработки.

Значительный антипролиферативный эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении PANC-1 клеток наблюдался после обработки 1,75 мг/мл, 2,5 мг/мл, 3,5 мг/мл или 5 мг/мл экстракта K в D1, D2, D3, D4 или D6. Например, процентное ингибирование для экстракта K в концентрации 2,5 мг/мл в D1 составляло 38,15% и процентное ингибирование для экстракта K в концентрации 5 мг/мл в D1 составляло 37,06%; процентное ингибирование для экстракта K в концентрации 2,5 мг/мл экстракта K в D2 составляло 75,64%, и процентное ингибирование для экстракта K в концентрации 5 мг/мл в D2 составляло 88,29%; и все из экстракта K в концентрации 1,75 мг/мл, 2,5 мг/мл, 3,5 мг/мл и 5 мг/мл значительно ингибировали пролиферацию PANC-1 клеток с процентным ингибированием более чем 90%.

Значение IC50 для экстракта водорослевого протеогликана составляет >5 мг/мл в D1 и от 1 до 1,75 мг/мл в D2.

Вышеуказанные результаты показали, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, характеризуется заметным ингибирующим эффектом в отношении PANC-1 клеток карциномы поджелудочной железы.

Пример 1.2. Клиническое применение экстракта водорослевого протеогликана для лечения пациентов с запущенной карциномой поджелудочной железы

Состояние пациента: мужчина, рожден в 1927 году, коронарное стентирование в 1996 году для лечения острого инфаркта миокарда; имплантация кардиостимулятора в 2003 году лечения брадикардии; массу в головке поджелудочной железы выявляли 3 декабря 2013 года посредством ультразвукового исследования для лечения фебрильного симптома; и слабодифференцированную запущенную карциному поджелудочной железы диагностировали посредством чрескожной толсто игольной биопсии массы головки поджелудочной железы с ультразвуковым контролем 26 декабря 2013 года. 14 января 2014 года осуществляли PTCD+ стентирование желчного протока. Экстракт водорослевого протеогликана, полученный в соответствии с примером 1.1, вводили пациенту 15 декабря 2013 года в дозе 1350 мг/сутки с повышением до 2025 мг/сутки после 20 суток. Пациент не получал другого лечения.

Наблюдение клинической эффективности: состояние пациента стабилизировалось после частичной ремиссии (PR), и общее время дожития составляло 20 месяцев.

На фиг. 3 показаны обнаруженные при визуализации с методом КТ изменения в поджелудочной железе пациента после введения экстракта водорослевого протеогликана в течение трех месяцев. Полученное в артериальную фазу изображение показало, что опухоль уменьшается с 46×51 мм до 35×46 мм через 3 месяца. Визуализация в венозную фазу показывала, что плотность центральной некротической области значительно снижалась. Это дополнительно подтверждало то, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, можно применять для лечения карциномы поджелудочной железы, и он характеризуется значительным ингибирующим эффектом в отношении запущенной карциномы поджелудочной железы.

Карцинома поджелудочной железы представляет собой злокачественную опухоль пищеварительного тракта с высокой степенью злокачественности. Пациенты с карциномой поджелудочной железы будут иметь время дожития, составляющее приблизительно 4 месяца без какого-либо лечения или 16 месяцев после резекции. Тем не менее, вследствие низких показателей эффективности диагностики карциномы поджелудочной железы на ранних стадиях в большинстве случаев диагностировании болезнь развилась до запущенной стадии, что не подходит для хирургического лечения. Существующие методы лекарственной терапии не могут эффективно продлить жизнь пациентов. Авторы настоящего изобретения обобщили эффекты методов лекарственной терапии, описанные в литературе из предшествующего уровня техники (таблица 6). Из таблицы 6 можно увидеть, что даже при использовании комплексной терапии общее время дожития составляло не более 9 месяцев. Неожиданно, пациент с запущенной карциномой поджелудочной железы в данном примере после приема экстракта водорослевого протеогликана, достиг неожиданного 20-месячного общего времени дожития. Это демонстрирует, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, значительно превосходит существующие методы лекарственной терапии при лечении пациентов с карциномой поджелудочной железы, и этот эффект является неожиданным.

Пример 2. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении злокачественной опухоли печени

В этом примере оценивали эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении медианного времени дожития у 11 пациентов с печеночно-клеточной карциномой.

Одиннадцать пациентов с печеночно-клеточной карциномой получали лечение экстрактом водорослевого протеогликана, полученным в соответствии с примером 1.1 (1080 мг/сутки), до тех пор, пока пациент не умирал, или пероральное введение становилось практически невозможным. Значения времени дожития во всех случаях составляли 2~43 месяца, и медианное время дожития составляло 15,2 месяца для 11 пациентов с НСС. Наибольшее время дожития составляло 43 месяца, 4 пациента достигали времени дожития более 20 месяцев, 8 пациентов достигали времени дожития более 11 месяцев, 9 пациентов достигали времени дожития более 6 месяцев, и 1 пациент достигал времени дожития менее 3 месяцев. В этих случаях у специального пациента, рекомендованного благотворительным фондом провинции Аньхой (Anhui Charity Federation), ZBFU из больницы провинции Аньхой (Anhui Hospital), диагностировали первичную злокачественную опухоль печени 2 августа 2005 года, T2N0M0, стадия II, с объемным очагом размером 3,0*3,7 см в правой доле печени; и вследствие спленомегалии, цирроза печени, присутствия камня в левой почке, сопровождающегося кровотечением, другие методы лечения не применялись. Этот пациент вступил в исследование 24 сентября 2005 года и начал принимать экстракт водорослевого протеогликана, полученный в соответствии с примером 1.1. ZBFU умер 6 апреля 2009 года. Этот пациент принимал экстракт водорослевого протеогликана непрерывно и был жив в течение 43 месяцев.

Время дожития у пациентов со злокачественной опухолью печени являлось наиболее сложной проблемой в лечении злокачественной опухоли печени. Различные методы химиотерапии для неоперабельных пациентов могут только продлить медианное время дожития на 1-2 месяца. В настоящее время стандартным средством для лечения злокачественной опухоли печени является сорафениб (торговое название: NEXAVAR), при этом медианное время дожития составляет 10,7 месяца и 7,9 месяца в группе, получавшей лечение, и в контрольной группе с плацебо, соответственно. Тем не менее, в этом примере после приема экстракта водорослевого протеогликана пациенты со злокачественной опухолью печени имеют медианное время дожития, составляющее 15,2 месяца. Это демонстрирует, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, значительно превосходит существующий лекарственный препарат в лечении злокачественной опухоли печени.

Пример 3. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении злокачественной опухоли толстой кишки

В этом примере оценивали терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении восьми пациентов со злокачественной опухолью толстой кишки.

Из этих 8 пациентов со злокачественной опухолью толстой кишки 2 пациента являются мужчинами, и 6 пациентов являются женщинами, имеют возраст от 38 до 68, и медианный возраст составляет 60,5; и оценка физического состояния находилась в диапазоне от 70 до 90. Два пациента, страдающих от злокачественной опухоли толстой кишки на клинической стадии III, и шесть пациентов, страдающих от злокачественной опухоли толстой кишки на клинической стадии IV; и, следовательно, все случаи представляли собой опухоли на клинической стадии III или IV. В 8 случаях диагностировали патологию (в 8 случаях применяли хирургическое вмешательство).

Общее состояние субъектов со злокачественной опухолью толстой кишки

Восемь пациентов со злокачественной опухолью толстой кишки принимали экстракт водорослевого протеогликана, полученный в соответствии с примером 1.1, в дозе 1080 мг/сутки. Через 56 суток лечения 1 случай показал частичную ремиссию (PR), 3 случая показали стабилизированное заболевание (SD), 4 случая показали прогрессирующее заболевание (PD). Показатель эффективности (CR+PR/общее количество случаев) для лечения восьми случаев злокачественной опухоли толстой кишки составлял 12,5%, и показатель контроля заболевания (CR+PR+SD/общее количество случаев) составлял 50%.

Пример 4. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении злокачественной опухоли желудка

Также изучали терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении пациентов со злокачественной опухолью желудка.

Из трех пациентов со злокачественной опухолью желудка все были мужчинами возрастом от 57 до 67 лет, причем медианный возраст составлял 65 лет. У всех трех пациентов присутствовало заболевание на запущенной стадии, причем в 2 случаях присутствовали опухоли на клинической стадии III, и в 1 случае присутствовала опухоль на клинической стадии IV; и тип ткани во всех случаях представлял собой аденокарциному.

В трех случаях диагностировали патологию (в том числе в 1 случае использовали биопсию и в 2 случаях использовали хирургическое вмешательство).

Трое пациентов со злокачественной опухолью желудка принимали экстракт водорослевого протеогликана, полученный в соответствии с примером 1.1, в дозе 1080 мг/сутки. После 56 суток лечения 2 случая показывали стабилизированное заболевание (SD), 1 случай показывал прогрессирующее заболевание (PD), и показатель контроля заболевания составлял 66,7%.

Пример 5. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении лимфомы

В этом примере оценивали терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении пациентов с лимфомой.

Состояние пациента: 62-летняя женщина, у которой диагностирована неходжкинская лимфома NHL (диффузная В-крупноклеточная), стадия IVB (опухоль на терминальной стадии). Предшествующее лечение включало в себя 6 курсов химиотерапии CHOP, 8 курсов химиотерапии IMVP-16 и 2 курса химиотерапии HDAra-c + VP-16. После вышеуказанного лечения массу размером 3×2 см обнаружили в левой поднижнечелюстной области.

Со 2 марта 2003 года пациенты с диффузной В-крупноклеточной неходжкинской лимфомой, у которых присутствовал рецидив после нескольких курсов химиотерапии, начали прием экстрактов водорослевого протеогликана, полученных в соответствии с примером 1.1, перорально в дозе 2700 мг/сутки, три раза в сутки. 31 марта 2003 года размер очага уменьшился до 1,5×1,8 см. Клиническую эффективность оценивали как частичную ремиссию (PR).

Вышеуказанная пациентка с рецидивирующей диффузной В-крупноклеточной неходжкинской лимфомой после нескольких курсов химиотерапии достигла частичной ремиссии после 28 суток лечения экстрактом водорослевого протеогликана, это демонстрирует, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытого в данном документе, характеризуется значительным терапевтическим эффектом в отношении лимфомы.

Пример 6. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении злокачественной опухоли пищевода

В этом примере оценивали терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении пациентов со злокачественной опухолью пищевода.

Два пациента со злокачественной опухолью пищевода вступали в исследование при оценке физического состояния 80, и оба имели запущенную стадию (стадия III и стадия IV) с отдаленными метастазами. После лечения экстрактом водорослевого протеогликана, полученным в соответствии с примером 1.1, один случай показал частичную ремиссию (PR), и один случай показал стабилизированное заболевание (SD), как показано в таблице ниже.

Оценка опухоли у изучаемых пациентов со злокачественной опухолью пищевода

Далее описывали специфическое состояние двух пациентов.

Пациент SXFA, мужчина, рожден 19 марта 1941 года, его состояние и лечение было следующим.

У пациента с помощью биопсии ткани диагностировали слабодифференцированную аденокарциному пищевода, IV стадия, 10 ноября 2005 года.

8 ноября 2005 года результаты визуализации методом КТ показали узловатое выпячивание длиной 6 см в слизистой оболочке, располагающееся в 40 мм от линии разреза с геморрагической эрозией.

С 13 августа 2006 года до 15 ноября 2006 года пациент принимал перорально экстракт водорослевого протеогликана, полученный в соответствии с примером 1.1, в дозе, составляющей 1080 мг/сутки, непрерывно, без получения любого другого лечения до и во время введения экстракта водорослевого протеогликана.

13 октября 2006 года результат визуализации методом КТ показал неоднородный дефект наполнения размером 5 см в нижней части пищевода, и высота очага составляла 5 мм.

Терапевтическую эффективность оценивали как стабилизированное заболевание (SD).

Пациент ZSCA, мужчина, рожден 17 июля 1957 года, его состояние и лечение было следующим.

У пациента с помощью прокола и мазка диагностировали плоскоклеточную карциному пищевода, IV стадия, 15 мая 2006 года.

17 мая 2006 года результат визуализации методом КТ показал лимфатический узел размером 5,5×5 см в правой ключице.

С 17 мая 2006 года по 1 ноября 2006 года пациент принимал перорально экстракт водорослевого протеогликана, полученный в соответствии с примером 1.1, в дозе, составляющей 1080 мг/сутки, непрерывно, без получения любого другого лечения до и во время введения экстракта водорослевого протеогликана.

1 ноября 2006 результат визуализации методом КТ показал лимфатический узел размером 2,5×2 см в правой ключице.

Терапевтическую эффективность оценивали как частичную ремиссию (PR).

Вышеуказанные данные показывают, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, также характеризуется терапевтическим эффектом в отношении злокачественных опухолей пищевода.

Пример 7. Экстракт водорослевого протеогликана облегчал боль, ассоциированную с опухолью

Пример 7.1. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении боли при злокачественной опухоли печени

Боль является обычным клиническим симптомом запущенной злокачественной опухоли печени, и она оказывает серьезное воздействие на качество жизни пациента. Сильные болеутоляющие лекарственные средства традиционно применялись для контроля боли. В этом примере 18 пациентов с печеночно-клеточной карциномой выбирали для изучения ингибирующего или профилактического эффекта экстракта водорослевого протеогликана в отношении боли.

Шестнадцать пациентов с печеночно-клеточной карциномой получали лечение экстрактом водорослевого протеогликана, полученного в соответствии с примером 1.1, в дозе 1080 мг/сутки до тех пор, пока пациенты не умирали, или пероральное введение становилось практически невозможным. Во всех случаях не принимали других болеутоляющих лекарственных средств в течение исследования, и боль у 14 пациентов измеряли по шкале оценки боли. Из этих 14 случаев 2 случая показали отсутствие боли в течение в течение всего периода исследования; 7 случаев показали облегчение боли; в 5 случаях сохранялась слабая боль 1-2 степени, без изменения. Типичные случаи включали следующих пациентов.

Одному пациенту требовалось принимать сильные болеутоляющие лекарственные средства на основе морфина при вступлении в исследование, и болеутоляющие лекарственные средства не требовались вскоре после введения экстракта водорослевого протеогликана. Другой пациент имел крупную опухоль (8×8,5 см), выявленную при томографическом исследовании, но болевой симптом не возникал у пациента после введения экстракта водорослевого протеогликана.

Вышеуказанные данные показали, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, характеризуется значительным ингибирующим и облегчающим эффектом в отношении боли.

Шкалы оценки боли, используемые в данном документе, являются следующими:

Оценка качества жизни пациента

Пример 1.2. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении боли при карциноме поджелудочной железы

Также изучали ингибирующий эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении боли у 24 пациентов со злокачественной опухолью поджелудочной железы и болевыми симптомами. 24 пациента с карциномой поджелудочной железы, вступившие в исследование, получали лечение экстрактом водорослевого протеогликана, полученным в соответствии с примером 1.1, в дозе 2025 мг/сутки до тех пор, пока пациенты не умирали, или пероральное введение становилось практически невозможным. Болевые симптомы у 24 пациентов значительно облегчались, что было измерено по шкале оценки боли.

Пример 8. Ингибирующий эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении воспаления

Стимулируемое опухолью воспаление считается одной из характеристик злокачественной опухоли. Хронические воспалительные заболевания могут повышать риск определенных злокачественных опухолей, и ряд эпидемиологических данных говорит о том, что NSAID, в особенности аспирин, являются сильными химическими средствами для профилактики. В опухолевом микроокружении присутствует много различных воспалительных клеток; и целенаправленное воздействие на эти факторы в наследственных, трансплантируемых и индуцируемых мышиных моделях злокачественных опухолей может значительно снижать проявление, развитие и распространение опухолевых заболеваний. Таким образом, эта сложная система взаимодействий при воспалении является целью для предупреждения и лечения злокачественного заболевания. В этом примере оценивали эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении экспрессии воспалительных медиаторов в клетках злокачественной опухоли.

Пример 8.1. Регуляторный эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении экспрессии медиаторов воспаления в модели злокачественной опухоли поджелудочной железы

В соответствии с протоколами, описанными в примере 1, получали экстракт водорослевого протеогликана и культивировали в клеточной линии карциномы поджелудочной железы PANC-I.

Клетки высевали на 100 мм чашки Петри (Corning®) (250000 клеток на чашку Петри в 16 мл среды) в День 1. PANC-1 клетки обрабатывали экстрактом водорослевого протеогликана в концентрации 5 мг/мл или содержащей PBS средой (контроль) в День 2.

Клетки делили на три группы: контрольная группа, группа 3-часовой обработки и группа 18-часовой обработки, в каждой группе обработку повторяли дважды.

При использовании системы SignArrays® от AnyGenes® с помощью qPCR изучали экспрессию факторов, ассоциированных с шестью путями передачи сигнала (SignArrays® от AnyGenes®), в том числе ангиогенезом, воспалением, интерфероновой и иммунной системой, цитокинами, системами окислительного стресса и HLA. В таблице 7 приведен ряд факторов, экспрессия которых значительно снижалась (по меньшей мере 1-кратно или более) по сравнению с контрольным образцом, из числа 76 оцениваемых медиаторов воспаления. Кратность изменения экспрессии некоторых иллюстративных факторов, экспрессия которых снижалась по сравнению с контролем, приведена в таблице 8.

Из вышеуказанных результатов можно увидеть, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, может регулировать экспрессию различных медиаторов воспаления и цитокинов в PANC-1 клетках карциномы поджелудочной железы и характеризуется значительным ингибирующим эффектом в отношении экспрессии многих воспалительных факторов.

Пример 8.2. Регуляторный эффект экстракта водорослевого протеогликана в отношении экспрессии медиаторов воспаления в моделях злокачественной опухоли печени и злокачественной опухоли легкого

В данном исследовании использовали клеточные линии печеночно-клеточной карциномы HuH7 и клеточные линии аденокарциномы легкого А549. Две клеточные линии культивировались AnyGenes®.

HuH7 клетки выращивали в среде DMEM, дополненной 10% FBS (фетальная бычья сыворотка, Gibco® от Life Technologies™), 1% L-глутамина (200 мМ; Gibco® от Life Technologies™), 1% пирувата натрия (100 мМ; Gibco® от Life Technologies™) и 1% стрептомицина-пенициллина (10000 Ед./мл пенициллина и 10000 мкг/мл стрептомицина Gibco®OT Life Technologies™), и инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа исключения трипанового синего.

А549 клетки выращивали в среде RPMI, дополненной 10% FBS (фетальная бычья сыворотка; Gibco® от Life Technologies™), 1% L-глутамина (200 мМ; Gibco® от Life Technologies™), 1% пирувата натрия (100 мМ; Gibco® от Life Technologies™), 1% стрептомицина-пенициллина (10000 Ед./мл пенициллина и 10000 мкг/мл стрептомицина; Gibco® от Life Technologies™), и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа исключения трипанового синего.

Экстракт водорослевого протеогликана получали в соответствии с протоколом, описанным в примере 1. Экспрессию соответствующих факторов оценивали в соответствии со способом, описанным в примере 3.1. В таблице 9 приведен ряд медиаторов воспаления и цитокинов, оцениваемых в А549 клетках и в HuH7 клетках, и ряд факторов, экспрессия которых значительно снижалась (по меньшей мере 2-кратно или более) по сравнению с контрольными образцами после 6 или 12 часов обработки. В таблице 10 приведена кратность изменения экспрессии некоторых иллюстративных факторов, экспрессия которых снижалась по сравнению с контролем.

Результаты в примерах 8.1 и 8.2 показывают, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, оказывается основным модулятором для регуляции экспрессии медиаторов воспаления и цитокинов в ряде моделей злокачественных опухолей, и он может значительно ингибировать экспрессию различных провоспалительных цитокинов, это демонстрирует, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, является способным к ингибированию возникновения и развития воспаления, в частности, воспаления, ассоциированного с опухолью.

Кроме того, в таблице 11 ниже показана соответствующая взаимосвязь между воспалительными факторами и заболеваниями, опосредованными факторами, из которой можно увидеть, что медиаторы воспаления и цитокины, которые регулируются экстрактом водорослевого протеогликана, раскрытым в данном документе, могут опосредовать развитие различных заболеваний. Таким образом, экстракты водорослевого протеогликана, способные к снижению экспрессии этих воспалительных факторов, можно применять для лечения или предупреждения ряда заболеваний и нарушений, ассоциированных с воспалительными факторами, в том числе, без ограничения, заболеваниями или нарушениями, приведенными в таблице 11.

Пример 9. Синергичный эффект экстракта водорослевого протеогликана в комбинации с химиотерапевтическими средствами в отношении лечения злокачественной опухоли

Экспериментальные животные, используемые в этом исследовании, представляли собой самок С57 мышей (18-22 г) или самок КМ мышей (18-22 г), которые были обеспечены Шанхайским центром экспериментальных животных (Shanghai Experimental Animal Center) Китайской академии наук, сертификат №: 005.

Опухоли, в том числе меланома В-16 и саркома S-180, обеспечивались Шанхайским институтом лекарственных веществ (Shanghai Institute of Materia Medica) Китайской академии наук.

Карбоплатин приобретали у фармацевтической фабрики Shandong Qilu Pharmaceutical Factory. Адриамицин приобретали у фармацевтической фабрики Zhejiang Haimen Pharmaceutical Factory. Этопозид приобретали у фармацевтической фабрики Pudong Pharmaceutical Factory в составе фармацевтической компании Yadong Pharmaceutical Company в Шанхайском исследовательском институте фармацевтической промышленности (Shanghai Pharmaceutical Industry Research Institute). 5-фторурацил приобретали у фармацевтической компании Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co., Ltd. циклофосфамид приобретали у фармацевтической компании Shanghai Hualian Pharmaceutical Co., Ltd. Остальные химиотерапевтические лекарственные средства приобретали у компании Beijing Kerui Biological Engineering Co., Ltd.

Пример 9.1. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами в отношении меланомы

Схема эксперимента

Использовали самок С57 мышей (18-22 г) и разрощенную меланому В16 за 7-11 суток. Опухолевую ткань превращали в клеточную суспензию. Мышей инокулировали подкожно в правую подмышечную область с клеточной суспензией в количестве приблизительно 4,5-5×10⁶ клеток/мышь. Спустя 24 часа мышей произвольно делили на различные группы и содержали в отдельных клетках (n=6). Экстракт водорослевого протеогликана вводили перорально, а карбоплатин, доксорубицин или СТХ вводили внутрибрюшинно, раз в сутки. Введение начинали на вторые сутки и продолжали в течение семи суток с использованием различных доз. Холостой контрольной группе давали нормальный солевой раствор (NS). Животных умерщвляли и взвешивали (масса тела в граммах) через 24 часа после отмены лекарственного средства. Опухоли вырезали и взвешивали. Среднюю массу опухоли рассчитывали для каждой группы. В соответствии со следующей формулой рассчитывали показатель ингибирования опухоли и проводили анализ с использованием Т-критерия.

А = средняя масса опухоли (г) в холостой контрольной группе,

В = средняя масса опухоли (г) в терапевтической группе

Доза

В соответствии с результатами предварительных экспериментов дозу экстракта водорослевого протеогликана (ниже в данном документе называемого водорослевым протеогликаном) определяли как 30 мг/кг и 60 мг/кг, дозы карбоплатина составляли 4 мг/кг и 8 мг/кг, доза доксорубицина составляла 1 мг/кг, и СТХ вводили в дозе 7,5 мг/кг.

Результаты экспериментов

Вышеуказанные результаты показали, что по сравнению с монотерапией противоопухолевый эффект водорослевого протеогликана, объединенного с карбоплатином или доксорубицином, значительно усиливался, но токсичность не повышалась. При приеме водорослевого протеогликана, например, в дозе 30 мг/кг, несмотря на то что сам по себе водорослевый протеогликан (30 мг/кг) не ингибировал эффективно рост меланомы (Р>0,05), он может значительно усиливать эффект других противоопухолевых лекарственных средств. Например, когда водорослевый протеогликан (30 мг/кг) использовали в комбинации с карбоплатином, противоопухолевый эффект карбоплатина значительно повышался (причем показатель ингибирования опухоли составлял 38,9%) по сравнению с монотерапией карбоплатином (Р<0,01). Когда водорослевый протеогликан (30 мг/кг) использовался в комбинации с доксорубицином, показатель ингибирования опухоли для доксорубицина значительно повышался на 13,1%. Когда карбоплатин объединяли с водорослевым протеогликаном (60 мг/кг), показатель ингибирования для карбоплатина значительно повышался на 26,6%.

Вышеуказанные результаты показывают, что экстракт водорослевого протеогликана, раскрытый в данном документе, может усиливать терапевтический эффект химиотерапевтических средств, таких как карбоплатин и доксорубицин, в отношении трансплантированной опухоли В16 меланомы у мышей, демонстрируя, что экстракт водорослевого протеогликана и обычно применяемые химиотерапевтические средства характеризуются синергическим эффектом при лечении меланомы.

Пример 9.2. Терапевтический эффект экстракта водорослевого протеогликана в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами в отношении саркомы S-180 у мышей

Схема эксперимента

Использовали самок КМ мышей (18-22 г) и разрощенную меланому S-180 за 7-11 суток. Опухолевую ткань превращали в клеточную суспензию. Мышей инокулировали подкожно в правую подмышечную область клеточной суспензией в количестве приблизительно 4,5-5×10⁶ клеток/мышь. Спустя 24 часа мышей произвольно делили на различные группы и содержали в отдельных клетках (n=6). Экстракт водорослевого протеогликана (ниже в данном документе называемый водорослевым протеогликаном) вводили перорально; а циклофосфамид, карбоплатин, 5-фторурацил и этопозид вводили внутрибрюшинно, раз в сутки. Введение начинали на вторые сутки и продолжали в течение семи суток с использованием различных доз. Холостой контрольной группе давали нормальный солевой раствор (NS). Животных умерщвляли и взвешивали (масса тела в граммах) через 24 часа после отмены лекарственного средства. Опухоли вырезали и взвешивали. Среднюю массу опухоли рассчитывали для каждой группы. В соответствии со следующей формулой рассчитывали показатель ингибирования опухоли и проводили анализ с использованием Т-критерия.

В соответствии с приведенной ниже формулой рассчитывали показатель ингибирования опухоли и проводили анализ с использованием Т-критерия.

A = средняя масса опухоли (г) в холостой контрольной группе,

В = средняя масса опухоли (г) в терапевтической группе

Результаты экспериментов

Из данных, приведенных в таблицах 15-18, можно увидеть, что водорослевый протеогликан в дозе 20-30 мг/кг не ингибировал рост саркомы S-180 (Р>0,05), а водорослевый протеогликан в дозе 60 мг/кг ингибировал рост саркомы S-180 с показателем ингибирования 35,4%, демонстрируя ингибирующий эффект водорослевого протеогликана в отношении роста саркомы у мышей.

Карбоплатин в дозе 4 мг/кг, используемый сам по себе, не оказывал ингибирующий эффект в отношении роста трасплантированной опухоли саркомы S-180 у мышей (Р>0,05). Когда карбоплатин в дозе 4 мг/кг использовали в комбинации с водорослевым протеогликаном в дозе 20 мг/кг, показатель ингибирования составлял 33%. Водорослевый протеогликан в дозе 60 мг/кг, используемый в комбинации с циклофосфамидом в дозе 7,5 мг/кг, достигал показателя ингибирования 52,6% в отношении роста саркомы S-180, что на 10% выше, чем показатель ингибирования, достигаемый при использовании только циклофосфамида.

Ингибирующий эффект в отношении роста трансплантированной опухоли саркомы S-180 у мышей, достигаемый отдельно этопозидом в дозе 3 мг/кг, составлял 26,9% (Р>0,05). Когда этопозид использовали с водорослевым протеогликаном в дозе 20 и 30 мг/кг, показатель ингибирования повышался до 33,5% (Р<0,05) и 35,7% (Р<0,01), соответственно.

5-Фторурацил в дозе 15 мг/кг, используемый сам по себе, оказывал умеренный ингибирующий эффект в отношении трансплантированной опухоли саркомы S-180 у мышей. Когда 5-фторурацил объединяли с водорослевым протеогликаном, противоопухолевый эффект значительно повышался с показателем ингибирования 67,5%, демонстрируя, что комбинация двух лекарственных средств обеспечивала синергический эффект.

Вышеуказанные данные показали, что комбинированное применение экстракта водорослевого протеогликана, раскрытого в данном документе, и химиотерапевтических средств, таких как 5-фторурацил, этопозид, карбоплатин и циклофосфамид, может повышать терапевтическую эффективность этих химиотерапевтических лекарственных средств в отношении саркомы S-180 у мышей, и синергический эффект водорослевого протеогликана, объединенного с 5-фторурацилом, является более значительным.

Кроме того, заявители также изучали ингибирующий эффект экстракта водорослевого протеогликана, используемого отдельно, и экстракта, используемого в комбинации с гемцитабином, в отношении опухоли in vivo у «голых» мышей со злокачественной опухолью поджелудочной железы, а также ингибирующий эффект в отношении карциномы поджелудочной железы в моделях с ксенотрансплантатами полученных от пациентов опухолей (PDX). Результаты показали, что комбинированное применение экстракта водорослевого протеогликана, раскрытого в данном документе, и гемцитабина также характеризуется синергическим эффектом в отношении лечения карциномы поджелудочной железы.

Понятно, что, несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в некоторых подробностях с целью иллюстрации и в качестве примеров, данное изобретение не ограничивается конкретными подробностями, описанными в этих конкретных формах. Специалисту в данной области техники понятно, что различные эквивалентные изменения и модификации технических признаков, связанных с настоящим изобретением, могут быть практически осуществлены без отступления от идеи настоящего изобретения, описанной в данном документе, и такие изменения и модификации находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к средству для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы. Предлагается применение экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в производстве лекарственного препарата для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы, причем экстракт водорослевого протеогликана получен с помощью определенных стадий. Предлагается способ лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы у субъекта, предусматривающий введение субъекту эффективного терапевтического количества экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана. Предлагается применение фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств в производстве лекарственного препарата для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы. Предлагается способ лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы у субъекта, предусматривающий введение субъекту эффективного терапевтического количества фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств. Вышеописанный экстракт или композиция, его содержащая, эффективны для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 20 табл., 9 пр.

1. Применение экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, в производстве лекарственного препарата для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы, причем экстракт водорослевого протеогликана получен с помощью следующих стадий:

(a) растворение порошка сине-зеленых водорослей в 5-20-кратном объеме воды и разрушение клеточной стенки;

(b) нагревание полученной в результате смеси на стадии (а) до 60-100°С и осуществление разделения твердых веществ и жидкости после охлаждения;

(c) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (b) до значения менее 7 и повторное осуществление разделения твердых веществ и жидкости; и

(d) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (с) до нейтрального, концентрирование и сушка, если это необходимо.

2. Применение по п. 1, причем экстракт водорослевого протеогликана и/или экстракт водорослевого протеогликана вместе с фармацевтически приемлемым носителем составлены в фармацевтически приемлемые лекарственные формы, предпочтительно жидкие продукты для перорального применения, капсулы, порошки, таблетки, гранулы, пилюли, сиропы и инъекционные растворы.

3. Применение по п. 1, причем лекарственный препарат вводится перорально, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно, предпочтительно вводится перорально.

4. Применение по п. 1, причем экстракт водорослевого протеогликана вводится в дозе, составляющей 20-150 мг/кг массы тела в сутки.

5. Применение по п. 1, причем злокачественная опухоль поджелудочной железы представляет собой первичную злокачественную опухоль или метастатическую злокачественную опухоль.

6. Способ лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы у субъекта, предусматривающий введение субъекту эффективного терапевтического количества экстракта водорослевого протеогликана или композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана, причем экстракт водорослевого протеогликана получен с помощью следующих стадий:

(a) растворение порошка сине-зеленых водорослей в 5-20-кратном объеме воды и разрушение клеточной стенки;

(b) нагревание полученной в результате смеси на стадии (а) до 60-100°С и осуществление разделения твердых веществ и жидкости после охлаждения;

(c) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (b) до значения менее 7 и повторное осуществление разделения твердых веществ и жидкости; и

(d) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (с) до нейтрального, концентрирование и сушка, если это необходимо.

7. Применение фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств в производстве лекарственного препарата для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы, причем экстракт водорослевого протеогликана получен с помощью следующих стадий:

(a) растворение порошка сине-зеленых водорослей в 5-20-кратном объеме воды и разрушение клеточной стенки;

(b) нагревание полученной в результате смеси на стадии (а) до 60-100°С и осуществление разделения твердых веществ и жидкости после охлаждения;

(c) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (b) до значения менее 7 и повторное осуществление разделения твердых веществ и жидкости; и

(d) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (с) до нейтрального, концентрирование и сушка, если это необходимо.

8. Применение по п. 7, причем противоопухолевые средства представляют собой ингибиторы синтеза нуклеотидов, такие как 5-фторурацил (5-FU); соединения платины, такие как карбоплатин; алкилирующие средства, такие как циклофосфамид и нитрозомочевины; ингибиторы ДНК-полимеразы, такие как гемцитабин; средства, препятствующие синтезу белков, такие как этопозид (VP-16); и противоопухолевые антибиотики, такие как адриамицин (ADM).

9. Способ лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы у субъекта, предусматривающий введение субъекту эффективного терапевтического количества фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств, причем экстракт водорослевого протеогликана получен с помощью следующих стадий:

(a) растворение порошка сине-зеленых водорослей в 5-20-кратном объеме воды и разрушение клеточной стенки;

(b) нагревание полученной в результате смеси на стадии (а) до 60-100°С и осуществление разделения твердых веществ и жидкости после охлаждения;

(c) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (b) до значения менее 7 и повторное осуществление разделения твердых веществ и жидкости; и

(d) доведение рН полученной в результате жидкости на стадии (с) до нейтрального, концентрирование и сушка, если это необходимо.

10. Способ по п. 9, причем противоопухолевые средства представляют собой ингибиторы синтеза нуклеотидов, такие как 5-фторурацил (5-FU); соединения платины, такие как карбоплатин; алкилирующие средства, такие как циклофосфамид и нитрозомочевины; ингибиторы ДНК-полимеразы, такие как гемцитабин; средства, препятствующие синтезу белков, такие как этопозид (VP-16); и противоопухолевые антибиотики, такие как адриамицин (ADM).

11. Способ по п. 9 или 10, причем фармацевтическую композицию, содержащую экстракт водорослевого протеогликана и одно или несколько из других противоопухолевых средств, вводят с помощью любого подходящего пути, как, например, перорально, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно; предпочтительно экстракт водорослевого протеогликана вводят перорально и одно или несколько из других противоопухолевых средств вводят внутрибрюшинно.

12. Применение по любому из пп. 1-5 и 7, 8, причем количество протеогликана, содержащегося в экстракте водорослевого протеогликана, составляет более чем 50%, более чем 60%, более чем 65%, более чем 70% или более чем 75% по массе.

13. Способ по любому из пп. 6 и 9, 10, причем количество протеогликана, содержащегося в экстракте водорослевого протеогликана, составляет более чем 50%, более чем 60%, более чем 65%, более чем 70% или более чем 75% по массе.

14. Способ по п. 11, причем количество протеогликана, содержащегося в экстракте водорослевого протеогликана, составляет более чем 50%, более чем 60%, более чем 65%, более чем 70% или более чем 75% по массе.