Способ моделирования острой динамической кишечной непроходимости в эксперименте Российский патент 2020 года по МПК A61K31/451 A61P1/12 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для создания модели острой динамической кишечной непроходимости с целью изучения, стадий ее развития, патогенеза, возможностей определения жизнеспособности кишечника и лечения.

Частота острой кишечной непроходимости в России составляет около 5 заболевших на 100 тысяч человек. Она является причиной госпитализации от 3 до 5% поступлений больных в хирургические стационары. (Ерюхин И.А., Петров В.П. Ханевич М.Д., 1999; Савельев, В.С., 2004). Летальность при данной патологии остается высокой и по данным разных авторов колеблется от 5,1 до 8,4%, занимая одно из ведущих мест среди всех ургентных хирургических заболеваний. (Чернов А.В., 2006; Gowen, G.F., 2007; Uludag M., Agkun I., Yetkin G., et al., 2004; Teixeira P.G., Karamanos E. Talving P. et al., 2013).

Динамическая или паралитическая кишечная непроходимость определяется как угнетение двигательной активности кишечника. Послеоперационная кишечная непроходимость является наиболее распространенным типом, однако, также во время сепсиса и критических состояний - паралитическая кишечная непроходимость является обычным явлением. Патогенез паралитической кишечной непроходимости до сих пор обсуждается. Недавние исследования, однако, показывают, что длительная фаза послеоперационной кишечной непроходимости вызвана энтерально-молекулярным воспалительным ответом и последующей миграцией лейкоцитов в мышечную ткань кишечных сегментов, которыми манипулируют во время операции. Это воспаление нарушает местную нервно-мышечную функцию и активирует нейрогенные тормозные пути, подавляя моторику всего желудочно-кишечного тракта. Механизмы, лежащие в основе рекрутирования воспалительных клеток и их взаимодействия с афферентной иннервацией кишечника. Наконец, опиоиды, вводимые для послеоперационного обезболивания, также в значительной степени способствуют снижению подвижности желудочно-кишечного тракта, наблюдаемой после абдоминальных операций. (Bauer A.J., Boeckxstaens G.E., 2004; Ten Broek RP, Issa Y, van Santbrink EJ, et al., 2013; Roses RE, Folkert IW, Krouse RS., 2018; Ten Broek RPG, Krielen P, Di Saverio S, et al., 2018; Turenkov A, Kelley KM, Boustany M., 2018; Bower KL, Lollar DI, Williams SL, Adkins FC, Luyimbazi DT, Bower CE, 2018; Bauman ZM, Evans CH., 2018; Pisano M, Zorcolo L, Merli C, et al., 2018).

Экономическая значимость лечения данной патологии наглядно иллюстрируется следующим сравнением: прямые затраты системы здравоохранения на лечение пациентов с острой тонкокишечной непроходимостью в Финляндии примерно равны затратам на лечение больных с раком желудка и раком прямой кишки (Kössi J., Salminen P., Laato M., 2014). А по данным американских авторов, в Соединенных Штатах ежегодно оперируется более чем 300.000 пациентов по поводу спаечной кишечной непроходимости, что требует финансовых затрат в объеме 1,3 миллиарда долларов. (Ray N.F.et al.,1998; Cappell MS, Batke M., 2008; Gore RM, Silvers RI, Thakrar KH, et al., 2015).

В настоящее время существует множество экспериментальных моделей воссоздания механической кишечной непроходимости. Известен способ моделирования острой кишечной непроходимости, включающий нижне-срединную лапаротомию, перевязку кишечника через лапаротомный разрез, отличающийся тем, что через анальное отверстие вводят мягкую трубку длиной 6 см и перевязывают кишечник толстыми лигатурами, накладывая первую лигатуру на трубке на расстоянии 1 см от дистального к анусу конца трубки, а вторую лигатуру - на кишке, не захватывая трубку, непосредственно у дистального конца трубки, после чего пересекают брыжейку между лигатурами вместе с питающими данный участок кишечника сосудами. (Леонов С.Д., Родин А. В. Способ моделирования острой кишечной непроходимости. Патент на изобретение RUS 2422913 07.12.2009).

Известен так же способ моделирования острой регулируемой низкой толстокишечной непроходимости заключающийся в том, что у подопытных собак через лапаротомный разрез, производят обтурацию путем введения через прямую кишку в просвет толстого кишечника диска из мелкопористого поролона диаметром, превышающим в два раза диаметр толстого кишечника, затем ниже места обтурации, кишечник оборачивают поливиниловой трубкой, осуществляют дополнительные разрезы слева и справа от основного лапаротомного разреза, через которые концы поливиниловой трубки выводят на переднюю стенку живота, ими регулируют силу сдавления кишечника, проводят исследования патологического процесса, затем устраняют непроходимость путем извлечения поливиниловой трубки из брюшной полости за один из концов, выведенных на переднюю стенку живота. (Набока Л. А., Чубин А. Н., Корнилова А. В. Способ создания низкой обтурационной кишечной непроходимости у собак. Заявка 2011108826/14, 2011.03.09).

В зарубежной литературе описан способ моделирования послеоперационной кишечной непроходимости, заключающийся в том, что лабораторных мышей подвергали лапаротомии с последующей экстернализацией тонкой кишки и слепой кишки без манипуляций, а затем с последующими различными степенями стандартизированного манипулирования давлением на тонкую кишку. (Novel method for studying postoperative ileus in mice. Sjoerd HW van Bree, Andrea Nemethova, Fleur S van Bovenkamp, Pedro Gomez-Pinilla, L Elbers, Martina Di Giovangiulio, Gianluca Matteoli, Jan van Vliet, Cathy Cailotto, Michael WT Tanck, Guy EE Boeckxstaens. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 2012; 4(4): 219-227. Published online 2012 Dec 26.).

Однако все вышеописанные методы моделирования и диагностики острой кишечной непроходимости применимы в основном для механической ее формы либо являются инвазивными, т.е связанными с операционной агрессией. В настоящее время отсутствует неинвазивный способ моделирования острой динамической кишечной непроходимости.

Изобретение направлено на улучшение воспроизводимости способа моделирования динамической кишечной непроходимости.

Предлагаемый технический результат достигается тем, что лабораторным крысам линии Wistar перорально вводят препарат Лоперамид в дозе 0,09 мг/сут на килограмм массы тела с интервалом между введениями 12 часов два раза в сутки в течение 3 суток.

Лоперамид - это антидиарейное лекарственное средство, одобренное для лечения диареи и доступное без рецепта. Лоперамид действует благодаря ряду различных механизмов действия, которые уменьшают перистальтику и секрецию жидкости, что приводит к увеличению времени прохождения через желудочно-кишечный тракт и увеличению абсорбции жидкости и электролитов из желудочно-кишечного тракта. Это производное фенилпиперидина с химической структурой, сходной с агонистами опиатных рецепторов. Лоперамид метаболизируется системой цитохрома P450 (CYP) и является субстратом для изофермента CYP3A4. Одновременный прием с ингибиторами CYP3A4 может повысить концентрацию Лоперамида. При передозировке Лоперамида наблюдаются симптомы угнетение ЦНС (ступор, нарушения координации движений, сонливость, миоз, мышечная гипертония, угнетение дыхания), а так же кишечная непроходимость. (Ющук Н.Д., Андреев Д.Н., Кучерявый Ю.А., 2017)

В данном исследовании мы поставили цель создание экспериментальной модели острой динамической кишечной непроходимости на крысах, используя фармакологические эффекты Лоперамида.

Экспериментальная часть работы выполнена на базе ФГБУ "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" Минздрава России. Исследования на всех этапах были выполнены в соответствии требованиям ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, ГОСТ Р ИСО 5725-2002 и «Правилами лабораторной практики», утвержденными приказом Минзравсоцразвития РФ от 23.08.2010 №708н. Эксперимент проходил с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU]. Имеется заключение Этического комитета (протокол №3 от 31.10.2011).

Предлагаемая сущность изобретения поясняется рисунками, где фиг. 1 - морфологическая картина стенки тонкой кишки в I и II сериях эксперимента; фиг. 2 - морфологическая картина стенки тонкой кишки с моделью острой динамической кишечной непроходимости на 3-и сутки эксперимента и фиг. 3 - морфологические изменения стенки тонкой кишки на 5-е сутки эксперимента (картина декомпенсированной кишечной непроходимости). Окраска гематоксилин-эозин ув.Х100.

Исследование проведено на 36 крысах самцах линии Wistar с массой тела 300±30 гр, которым перорально вводился Лоперамид 2 раза в сутки с интервалом 12 часов в течение 5 суток. С целью выявления зависимости «доза-эффект», учитывая особенности основного обмена крыс и для исключения токсического действия препарата, все животные были разделены на 3 серии (по 12 особей). В первой группе суточная доза Лоперамида составляла 0,022 мг/кг/сут, во второй - 0,044 мг/кг/сут и третьей - 0,09 мг/кг/сут, что как показало последующее исследование являлось максимальной дозой позволяющей избежать токсического действия препарата. У животных был обычный, привычный, водно-пищевой режим. После моделирования патологии крысы по одной располагались на белом листе бумаги для оценки количества дефекаций (болюсов) в течении 24 часов. Учитывалось среднее число дефекаций по количеству болюсов. Животные под наркозом выводились из эксперимента на 2,3,4,5 сутки с последующим забором образцов тонкого кишечника для проведения патоморфологического исследования. Для гистологического исследования у животных забирали участки ткани тонкого кишечника.

Образцы ткани фиксировали в течение 24 часов при комнатной температуре забуференным формалином в объеме более чем в 20 раз превышающем объем образца. По окончании фиксации образцы перекладывали в кассеты (АпексЛаб, Россия). Кассеты с образцами отмывали от формалина 30 минут в проточной воде, слабой струей из-под крана. Проводка материала осуществлялась путем поочередного перенесения кассет с образцами по серии изопропиловых спиртов возрастающей концентрации. Затем из 100% изопропилового спирта переносили в равную (1:1) смесь изопропанола и о-ксилола (Химмед, Россия) на 1 час, а затем на 40 минут в о-ксилол. Пропитка парафином осуществлялось в четырех сменах предварительно расплавленного парафина Formula «R» (Leica, США) при 56 градусах в термостате (Смоленское СКТБ-СПУ, Россия) по 30-45 минут в каждой. Заливка образцов в расплавленный парафин проводилась в заливочных формах (АпексЛаб, Россия). После полного застывания парафина парафиновый блок извлекали из формы. Перед началом резки парафиновые блоки охлаждали до -20°С. Срезы изготавливали на ротационном микротоме с ручным приводом Leica RM2125RTS (Leica, США) одноразовыми лезвиями S35 (Feather, Япония), толщина срезов 4-5 мкм. Срезы переносили на поверхность водяной бани (КБ Техном, Россия), нагретой от 35 до 49°С для расправления парафина и монтировались на стекла SuperFrost Plus (АпексЛаб, Россия). Полученные стекла выкладывались на нагревательный столик (КБ Техном, Россия) и в течение 15 минут подсушивались при 70°С. Готовые срезы хранились при 2-8°С. Для расплавления парафина срезы помещали в термостат (Смоленское СКТБ-СПУ, Россия) и нагревали при 60°С в течение 30 минут. Депарафинирование срезов осуществляли в двух сменах о-ксилола (Химмед, Россия) по 10 минут в каждой емкости. Затем следовала регидратация срезов в серии изопропиловых спиртов (Химмед, Россия) убывающей концентрации (100%, 100%, 70%, 50%) в емкостях по 5 минут в каждом. Срезы, освобожденные от парафина, промывали в дистиллированной воде 2 минуты.

Для визуализации ядер использовали гематоксилин Майера (БиоВитрум, Россия) по инструкции производителя 5 минут в ванночке с раствором. Ополаскивали дистиллированной водой и подсинивали ядра в проточной воде, а затем снова переносили в дистиллированную воду. Для обозначения цитоплазмы использовали 1% раствор эозина (БиоВитрум, Россия), наносили на стекла по 1-2 мл, инкубировали 1 минуту, а затем промывали в дистиллированной воде. Проводку проводили в сокращенном варианте, начиная с 70% изопропилового спирта (Химмед, Россия) (спирт с концентрацией ниже 70% способен смыть эозин) на 30 секунд, затем перенося препараты в две смены 100% изопропанола по 3 минуты в каждой и в две смены о-ксилола по 3 минуты в каждой. Монтировали полученные препараты под покровное стекло в среду на основе ксилола Витрогель (БиоВитрум, Россия).

Полученные препараты исследовали с использованием микроскопа Olympus BX53 (Olympus, Япония) с набором объективов UPlanFL N 4x/0.13, UPlanFL N 10x/0.30, UPlanFL N 40x/0.75. Фотографии делали с помощью камеры Infinity 2 (Lumenera, Канада) при 40х и 100х увеличениях.

Количественную оценку окрашенных областей проводили визуально по полям зрения. Анализ изображений осуществлялся с помощью программы «Микро-анализ Pro» (ООО «ЛОМО-Микросистемы», Санкт-Петербург). Исследовали следующие показатели: длина ворсинок, ширина ворсинок, глубина крипт, ширина крипт. Статистическую обработку данных, полученных в ходе эксперимента, проводили с использованием пакетов статистических программ Microsoft Excel 2010 и STATISTIKA 6.0 для Windows. Средние значения изучаемых показателей представлены в виде (М±m), где М - среднее арифметическое, а m - стандартная ошибка среднего. Для анализа различий показателей между группами использовали t-критерий Стьюдента. Достоверным считали различие сравниваемых показателей при p<0,05.

В результате морфологический исследований в первой и второй сериях с дозами Лоперамида 0,022 мг/кг/сут и 0,044 мг/кг/сут соответственно, гистологические и морфометрические изменения стенки тонкой кишки в исследуемые сроки не имели достоверных отличий от нормальных значений. Морфологически визуализируется толстая слизистая, практически не нарушенная со стороны просвета. Широкие и длинные ворсинки. Среднее количество болюсов в I серии на вторые сутки - 2,2, на 3-и сутки эксперимента - 1,4. После 3 суток дефекация прекращалась. Во II серии на 2-е сутки эксперимента количество болюсов - 1,1, после чего дефекация прекращалась (фиг. 1).

Пример 1. Лабораторное животное №26 (третья серия эксперимента). Самец возраст - 1 год 3 месяца, масса тела 312 г. Начало эксперимента 12.06.19 в 9.00. Перорально введен препарат Лоперамид в разовой дозе 0,045 мг/кг массы тела. Далее введение препарата Лоперамид продолжалось в разовой дозе 0,045 мг/кг массы тела, в суточной дозе 0,09 мг/кг/сут, с интервалом 12 часов т.е 2 раза в сутки в течение 72 часов. Дефекация прекратилась через 24 часа после введения препарата (в клетке отсутствовали болюсы). Через 72 часа животное выведено из эксперимента. При аутопсии макроскопически обращало на себя внимание раздутые петли тонкого кишечника диаметром до 5 мм, заполнены жидким химусом и газом. Толстый кишечник заполнен каловыми массами. Микроскопически: гистологическая картина характеризовалась выраженным воспалением в строме ворсинок, выраженой лимфоплазмоцитарной инфильтрацией без примесей нейтрофилов с малым количеством эозинофилов и клеток Панета. Отмечались явления слущивания эпители, участков обнажения собственной пластинки слизистой оболочки не наблюдалось. Кровенаполнение сосудов слизистой оболочки и подслизистого слоя было умеренным. Лизиса клеток не отмечается. Длина ворсинок тонкого кишечника (в различных полях зрения) составила 206±5,8 мкм, ширина ворсинок- 54,2±1,5 мкм, глубина крипт - 61,3±1,0 мкм, ширина крипт - 25,8±0,4 мкм (фиг. 2). Данная картина интерпретирована как динамическая кишечная непроходимость в стадии компенсации.

Пример 2. Лабораторное животное №29 (третья серия эксперимента). Самец возраст - 1 год 4 месяца, масса тела 314 г. Начало эксперимента 12.06.19 в 9.00. Перорально введен препарат Лоперамид в разовой дозе 0,045 мг/кг массы тела. Далее введение препарата Лоперамид продолжалось в разовой дозе 0,045 мг/кг массы тела, в суточной дозе 0,09 мг/кг/сут, с интервалом 12 часов т.е 2 раза в сутки в течение 120 часов. Дефекация прекратилась через 24 часа после введения препарата (в клетке отсутствовали болюсы). Через 120 часов животное выведено из эксперимента. При аутопсии (макроскопически) обращали на себя внимание раздутые и отечные петли тонкого кишечника с синюшным оттенком, диаметром до 7 мм, заполнены жидким химусом и газом. Толстый кишечник заполнен каловыми массами. Микроскопически: гистологическая картина характеризовалась утончением слизистой оболочки тонкой кишки, лизисом клеток верхней части ворсинок, при этом основание ворсинок расширено из-за обилия лимфоидных клеток. Клетки Панета отсутствуют. При морфометрическом исследовании выявлены значительные изменения размеров ворсинок и крипт с уменьшением высоты ворсинок в 1,2 раза по сравнению с интактными животными. В просвете кишечника визуализировано много волос, не переваренной пищи и слизи. Длина ворсинок тонкого кишечника (в различных полях зрения) составила 144,5±5,1 мкм, ширина ворсинок - 42,3±0,8 мкм, глубина крипт - 52,3±0,7 мкм, ширина крипт - 21,5±0,4 мкм (фиг. 3). Данная картина интерпретирована как динамическая кишечная непроходимость в стадии декомпенсации.

Дозозависимое влияние применения Лоперамида на морфометрические показатели и функцию кишечника крыс при создании модели динамической кишечной непроходимости в группах исследования (М±m) представлено в таблице.

Предложенный способ позволяет воспроизвести способ моделирования динамической кишечной непроходимости в эксперименте на крысах с применением Лоперамида, он отличается простотой применения, позволяет избежать токсического влияния препарата и может быть использован для изучения стадий развития динамической кишечной непроходимости, ее патогенеза дает возможность определить степень жизнеспособности кишечника, что в конечном итоге позволит улучшить результаты лечения данного заболевания у человека.

Таблица

Серия Доза (мг/кг/сут) Сутки Длина ворсинок (мкм) Ширина ворсинок (мкм) Глубина крипт (мкм) Ширина крипт (мкм) Среднее количество болюсов (сут.) I (n=12) 0,022 2 365,3±4,3 65,3±0,9 76,3±0,6 31,3±0,4 2,3 3 357,3±3,3 64,4±0,7 74,3±0,4 30,1±0,3 1,4 4 342,3±3,3 63,4±0,4 72,3±0,5 30,2±0,6 0 5 315,3±4,2 62,3±0,8 70,3±0,2 28,3±0,3 0 II (n=12) 0,044 2 345,3±4,3 63,3±0,9 70,3±0,4 30,3±0,6 1,1 3 328,3±2,9 61,0±0,5 69,3±0,3 30,6±0,5 0 4 310,3±3,8 60,3±0,7 68,3±0,5 29,3±0,3 0 5 295,3±2,8 59,3±0,9 65,3±0,4 27,3±0,4 0 III (n=12) 0,09 2 235,3±3,8 60,3±0,7 66,3±0,6 28,3±0,5 0 3 205,4±6,3* 55,3±1,3* 62,3±0,9* 26,3±0,5* 0 4 199,2±4,5 52,1±0,9 60,5±1,1 24,1±0,7 0 5 145,5±5,2 42,3±0,8 53,3±0,9 22,3±0,3 0

*- значения при р≤0,05

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для моделирования острой динамической кишечной непроходимости в эксперименте. Лабораторным крысам линии Wistar перорально вводят препарат Лоперамид в дозе 0,09 мг/сут на килограмм массы тела с интервалом между введениями 12 часов два раза в сутки в течение 3 суток. Способ обеспечивает улучшение воспроизводимости при моделировании острой динамической кишечной непроходимости за счет перорального введения крысам препарата Лоперамида, что является неинвазивным способом моделирования острой динамической кишечной непроходимости. 1 табл., 2 пр., 3 ил.

Способ моделирования острой динамической кишечной непроходимости в эксперименте, заключающийся в том, что лабораторным крысам линии Wistar перорально вводят препарат Лоперамид в дозе 0,09 мг/сут на килограмм массы тела с интервалом между введениями 12 часов два раза в сутки в течение 3 суток.