РЕАКЦИОННЫЙ СОСУД И РЕАКЦИОННОЕ УСТРОЙСТВО, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2020 года по МПК C12M1/38 C12Q1/6806 C12Q1/686 

Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение относится к реакционным сосудам и реакционным устройствам, используемым для проведения полимеразных цепных реакций (ПЦР).

Уровень техники

Генетическое тестирование широко используется при исследованиях в широком спектре медицинских областей, при идентификации сельскохозяйственных продуктов и патогенных микроорганизмов, для оценки безопасности пищевых продуктов и даже для исследования патогенных вирусов и различных инфекционных заболеваний. Для того чтобы обнаружить с высокой точностью ничтожное количество ДНК гена, известны методы анализа результата, полученного путем амплификации части ДНК. Прежде всего, ПЦР – это замечательная технология, в которой определенная часть очень малого количества ДНК, взятого из организма или откуда-либо еще, селективно амплифицируется.

В ПЦР заданный термический цикл прикладывается к образцу, в котором смешаны биологический образец, содержащий ДНК, и реагент ПЦР, состоящий из праймеров, ферментов и т.п., с целью вызвать повторение реакций денатурации, отжига и элонгации, таким образом, чтобы обеспечить селективную амплификацию ДНК.

Как правило, ПЦР осуществляют путем помещения определенного количества целевого образца в ПЦР-трубку или реакционный сосуд, такой как микропланшет (микролунку), в котором выполнено множество ячеек. Однако в последние годы практикуется проведение ПЦР с помощью реакционного сосуда (также называемого "чипом"), содержащего выполненный на подложке микроканал (см., например, Патентный документ 1).

Патентный документ 1: JP 2009-232700

Раскрытие изобретения

Проблема, решаемая изобретением

В ПЦР, например, необходимо определенное количество раз проводить термический цикл для образца путем перемещения образца таким образом, чтобы он перемещался из области канала, в которой поддерживается средняя температура порядка 60°C, в область канала, где поддерживается высокая температура порядка 95°C, и обратно. Поскольку образец обычно представляет собой водный раствор, давление пара становится высоким в области высокой температуры порядка 95°C, и содержащаяся в образце вода, скорее всего, испарится. Часть испарившейся из образца воды конденсируется или образует капли в части канала, где температура относительно низка, что приводит к образованию большого количества воды, которая может заблокировать канал. Когда канал таким образом блокируется массой жидкости, существует возможность, что перемещающее усилие не будет должным образом действовать на образец, даже когда внутренний объем канала находится под давлением, таким образом, что перемещение образца надлежащим образом оказывается невозможным. Если образец невозможно переместить соответствующим образом, как было описано выше, проведение устойчивой ПЦР также становится невозможным.

В связи с этим, целью настоящего изобретения является создание реакционного сосуда и реакционного устройства, позволяющих осуществлять устойчивую ПЦР путем перемещения образца надлежащим образом.

Средства решения проблемы

Реакционный сосуд согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения содержит: подложку; выполненный на подложке канал для перемещения образца; пару воздушных коммуникационных отверстий, выполненных на соответствующих концах канала, и область термического цикла, служащую для обеспечения воздействия термического цикла на образец, расположенную между указанной парой воздушных коммуникационных отверстий в канале. Канал содержит множество каналов ответвления между областью термического цикла и по меньшей мере одним из воздушных коммуникационных отверстий.

Область термического цикла может содержать первую температурную область, в которой поддерживается первая температура, и вторую температурную область, в которой поддерживается вторая температура, которая выше первой температуры. Указанное множество каналов ответвления может быть расположено между второй температурной областью и воздушным коммуникационным отверстием, на стороне второй температурной области.

Ответвляющая часть канала в области термического цикла и указанное множество каналов ответвления могут быть расположены рядом со второй температурной областью.

По меньшей мере один из указанного множества каналов ответвления может быть расположен так, чтобы проходить рядом со второй температурной областью.

Каждый из указанного множества каналов ответвления может иметь изогнутую часть. Изогнутая часть по меньшей мере одного из указанного множества каналов ответвления может иметь радиус кривизны больше радиуса кривизны изогнутых частей других каналов ответвления.

Еще одно осуществление настоящего изобретения относится к реакционному устройству. Это реакционное устройство содержит: описанный выше реакционный сосуд; температурный регулятор для регулирования температуры в зоне термического цикла; и систему подачи жидкости, осуществляющую перемещение и остановку образца в канале.

Преимущество настоящего изобретения

Согласно настоящему изобретению, путем надлежащего перемещения образца может быть обеспечено проведение устойчивой ПЦР.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1A и 1B – схемы реакционного сосуда согласно вариантам осуществления настоящего изобретения;

фиг. 2 – вид реакционного сосуда, показанного на фиг. 1A, в разрезе по плоскости A-A;

фиг. 3 – вид в плане подложки реакционного сосуда;

фиг. 4 – схематичное изображение реакционного сосуда с введенным образцом;

фиг. 5 – схема реакционного устройства согласно варианту осуществления настоящего изобретения; и

фиг. 6 – схема, поясняющая принцип работы реакционного сосуда согласно настоящему изобретению.

Осуществление изобретения

Ниже приведено подробное описание возможных вариантов осуществления реакционного сосуда и реакционного устройства согласно настоящему изобретению. Одинаковые или аналогичные элементы, детали и процессы на всех прилагаемых чертежах обозначены одинаковыми ссылочными позициями, повторные объяснения опускаются. Кроме того, рассматриваемые варианты осуществления никоим образом не ограничивают настоящее изобретение и приводятся исключительно в целях иллюстрации, и все признаки, описанные в данных вариантах осуществления и их комбинациях, не обязательно являются существенными для изобретения.

На фиг. 1A и 1B показаны схемы реакционного сосуда 10 согласно варианту осуществления настоящего изобретения. На фиг. 1A показан вид в плане реакционного сосуда 10, а на фиг. 1B приведен вид спереди реакционного сосуда 10. На фиг. 2 приведен вид в разрезе по плоскости A-A реакционного сосуда 10, показанного на фиг. 1A. На фиг. 3 показан вид в плане подложки 14 реакционного сосуда 10.

Реакционный сосуд 10 содержит выполненную из смолы подложку 14, содержащую канавкообразный канал 12, выполненный на её нижней поверхности 14a, герметизирующую канал пленку 16, прикрепленную к нижней поверхности 14a подложки 14, служащую для герметизации канала 12, и две герметизирующие пленки (первую герметизирующую пленку 18 и вторую герметизирующую пленку 20), прикрепленные к верхней поверхности 14b подложки 14.

Предпочтительно, подложка 14 выполнена из материала, устойчивого к изменениям температуры и стойкого к используемому раствору образца. Кроме того, подложка 14, предпочтительно, выполнена из материала, обладающего хорошей формуемостью, прозрачностью и непроницаемостью, а также низкой самофлюоресценцией. В качестве такого материала может использоваться неорганический материал, такой как стекло, кремний (Si) и т.п., или как смола, например, акриловая, полиэфирная, кремнийорганическая и т.п., в частности, циклоолефиновая полимерная смола (ЦПС). В иллюстративном примере подложка 14 имеет длину 76 мм, ширину 26 мм и толщину 4 мм.

Канавкообразный канал 12 выполнен на нижней поверхности 14a подложки 14. В реакционном сосуде 10 согласно рассматриваемому варианту реализации, бóльшая часть канала 12 выполнена в виде канавки, открывающейся на нижнюю поверхность 14a подложки 14. Это сделано с целью облегчения формования посредством литья под давлением с использованием металлической пресс-формы или аналогичного устройства. Для герметизации этой канавки, чтобы её можно было использовать в качестве канала, к нижней поверхности 14a подложки 14 прикреплена герметизирующая канал пленка 16. Представленные в качестве примера размеры канала 12 включают ширину 0,7 мм и глубину 0,7 мм.

Одна из основных поверхностей герметизирующей пленки 16 может быть липкой, или герметизирующая пленка может иметь функциональный слой, обеспечивающий липкость или адгезивность при прижатии, энергетическом облучении ультрафиолетовыми лучами и т.п., нагревании и т.д. на одной из её основных сторон. Таким образом, герметизирующая канал пленка 16 может легко прикрепляться к нижней поверхности 14a подложки 14 при плотном контакте с нижней поверхностью 14a. Предпочтительно, герметизирующая канал пленка 16 выполнена из материала, включающего адгезив, с низкой самофлюоресценцией. В этом отношении, может использоваться прозрачная пленка, выполненная из смолы, например, циклоолефиновой полимерной смолы, полиэфирной смолы, полипропиленовой смолы, полиэтиленовой смолы или акриловой смолы, однако, могут использоваться и другие материалы. Кроме того, герметизирующая пленка 16 может быть выполнена из пластинчатого стекла или полимера. Поскольку в этом случае герметизирующая пленка 16 будет обладать жесткостью, она будет полезна для предотвращения коробления и деформации реакционного сосуда 10.

На одном конце 12a канала 12 в подложке 14 выполнено первое воздушное коммуникационное отверстие 24. На другом конце 12b канала 12 в подложке 14 выполнено второе воздушное коммуникационное отверстие 26. Оба эти отверстия, т.е. первое воздушное коммуникационное отверстие 24 и второе воздушное коммуникационное отверстие 26 выполнены так, что они открываются на верхнюю поверхность 14b подложки 14.

Между первым воздушным коммуникационным отверстием 24 и одним концом 12a канала 12 в подложке 14 обеспечен первый фильтр 28. Между вторым воздушным коммуникационным отверстием 26 и другим концом 12b канала 12 в подложке 14 обеспечен второй фильтр 30. Оба фильтра, т.е. первый фильтр 28 и второй фильтр 30, предусмотренные на соответствующих концах канала 12, обладают хорошими характеристиками низкопримесности и пропускают только воздух, предотвращая загрязнение, чтобы ПЦР не прерывали амплификацию ДНК-мишени и обнаружение амплификации, и чтобы качество ДНК-мишени не ухудшалось. В качестве фильтрующего материала может использоваться, например, материал, полученный путем обработки полиэтилена водоотталкивающими веществами. Кроме того, могут использоваться и другие известные материалы, при условии, что они выполняют вышеуказанную функцию. Первый фильтр 28 и второй фильтр 30 выполняются таким образом, чтобы без зазора входить в пространство для установки фильтра, выполненное в подложке 14, и их диаметр, например, может составлять 4 мм, а толщина – 2 мм.

Как показано на фиг. 1A, между парой воздушных коммуникационных отверстий, т.е. между первым воздушным коммуникационным отверстием 24 и вторым воздушным коммуникационным отверстием 26, канал 12 содержит область 32 термического цикла, служащую для подвергания образца воздействию термического цикла, и область 34 дозирования, служащую для осуществления так называемого дозирования, в ходе которого извлекается определенное количество образца. Область 32 термического цикла расположена со стороны первого воздушного коммуникационного отверстия 24 в канале 12. Область 34 дозирования расположена со стороны второго воздушного коммуникационного отверстия 26 в канале 12. Область 32 термического цикла и область 34 дозирования сообщаются друг с другом. Путем перемещения образца, дозированного в области 34 дозирования, в область 32 термического цикла, таким образом, что образец непрерывно перемещается туда-обратно между областями реакции, в которых поддерживается заданная температура, входящими в область 32 термического цикла, образец можно подвергать воздействию термического цикла.

Когда реакционный сосуд 10 установлен на описываемом ниже реакционном устройстве, область 32 термического цикла канала 12 включает в себя область реакции (далее называемую "областью 38 средней температуры"), в которой поддерживается относительно низкая температура (около 55°C), область реакции (далее называемую "областью 36 высокой температуры"), в которой поддерживается относительно высокая температура (около 95°C), и соединительную область 40, соединяющую область 36 высокой температуры с областью 38 средней температуры. Область 36 высокой температуры расположена на стороне первого воздушного коммуникационного отверстия 24, а область 38 средней температуры расположена на стороне второго воздушного коммуникационного отверстия 26 (иными словами, на стороне области 34 дозирования).

Как область 36 высокой температуры, так и область 38 средней температуры, каждая содержит канал змеевидной формы, который, в свою очередь, образован из чередующихся криволинейных и прямолинейных участков. При использовании вышеописанного канала змеевидной формы, эффективная область, т.е. область, в которой может быть эффективно использован нагреватель или иное аналогичное описанное ниже средство регулирования температуры, ограничена, и преимущество этого заключается в том, что вариации температуры в области реакции можно легко уменьшить, и в том, что можно уменьшить габариты реакционного сосуда, благодаря чему уменьшаются размеры и всего реакционного устройства в целом. Соединительная область 40 может быть выполнена в виде прямолинейного канала.

Область 34 дозирования канала 12 расположена между областью 38 средней температуры в области 32 термического цикла и вторым фильтром 30. Как уже было указано выше, область 34 дозирования служит для дозирования определенного количества образца, который должен быть подвергнут ПЦР. Область 34 дозирования содержит канал 42 дозирования для отмеривания заданного количества образца, два канала ответвления (первый канал 43 ответвления и второй канал 44 ответвления), ответвляющиеся от канала 42 дозирования, первое отверстие 45 ввода образца, расположенное на конце первого канала 43 ответвления, и второе отверстие 46 ввода образца, расположенное на конце второго канала 44 ответвления. Первое отверстие 45 ввода образца сообщается с каналом 42 дозирования через первый канал 43 ответвления. Второе отверстие 46 ввода образца сообщается с каналом 42 дозирования через второй канал 44 ответвления. Канал 42 дозирования выполнен в виде канала змеевидной формы с целью дозирования заданного количества образца на минимальной площади. Первое отверстие 45 ввода образца и второе отверстие 46 ввода образца выполнены так, что они открываются на верхнюю поверхность 14b подложки 14. Первое отверстие 45 ввода образца имеет относительно малый диаметр, второе отверстие 46 ввода образца имеет относительно большой диаметр. Если точку ответвления, в которой первый канал 43 ответвления ответвляется от канала 42 дозирования, обозначить как первую точку 431 ответвления, и точку ответвления, в которой второй канал 44 ответвления ответвляется от канала 42 дозирования, обозначить как вторую точку 441 ответвления, то объем образца, который должен быть подвергнут воздействию ПЦР, будет практически равен объему внутри канала 42 дозирования между первой точкой 431 ответвления и второй точкой 441 ответвления.

В рассматриваемом варианте осуществления, область 34 дозирования расположена между областью 32 термического цикла и вторым фильтром 30. Однако положение области 34 дозирования не ограничивается данным вариантом, и область 34 дозирования может быть расположена между областью 32 термического цикла и первым фильтром 28. Если дозирование образца может быть точно осуществлено с помощью пипетки или аналогичного устройства, канал может быть выполнен без области 34 дозирования, или выполнен таким образом, чтобы ввод образца производился непосредственно в область термического цикла или иным подобным образом.

В реакционном сосуде 10 согласно настоящему варианту осуществления, канал 12 также содержит два канала ответвления (первый канал 61 ответвления и второй канал 62 ответвления), расположенные параллельно между областью 36 высокой температуры области 32 термического цикла и первым воздушным коммуникационным отверстием 24. Иными словами, хотя канал 12 и является единым каналом в области 32 термического цикла, канал 12 разветвляется на первый канал 61 ответвления и второй канал 62 ответвления в точке 63 разветвления, расположенной вблизи области 36 высокой температуры. Первый канал 61 ответвления и второй канал 62 ответвления расположены так, что проходят по разным частям подложки 14 и снова соединяются в одном конце 12a канала 12. Как показано на фиг. 1A, первый канал 61 ответвления отходит вверх от точки 63 разветвления, чтобы отойти от области 36 высокой температуры, затем делает поворот налево с относительно малым радиусом кривизны и достигает одного конца 12a канала 12. С другой стороны, второй канал 62 ответвления отходит влево от точки 63 разветвления и проходит в близости с областью 36 высокой температуры, и затем достигает одного конца 12a канала 12. В рассматриваемом варианте осуществления изогнутая часть второго канала 62 ответвления поворачивает вверх с бóльшим радиусом кривизны, чем изогнутая часть первого канала 61 ответвления. Это позволяет ожидать эффект, при котором локальная концентрация массы жидкости менее вероятна. Однако форма изгиба канала этим не ограничивается, и специалист в данной области может выбрать форму изгиба в зависимости от размера реакционного сосуда и удобства конструкции и производства реакционного устройства.

Первое воздушное коммуникационное отверстие 24, второе воздушное коммуникационное отверстие 26, первый фильтр 28, второй фильтр 30, первое отверстие 45 ввода образца и второе отверстие 46 ввода образца открываются на верхнюю поверхность 14b подложки 14. Таким образом, для герметизации первого воздушного коммуникационного отверстия 24, второго воздушного коммуникационного отверстия 26, первого фильтра 28 и второго фильтра 30 к верхней поверхности 14b подложки 14 прикреплена первая герметизирующая пленка 18. Для герметизации первого отверстия 45 ввода образца и второго отверстия 46 ввода образца к верхней поверхности 14b подложки 14 прикреплена вторая герметизирующая пленка 20. Когда первая герметизирующая пленка 18 и вторая герметизирующая пленка 20 прикреплены, весь канал образует закрытое пространство.

Используемая первая герметизирующая пленка 18 имеет размеры, которые позволяют одновременно закрыть первое воздушное коммуникационное отверстие 24, второе воздушное коммуникационное отверстие 26, первый фильтр 28 и второй фильтр 30. Описываемый позже насос нагнетательного типа подсоединяется к первому воздушному коммуникационному отверстию 24 и второму воздушному коммуникационному отверстию 26 путем перфорирования первой герметизирующей пленки 18, в местах, соответствующих расположению первого воздушного коммуникационного отверстия 24 и второго воздушного коммуникационного отверстия 26 полой иглой (иглой шприца с острым концом), предусмотренной на наконечнике насоса. Таким образом, первая уплотнительная пленка 18, предпочтительно, представляет собой пленку, выполненную из материала, легко перфорируемого иглой, и/или имеет толщину, которую можно легко перфорировать иглой. В рассматриваемом варианте осуществления описывается герметизирующая пленка, имеющая размеры, позволяющие одновременно герметизировать первое воздушное коммуникационное отверстие 24, второе воздушное коммуникационное отверстие 26, первый фильтр 28 и второй фильтр 30. Однако эти воздушные коммуникационные отверстия и фильтры можно герметизировать по отдельности. Кроме того, пленка, герметизирующая первое воздушное коммуникационное отверстие 24 и второе воздушное коммуникационное отверстие 26, может быть снята, чтобы осуществить подключение к насосу нагнетательного типа.

В качестве второй герметизирующей пленки 20 используется герметизирующая пленка, размеры которой позволяют одновременно герметизировать первое отверстие 45 ввода образца и второе отверстие 46 ввода образца. Введение образца в канал 12 через первое отверстие 45 ввода образца и второе отверстие 46 ввода образца осуществляется отделением второй герметизирующей пленки 20 от подложки 14, и, после введения заданного количества образца, вторую герметизирующую пленку 20 снова приклеивают к верхней поверхности 14b подложки 14. Таким образом, вторая герметизирующая пленка 20, предпочтительно, должна обладать достаточной липкостью, чтобы выдерживать несколько циклов отделения и повторного приклеивания. В качестве альтернативы, в качестве второй герметизирующей пленки 20 после введения образца можно использовать новую пленку. В этом случае, требования, предъявляемые к пленке в связи с её многократным отделением и повторным приклеиванием, могут быть не такими высокими.

Как и герметизирующая канал пленка 16, первая герметизирующая пленка 18 и вторая герметизирующая пленка 20 могут иметь адгезивный слой или функциональный слой, обеспечивающий липкость или адгезивность при прижимании, сформированный на одной из её главных сторон. В этом отношении, может использоваться прозрачная пленка, выполненная из смолы, например, циклоолефиновой полимерной смолы, полиэфирной смолы, полипропиленовой смолы, полиэтиленовой смолы или акриловой смолы, однако, могут использоваться и другие материалы. Как было указано выше, такое свойство пленки, как её липкость или адгезивность, не должны деградировать до такой степени, чтобы это влияло на возможность её использования при многократном отделении и повторном приклеивании. Однако при использовании новой пленки после отделения и ввода образца или подсоединения нагнетательного насоса, важность этого свойства пленки, связанного с возможностью её отделения и повторного приклеивания, является не столь значимой.

Ниже будет рассмотрен способ использования описанного выше реакционного сосуда 10. Сначала приготовляют образец, который должен быть подвергнут амплификации путем подвергания воздействию термического цикла. В качестве образца может использоваться, например, образец, полученный путем добавления флюоресцентного зонда, термоустойчивого фермента и четырех типов дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) как реагентов ПЦР, к смеси, содержащей один или несколько типов ДНК. Кроме того, добавляют праймер, реагирующий конкретно на подвергнутую реакции ДНК. Могут быть использованы также коммерчески доступные наборы реагентов для ПЦР в реальном времени, и т.п.

Затем вторую герметизирующую пленку 20 отделяют от подложки 14, таким образом, чтобы открыть первое отверстие 45 ввода образца и второе отверстие 46 ввода образца.

После этого с помощью пипетки, шприца или аналогичного инструмента вводят образец в отверстие ввода образца. На фиг. 4 схематично изображен реакционный сосуд 10 с введенным в него образцом 50. Образец 50 вводят в канал 42 дозирования через первое отверстие 45 ввода образца или через второе отверстие 46 ввода образца. Способ ввода этим не ограничивается. В качестве альтернативы, например, соответствующее количество образца 50 может быть введено непосредственно с помощью пипетки или капельницы. При вводе образца с помощью пипетки, образец 50 вводят через первое отверстие 45 ввода образца, имеющее относительно меньший диаметр. В этом случае, образец 50 поступает в канал 42 дозирования, перемещаясь ко второму отверстию 46 ввода образца. При вводе образца с помощью капельницы, образец 50 вводят через второе отверстие 46 ввода образца, имеющее относительно больший диаметр. В этом случае, образец 50 поступает в канал 42 дозирования, перемещаясь к первому отверстию 45 ввода образца. Избыток образца, введенного через какое-либо из отверстий ввода образца, превышающий объем канала ответвления, скапливается на другом отверстии ввода образца. Таким образом, для того чтобы использовать компонент отверстия ввода образца как своего рода сервер, компонент отверстия ввода образца может быть выполнен имеющим определенный объем. Как будет указано ниже, образец 50, введенный в канал 42 дозирования между первой точкой 431 ответвления и второй точкой 441 ответвления, подвергается ПЦР путем создания повышенного давления со стороны первого воздушного коммуникационного отверстия 24 и второго воздушного коммуникационного отверстия 26. Таким образом, область 34 дозирования реакционного сосуда 10 осуществляет функцию дозирования путем извлечения заданного количества образца.

Затем вторую герметизирующую пленку 20 снова прикрепляют к подложке 14, таким образом, чтобы закрыть первое отверстие 45 ввода образца и второе отверстие 46 ввода образца. Вместо второй герметизирующей пленки 20, которая была отделена, может быть прикреплена новая вторая герметизирующая пленка 20. На этом введение образца 50 в реакционный сосуд 10 заканчивается.

Вышеупомянутая функция дозирования в реакционном сосуде не исключает введения образца при точном дозировании образца с помощью только пипетки.

На фиг. 5 показана схема реакционного устройства 100 согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Реакционное устройство 100 согласно данному варианту осуществления включает в себя область размещения реакционного сосуда (не показана), на которую устанавливается реакционный сосуд 10, систему 102 регулирования температуры и центральный процессор (CPU) 105. Как показано на фиг. 5, реакционный сосуд 10, установленный в области размещения реакционного сосуда, снабжен системой регулирования температуры 102, чтобы можно было точно регулировать температуру в области 36 высокой температуры в канале 12 реакционного сосуда 10 и поддерживать её значение около 95°C, а также регулировать температуру в области средней температуры, поддерживая её значение равным приблизительно 60°C.

Система 102 регулирования температуры служит для поддержания заданной температуры в каждой температурной области области термического цикла; эта система содержит высокотемпературный нагреватель 104 для осуществления нагрева в области 36 высокой температуры канала 12, среднетемпературный нагреватель 106 для нагрева в области 38 средней температуры канала 12, температурный датчик (не показан), например, такой как термопара или аналогичный элемент, служащий для измерения фактической температуры в каждой температурной области, управляющее устройство 108 высокотемпературного нагревателя для регулирования температуры высокотемпературного нагревателя 104 и управляющее устройство 110 среднетемпературного нагревателя для регулирования температуры среднетемпературного нагревателя 106. Кроме того, реакционное устройство 100 согласно рассматриваемому варианту осуществления содержит нагреватель 112 дозирования для нагрева области 34 дозирования канала 12 и управляющее устройство 114 нагревателя дозирования для регулирования температуры нагревателя 112 дозирования. Информация по фактической температуре, замеренной температурным датчиком, посылается в CPU 105. На основании информации по фактической температуре в каждой температурной области, CPU 105 осуществляет управление управляющим устройством каждого нагревателя, поддерживая, таким образом, температуру каждого нагревателя на заданном уровне. Каждый нагреватель может представлять собой, например, резисторный нагревательный элемент, элемент Пельтье и т.п. Система 102 регулирования температуры может дополнительно содержать и другие элементы, служащие для улучшения регулируемости температуры в каждой температурной области.

Реакционное устройство 100 согласно настоящему варианту осуществления также содержит систему 120 подачи жидкости, служащую для перемещения и остановки образца 50 в канале 12 реакционного сосуда 10. Система 120 подачи жидкости содержит первый насос 122, второй насос 124, управляющее устройство 126 первого насоса для привода первого насоса 122, управляющее устройство 128 второго насоса для привода второго насоса 124, первую трубку 130 и вторую трубку 132.

Один конец первой трубки 130 соединен с первым воздушным коммуникационным отверстием 24 реакционного сосуда 10. Предпочтительно, в месте соединения первого воздушного коммуникационного отверстия 24 с концом первой трубки 130 предусмотрен уплотнительный материал 134 или уплотнение для обеспечения герметичности. Другой конец первой трубки 130 соединен с выходом первого насоса 122. Аналогичным образом, один конец второй трубки 132 соединен со вторым воздушным коммуникационным отверстием 26 реакционного сосуда 10. Предпочтительно, в месте соединения второго воздушного коммуникационного отверстия 26 с концом второй трубки 132 предусмотрен уплотнительный элемент 136 или уплотнение для обеспечения герметичности. Другой конец второй трубки 132 соединен с выходом второго насоса 124.

В качестве первого насоса 122 и второго насоса 124 могут использоваться, например, микровоздуходувки, каждая из которых содержит диафрагменный насос. В качестве первого насоса 122 и второго насоса 124, например, могут быть использованы микровоздуходувки модели MZB1001 T02 производства компании Murata Manufacturing Co., Ltd., или аналогичные. Хотя эта микровоздуходувка может повысить давление на вторичной стороне относительно давления на первичной стороне, давление на первичной стороне и на вторичной стороне выравниваются в момент остановки насоса, или когда он остановлен.

CPU 105 регулирует подачу и повышение давления воздуха первым насосом 122 и вторым насосом 124 с помощью управляющего устройства 126 первого насоса и управляющего устройства 128 второго насоса. Наддув и/или повышение давления от первого насоса 122 и второго насоса 124 действует на образец 50 внутри канала 12 через первое воздушное коммуникационное отверстие 24 и второе воздушное коммуникационное отверстие 26 и выполняет функцию движущего усилия для перемещения образца 50. Выражаясь более конкретно, при переменном включении первого насоса 122 и второго насоса 124, давление, действующее на одну торцовую поверхность образца 50 становится больше давления, действующего на другую торцовую поверхность, в результате чего возникает движущее усилие, обеспечивающее перемещение образца 50. Путем переменного включения первого насоса 122 и второго насоса 124 образец 50 можно возвратно-поступательно перемещать в канале, таким образом, чтобы он попадал по очереди в каждую из температурных областей канала 12 реакционного сосуда 10. В результате, образец 50 подвергается воздействию термического цикла. Более конкретно, ДНК-мишень в образце 50 селективно амплифицируется путем повторяющегося воздействия операции денатурации в области высокой температуры и операции отжига и элонгации в области средней температуры. Иными словами, область высокой температуры можно рассматривать как область температуры, при которой происходит денатурация, и область средней температуры можно рассматривать как область температуры, при которой происходят отжиг и элонгация. Время пребывания в каждой температурной области может устанавливаться соответствующим образом путем изменения времени, в течение которого образец 50 остается в определенном положении в каждой температурной области.

Реакционное устройство 100 согласно настоящему варианту осуществления дополнительно содержит детектор 140 флюоресценции. Как было указано выше, к образцу 50 добавляют определенный флюоресцентный зонд. Поскольку интенсивность сигнала флюоресценции, излучаемой образцом 50, повышается в процессе амплификации ДНК, значение интенсивности сигнала флюоресценции можно использовать в качестве показателя при принятии решения о продолжении процесса ПЦР или окончании реакции.

В качестве детектора 140 флюоресценции может быть использован оптико-волоконный детектор флюоресценции FLE-510 производства компании Nippon Sheet Glass Co., Ltd., представляющий собой очень компактную оптическую систему, позволяющую быстро измерять и обнаруживать флюоресценцию, независимо от того, проводится тест в освещенном или темном месте. Этот оптико-волоконный детектор флюоресценции позволяет настраивать спектральную характеристику возбуждения света/флюоресценции, таким образом, чтобы спектральная характеристика подходила к характеристике флюоресценции, излучаемой образцом 50, и, таким образом, позволяла получить оптимальную оптическую систему для образца с разными характеристиками. Кроме того, оптико-волоконный детектор флюоресценции пригоден для обнаружения флюоресценции образца в маленькой или узкой области, такой как канал, вследствие малого диаметра луча света, выдаваемого оптико-волоконным детектором флюоресценции.

Оптико-волоконный детектор флюоресценции 140 содержит оптическую головку 142, управляющее устройство 144 детектора флюоресценции и световод 146, соединяющий оптическую головку 142 с управляющим устройством 144 детектора флюоресценции. Управляющее устройство 144 детектора флюоресценции содержит источник света для создания возбуждающего света (светодиод, лазер или источник света, обеспечивающий свет других заданных длин волн), оптико-волоконный мультиплексор/демультиплексор и фотоэлектрическое преобразующее устройство (фотодиод, лавинный фотодиод или фотоэлемент типа фотоэлектронного умножителя (ФЭУ)) (ни одно из вышеуказанных устройств не показано), и т.д., и выполнен в виде управляющего устройства или аналогичного устройства для управления вышеуказанными устройствами. Оптическая головка 142 представляет собой оптическую систему, такую как линза, и выполняет функцию направленного облучения образца возбуждающим светом и приема флюоресценции, излучаемой образцом. Собранная флюоресценция по световоду 146 поступает управляющее устройство 144 детектора флюоресценции, где она отделяется от возбуждающего света в оптико-волоконном мультиплексоре/демультиплексоре и преобразуется в электрический сигнал фотоэлектрическим преобразующим элементом.

В реакционном устройстве 100 согласно рассматриваемому варианту осуществления настоящего изобретения, оптическая головка 142 устроена таким образом, что может быть обнаружена флюоресценция от образца 50 в канале, соединяющем область высокой температуры с областью средней температуры. Поскольку при циклическом возвратно-поступательном перемещении образца 50 в канале протекает реакция, таким образом, что происходит амплификация содержащейся в образце 50 ДНК, отслеживание изменения количества обнаруженной флюоресценции дает возможность установления прогресса амплификации ДНК в реальном времени. Кроме того, в реакционном устройстве 100 согласно рассматриваемому варианту осуществления, выходное значение, получаемое от детектора 140 флюоресценции, используется для управления перемещением образца 50, как будет описано ниже. В качестве детектора флюоресценции может быть использован не только оптико-волоконный детектор флюоресценции, при условии, что детектор флюоресценции обеспечивает обнаружение флюоресценции образца.

На фиг. 6 приведена схема, поясняющая принцип работы реакционного сосуда согласно представленному осуществлению настоящего изобретения. В реакционном сосуде 10, показанном на фиг. 6, образец 50, введенный в канал 42 дозирования между первой точкой 431 ответвления и второй точкой 441 ответвления в области 34 дозирования, был перемещен в область 32 термического цикла. Точнее говоря, при установке заполненного образцом 50 реакционного сосуда 10 в реакционное устройство 100 и включении только второго насоса 124, образец 50 из области 34 дозирования был продвинут в область 32 термического цикла. После этого, как было указано выше, путем переменного включения первого насоса 122 и второго насоса 124 (см. фиг. 5), образец 50 совершал возвратно-поступательные перемещения в канале 12, непрерывно перемещаясь между областью 36 высокой температуры и областью 38 средней температуры, и, таким образом, подвергался воздействию термического цикла. Управление нагревателем 112 дозирования может осуществляться таким образом, что температура области 34 дозирования, в частности, температуры первого отверстия 45 ввода образца и второго отверстия 46 ввода образца в области 34 дозирования, при воздействии термического цикла на образец 50 становятся ниже, чем эти температуры, когда образец 50 находится в области 34 дозирования. Таким образом, может предотвращаться ситуация, при которой тепло от области 32 термического цикла передается к первому отверстию 45 ввода образца и второму отверстию 46 ввода образца и повышает температуру, проталкивая образец, оставшийся в первом отверстии 45 ввода образца и втором отверстии 46 ввода образца, в канал, таким образом, что оставшийся образец поступает внутрь канала. Это необходимо потому, что существует возможность, что возвратно-поступательное движение подвергаемого ПЦР образца может быть затруднено, когда такие образцы находятся на расстоянии друг от друга.

При возвратно-поступательном движении между областью 36 высокой температуры и областью 38 средней температуры (т.е. в процессе термического цикла ПЦР), давление пара в области 36 высокой температуры возрастает, и существует возможность испарения воды, содержащейся в образце 50. Часть испарившейся из образца 50 воды конденсируется в той части канала 12, в которой температура является относительно низкой, что приводит к образованию воды, которая может заблокировать канал. Например, как показано на фиг. 6, температура первого канала 61 ответвления, расположенного на удалении от области 36 высокой температуры, является пониженной, что может приводить к образованию жидкой массы 65.

Однако в реакционном сосуде 10 согласно рассматриваемому варианту осуществления, даже когда первый канал 61 ответвления заблокирован жидкой массой 65, как это показано на фиг. 6, создаваемый насосом (см. фиг. 5) напор может воздействовать на образец 50 через второй канал 62 ответвления, который не блокирован, и образец 50 может надлежащим образом перемещаться, чтобы происходила устойчивая ПЦР.

Когда точка 63 разветвления расположена на удалении от области 36 высокой температуры, существует вероятность образования жидкой массы в самой точке 63 разветвления. В этом случае, воздействие создаваемого насосом напора на образец 50 трудно обеспечить. Таким образом, как показано на фиг. 6, точка 63 разветвления, предпочтительно, расположена рядом с областью 36 высокой температуры. При расположении точки 63 разветвления рядом с областью 36 высокой температуры тепло от области 36 высокой температуры передается к точке 63 разветвления, таким образом, предотвращая формирование жидкой массы в точке 63 разветвления, и создаваемый насосом напор беспрепятственно передается на образец 50.

В рассмотренном варианте осуществления предусмотрены два канала ответвления. Однако количество каналов ответвления не ограничено двумя, и между областью 36 высокой температуры и первым воздушным коммуникационным отверстием 24 в области 32 термического цикла могут быть предусмотрены три и более канала ответвления.

Предпочтительно, по меньшей мере один канал ответвления из множества каналов ответвления выполнен так, что проходит рядом с областью 36 высокой температуры. Например, в описанном выше варианте осуществления, первый канал 61 ответвления проходит на удалении от области 36 высокой температуры, а второй канал 62 ответвления проходит рядом с областью 36 высокой температуры. Это обеспечивает передачу тепла от области 36 высокой температуры к второму каналу 62 ответвления, предотвращая образование жидкой массы во втором канале 62 ответвления, и, таким образом, обеспечивая передачу надлежащим образом создаваемого насосом напора к образцу 50. Иными словами, это можно пояснить следующим образом. Если испарившаяся из образца вода вследствие конденсации и т.п. образует жидкую массу, и участок канала, который, скорее всего, окажется заблокированным, известен на основании опыта или экспериментальных исследований, блокирование этого участка можно допустить, но даже в такой ситуации можно обеспечить резервные или обводные каналы для подачи и создания напора воздуха, выполняющего роль движущего усилия.

В рассмотренном выше варианте осуществления, как первый канал 61 ответвления, так и второй канал 62 ответвления имеют изогнутую часть, причем изогнутая часть второго канала 62 ответвления, проходящая рядом с областью 36 высокой температуры, имеет больший радиус кривизны, чем радиус кривизны изогнутой части первого канала 61 ответвления, проходящего на удалении от области высокой температуры. Как правило, при большем радиусе кривизны изогнутой части образование жидкой массы в канале менее вероятно. Таким образом, придавая изогнутой части второго канала 62 ответвления больший радиус кривизны, чем радиус кривизны изогнутой части первого канала 61 ответвления, обеспечивается уменьшение вероятности образования жидкой массы во втором канале 62 ответвления, и, таким образом, создаваемый насосом напор может надлежащим образом воздействовать на образец 50. Помимо рассмотренного выше варианта осуществления, раскрывается конфигурация, в которой имеется множество каналов между областью 36 высокой температуры и первым воздушным коммуникационным отверстием 24 в области 32 термического цикла. Для других частей канала, например, для участка, в котором, как известно на основании опыта или результатов исследований, блокирование в результате образования жидкой массы вследствие испарения образца является вероятным, может быть предусмотрено множество каналов.

Настоящее описание объясняет настоящее изобретение на основе возможных вариантов его осуществления. Эти варианты осуществления являются лишь иллюстративными, и, как будет ясно специалистам, может быть разработано много других различных изменений и модификаций, которые все охватываются объемом настоящего изобретения.

Ссылочные позиции

10 реакционный сосуд, 12 канал, 14 подложка, 16 герметизирующая канал пленка, 18 первая герметизирующая пленка, 20 вторая герметизирующая пленка, 24 первое воздушное коммуникационное отверстие, 26 второе воздушное коммуникационное отверстие, 28 первый фильтр, 30 второй фильтр, 32 область термического цикла, 34 область дозирования, 36 область высокой температуры, 38 область средней температуры, 40 соединительная область, 42 канал дозирования, 43 первый канал ответвления, 44 второй канал ответвления, 45 первое отверстие ввода образца, 46 второе отверстие ввода образца, 50 образец, 61 первый канал ответвления, 62 второй канал ответвления, 63 точка разветвления, 65 жидкая масса, 100 реакционное устройство, 102 система регулирования температуры, 104 высокотемпературный нагреватель, 105 CPU, 106 среднетемпературный нагреватель, 108 управляющее устройство высокотемпературного нагревателя, 110 управляющее устройство среднетемпературного нагревателя, 112 нагреватель дозирования, 114 управляющее устройство нагревателя дозирования, 120 система подачи жидкости, 122 первый насос, 124 второй насос, 126 управляющее устройство первого насоса, 128 управляющее устройство второго насоса, 130 первая трубка, 132 вторая трубка, 134, 136 уплотнительный элемент, 140 детектор флюоресценции, 142 оптическая головка, 144 управляющее устройство детектора флюоресценции, 146 световод, 431 первая точка ответвления, 441 вторая точка ответвления

Промышленная применимость.

Настоящее изобретение можно использовать для проведения полимеразных цепных реакций (ПЦР).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен реакционный сосуд и реакционное устройство для проведения полимеразной цепной реакции. Реакционный сосуд содержит подложку, канал для перемещения образца, отверстие для введения образца внутрь канала, пару воздушных коммуникационных отверстий на концах канала и область термического цикла между парой воздушных коммуникационных отверстий. Причем канал содержит множество каналов ответвления между областью термического цикла и воздушным коммуникационным отверстием, а область термического цикла содержит первую температурную область и вторую температурную область. Реакционное устройство содержит указанный реакционный сосуд, температурный регулятор и систему подачи жидкости. Изобретения обеспечивают надлежащее перемещение образца для проведения устойчивого ПЦР. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Реакционный сосуд для проведения полимеразной цепной реакции, содержащий:

подложку;

канал для перемещения образца, выполненный на подложке;

отверстие ввода образца для введения образца внутрь канала;

пару воздушных коммуникационных отверстий, обеспеченных на соответствующих концах канала; и

область термического цикла, служащую для обеспечения воздействия термического цикла на образец, расположенную между указанной парой воздушных коммуникационных отверстий в канале,

причем канал содержит множество каналов ответвления между областью термического цикла и по меньшей мере одним из указанных воздушных коммуникационных отверстий,

причем область термического цикла содержит первую температурную область, в которой поддерживается первая температура, и вторую температурную область, в которой поддерживается вторая температура, которая выше первой температуры,

при этом указанное множество каналов ответвления расположено между второй температурной областью и воздушным коммуникационным отверстием на стороне второй температурной области,

причем вторая температурная область и воздушное коммуникационное отверстие, расположенное на стороне второй температурной области, сообщаются друг с другом через указанное множество каналов ответвления, расположенное между ними,

причем канал в области термического цикла разветвляется на указанное множество каналов ответвления в точке разветвления,

при этом расстояние между указанной точкой разветвления и второй температурной областью меньше, чем расстояние между указанной точкой разветвления и первой температурной областью.

2. Реакционный сосуд по п. 1, в котором расстояние между по меньшей мере одним из указанного множества каналов ответвления и второй температурной областью меньше, чем расстояние между другим каналом ответвления и второй температурной областью.

3. Реакционный сосуд по п. 1 или 2,

в котором каждый из указанного множества каналов ответвления имеет изогнутую часть, и

изогнутая часть по меньшей мере одного из указанного множества каналов ответвления имеет радиус кривизны больше радиуса кривизны изогнутых частей других каналов ответвления.

4. Реакционное устройство для проведения полимеразной цепной реакции, содержащее:

реакционный сосуд по любому из пп. 1-3;

температурный регулятор для регулирования температуры области термического цикла; и

систему подачи жидкости, осуществляющую перемещение и остановку образца в канале для перемещения образца.