ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ РЕАКЦИОННЫЙ СОСУД Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/686 G01N35/08 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к технологическим реакционным сосудам, используемым для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Уровень техники

Генетическое тестирование широко применяется для исследований в разнообразных областях медицины, идентификации сельскохозяйственных продуктов и патогенных микроорганизмов, для оценки безопасности продовольственных товаров, и даже для исследования патогенных вирусов и множества инфекционных заболеваний. Для того чтобы детектировать с высокой чувствительностью небольшое количество ДНК, известны методы анализа полученного продукта путем амплификации части ДНК. Прежде всего, способ с использованием ПЦР представляет собой передовую технологию, в которой определенная часть очень небольшого количества ДНК, взятого из организма и т.п., подвергается селективной амплификации.

В реакции ПЦР образец подвергается обработке в заданном термическом цикле, в котором биологический образец, содержащий ДНК, и реагент ПЦР, состоящий из праймеров, ферментов, и тому подобного, смешиваются для того, чтобы вызвать реакции денатурирования, гибридизации и удлинения, которые могут повторяться, так чтобы конкретная часть ДНК подвергалась селективной амплификации.

В обычной практике ПЦР проводят путем введения заданного количества целевого образца в пробирку ПЦР или технологический реакционный сосуд, такой как микропланшет (микролунка), в которой образуется множество углублений. Однако в последние годы, разработана ПЦР с использованием технологического реакционного сосуда (также называется “чип реакционной обработки”), снабженного микроканалами, которые образуются на подложке (см. Патентные документы 1–3).

Патентный документ 1: Опубликованная заявка на патент Японии № 2009-232700

Патентный документ 2: Опубликованная заявка на патент Японии № 2007-51881

Патентный документ 3: Опубликованная заявка на патент Японии № 2007-285777

Раскрытие изобретения

Проблемы, решаемые в изобретении

В процессе ПЦР с использованием технологического реакционного сосуда, описанного выше, с целью воздействия термического цикла на образец, часть канала технологического реакционного сосуда преобразуется в извилистый канал, причем извилистый канал поддерживается при заданной температуре (например, приблизительно 95°C или 55°C) с помощью внешнего нагревателя и т.п. Извилистый канал представляет собой канал, в котором имеются непрерывные изгибы за счет комбинации криволинейных участков и прямолинейных участков. Путем преобразования канала, предназначенного для применения термического цикла к образцу, в извилистый канал, может быть улучшена эффективность нагревания с помощью внешнего нагревателя, причем ограниченная площадь подложки может быть эффективно использована.

Образец в канале технологического реакционного сосуда может перемещаться под действием регулируемого потока воздуха внутрь канала или под давлением внутри канала. Однако для того чтобы термической цикл применялся к образцу соответствующим образом, необходимо точно останавливать образец в извилистом канале, который поддерживается при заданной температуре.

В связи с изложенным, целью настоящего изобретения является разработка технологического реакционного сосуда, в котором возможно останавливать образец в извилистом канале с улучшенной точностью.

Средства решения проблемы

Технологический реакционный сосуд согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения представляет собой технологический реакционный сосуд, который включает подложку и канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки, причем канал включает извилистый канал и стопорный канал, примыкающий к извилистому каналу. Площадь поперечного сечения стопорного канала превышает площадь поперечного сечения извилистого канала.

При условии, что площадь поперечного сечения извилистого канала обозначена как Sr и площадь поперечного сечения стопорного канал обозначена как Sb, отношение площадей поперечного сечения Sb/Sr может находиться в диапазоне 1 < Sb/Sr ≤ 1,8. Отношение площадей поперечного сечения Sb/Sr может находиться в диапазоне 1,02 ≤ Sb/Sr ≤ 1,5. Отношение площадей поперечного сечения Sb/Sr может находиться в диапазоне 1,02 ≤ Sb/Sr ≤ 1,2.

Извилистый канал и стопорный канал, каждый, имеют отверстие, нижнюю поверхность, и боковые поверхности, имеющие конусную форму, расширяющуюся от нижней поверхности в направлении отверстия.

Извилистый канал может иметь отверстие шириной от 0,55 мм до 0,95 мм, a нижнюю поверхность шириной от 0 мм до 0,95 мм, глубиной от 0,5 мм до 0,9 мм, и угол конусности от 0° до 45°. Стопорный канал может иметь отверстие шириной от 0,65 мм до 1,05 мм, нижнюю поверхность шириной от 0 мм до 1,05 мм, глубиной от 0,5 мм до 0,9 мм, и угол конусности от 0° до 45°.

Соединительные части между нижней поверхностью и боковыми поверхностями могут иметь криволинейную поверхность. Радиус кривизны соединительных частей может составлять от 0,2 мм до 0,4 мм.

Извилистый канал может включать изогнутую часть в горизонтальной проекции. Радиус кривизны изогнутой части может составлять от 0,5 мм до 10 мм.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения также относится к технологическому реакционному сосуду. Этот технологический реакционный сосуд представляет собой технологический реакционный сосуд, который включает подложку и канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки, причем канал включает извилистый канал и канал детектирования, который облучается возбуждающим светом, для того чтобы детектировать излучение флуоресценции от образца, проходящего внутри канала. Площадь поперечного сечения канала детектирования превышает площадь поперечного сечения извилистого канала.

При условии, что площадь поперечного сечения извилистого канала обозначена как Sr и площадь поперечного сечения канала детектирования обозначена как Sd, отношение площадей поперечного сечения Sd/Sr может находиться в диапазоне 1 < Sd/Sr ≤ 1,8. Отношение площадей поперечного сечения Sd/Sr может находиться в диапазоне 1,02 ≤ Sd/Sr ≤ 1,5. Отношение площадей поперечного сечения Sd/Sr может находиться в диапазоне 1,02 ≤ Sd/Sr ≤ 1,2.

Извилистый канал и канал детектирования, каждый, имеет отверстие, нижнюю поверхность и боковые поверхности, имеющие конусную форму, расширяющуюся от нижней поверхности в направлении отверстия.

Извилистый канал может иметь отверстие шириной от 0,55 мм до 0,95 мм, нижнюю поверхность шириной от 0 мм до 0,95 мм, глубиной от 0,5 мм до 0,9 мм, и угол конусности от 0° до 45°. Канал детектирования может иметь отверстие шириной от 0,7 мм до 1,2 мм, нижнюю поверхность шириной от 0,15 мм до 1,2 мм, глубиной от 0,5 мм до 1,2 мм, и угол конусности от 0° до 45°.

Нижняя поверхность канала детектирования может формироваться на плоскости, параллельной основной поверхности подложки.

Соединительные части между нижней поверхностью и боковой поверхностью могут иметь вид угловой формы.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения также относится к технологическому реакционному сосуду. Указанный технологический реакционный сосуд представляет собой технологический реакционный сосуд, который включает подложку и канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки, причем канал включает извилистый канал и стопорный канал, примыкающий к извилистому каналу, а также канал детектирования, который облучается возбуждающим светом, для того чтобы детектировать излучение флуоресценции от образца, проходящего внутри канала. Площадь поперечного сечения стопорного канала превышает площадь поперечного сечения извилистого канала, и площадь поперечного сечения канала детектирования превышает площадь поперечного сечения извилистого канала.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения также относится к технологическому реакционному сосуду. Указанный технологический реакционный сосуд представляет собой технологический реакционный сосуд, который включает подложку, канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки, канал ответвления, и отверстие для введения образца, находящееся в канале ответвления, несколько реакционных зон расположены на подложке, причем в каждой поддерживается заданная температура, когда используется технологический реакционный сосуд, при этом расстояние между реакционной зоной, ближайшей к каналу ответвления и отверстию для введения образца, среди указанных нескольких реакционных зон, и каналом ответвления и отверстием для введения образца составляет 5 мм или больше.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу проведения реакции с использованием технологического реакционного сосуда. Этот способ включает: введение образца внутрь канала через отверстие для введения образца и канал ответвления; нагревание каждой из нескольких реакционных зон до заданной температуры; перемещение образца между указанными несколькими реакционными зонами и вовлечение образца в реакцию ПЦР. Образец, оставшийся в канале ответвления и отверстии для введения образца, не выталкивается внутрь канала в течение ПЦР.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения также относится к технологическому реакционному сосуду. Указанный технологический реакционный сосуд представляет собой технологический реакционный сосуд, который включает подложку, канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки, два фильтра, находящихся соответственно на концах канала, канал ответвления, и отверстие для введения образца, находящееся в канале ответвления, причем объем канала от отверстия для введения образца до фильтра, наиболее близкого к отверстию для введения образца, обозначенный как Vf, и объем образца, введенный из отверстия для введения образца и обозначенный как Vs, удовлетворяют соотношению: k × Vs < Vf (где k обозначает действительное число от 0,1 до 10).

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения также относится к технологическому реакционному сосуду. Указанный технологический реакционный сосуд представляет собой технологический реакционный сосуд, который включает подложку, канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки, два фильтра, находящихся соответственно на концах канала, канал ответвления и отверстие для введения образца, находящееся в канале ответвления, причем, когда объем образца, введенного из отверстия для введения образца, составляет от 1 мкл до 50 мкл, длина канала от отверстия для введения образца до фильтра, ближайшего к этому отверстию для введения образца, составляет от 2 мм до 200 мм.

Преимущества изобретения

Согласно настоящему изобретению может быть разработан технологический реакционный сосуд, в котором возможно улучшение точности остановки образца в извилистом канале.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 – вид в плане подложки, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 2 - схема для пояснения структуры поперечного сечения технологического реакционного сосуда;

Фиг. 3 - принципиальная схема для пояснения технологического реакционного устройства, в котором можно использовать технологический реакционный сосуд;

Фиг. 4A и 4B - схемы для пояснения формы канала в подложке технологического реакционного сосуда, показанного на фиг. 1;

Фиг. 5 - схема, демонстрирующая пример варианта извилистого канала;

Фиг. 6 – вид в плане подложки, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде, согласно примеру первого варианта осуществления изобретения;

Фиг. 7 – вид в плане подложки, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 8 - схема, где показано поперечное сечение канала детектирования технологического реакционного сосуда согласно второму варианту осуществления изобретения;

Фиг. 9 – вид в плане подложки, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 10 – схематичный увеличенный вид в плане области в окрестности канала ответвления и отверстия для введения образца;

Фиг. 11 - схематичный вид, в поперечном разрезе, окрестности канала ответвления и отверстия для введения образца, показанного на фиг. 10, который разрезан по линии A-A; и

Фиг. 12 – вид в плане подложки, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде согласно четвертому варианту осуществления настоящего изобретения.

Способ осуществления изобретения

В последующем будет приведено пояснение относительно технологического реакционного сосуда согласно варианту осуществления настоящего изобретения. Аналогичные или эквивалентные составляющие элементы, части и процессы, иллюстрированные на каждом чертеже, обозначены одинаковыми номерами позиций, причем повторные объяснения будут соответственно опущены. Кроме того, варианты осуществления не ограничивают изобретение и приведены с целью иллюстрации, причем не все признаки, описанные в вариантах осуществления и их комбинациях, необязательно существенны для изобретения.

Первый вариант осуществления изобретения

Технологический реакционный сосуд согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения состоит из подложки, герметизирующей пленки, прикреплённой к подложке, и фильтра. На Фиг. 1 показан вид в плане подложки, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения. Фиг. 2 представляет собой схему для пояснения структуры поперечного сечения технологического реакционного сосуда. Фиг. 2 является схемой для пояснения взаимного расположения между каналом, пленкой, и фильтром, которые находятся на подложке, причем следует отметить, что схема отличается от вида в поперечном разрезе реализованного технологического реакционного сосуда.

Технологический реакционный сосуд 10 содержит подложку 14 из смолы, имеющую канал типа канавки 12, образованный на ее верхней поверхности 14a, герметизирующую пленку 16 канала, первую герметизирующую пленку 18, и вторую герметизирующую пленку 19, которые прикреплены на верхней поверхности 14a подложки 14, третью герметизирующую пленку 20, четвертую герметизирующую пленку 21, и пятую пленку (не показана), которые прикреплены на нижней поверхности 14b подложки 14, и первый фильтр 28 и второй фильтр 30, которые расположены внутри подложки 14.

Предпочтительно подложка 14 выполнена из материала, который стабилен при изменении температуры и является стойким к раствору образца, который используется. Кроме того, предпочтительно подложка 14 выполнена из материала, который обладает хорошей пластичностью, хорошей прозрачностью и непроницаемостью, и низкой характеристикой собственной флуоресцентности. В качестве такого материала предпочтительно используют смолу, такую как акриловая, полипропиленовая, силиконовая, и т.п., особенно предпочтительна смола из циклического полиолефина.

Канал типа канавки 12 формируется на верхней поверхности 14a подложки 14. В технологическом реакционном сосуде 10 большая часть канала 12 имеет форму канавки, открытой на верхней поверхности 14a подложки 14. Она обеспечивает легкое прессование путем инжекционного формования с использованием металлической пресс-формы. С целью герметизации указанной канавки для того, чтобы использовать канавку в качестве канала, на верхней поверхности 14a подложки 14 прикреплена пленка 16, герметизирующая канал. Кроме того, с целью более эффективного производства подложки промышленным способом, используя метод инжекционного формования, структура канала может включать боковую поверхность, имеющую определенный угол относительно основной поверхности подложки, который имеет название “угол штамповочного уклона”.

Пленка, герметизирующая канал 16, может быть приклеена на одной из основных поверхностей канала или может иметь функциональный слой, который обладает сцепляемостью или адгезионной способностью под действием прессования, облучения ультрафиолетовыми лучами и т.п., нагревания и т.д., и формируется на одной из основных поверхностей. Таким образом, пленка, герметизирующая канал 16, способна легко превращаться в единое целое с верхней поверхностью 14a подложки 14, в то же время оставаясь в непосредственном контакте с верхней поверхностью 14a. Желательно, чтобы пленка, герметизирующая канал 16, была выполнена из материала, содержащего адгезионное соединение, которое имеет низкую собственную флуоресцентность. В связи с указанным, подходящей является прозрачная пленка, изготовленная из смолы, такой как циклоолефиновый полимер, полиэфир, полипропиленовая, полиэтиленовая или акриловая смола, без ограничения указанным. Кроме того, пленка, герметизирующая канал 16, может быть сформирована из стекла или смолы в виде пластинки. Поскольку в этом случае можно ожидать определенной жесткости, пленка, герметизирующая канал 16, применяется для предотвращения искривления и деформации технологического реакционного сосуда 10.

Первый фильтр 28 предусмотрен на одном конце 12a канала 12. Второй фильтр 30 предусмотрен на другом конце 12b канала 12. Пара из первого фильтра 28 и второго фильтра 30, предусмотренных на соответствующих концах канала 12, предотвращает загрязнение, таким образом, амплификация целевой ДНК и детектирование амплификации не прерываются реакцией ПЦР, или таким образом, не ухудшается качество целевой ДНК. Что касается размеров первого фильтра 28 и второго фильтра 30, первый фильтр 28 и второй фильтр 30 формируются таким образом, чтобы они соответствовали пространству для монтажа фильтра, предусмотренному в подложке 14, без какого-либо зазора.

Первый воздушный коммуникационный порт 24, связывающий один конец 12a канала 12 через проход 29 для введения воздуха, с первым фильтром 28, предусмотрен в подложке 14. Аналогично, второй воздушный коммуникационный порт 26, связывающий другой конец 12b канала 12 через проход 31 для введения воздуха, со вторым фильтром 30, предусмотрен в подложке 14. Пара из первого воздушного коммуникационного порта 24 и второго воздушного коммуникационного порта 26, формируется таким образом, чтобы она была открытой на верхней поверхности 14a подложки 14.

В первом варианте, в качестве первого фильтра 28 и второго фильтра 30, используют фильтры с достаточно низким содержанием примесей, воздухопроницаемостью и гидрофобностью или маслоотталкивающей способностью. Первый фильтр 28 и второй фильтр 30 предпочтительно представляют собой, например, пористые смолы, спечённые прессовки смол, и т.п., причем примеры включают фторсодержащую смолу (хотя не ограничены указанным), ПТФЭ (политетрафторэтилен), PFA (перфторалкоксиалкан), FEP (coполимер перфторэтилена и пропилена), ETFE (coполимер этилена и тетрафторэтилена), и т.д. Кроме того, в качестве фильтра, выполненного из ПТФЭ (политетрафторэтилена), могут быть использованы PF020 (произведены на фирме ADVANTEC Group) или т.п. (хотя не ограничены указанным). Кроме того, в качестве первого фильтра 28 и второго фильтра 30, могут быть использованы фильтры, поверхность которых приобрела водоотталкивающие свойства путем покрытия фторсодержащей смолой. Другие фильтрующие материалы включают полиэтилен, полиамид, полипропилен, и т.п., причем может быть использован любой материал, который может предотвращать загрязнение образца, который вовлекается в ПЦР и не препятствует реакции ПЦР. Еще лучше использовать материал, который обеспечивает проход воздуха, хотя предотвращает проход жидкости, причем эксплуатационные характеристики и качество материала не ограничиваются, при условии, что материал удовлетворяет некоторым из указанных требований для необходимой эффективности.

В технологическом реакционном сосуде 10 установлены реакционные зоны, где могут регулироваться несколько уровней температуры с помощью технологического реакционного устройства, описанного ниже, с целью воздействия термического цикла на образец, протекающий через канал 12. Термический цикл может воздействовать на образец путем перемещения образца таким образом, что образец непрерывно двигается возвратно-поступательно в канале, внутри реакционной зоны, в которой поддерживаются несколько уровней температуры.

В первом варианте реакционная зона включает высокотемпературную область 36 и среднетемпературную область 38. Высокотемпературная область 36 представляет собой область, соответствующую эффективной поверхности высокотемпературного нагревателя, когда технологический реакционный сосуд 10 смонтирован на технологическом реакционном устройстве и поддерживается при относительно высокой температуре (например, приблизительно 95°C). Среднетемпературная область 38 представляет собой область, соответствующую эффективной поверхности среднетемпературного нагревателя, когда технологический реакционный сосуд 10 смонтирован на технологическом реакционном устройстве и поддерживается при температуре ниже, чем температура высокотемпературной области 36 (например, приблизительно 62°C).

Высокотемпературная область 36 и среднетемпературная область 38, каждая из них, включает канал извилистой формы, в котором имеются непрерывные изгибы за счет комбинации криволинейных участков и прямолинейных участков. Иными словами, высокотемпературная область 36 включает высокотемпературный извилистый канал 35, и среднетемпературная область 38 включает среднетемпературный извилистый канал 37. Поскольку такой извилистый канал позволяет эффективно использовать ограниченную поверхность подложки 14, реальный размер технологического реакционного сосуда можно уменьшить, внося вклад в уменьшение габаритов технологического реакционного устройства. Кроме того, можно эффективно использовать ограниченную эффективную поверхность нагревателя, входящего в систему регулирования температуры, описанную позднее, и можно легко снизить колебания температуры в реакционной зоне.

Как показано на Фиг. 1, формируется соединительный канал 40 между одним концом 35a высокотемпературного извилистого канала 35 и одним концом 37a среднетемпературного извилистого канала 37. Этот соединительный канал 40 является прямолинейным каналом. Практически в центральной части соединительного канала 40, когда технологический реакционный сосуд 10 монтируется в технологическом реакционном устройстве, устанавливается область (называемая как “область детектирования флуоресценции”) 86, которая облучается возбуждающим светом для того, чтобы детектировать флуоресценцию от образца, проходящего внутри канала. Канал, содержащийся в области детектирования флуоресценции 86, называется “каналом детектирования 61”.

Другой конец 35b высокотемпературного извилистого канала 35 сообщается с высокотемпературным стопорным каналом 45. Высокотемпературный стопорный канал 45 формируется рядом с высокотемпературным извилистым каналом 35 и на задней стороне (на стороне второго фильтра 30) высокотемпературного извилистого канала 35, если смотреть от соединительного канала 40. Другой конец 37b среднетемпературного извилистого канала 37 сообщается со среднетемпературным стопорным каналом 46. Среднетемпературный стопорный канал 46 формируется рядом с среднетемпературным извилистым каналом 37 и на задней стороне (на стороне первого фильтра 28) среднетемпературного извилистого канала 37, если смотреть от соединительного канала 40.

Высокотемпературный стопорный канал 45 является прямолинейным каналом и формируется таким образом, чтобы его площадь поперечного сечения превышала площадь поперечного сечения высокотемпературного извилистого канала 35. Аналогично, среднетемпературный стопорный канал 46 представляет собой прямолинейный канал и формируется таким образом, чтобы его площадь поперечного сечения превышала площадь поперечного сечения среднетемпературного извилистого канала 37. Как будет подробно описано ниже, высокотемпературный стопорный канал 45 и среднетемпературный стопорный канал 46 предназначены для торможения образца, протекающего через высокотемпературный извилистый канал 35 и среднетемпературный извилистый канал 37, соответственно.

В первом варианте, как показано на Фиг. 1, как высокотемпературный извилистый канал 35, так и высокотемпературный стопорный канал 45 включены в высокотемпературную область 36. С другой стороны, что касается среднетемпературной области 38, хотя среднетемпературный извилистый канал 37 включается в среднетемпературную область 38, среднетемпературный стопорный канал 46 не включен в среднетемпературную область 38. При остановке образца в высокотемпературной области 36 во время ПЦР, образец находится, по меньшей мере, в высокотемпературном извилистом канале 35 и в высокотемпературном стопорном канале 45. С другой стороны, при остановке образца в среднетемпературной области 38 во время ПЦР, образец находится, по меньшей мере, в среднетемпературном извилистом канале 37. Образец, находящийся в каналах, содержащихся в высокотемпературной области 36 и в среднетемпературной области 38, по существу, нагревается и поддерживается при заданной температуре в течение определенного периода времени. Вследствие этого протекают такие реакции, как денатурирование и гибридизация.

Высокотемпературный стопорный канал 45 сообщается с вторым воздушным коммуникационным портом 26 через второй фильтр 30 и проход 31 для ввода воздуха. Среднетемпературный стопорный канал 46 сообщается с буферным каналом (запасной канал) 39. Буферный канал 39 сообщается с первым воздушным коммуникационным портом 24 через первый фильтр 28 и проход 29 для ввода воздуха.

В части буферного канала 39 предусмотрена точка разветвления, и канал ответвления 42 разветвляется от точки разветвления. Отверстие для введения образца 44 формируется на периферическом конце канала ответвления 42 таким образом, чтобы быть открытым на нижней поверхности 14b подложки 14. Буферный канал 39 может быть использован в качестве временного резервного канала образца, используемого, когда технологический реакционный сосуд 10 вводится в технологическое реакционное устройство после того, как заданное количество образца введено из отверстия для введения образца 44.

Как показано на Фиг. 2, первая герметизирующая пленка 18 прикреплена к верхней поверхности 14a подложки 14 с целью герметизации первого воздушного коммуникационного порта 24. Вторая герметизирующая пленка 19 прикреплена к верхней поверхности 14a подложки 14 с целью герметизации второго воздушного коммуникационного порта 26. Третья герметизирующая пленка 20 прикреплена к нижней поверхности 14b подложки 14 для того, чтобы герметизировать проход 29 ввода воздуха и первый фильтр 28. Четвертая герметизирующая пленка 21 прикреплена к нижней поверхности 14b подложки 14 для того, чтобы герметизировать проход 31 ввода воздуха и второй фильтр 30. Пятая герметизирующая пленка (не показана) прикреплена к нижней поверхности 14b подложки 14 для того, чтобы герметизировать отверстие для введения образца 44. В качестве этих герметизирующих пленок могут быть использованы прозрачные пленки, полученные из таких смол, как циклоолефиновый полимер, полиэфир, полипропиленовая, полиэтиленовая, или акриловая смола в качестве основного материала. В состоянии, где все герметизирующие пленки, включая пленку, герметизирующую канал 16, закреплены, канал в целом образует замкнутое пространство.

Когда к технологическому реакционному сосуду 10 подсоединяется устройство подачи жидкости, которое будет описано в дальнейшем, первая герметизирующая пленка 18 и вторая герметизирующая пленка 19, герметизирующая первый воздушный коммуникационный порт 24 и второй воздушный коммуникационный порт 26, удаляются, и трубопроводы, предусмотренные в устройстве подачи жидкости, подсоединяют к первому 24 и второму воздушному коммуникационному порту 26. В качестве альтернативы, это соединение может быть осуществлено путем перфорирования первой герметизирующей пленки 18 и второй герметизирующей пленки 19 полой иглой (инъекционная игла с заострённым наконечником), предусмотренной в устройстве подачи жидкости. В этом случае, предпочтительно первая герметизирующая пленку 18 и вторая герметизирующая пленка 19 выполнены из материала, который легко пробивается иглой и/или имеет толщину, которая легко пробивается иглой.

Введение образца внутрь канала 12 через отверстие для введения образца 44 осуществляется после удаления пятой герметизирующей пленки с подложки 14, и, после введения заданного количества образца, пятую герметизирующую пленку снова прикрепляют к нижней поверхности 14b подложки 14. В то же время, поскольку воздух внутри канала выталкивается из-за введения образца, вторая герметизирующая пленка может быть удалена заранее для того, чтобы выпустить воздух. Поэтому в качестве пятой герметизирующей пленки, желательно иметь достаточно клейкую пленку, которая может выдержать несколько циклов прикрепления и удаления. Альтернативно, в качестве пятой герметизирующей пленки, новая пленка может быть прикреплена после введения образца. В этом случае могут быть ослаблены строгие требования к свойству, касающемуся многократного прикрепления и удаления пленки.

Способ введения образца в отверстие для введения образца 44 конкретно не ограничен. Например, соответствующее количество образца можно непосредственно вводить через отверстие для введения образца 44 с использованием пипетки, капельницы, шприца, и т.п. В качестве альтернативы может быть использован способ введения, который осуществляется, для предотвращая загрязнение, с помощью игольчатого чипа, в который вставлен фильтр, выполненный из пористого ПТФЭ или полиэтиленовая. В общем в продаже есть много типов таких игольчатых чипов и их можно легко получить, причем игольчатые чипы могут быть использованы, когда они прикреплены к наконечнику пипетки, капельницы, шприца и т.п.. Кроме того, образец может перемещаться в заданное положение в канале 12 путем загрузки и введения образца с помощью пипетки, капельницы, шприца и т.п., с последующим дополнительным проталкиванием образца под давлением. Хотя не показано, могут быть предусмотрены несколько отверстий для введения образцов. В этом случае, с использованием пространства буферного канала 39 между этими несколькими отверстиями для введения образцов, можно обеспечить легкое измерение заданного объема образца, который вовлекается в такой процесс, как реакция ПЦР. Подробности способа, используемого в настоящее время, можно найти в описании опубликованной заявки на патент Японии № 2016-19606.

Образец включает в себя, например, продукт, полученный путем добавления термически стабильного фермента и четырех типов дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) в качестве реагента реакций ПЦР к смеси, содержащей один или больше типов ДНК. Кроме того, добавляется праймер, который специфически взаимодействует с ДНК, участвующей в реакции, и в некоторых случаях, флуоресцентный зонд, такой как TaqMan (TaqMan является зарегистрированной торговой маркой фирмы Roche Diagnostics Gesellschaft с ограниченной ответственностью) или SYBR Green (SYBR является зарегистрированной торговой маркой фирмы Molecular Probes, Incorporated). Также могут быть использованы промышленно доступные наборы реагентов ПЦР в реальном масштабе времени.

Фиг. 3 представляет собой схему для пояснения технологического реакционного устройства 100, в котором можно использовать технологический реакционный сосуд 10 и конкретно является только частью, которая непосредственно относится к технологическому реакционному сосуду 10, то есть, концептуально извлечен.

В технологическом реакционном устройстве 100 предусмотрена часть (не показана) для установки контейнера, в который устанавливается технологический реакционный сосуд 10, высокотемпературный нагреватель 104 для нагревания высокотемпературной области 36 канала 12, среднетемпературный нагреватель 106 для нагревания среднетемпературной области 38 канала 12, и датчик температуры (не показан), например, такой как термопара и т.п., для измерения фактической температуры в каждой реакционной зоне. Каждый нагреватель может быть, например, элементом нагрева электрическим током, элементом Пельтье и т.п. С помощью указанных нагревателей, соответствующего задающего устройства нагревателя (не показано), устройства управления (не показано) такого как микрокомпьютер, высокотемпературная область 36 в канале 12 технологического реакционного сосуда 10 поддерживается приблизительно при температуре 95°C, и среднетемпературная область 38 поддерживается приблизительно при температуре 62°C. Таким образом, устанавливается температура каждой реакционной зоны в области термического цикла.

Дополнительно в каждом технологическом реакционном устройстве 100 предусмотрен детектор флуоресценции 140. Как описано выше, заданный флуоресцентный зонд добавляют в образец S. Поскольку интенсивность сигнала флуоресценции от образца S возрастает по мере протекания амплификации ДНК, величина интенсивности сигнала флуоресценции может быть использована в качестве показателя, на основе которого принимается решение о развитии ПЦР или прекращении этой реакции.

В качестве детектора флуоресценции 140 может быть использован волоконно-оптический детектор флуоресценции FLE-510, произведенный фирмой Nippon Sheet Glass Co., Ltd., который представляет собой весьма компактное оптическое устройство, которое обеспечивает быстрое измерение и детектирование флуоресценции, независимо от того, является участок освещенным или он находится в темноте. Указанный волоконно-оптический детектор флуоресценции позволяет регулировать спектральную характеристику оптического возбуждения/флуоресценции таким образом, чтобы спектральная характеристика была подходящей для характеристики флуоресценции, излучаемой образцом S, и таким образом, обеспечивает оптимальное оптическое детектирующее устройство для образцов, имеющих различные свойства, которые могут быть предоставлены. Кроме того, волоконно-оптический детектор флуоресценции приспособлен для детектирования флуоресценции из образца, находящегося в небольшом или узком участке, таком как канал, благодаря малому диаметру светового луча, доставляемого в волоконно-оптический детектор флуоресценции, а также отличной скорости реагирования.

В волоконно-оптическом детекторе флуоресценции 140 предусмотрена оптическая головка 142, запускающее устройство детектора флуоресценции 144, и оптическое волокно 146, соединяющее оптическую головку 142 и запускающее устройство детектора флуоресценции 144. Задающее устройство детектора флуоресценции 144 включает источник света для оптического возбуждения (светодиод - LED, лазер, или источник света, приспособленный для излучения с другими специфическими длинами волн), волоконно-оптический мультиплексор/демультиплексор и устройство фотоэлектрического преобразования (PD, APD, или светоприёмник, такой как фотоэлектронный умножитель) (все они не показаны на фиг. 3), и т.п., и включают запускающее устройство и т.п. для управления. Оптическая головка 142 включает оптическое устройство, такое как линзы, и выполняет функцию непосредственного облучения образца, который подвергается оптическому возбуждению, и сбору флуоресценции, излучаемой образцом. Собранная флуоресценция отделяется от оптического возбуждения с помощью волоконно-оптического мультиплексора/демультиплексора внутри задающего устройства детектора флуоресценции 144 через оптическое волокно 146 и превращается в электрический сигнал с помощью фотоэлектрического преобразователя. В качестве волоконно-оптического детектора флуоресценции могут быть использованы те, что описаны в Опубликованной заявке на патент Японии № 2010-271060. Кроме того, волоконно-оптический детектор флуоресценции может быть модифицирован таким образом, чтобы обеспечить коаксиальное детектирование излучений с различными длинами волн, с использованием одной или многочисленных оптических головок. Описанное в документе WO 2014/003714 изобретение может быть использовано в качестве детектора флуоресценции для многочисленных длин волн и обработки их сигналов.

В технологическом реакционном устройстве 100 оптическая головка 142 установлена таким образом, чтобы можно было детектировать флуоресценцию из образца S в канале детектирования 61. Поскольку реакция развивается, в то время как образец S перемещается в канале в возвратно-поступательном режиме так, что содержащаяся в образце S заданная ДНК подвергается амплификации, путем регистрации изменения количества детектируемой флуоресценции, можно исследовать амплификацию ДНК в реальном масштабе времени. Кроме того, в технологическом реакционном устройстве 100, выходная величина из детектора флуоресценции 140 используется для регулирования перемещения образца S. Например, выходная величина из детектора флуоресценции 140 может передаваться в устройство управления и может быть использована в качестве параметра в момент регулирования устройства подачи жидкости, описанного ниже. Детектор флуоресценции не ограничивается волоконно-оптическим детектором флуоресценции, при условии, что детектор флуоресценции выполняет функцию детектирования флуоресценции от образца.

В технологическом реакционном устройстве 100 дополнительно предусмотрено устройство подачи жидкости (не показано) для перемещения и остановки образца S внутри канала 12 технологического реакционного сосуда 10. Хотя устройство подачи жидкости не ограничено указанным, образец S может перемещаться в одном направлении внутри канала 12 путем подачи (продувка воздухом) воздуха из одного из первого воздушного коммуникационного порта 24 или второго воздушного коммуникационного порта 26 через первый воздушный коммуникационный порт 24 или второй воздушный коммуникационный порт 26. Кроме того, устройство подачи жидкости может быть остановлено в заданном положении путем остановки подачи воздуха в канал или путем выравнивания давления на обеих сторонах образца S внутри канала 12.

В устройстве подачи жидкости могут быть использованы шприцевой насос, диафрагменный насос, воздуходувка, и т.п. в качестве средства (средство продувки воздухом), которое обеспечивает операции продувки воздухом и повышение давления. Кроме того, в качестве устройств, обеспечивающих остановку образца S в заданном положении, могут быть использованы комбинации средств продувки воздухом, трехходовой клапан (трёхлинейный распределитель), и тому подобное. Например, возможен вариант осуществления, в котором предусмотрены первый и второй трехходовой клапаны и где каждый канал соединяется в первом трехходовом клапане таким образом, что его первый канал (общий канал) соединяется с первым воздушным коммуникационным портом, второй канал соединяется с описанным выше средством продувки воздухом, и третий канал открыт в атмосферу, и каждый канал соединяется во втором трехходовом клапане таким образом, что его первый канал (общий канал) соединяется со вторым воздушным коммуникационным портом, второй канал соединяется с описанным выше средством продувки воздухом, и третий канал открыт в атмосферу. Конкретные варианты осуществления устройства описаны, например, в документах JP 4-325080 и JP 2007-285777. Например, образец S перемещается в одном направлении путем эксплуатации трехходового клапана, соединенного с одним воздушным коммуникационным портом таким образом, что средство продувки воздухом и воздушный коммуникационный порт поддерживают связь между собой, и путем эксплуатации трехходового клапана, соединенного с другим воздушным коммуникационным портом таким образом, что воздушный коммуникационный порт сообщается с атмосферой. Впоследствии, образец S останавливается путем эксплуатации обоих трехходовых клапанов таким образом, что оба воздушные коммуникационные порты поддерживают связь с атмосферой.

Кроме того, эксплуатация трехходовых клапанов и средства подачи жидкости может быть осуществлена, используя устройство управления с соответствующим задающим устройством. В частности, детектор флуоресценции 140, расположенный как описано выше, передает выходную величину, основанную на полученном сигнале флуоресценции, в устройство управления таким образом, что устройство управления распознает положение прохождение образца S в канале 12, и таким образом, устройство управления обеспечивает регулирование устройства подачи жидкости, включающее трехходовые клапаны и средства подачи жидкости.

Следовательно, путем последовательно и непрерывно действующих трехходовых клапанов, которые соединены с соответствующими сторонами канала 12, образец S непрерывно подвергается возвратно-поступательному движению между высокотемпературной областью 36 и среднетемпературной областью 38 в канале 12. Это обеспечивает воздействие соответствующего термического цикла на образец S.

На Фиг. 4A и 4B приведены схемы для объяснения формы канала 12 в подложке 14 технологического реакционного сосуда 10, показанного на Фиг. 1. На Фиг. 4A показано поперечное сечение извилистого канала 53. На Фиг. 4В показано поперечное сечение стопорного канала 54. Извилистый канал 53 соответствует высокотемпературному извилистому каналу 35 и среднетемпературному извилистому каналу 37. Стопорный канал 54 соответствует высокотемпературному стопорному каналу 45 и среднетемпературному стопорному каналу 46.

Как показано на Фиг. 4A, извилистый канал 53 представляет собой трапециевидный канал и имеет отверстие 47, нижнюю поверхность 48, и боковые поверхности 49, расположенные с соответствующих сторон нижней поверхности 48. Боковые поверхности 49 имеют конусообразную форму, расширяющуюся от нижней поверхности 48 в направлении отверстия 47. Параметры, которые определяют форму и размеры извилистого канала 53, включают глубину Dr, угол конусности Tr, ширину отверстия Wr1, ширину нижней поверхности Wr2, и площадь поперечного сечения Sr. Нижняя поверхность 48 и боковые поверхности 49 являются плоскими, а соединительные части 55 между нижней поверхностью 48 и боковыми поверхностями 49 имеют угловую форму.

Как показано на Фиг. 4B, стопорный канал 54 также является трапециевидным каналом и имеет отверстие 50, нижнюю поверхность 51, и боковые поверхности 52, расположенные с соответствующих сторон нижней поверхности 51. Боковые поверхности 52 имеют конусную форму, расширяющуюся от нижней поверхности 51 в направлении отверстия 50. Параметры, которые определяют форму и размеры извилистого канала 53, включают глубину Db, угол конусности Tb, ширину отверстия Wb1, ширину нижней поверхности Wb2, и площадь поперечного сечения Sb. Нижняя поверхность 51 и боковые поверхности 52 являются плоскими, а соединительные части 58 между нижней поверхностью 51 и боковыми поверхностями 52 имеют угловую форму.

В технологическом реакционном сосуде 10 в соответствии с первым вариантом осуществления, площадь поперечного сечения Sb стопорного канал 54 превышает площадь поперечного сечения Sr извилистого канала 53. Скорость перемещения образца изменяется в зависимости от площади поперечного сечения канала. Обычно, когда площадь поперечного сечения канала увеличивается, скорость перемещения образца уменьшается. Сделав площадь поперечного сечения Sb стопорного канал 54 больше, чем площадь поперечного сечения Sr извилистого канала 53, можно создавать тормозящее воздействие на образец. Таким образом, облегчается регулирование движения/остановки образца с помощью устройства подачи жидкости в технологическом реакционном устройстве 100, причем может быть усовершенствована точность остановки образца в заданном положении в извилистом канале 53. Кроме того, даже в случае, когда образец вводится внутрь канала 12 в количестве, превышающем заданное количество, можно сдерживать выход образца из извилистого канал 53 за установленные пределы.

Отношение площадей поперечного сечения Sb/Sr, то есть площади поперечного сечения Sr извилистого канала 53 и площади поперечного сечения Sb стопорного канал 54, может находиться в диапазоне 1< Sb/Sr≤ 1,8, предпочтительно в диапазоне 1,02≤ Sb/Sr≤ 1,5, и более предпочтительно в диапазоне 1,02 ≤ Sb/Sr ≤ 1,2. Путем задания величины отношения площадей поперечного сечения Sb/Sr внутри указанного диапазона, можно генерировать соответствующее тормозное действие, описанное выше.

В технологическом реакционном сосуде 10 согласно первому варианту осуществления, ширина отверстия Wr1 извилистого канала 53 может составлять от 0,55 мм до 0,95 мм, и предпочтительно от 0,65 мм до 0,85 мм. Ширина нижней поверхности Wr2 извилистого канала 53 может составлять от 0 мм до 0,95 мм, и предпочтительно от 0,4 мм до 0,6 мм. Глубина Dr извилистого канала 53 может составлять от 0,5 мм до 0,9 мм, и предпочтительно от 0,6 мм до 0,8 мм. Угол конусности Tr извилистого канала 53 может составлять от 0° до 45°, предпочтительно от 10° до 30°, и более предпочтительно от 15° до 25°. Следует заметить, что в технологическом реакционном сосуде 10 согласно первому варианту осуществления, когда ширина нижней поверхности Wr2 извилистого канала 53 меньше, чем ширина отверстия Wr1, так что ширина нижней поверхности Wr2 составляет 0 мм или около 0 мм, форма поперечного сечения извилистого канала 53 становится весьма близкой к инверсной треугольной форме. Кроме того, следует заметить, что, когда угол конусности Tr уменьшается до 0° или близко к 0°, форма поперечного сечения извилистого канала 53 становится весьма близкой к прямоугольной.

Ширина отверстия Wb1 стопорного канал 54 может составлять от 0,65 мм до 1,05 мм, и предпочтительно от 0,75 мм до 0,95 мм. Ширина нижней поверхности Wb2 стопорного канал 54 может составлять от 0 мм до 1,05 мм, и предпочтительно от 0,5 мм до 0,7 мм. Глубина Db стопорного канал 54 может составлять от 0,5 мм до 0,9 мм, и предпочтительно от 0,6 мм до 0,8 мм. Угол конусности Tb стопорного канал 54 может составлять от 0° до 45°, и предпочтительно от 10° до 35°. Следует заметить, что в технологическом реакционном сосуде 10 согласно первому варианту осуществления, когда ширина нижней поверхности Wb2 стопорного канал 54 является меньше, чем ширина отверстия Wb1, так, что ширина нижней поверхности Wb2 составляет 0 мм или около 0 мм, форма поперечного сечения стопорного канал 54 становится весьма близкой к инверсной треугольной форме. Кроме того, следует заметить, что, когда угол конусности Tb уменьшается до 0° или близко к 0°, форма поперечного сечения извилистого канала 54 становится весьма близкой к прямоугольной.

Путем формирования извилистого канала 53 и стопорного канала 54, имеющих указанные выше размеры, непрерывное движение образца (который может включать поверхностно-активное вещество) становится плавным, что обеспечивает легкость производства, а также с использованием такой традиционной технологии производства, как инжекционное формование.

На Фиг. 5 показан пример варьирования извилистого канала. В извилистом канале 53, показанном на Фиг. 4A, соединительные части между нижней поверхностью 48 и боковыми поверхностями 49 имеют угловую форму. Однако в извилистом канале 56, показанном на Фиг. 5, соединительные части 55 между нижней поверхностью 48 и боковыми поверхностями 49 имеют криволинейную поверхность. На Фиг. 5 нижняя поверхность 48 является плоской. Однако нижняя поверхность 48 может быть криволинейной поверхностью, непрерывно связанная с соединительными частями 55.

В настоящем варианте осуществления, как описано выше, извилистый канал используется с целью повышения эффективности нагревания нагревателем. Однако, в зависимости от способа инжекционного формования, в котором пресс-форма заполняется смолой с высокой скоростью, существуют ситуации, когда форма такого канала вызывает противодействие или становится препятствием, и прессование нельзя осуществить должным образом, например, происходит изменение скорости заполнения смолой или образуется полость. В таком случае может образоваться линия оплавления в области, включающей извилистый канал, и в канале может образоваться полость, такая как ямка. Указанная полость может быть препятствовать движению образца. Как в извилистом канале 56 согласно варианту настоящего примера, путем формирования соединительных частей 55, имеющих криволинейную поверхность, поток смолы внутри пресс-формы во время инжекционного формования становится плавным. Таким образом, образование линии оплавления вблизи реакционного канала может быть подавлено. Радиус кривизны R1 соединительных частей 55 может составлять, например, от 0,2 мм до 0,38 мм, и предпочтительно от 0,3 мм до 0,35 мм. Таким же образом, в стопорном канале 54, соединительные части 58 между нижней поверхностью 51 и боковыми поверхностями 52 могут иметь криволинейную поверхность.

Как показано на Фиг. 1, высокотемпературный извилистый канал 35 и среднетемпературный извилистый канал 37 включают несколько изогнутых частей 57. Радиус кривизны R2 изогнутых частей 57 может составлять, например, от 0,3 мм до 10 мм, и предпочтительно от 0,5 мм до 6 мм. Устанавливая радиус кривизны изогнутых частей 57 в указанном диапазоне, можно дополнительно подавить образование линии оплавления и, более того, при движении образца внутри извилистого канала, можно легко поддерживать постоянную скорость перемещения образца в изогнутых частях 57.

Фиг. 6 является горизонтальной проекцией подложки 14, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде 60 согласно примеру первого варианта осуществления. Технологический реакционный сосуд 60 согласно варианту настоящего примера отличается от технологического реакционного сосуда 10, показанного на Фиг. 1 тем, что среднетемпературный извилистый канал 37 и среднетемпературный стопорный канал 46 включены в среднетемпературную область 38. С другой стороны, как в случае высокотемпературного извилистого канала 35, как высокотемпературный извилистый канал 35, так и высокотемпературный стопорный канал 45 включены в высокотемпературную область 36, как в технологическом реакционном сосуде 10. При остановке образца в высокотемпературной области 36 в ходе реакции ПЦР, образец находится, по меньшей мере, как в высокотемпературном извилистом канале 35, так и в высокотемпературном стопорном канале 45. С другой стороны, при остановке образца в среднетемпературной области 38 в ходe реакции ПЦР, образец находится, по меньшей мере, как в среднетемпературном извилистом канале 37 так и в среднетемпературном стопорном канале 46.

Кроме того, в технологическом реакционном сосуде 60 согласно варианту настоящего примера высокотемпературный стопорный канал 45 формируется таким образом, что его площадь поперечного сечения превышает площадь поперечного сечения высокотемпературного извилистого канала 35. Таким же образом, среднетемпературный стопорный канал 46 формируется таким образом, что его площадь поперечного сечения превышает площадь поперечного сечения среднетемпературного извилистого канала 37. Поэтому на образец, протекающий через высокотемпературный извилистый канал 35 и среднетемпературный извилистый канал 37, действует торможение.

Второй вариант осуществления

Как описано со ссылкой на фигуру 3, технологическое реакционное устройство 100 включает детектор флуоресценции 140 для того, чтобы облучать образец, при перемещении внутри канала технологического реакционного сосуда, возбуждающим излучением в ходе реакции ПЦР и измерять флуоресценцию, излучаемую образцом. В детекторе флуоресценции 140 оптическая головка 142 выполняет функцию направления облучения образца возбуждающим излучением и накопления флуоресценции, излучаемой образцом. Диаметр фокального пятна оптической головки 142 обычно составляет приблизительно от 0,15 мм до 0,45 мм, то есть пятно очень мало. Поэтому при размещении и фиксации оптической головки 142 в технологическом реакционном устройстве 100 требуется высокая точность. В результате технологичность компоновки может быть снижена, и стоимость деталей может увеличиться. Поэтому во втором варианте осуществления предусмотрен технологический реакционный сосуд, в котором можно преодолеть указанную проблему.

Технологический реакционный сосуд согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения также включает подложку, герметизирующую пленку, прикреплённую к подложке, и фильтр. Компоненты, аналогичные имеющимся в технологическом реакционном сосуде 10 согласно первому варианту осуществления, обозначены такими же номерами позиций, причем избыточное описание будет пропущено как ненужное.

Фиг. 7 представляет собой горизонтальную проекцию подложки 14, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде 70 согласно второму варианту осуществления настоящего изобретения. Технологический реакционный сосуд 70 согласно второму варианту осуществления не включает каналы, которые соответствуют высокотемпературному стопорному каналу 45 и среднетемпературному стопорному каналу 46 технологического реакционного сосуда 10 согласно первому варианту осуществления. Более того, технологический реакционный сосуд 70 согласно второму варианту осуществления имеет конфигурацию, отличающуюся от технологического реакционного сосуда 10 согласно первому варианту осуществления в том, что касается канала детектирования 61.

На Фиг. 8 показано поперечное сечение канала детектирования 61 в технологическом реакционном сосуде 70 согласно второму варианту осуществления. Канал детектирования 61 предусмотрен в соединительном канале 40 и облучается возбуждающим светом для того, чтобы детектировать излучение флуоресценции образца. Как показано на Фиг. 8, канал детектирования 61 представляет собой трапецевидный канал и включает отверстие 62, нижнюю поверхность 63, и боковые поверхности 64, расположенные на соответствующих сторонах нижней поверхности 63. Боковые поверхности 64 имеют конусообразную форму, расширяющуюся от нижней поверхности 63 в направлении отверстия 62. Параметры, которые определяют форму и размеры канала детектирования 61, включают глубину Dd, угол конусности Td, ширину отверстия Wd1, ширину нижней поверхности Wd2, и площадь поперечного сечения Sd.

В технологическом реакционном сосуде 70, согласно второму варианту осуществления, площадь поперечного сечения Sd канала детектирования 61 превышает площадь поперечного сечения Sr извилистого канала 53 (смотрите фигуру 4A). Сделав площадь поперечного сечения Sd канала детектирования 61 больше площади поперечного сечения Sr извилистого канала 53, как описано, облегчается допуск оптической головки 142 в технологическое реакционное устройство 100 при компоновке, таким образом, улучшается технологичность монтажных работ и снижаются затраты на компоненты.

В технологическом реакционном сосуде 70, согласно второму варианту осуществления, отношение площадей поперечного сечения Sd/Sr для площади поперечного сечения Sr извилистого канала 53 и площади поперечного сечения Sd канала детектирования 61 может находиться в диапазоне 1 < Sd/Sr ≤ 1,8, предпочтительно в диапазоне 1,02 ≤ Sd/Sr ≤ 1,5, и более предпочтительно в диапазоне 1,02 ≤ Sd/Sr ≤ 1,2.

В технологическом реакционном сосуде 70, согласно второму варианту осуществления, ширина отверстия Wr1 извилистого канала 53 может составлять от 0,55 мм до 0,95 мм, и предпочтительно от 0,65 мм до 0,85 мм. Ширина нижней поверхности Wr2 извилистого канала 53 может составлять от 0 мм до 0,95 мм, и предпочтительно от 0,4 мм до 0,6 мм. Глубина Dr извилистого канала 53 может составлять от 0,5 мм до 0,9 мм, и предпочтительно от 0,6 мм до 0,8 мм. Угол конусности Tr извилистого канала 53 может составлять от 0° до 45°, предпочтительно от 10° до 30°, и более предпочтительно от 15° до 25°. Следует заметить, что в технологическом реакционном сосуде 70, согласно второму варианту осуществления, когда ширина нижней поверхности Wr2 извилистого канала 53 меньше, чем ширина отверстия Wr1, так что ширина нижней поверхности Wr2 составляет 0 мм или около 0 мм, форма поперечного сечения извилистого канала 53 становится весьма близкой к инверсной треугольной форме. Кроме того, следует заметить, что, когда угол конусности Tr уменьшается до 0° или близко к 0°, форма поперечного сечения извилистого канала 53 становится весьма близкой к прямоугольной.

В технологическом реакционном сосуде 70, согласно второму варианту осуществления, ширина отверстия Wd1 канала детектирования 61 может составлять от 0,7 мм до 1,2 мм, и предпочтительно от 0,8 мм до 1,1 мм. Ширина нижней поверхности Wd2 канала детектирования 61 может составлять от 0,15 мм до 1,2 мм, и предпочтительно от 0,55 мм до 0,95 мм. Глубина Dd канала детектирования 61 может составлять от 0,5 мм до 1,2 мм, и предпочтительно от 0,6 мм до 1,1 мм. Угол конусности Td канала детектирования 61 может составлять от 0° до 45°, предпочтительно от 10° до 35°, и более предпочтительно от 15° до 30°.

Путем формирования извилистого канала 53 канала детектирования 61 с указанными выше размерами, непрерывное движение образца (который может включать поверхностно-активное вещество) становится плавным, что обеспечивает легкость производства, также с использованием такой традиционной технологии производства, как инжекционное формование.

Кроме того, путем увеличения ширины нижней поверхности Wd2 в поперечном сечении канала детектирования 61, можно дополнительно улучшить влияние на вышеуказанный допуск, причем расстояние между противостоящими боковыми поверхностями 64 увеличивается. Таким образом, может быть снижена вероятность того, что отражение, лучепреломление, рассеяние, и т.п. на боковых поверхностях 64 затруднит стабильное измерение флуоресценции.

Нижняя поверхность 63 канала детектирования 61 образуется на плоскости, параллельной основной поверхности (то есть, верхней поверхности 14a и нижней поверхности 14b) подложки 14. Кроме того, когда технологический реакционный сосуд 70 устанавливается в технологическом реакционном устройстве 100 (смотрите фигуру 3), оптическая головка 142 детектора флуоресценции 140 установлена таким образом, чтобы ее оптическая ось была практически перпендикулярна нижней поверхности 63 и основной поверхности подложки 14. При такой компоновке может быть подавлено нежелательное лучепреломление или отражение возбужденного света, испускаемого оптической головкой 142 на образец, или флуоресценция, излучаемая образцом, и может быть осуществлено стабильное детектирование интенсивности флуоресценции.

Нижняя поверхность 63 и боковые поверхности 64 являются плоскими, а соединительные части 65 между нижней поверхностью 63 и боковые поверхности 64 имеют угловую форму. Иными словами, соединительные части 65 между нижней поверхностью 63 и боковыми поверхностями 64 практически не имеют криволинейной поверхности, и например, их радиус закругления может составлять приблизительно 0,02 мм или меньше, предпочтительно 0,01 мм или меньше, и более предпочтительно 0,005 мм или меньше. В области детектирования флуоресценции 86, если криволинейная поверхность и т.п. присутствует в части, которая соответствует части с испускаемой флуоресценцией или с оптическим возбуждением, криволинейная поверхность и т.п. может вызвать беспорядочное лучепреломление или рассеяние, что может затруднять стабильное измерение флуоресценции. Поэтому, следует предотвращать такое состояние, придав поперечному сечению канала детектирования 61 такую форму, чтобы в максимальной степени исключалась криволинейная поверхность и т.п.

Третий вариант осуществления

Фиг. 9 представляет собой горизонтальную проекцию подложки 14, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде 90 согласно третьему варианту осуществления настоящего изобретения. Фиг. 10 является увеличенной схемой горизонтальной проекции, на которой показаны ответвления 42 в окрестности канала и отверстие для введения образца 44. На Фиг. 11 схематично приведен вид в поперечном разрезе ответвления 42 в окрестности канала и отверстие для введения образца 44, показанного на Фиг. 10, которое показано в сечении по линии A-A.

Как описано выше, канал ответвления 42 ответвляется от части буферного канала 39, причем отверстие для введения образца 44 образуется на периферическом конце канала ответвления 42 таким образом, чтобы быть открытым на нижней поверхности 14b подложки 14. Образец вводится из указанного отверстия для введения образца 44 и течет внутри буферного канала 39 по каналу ответвления 42. Образец, заполняющий буферный канал 39, перемещается в высокотемпературный извилистый канал 35 или в среднетемпературный извилистый канал 37 и вовлекается в реакцию ПЦР. Однако, имеется вероятность того, что образец остается в канале ответвления 42 и в отверстии для введения образца 44. Как описано выше, высокотемпературную область 36 и среднетемпературную область 38 нагревают с помощью нагревателя технологического реакционного устройства в ходе ПЦР. Когда тепло, действующее на высокотемпературную область 36 и среднетемпературную область 38, передается в канал ответвления 42 и отверстие для введения образца 44, воздух, присутствующий в канале ответвления 42 и отверстии для введения образца 44, расширяется, и оставшийся образец может выталкиваться в буферный канал 39 под действием расширяющегося воздух. Другими словами, в канале 12 находятся: образец, который вовлекается в ПЦР (называется “основным образцом”), и остаточный образец, хотя они отделены друг от друга. Когда основной образец и остаточный образец находятся в канале 12, хотя они отделены друг от друга в канале 12, как описано выше, существует вероятность того, что движущее усилие не действует на основной образец соответствующим образом, даже когда внутри канала 12 повышается давление, так что образец не может двигаться надлежащим образом.

Поэтому технологический реакционный сосуд 90 по третьему варианту осуществления настоящего изобретения формируется таким образом, что расстояние dε между среднетемпературной областью 38, вблизи канала ответвления 42 и отверстия для введения образца 44, и каналом ответвления 42 и отверстием для введения образца 44 составляет 5 мм или больше. Когда подложка 14 произведена из смолы или стекла, устанавливая расстояние dε равным 5 мм или больше, можно предотвратить или по меньшей мере подавить передачу тепла из среднетемпературной области 38 в канал ответвления 42 и отверстие для введения образца 44. Таким образом, могут быть устранены такие затруднения, которые описаны выше. Расстояние dε составляет 5 мм или больше, предпочтительно 6 мм или больше, более предпочтительно 7,5 мм или больше, и еще более предпочтительно 9 мм или больше. Как и следовало ожидать, чем больше расстояние dε, тем лучше, с точки зрения предотвращения передачи тепла. Однако, если расстояние dε чрезмерно велико, то увеличиваются размеры технологического реакционного сосуда 90. Расстояние dε составляет 50 мм или меньше, предпочтительно 40 мм или меньше, более предпочтительно 30 мм или меньше, и еще более предпочтительно 25 мм или меньше.

В настоящем варианте осуществления, поскольку среднетемпературная область 38 находится ближе к каналу ответвления 42 и отверстию для введения образца 44, чем высокотемпературная область 36, определяется расстояние dε между среднетемпературной областью 38 и каналом ответвления 42 и отверстием для введения образца 44. Однако в другом варианте осуществления, когда высокотемпературная область находится ближе к каналу ответвления 42 и отверстию для введения образца 44, чем среднетемпературная область, определяется расстояние dε между высокотемпературной областью и каналом ответвления и отверстием для введения образца. Другими словами, расстояние dε между реакционной зоной, ближайшей к каналу ответвления 42 и к отверстию для введения образца 44 среди многочисленных реакционных зон, и каналом ответвления 42 и отверстием для введения образца 44 может составлять 5 мм или больше.

Четвертый вариант осуществления

Фиг. 12 является горизонтальной проекцией подложки 14, предусмотренной в технологическом реакционном сосуде 110 согласно четвертому варианту осуществления настоящего изобретения. Канал ответвления 42 ответвляется от части буферного канала 39, причем отверстие для введения образца 44 формируется на периферическом конце канала ответвления 42 таким образом, чтобы оно было открытым на нижней поверхности 14b подложки 14. Образец, введенный из отверстия для введения образца 44, протекает в направлении одного из фильтров, контактирует с поверхностью фильтра, причем часть поверхности фильтра может быть закрыта или закупорена образцом. Когда фильтр частично или полностью закупорен, движущее усилие шприцевого насоса, диафрагменного насоса, воздуходувки, и т.п., служащая средством подачи жидкости, менее вероятно действует на образец через фильтр. Следовательно, возвратно-поступательное движение между высокотемпературной областью и среднетемпературной областью может осуществляться в необычном режиме, что может препятствовать реакции ПЦР.

Поэтому в технологическом реакционном сосуде 110 согласно четвертому варианту осуществления настоящего изобретения, если объем канала от отверстия для введения образца 44 до фильтра, ближайшего к отверстию для введения образца (первый фильтр 28 на Фиг. 12), обозначен как Vf, и объем образца, введенный из отверстия для введения образца, обозначен как Vs, выполняется следующее условие:

k × Vs < Vf

(где k является коэффициентом, представленным как действительное число от 0,1 до 10).

Коэффициент k определяют на основе введенного объема Vs образца, типа и вязкости растворителя образца, который будет введен, количества и свойств таких веществ, как поверхностно-активное вещество, добавленных к образцу, смачиваемости и сопротивляемости поверхности подложки, пленки, герметизирующей канал, и т.д., и т.п.. Величина коэффициента k предпочтительно составляет от 0,3 до 5, более предпочтительно от 0,4 до 2. Кроме того, даже когда все количество введенного образца течет в направлении фильтра, наиболее близкого к отверстию для введения образца, коэффициент k может быть больше чем 1 (1 < k), с точки зрения, что край образца не контактирует с поверхностью фильтра. С другой стороны, при большом значении коэффициента k, величина Vf становится большой. Поэтому величина коэффициента k может составлять от 0,4 до 0,6, с точки зрения экономии пространства основной поверхности подложки.

Объем Vs вводимого образца составляет от 1 мкл до 50 мкл (микролитр), предпочтительно от 5 мкл до 40 мкл, и более предпочтительно от 10 мкл до 30 мкл. Когда форма поперечного сечения канала представлена на Фиг. 4A, длина Lh канала от отверстия для введения образца 44 до фильтра, ближайшего к отверстию для введения образца 44, составляет от 2 мм до 200 мм, и предпочтительно составляет от 5 мм до 100 мм, более предпочтительно от 10 мм до 50 мм, и еще более предпочтительно от 20 мм до 40 мм. Если длина Lh канала слишком мала, то возрастает вероятность контакта образца с фильтром. Если длина Lh слишком велика, то размер подложки 14 становится слишком большим. Это нежелательно с точки зрения экономии пространства, занимаемого подложкой, а также затрудняет миниатюризацию технологического реакционного устройства.

По меньшей мере часть канала от отверстия для введения образца 44 до фильтра, ближайшего к отверстию для введения образца 44, может представлять собой канал с поперечным сечением, показанным на Фиг. 4B или с поперечным сечением, показанным на Фиг. 8. Сделав относительно большой площадь поперечного сечения канала от отверстия для введения образца 44 до фильтра, можно сократить длину Lh. Кроме того, можно ожидать тормозящий эффект для предотвращения превышения скорости образца в ходе протекания реакции, такой как ПЦР, и может быть предотвращено загрязнение фильтра образцом.

Например, даже в случае, когда исполнитель ввел образец после ошибочного удаления герметизирующей пленки, которая уплотняла фильтр, наиболее близкий к отверстию для введения образца 44, или герметизирующей пленки, которая уплотняла воздушный коммуникационный порт, наиболее близкий к фильтру в момент введения образца из отверстия для введения образца 44, можно предотвратить течение образца в направлении фильтра вблизи отверстия для введения образца и его контактирование с фильтром, что приводит к загрязнению фильтра.

Приведенное выше описание представляет собой объяснение на основе вариантов осуществления настоящего изобретения. Указанные варианты осуществления предназначены только для иллюстрации, причем для специалистов в этой области техники будет очевидно, что могут быть разработаны различные модификации составляющих элементов и процессов, и что указанные модификации также входят в объем настоящего изобретения.

Например, технологический реакционный сосуд по одному варианту осуществления может включать высокотемпературный стопорный канал 45 и среднетемпературный стопорный канал 46 в технологическом реакционном сосуде 10 согласно первому варианту осуществления, описанному выше, и канал детектирования 61 в технологическом реакционном сосуде 70 согласно второму варианту осуществления, описанному выше. В этом случае, может быть осуществлен технологический реакционный сосуд, способный демонстрировать оба эффекта указанных двух вариантов осуществления.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение применимо для полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Описание номеров позиций

10, 60, 70, 90, 110 технологический реакционный сосуд,

12 канал,

14 подложка,

16 пленка, герметизирующая канал,

18 первая герметизирующая пленка,

19 вторая герметизирующая пленка,

20 третья герметизирующая пленка,

21 четвертая герметизирующая пленка,

24 первый воздушный коммуникационный порт,

26 второй воздушный коммуникационный порт,

28 первый фильтр,

29, 31 проход ввода воздуха,

30 второй фильтр,

35 высокотемпературный извилистый канал,

36 высокотемпературная область,

37 среднетемпературный извилистый канал,

38 среднетемпературная область,

39 буферный канал,

40 соединительный канал,

42 канал ответвления,

44 отверстие для введения образца,

45 высокотемпературный стопорный канал,

46 среднетемпературный стопорный канал,

47, 50, 62 отверстия,

48, 51, 63 нижние поверхности,

49, 52, 64 боковые поверхности,

53, 56 извилистый канал,

54 стопорный канал,

55, 58, 65 соединительные части,

57 изогнутая часть

61 канал детектирования,

86 область детектирования флуоресценции,

100 технологическое реакционное устройство,

104 высокотемпературный нагреватель,

106 среднетемпературный нагреватель,

140 детектор флуоресценции,

142 оптическая головка,

144 запускающее устройство детектора флуоресценции,

146 оптическое волокно.

Изобретение относится к технологическим реакционным сосудам для проведения полимеразной цепной реакции. Предложен технологический реакционный сосуд, содержащий подложку и канал в виде канавки, образованный на верхней поверхности подложки. Для подложки установлены реакционные зоны, каждая из которых поддерживается при заданной температуре, и образец циклически совершает возвратно-поступательное движение между реакционными зонами для проведения реакции, при этом канал включает извилистый канал, включенный в каждую из указанных реакционных зон, и стопорный канал, примыкающий к каждому извилистому каналу, причем площадь поперечного сечения стопорного канала превышает площадь поперечного сечения извилистого канала. Предложены также варианты указанного сосуда. Технический результат – в предложенном сосуде возможно останавливать образец в извилистом канале с улучшенной точностью. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 12 ил.

1. Технологический реакционный сосуд для проведения полимеразной цепной реакции, содержащий подложку и канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки,

для указанной подложки установлены реакционные зоны, каждая из которых поддерживается при заданной температуре, и образец циклически совершает возвратно-поступательное движение между указанными реакционными зонами, для того чтобы происходила реакция,

при этом указанный канал включает в себя извилистый канал, включенный в каждую из указанных реакционных зон, и стопорный канал, примыкающий к каждому извилистому каналу,

причем площадь поперечного сечения стопорного канала превышает площадь поперечного сечения извилистого канала.

2. Технологический реакционный сосуд по п. 1, в котором отношение площадей поперечного сечения Sb/Sr находится в диапазоне 1 < Sb/Sr ≤ 1,8, где Sr обозначает площадь поперечного сечения извилистого канала, а Sb обозначает площадь поперечного сечения стопорного канала.

3. Технологический реакционный сосуд по п. 2, в котором отношение площадей поперечного сечения Sb/Sr находится в диапазоне 1,02 ≤ Sb/Sr ≤ 1,5.

4. Технологический реакционный сосуд по п. 2, в котором отношение площадей поперечного сечения Sb/Sr находится в диапазоне 1,02 ≤ Sb/Sr ≤ 1,2.

5. Технологический реакционный сосуд по любому из пп. 1-4, в котором извилистый канал и стопорный канал, каждый из них, имеет отверстие, нижнюю поверхность и боковые поверхности, имеющие конусную форму, расширяющуюся от нижней поверхности в направлении отверстия.

6. Технологический реакционный сосуд по п. 5, в котором

извилистый канал имеет ширину отверстия от 0,55 мм до 0,95 мм, ширину нижней поверхности от 0 мм до 0,95 мм, глубину от 0,5 мм до 0,9 мм и угол конусности от 0° до 45°,

при этом стопорный канал имеет ширину отверстия от 0,65 мм до 1,05 мм, ширину нижней поверхности от 0 мм до 1,05 мм, глубину от 0,5 мм до 0,9 мм и угол конусности от 0° до 45°.

7. Технологический реакционный сосуд по п. 5 или 6, в котором соединительные части между нижней поверхностью и боковыми поверхностями имеют криволинейную поверхность.

8. Технологический реакционный сосуд по п. 7, в котором радиус кривизны соединительных частей составляет от 0,2 мм до 0,38 мм.

9. Технологический реакционный сосуд по любому из пп. 1-8, в котором

извилистый канал включает в себя изогнутую часть,

при этом радиус кривизны изогнутой части составляет от 0,3 мм до 10 мм.

10. Технологический реакционный сосуд для проведения полимеразной цепной реакции, содержащий подложку и канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки,

для указанной подложки установлены реакционные зоны, каждая из которых поддерживается при заданной температуре, и образец циклически совершает возвратно-поступательное движение между указанными реакционными зонами, для того чтобы происходила реакция,

при этом указанный канал включает в себя извилистый канал, включенный в каждую из указанных реакционных зон, соединительный канал, соединяющий указанные реакционные зоны, и канал детектирования, включенный в указанный соединительный канал и выполненный с возможностью облучения его возбуждающим светом, для того чтобы детектировать флуоресценцию от образца, проходящего внутри канала,

причем площадь поперечного сечения канала детектирования превышает площадь поперечного сечения извилистого канала.

11. Технологический реакционный сосуд по п. 10, в котором отношение площадей поперечного сечения Sd/Sr находится в диапазоне 1 < Sd/Sr ≤ 1,8, где Sr обозначает площадь поперечного сечения извилистого канала, и Sd обозначает площадь поперечного сечения канала детектирования.

12. Технологический реакционный сосуд по п. 11, в котором отношение площадей поперечного сечения Sd/Sr находится в диапазоне 1,02 ≤ Sd/Sr ≤ 1,5.

13. Технологический реакционный сосуд по п. 11, в котором отношение площадей поперечного сечения Sd/Sr находится в диапазоне 1,02 ≤ Sd/Sr ≤ 1,2.

14. Технологический реакционный сосуд по любому из пп. 10-13, в котором извилистый канал и канал детектирования, каждый, имеет отверстие, нижнюю поверхность и боковые поверхности, имеющие конусную форму, расширяющуюся от нижней поверхности в направлении отверстия.

15. Технологический реакционный сосуд по п. 14, в котором

извилистый канал имеет ширину отверстия от 0,55 мм до 0,95 мм, ширину нижней поверхности от 0 мм до 0,95 мм, глубину от 0,5 мм до 0,9 мм и угол конусности от 0° до 45°,

при этом канал детектирования имеет ширину отверстия от 0,7 мм до 1,2 мм, ширину нижней поверхности от 0,15 мм до 1,2 мм, глубину от 0,5 мм до 1,2 мм и угол конусности от 0° до 45°.

16. Технологический реакционный сосуд по п. 14 или 15, в котором нижняя поверхность в канале детектирования сформирована на плоской поверхности, параллельной основной поверхности подложки.

17. Технологический реакционный сосуд по п. 16, в котором соединительные части между нижней поверхностью и боковыми поверхностями имеют угловую форму.

18. Технологический реакционный сосуд для проведения полимеразной цепной реакции, содержащий подложку и канал в виде канавки, сформированный на основной поверхности подложки,

для указанной подложки установлены реакционные зоны, каждая из которых поддерживается при заданной температуре, и образец циклически совершает возвратно-поступательное движение между указанными реакционными зонами, для того чтобы происходила реакция,

при этом указанный канал включает в себя извилистый канал, включенный в каждую из указанных реакционных зон, стопорный канал, примыкающий к каждому извилистому каналу, соединительный канал, соединяющий указанные реакционные зоны, и канал детектирования, включенный в соединительный канал и выполненный с возможностью облучения его возбуждающим светом, для того чтобы детектировать флуоресценцию от образца, проходящего внутри канала,

при этом площадь поперечного сечения стопорного канал превышает площадь поперечного сечения извилистого канала, и

площадь поперечного сечения канала детектирования превышает площадь поперечного сечения извилистого канала.

19. Технологический реакционный сосуд по п. 1 или 18, дополнительно содержащий канал ответвления, отходящий от указанного канала, и отверстие для введения образца, находящееся в канале ответвления,

при этом расстояние между реакционной зоной, ближайшей к каналу ответвления и к отверстию для введения образца, среди указанных реакционных зон, и каналом ответвления и отверстием для введения образца составляет 5 мм или больше.

20. Технологический реакционный сосуд по п. 1 или 18, дополнительно содержащий два фильтра, находящиеся соответственно на концах указанного канала, канал ответвления, отходящий от указанного канала, и отверстие для введения образца, находящееся в канале ответвления,

при этом указанный сосуд удовлетворяет следующему соотношению: k × Vs < Vf , где k обозначает действительное число от 0,1 до 10, Vf обозначает объем канала от отверстия для введения образца до фильтра, ближайшего к отверстию для введения образца, и Vs обозначает объем образца, вводимого из отверстия для введения образца.

21. Технологический реакционный сосуд по п. 1 или 18, дополнительно содержащий два фильтра, находящиеся соответственно на концах указанного канала, канал ответвления, отходящий от указанного канала и отверстие для введения образца, находящееся в канале ответвления,

при этом указанный сосуд удовлетворяет следующему условию: в случае, когда объем образца, вводимый из отверстия для введения образца, составляет от 1 мкл до 50 мкл, длина канала от отверстия для введения образца до фильтра, ближайшего к отверстию для введения образца, составляет от 2 мм до 200 мм.

22. Технологический реакционный сосуд по п. 1 или 18, в котором стопорный канал, примыкающий к извилистому каналу, включенному в одну реакционную зону из указанных реакционных зон, расположен на стороне, удаленной от других реакционных зон.

23. Технологический реакционный сосуд по любому из пп. 1-22, в котором указанные реакционные зоны включают в себя высокотемпературную зону, поддерживаемую при сравнительно высокой температуре, и среднетемпературную зону, поддерживаемую при температуре, ниже температуры высокотемпературной зоны.