УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ Российский патент 2021 года по МПК C12M1/00 C12M1/38 G01N21/13 G01N21/64 G01N35/00 G01N35/08 B01J19/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к процессорам для проведения реакций типаполимеразной цепной реакции.

Уровень техники

Генетическое тестирование широко используется во множестве исследований в разнообразных областях медицины, при идентификации сельскохозяйственных продуктов и патогенных микроорганизмов, оценке безопасности пищевых продуктов и даже при исследованиях патогенных вирусов и множества инфекционных заболеваний. Для детектирования с высокой чувствительностью малых количеств ДНК, которая несет гены, существуют методы, основанные на анализе результатов, получаемых при амплификации участка ДНК. Помимо всего сказанного, ПЦР является превосходной технологией, в которой селективно амплифицируется определенный участок очень небольшого количества ДНК, взятого из организма или иных источников.

В ПЦР заданный образец подвергают термоциклированию, где в образце смешана биологическая проба, содержащая ДНК, и реагенты ПЦР состоящие из праймеров, ферментов и т.п., таким образом, чтобы вызвать реакции денатурации, отжига и элонгации, которые должны повторяться, так чтобы конкретный участок ДНК селективно амплифицировался.

Обычная практика выполнения ПЦР предусматривает помещение заранее определенного количества целевого образца в пробирку для ПЦР или в сосуд для проведения реакции, такой как микропланшет, в котором формируется множество лунок. Однако в последние годы в практику вошла ПЦР, использующая сосуд для проведения реакции (также упоминаемый как чип), снабженный микроканалом, который формируется на подложке (например, патентный документ 1).

[Патентный документ 1] Японская публикация патентной заявки № 2009-232700

Раскрытие изобретения

Проблема, которая должна быть решена этим изобретением

В ПЦР, использующей сосуд для проведения реакции с каналом возвратно-поступательного типа, чтобы подвергнуть образец термоциклированию, на канале устанавливают множество температурных областей, каждая из которых поддерживается при разных температурах, и образец движется возвратно-поступательным способом между множеством температурных областей в канале. Чтобы должным образом применять к образцу температурный цикл, необходимо точно останавливать пробу в каждой температурной области. Вариации положения остановки могут препятствовать началу реакции, приводят к тому, что протекание реакции варьирует в зависимости от местоположения образца, и вызывают ошибки реакции, например, реакции амплификации ДНК, что может привести работников и тех, кто иным образом связан с этой работой, к ошибочным результатам.

С учетом этого уровня техники задача настоящего изобретения заключается в обеспечении технологии, способной точно останавливать образец в заданном месте в температурной области в процессоре для проведения реакции, способном подвергнуть образец термоциклированию, перемещая образец возвратно-поступательным способом в канале, в котором образованы области с различными температурами.

Средства решения проблем

Процессор для проведения реакции, соответствующий варианту осуществления настоящего изобретения, содержит: сосуд для проведения реакции, в котором сформирован канал, по которому движутся образцы; систему подачи текучей среды, которая перемещает и останавливает образец в канале; систему управления температурой, которая обеспечивает множество температурных областей, в каждой из которых поддерживается разная температура, множество температурных областей, содержащих, по меньшей мере, первую температурную область и вторую температурную область; систему обнаружения, которая обнаруживает образец, проходящий через область обнаружения, которая устанавливается между смежными температурными областями канала, причем область обнаружения содержит, по меньшей мере, первую область обнаружения, которая установлена между первой температурной областью и второй температурной областью канала; и блок управления, управляющий системой подачи текучей среды, основываясь на сигнале, обнаруживаемом системой обнаружения. Блок управления сформирован для выполнения управления возвратно-поступательным движением образца во множестве циклов, где в одном цикле образец останавливается на заданный период времени в первой температурной области, затем движется из первой температурной области во вторую температурную область после прохождения через первую область обнаружения и затем останавливается на заданный период времени, и после этого возвращается в первую температурную область и останавливается. При условии, что: время выдержки, требующееся до того момента, когда блок управления подаст команду системе подачи текучей среды остановить образец после того времени, когда прохождение образца через первую область обнаружения обнаруживается системой обнаружения, время перемещения из первой температурной области во вторую температурную область в n-ном цикле (n - целое число, равное или больше 1), обозначается как t^1→2_d (n); целевое положение остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле обозначается как X^[2]₀ (n); время прохождения образцы через область обнаружения, то есть, движения из первой температурной области во вторую температурную область в n-ом цикле, обозначается как t^1→2_p (n); длина образца в канале обозначается как L; и фиксированный период времени, специфичный для процессора для проведения реакции, обозначается как t_c, время выдержки t^1→2_d (n) определяется следующим уравнением: t^1→2_d (n) = X^[2]₀(n) * t^1→2_p(n)/L-t_c. Целевое положение X^[2]₀ (n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-ом цикле корректируется относительно целевого положения X^[2]₀ (n) остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле, основываясь на результате управления остановкой образца в n-ом цикле.

Целевое положение X^[2] ₀(n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-ом цикле может корректироваться относительно целевого положения X^[2]₀(n) остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле, основываясь на положении X^[2]₁(n) остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле и расчетном целевом положении X^[2]₀₀ остановки во второй температурной области.

Целевое положение X^[2]₀(n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-ом цикле может корректироваться относительно целевого положения X^[2]₀(n) остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле, основываясь на разности ∆X^[2](n) между положением X^[2]₁(n) остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле и расчетным целевым положением X^[2]₀₀ остановки во второй температурной области.

Целевое положение X^[2]₀(n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-ом цикле может быть определено, корректируя целевое положение X^[2]₀(n) остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле.

Целевое положение X^[2]₀(n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-ом цикле может быть установлено следующим уравнением: X^[2]₀(n+1) = X^[2]₀(n) + k^[2](n) и поправочный член k^[2](n) может быть определен, основываясь на соотношении с разностью ∆X^[2](n) в n-ом цикле.

Поправочный член k^[2](n) может быть определен со ссылкой на таблицу, описывающую соотношение между разностью ∆X^[2](n) и поправочным членом k^[2](n) в n-ом цикле.

Положение X^[2]₁(n) остановки образца во второй температурной области в n-ом цикле может быть получено как значение X^[2]₁₁(n), определенное следующим уравнением: X^[2]₁₁(n) = L/t^2→nt_p(n) * {t^2→nt_mp(n) - t_c}. В этом уравнении t^2→nt_p(n) - время прохождения через область обнаружения, через которую образец проходит сразу после того, как покидает вторую температурную область, то есть, перемещается из второй температурной области в последующую температурную область, и t^2→nt_mp(n) является временем, требующимся от того момента, когда начинается работа системы подачи текучей среды для движения образца, до того момента, когда блок управления распознает, что передняя часть образца достигла области обнаружения, через которую образец проходит сразу после этого, то есть, перемещается от второй температурной области до последующей температурной области.

Результат изобретения

В соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечена технология, способная точно останавливать образец в заданном положении в температурной области в процессоре для проведения реакции, способном подвергнуть образец термоциклированию, перемещая образец возвратно-поступательным способом в канале, в котором устанавливаются различные температурные области.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1A и 1B – схематическое изображение сосуда для проведения реакции, используемого в процессоре для проведения реакции, соответствующем варианту осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 2 – схематическое изображение процессора для проведения реакции, соответствующий варианту осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 3 – схематическое изображение положения остановки образца;

Фиг. 4 – график, демонстрирующий изменения во флуоресцентном сигнале;

Фиг. 5 – график, демонстрирующий результаты эксперимента по контролированию перемещения образца в соответствии со сравнительным примером 1;

Фиг. 6 – график, демонстрирующий результаты эксперимента по контролированию перемещения образца в соответствии со сравнительным примером 2;

Фиг. 7 – график, демонстрирующий результаты эксперимента по контролированию перемещения образца в соответствии со со сравнительным примером 3;

Фиг. 8 – схема иллюстрирующая термоциклирование;

Фиг. 9 – диаграмма, где сравнивается фактическое положения остановки образца и положение остановки, оцененного, основываясь на настоящем изобретении, для образца, используемого в эксперименте, показанном на фиг. 5;

Фиг. 10 – диаграмма, где сравнивается фактическое положения остановки образца и положение остановки, оцененного, основываясь на настоящем изобретении, для образца, используемого в эксперименте, показанном на фиг. 6;

Фиг. 11 – диаграмма, где сравнивается фактическое положения остановки образца и положение остановки, оцененного, основываясь на настоящем изобретении, для образца, используемого в эксперименте, показанном на фиг. 7;

Фиг. 12 – блок-схема последовательности выполнения операций способа управления движением образца в процессоре для проведения реакции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 13 – график, демонстрирующий результат эксперимента по управлению движением, в котором был использован способ управления движением в соответствии с настоящим вариантом осуществления, где на графике сравнивается фактическое положение остановки образца с положением остановки оцененным, основываясь на настоящем изобретении, оба положения оцениваются в низкотемпературной области;

Фиг. 14 – схематическое изображение другого варианта осуществления сосуда для процесса для проведения реакции; и

Фиг. 15 – схематическое изображение другого варианта осуществления процессора для проведения реакции.

Способы осуществления изобретения

Здесь далее будет дано объяснение в отношении процессора для проведения реакции, соответствующего варианту осуществления настоящего изобретения. Этот процессор для проведения реакции является устройством для выполнения ПЦР. Одни и те же или эквивалентные составляющие элементы, детали и процессы, показанные на каждом чертеже, будут обозначаться одними и теми же ссылочными позициями и их повторные объяснения соответственно будут пропущены. Дополнительно отмечаем, что эти варианты осуществления не ограничивают изобретение и показаны исключительно с целью иллюстрации и все признаки, описанные в вариантах осуществления, и их сочетания, не я обязательно являются существенно важными для изобретения.

На фиг. 1A и 1B представлено схематическое изображение сосуда 10 для проведения реакции, применяемого в процессоре для проведения реакции, согласно варианту осуществления настоящего изобретения. На фиг. 1A показан вид сверху сосуда 10 для проведения реакции и на фиг. 1B показан вид спереди сосуда 10 для проведения реакции.

Как показано на фиг. 1A и 1B, сосуд 10 для проведения реакции содержит подложку 14 и пленку 16, герметизирующую канал.

Подложка 14 предпочтительно формируется из материала, стабильного при изменениях температуры и устойчивого к используемому раствору образца. Дополнительно, подложка 14 предпочтительно формируется из материала, обладающего хорошей пластичностью, хорошей прозрачностью и барьерным свойством и свойством низкой самофлуоресценции. В качестве такого материала предпочтительны неорганический материал, такой как стекло, кремний (Si) и т. п., смола, такая как акриловая смола, полиэфир, кремний и т. п., и, в частности, циклоолефин. Для примера, размеры подложки 14 составляют: длинная сторона 75 мм, короткая сторона 25 мм и толщина 4 мм.

Канал 12 в виде канавки формируется на нижней поверхности 14a подложки 14 и этот канал 12 изолируется пленкой 16, герметизирующей канал. Для примера, размеры канала 12, сформированного на нижней поверхности 14a подложки 14 составляют: ширина 0,7 мм и глубина 0,7 мм. Первый порт 17 связи, который связывается с внешней средой, формируется в месте расположения одного конца канала 12 в подложке 14. Второй порт 18 связи формируется в месте расположения другого конца канала 12 в подложке 14. Пара из первого порта 17 связи и второго порта 18 связи, сформированных на соответствующих концах канала 12, формируется так, чтобы выходить на верхнюю поверхность 14b подложки 14. Такая подложка может изготавливаться литьем под давлением или операцией резания на станке с числовым управлением (NC) и т. п.

Как показано на фиг. 1B, на нижней поверхности 14a подложки 14 прикрепляется пленка, герметизирующая канал 16. В сосуде 10 для проведения реакции, соответствующем варианту осуществления, большая часть канала 12 формируется в виде канавки, видимой на нижней поверхности 14a подложки 14. Такую канавку легко выполнять прессованием посредством литья под давлением, используя металлическую пресс-форму и т. п. Чтобы изолировать эту канавку, с тем, чтобы использовать канавку в качестве канала, пленка 16, герметизирующая канал, прикрепляется на нижней поверхности 14a подложки 14.

Пленка 16, герметизирующая канал, может быть клейкой и/или адгезивной на одной из ее основных поверхностей или может иметь функциональный слой, обладающий клейкостью и/или адгезивностью под действием нажатия, облучения энергией ультрафиолетовых лучей и т. п., нагревания и т. п., сформированный на одной из основных поверхностей. Таким образом, пленка 16, герметизирующая канал, имеет функцию способности легко становиться интегрированной с нижней поверхностью 14a подложки 14 при плотном контакте с нижней поверхностью 14a. Пленка 16, герметизирующая канал, желательно изготавливается из материала, содержащего клейкое вещество и имеющего свойство низкой самофлуоресценции. В этом отношении пригодна прозрачная пленка, изготовленная из смолы, такой как циклоолефин, полиэфир, полипропилен, полиэтилен или акрил, но список этим не ограничивается. Дополнительно, пленка 16, герметизирующая канал, может быть сформирована из пластинчатого стекла или смолы. Поскольку, как можно ожидать, в этом случае она будет жесткой, пленка 16, герметизирующая канал, полезна для предотвращения коробления и деформации сосуда 10 для проведения реакции.

Канал 12 снабжен областью реакции, в которой возможно управление температурой на множестве уровней посредством процессора для проведения реакции, описанного позже. Образец можно термоциклировать перемещении его таким образом, что он непрерывно совершает возвратно-поступательное движение в области реакции, где поддерживаются множество уровней температуры.

Область реакции канала 12, показанная на фиг. 1A и 1B, содержит канал извилистой формы с протяженными поворотами, выполняемыми, комбинируя изогнутые участки и прямые участки. Когда сосуд 10 для проведения реакции будет смонтирован на процессоре для проведения реакции, описанном позже, правая сторона канала 12 на чертежах, как ожидается, станет областью реакции с относительно высокой температурой (приблизительно 95 °C) (здесь далее упоминается как "высокотемпературная область"), а левая сторона канала 12, как ожидается, станет областью с более низкой температурой (приблизительно 55 °C) (здесь далее упоминается как "низкотемпературная область"). Дополнительно, область реакции канала 12 содержит между ними область соединения для соединения высокотемпературной области и низкотемпературной области. Эта область соединения может быть линейным каналом.

Когда высокотемпературная область и низкотемпературная область являются каналами извилистой формы, как в настоящем варианте осуществления, эффективная площадь нагревателя и т. п., образующих средство управления температурой, описанное позже, могут эффективно использоваться и обладают теми преимуществами, что позволяет уменьшить варьирование температуры в области реакции и что реальный размер сосуда для проведения реакции может быть уменьшен, позволяя создавать процессоры для проведения реакции малого размера.

Образец, подвергаемый термоциклированию, вводится в канал 12 через первый порт 17 связи или через второй порт 18 связи. Способ введения этим не ограничивается. Альтернативно, например, соответствующее количество образца может вводиться напрямую через порт связи, используя пипетку, капельницу, шприц и т. п. Альтернативно, может использоваться способ введения, который предотвращает загрязнение, например , через наконечник иглы конической формы, в который устанавливается фильтр из пористого PTFE или полиэтилена. В целом, в продаже имеется много типов таких наконечников иглы и их можно легко получить и наконечники иглы могут использоваться, присоединяясь к наконечнику пипетки, капельницы, шприца и т. п. Дополнительно, образец может перемещаться в заданное положение в канале посредством выпуска и введения образцы пипеткой, капельницей, шприцом и т. п. и затем дополнительно двигаться под воздействием давления.

Образец включает, например, те, которые получаются добавлением флуоресцентной пробы, термостабильного фермента и четырех типов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) в качестве реагентов ПЦР в смесь, содержащую один или более типов ДНК. Дополнительно подмешивается праймер, который определенным образом реагирует с ДНК, которая участвует в реакции. Также могут использоваться коммерчески доступные наборы реагентов для ПЦР в реальном времени и т.п.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение процессора 30 для проведения реакции, соответствующего варианту осуществления настоящего изобретения.

Процессор 30 для проведения реакции, соответствующий варианту осуществления, содержит участок для размещения сосуда для проведения реакции (не показан), на котором размещаются сосуд 10 для проведения реакции, система 32 управления температурой, и центральный процессор 36. Как показано на фиг. 2, система 32 управления температурой выполняется относительно сосуда 10 для проведения реакции, помещенного на участке для размещения сосуда для проведения реакции таким образом, чтобы быть способной точно поддерживать и управлять температурой, чтобы в правой области канала 12 сосуда 10 для проведения реакции, показанного на чертеже, она составляла приблизительно 95 °C (высокотемпературный диапазон), и в левой области канала, показанного на чертеже, она составляла приблизительно 55 °C (низкотемпературный диапазон).

Система 32 регулирования температуры предназначена для поддержания температуры каждой температурной области в области проведения реакции и, в частности, снабжена высокотемпературным нагревателем 60 для нагревания высокотемпературной области канала 12, низкотемпературным нагревателем 62 для нагревания низкотемпературной области канала 12, температурным датчиком (не показан), таким как, например, термопара и т.п., чтобы измерять фактическую температуру каждой температурной области, драйвером 33 высокотемпературного нагревателя, чтобы управлять температурой высокотемпературного нагревателя 60, и драйвером 35 низкотемпературного нагревателя, чтобы управлять температурой низкотемпературного нагревателя 62. Информация о фактической температуре, измеренной температурным датчиком, посылается на центральный процессор 36. Основываясь на информации о фактической температуре каждой температурной области, центральный процессор 36 управляет драйвером каждого нагревателя, так чтобы температура каждого нагревателя становилась равной заданной температуре. Каждый нагреватель может быть, например, резистивным нагревательным элементом, элементом Пельтье и т.п. Система 32 управления температурой может быть дополнительно снабжена и другими компонентами для улучшения управляемости температурой в каждой температурной области.

Процессор 30 для проведения реакции, соответствующий настоящему варианту осуществления, дополнительно снабжен системой 37 подачи текучей среды для перемещения внутри канала 12 образца 20, введенного в канал 12 сосуда 10 для проведения реакции. Система 37 подачи текучей среды снабжена первым насосом 39, вторым насосом 40, драйвером 41 первого насоса для управления первым насосом 39, драйвером 42 второго насоса для управления вторым насосом 40, первой трубкой 43 и второй трубкой 44.

Один конец первой трубки 43 соединяется с первым портом 17 связи сосуда 10 для проведения реакции. Упаковочный материал 45 или иной вид уплотнения для обеспечения воздухонепроницаемости предпочтительно располагается в месте соединения первого порта 17 связи и конца первой трубки 43. Другой конец первой трубки 43 соединяется с выходом первого насоса 39. Таким же образом, один конец второй трубки 44 соединяется со вторым портом 18 связи сосуда 10 для проведения реакции. Упаковочный материал 46 или уплотнение для обеспечения воздухонепроницаемости предпочтительно располагается в месте соединения второго порта 18 связи и конца второй трубки 44. Другой конец второй трубки 44 соединяется с выходом второго насоса 40.

Первый насос 39 и второй насос 40 могут быть, например, насосами микровоздуходува, каждая из которых содержит диафрагменный насос. В качестве первого насоса 39 и второго насоса 40 могут использоваться, например, микровоздуходувы (модель MZB1001 T02), изготовленные компанией Murata Manufacturing Co., Ltd. и т. п. Хотя этот насос микровоздуходува во время работы может увеличивать давление на вторичной стороне больше, чем на первичной стороне, давление на первичной стороне и давление на вторичной стороне становятся равными в момент, когда насос останавливается или когда насос остановлен.

Центральный процессор 36 управляет подачей и давлением воздуха от первого насоса 39 и второго насоса 40 посредством драйвера 41 первого насоса и драйвера 42 второго насоса. Подача воздуха и давление от первого насоса 39 и от второго насоса 40 воздействуют на образец 20 внутри канала через первый порт 17 связи и второй порт 18 связи и становятся движущей силой для движения образца 20. Более конкретно, поочередно управляя первым насосом 39 и вторым насосом 40, давление, прикладываемое к одной из торцевых поверхностей образца 20, становится больше, чем давление, прикладываемое к другому концу, и таким образом может быть получена движущая сила, связанная с движением образца 20. При поочередном управлении первым насосом 39 и вторым насосом 40 образец 20 может двигаться, совершая возвратно-поступательное движение в канале, так чтобы проходить через каждую температурную область канала 12 сосуда 10 для проведения реакции. В результате, к образцу 20 может быть применено термоциклирование. Более конкретно, целевая ДНК в образце 20 селективно амплифицируется посредством повторяющегося применения этапа денатурации в высокотемпературной области и этапа отжига и элонгации в низкотемпературной области. Другими словами, высокотемпературная область может рассматриваться как область температуры денатурации, а низкотемпературная область может рассматриваться как область отжига и элонгации. Время пребывания в каждой температурной области может быть соответственно установлено, изменяя время, в течение которого образец 20 стоит в заданном положении в каждой температурной области.

Процессор 30 для проведения реакции, соответствующий варианту осуществления, дополнительно снабжен флуоресцентным детектором 50. Как описано выше, определенная заранее флуоресцентная проба добавляется к образцу 20. Поскольку интенсивность сигнала флуоресценции, испускаемого пробой 20, увеличивается по мере того, как происходит амплификация ДНК, значение интенсивности сигнала флуоресценции может использоваться в качестве индекса, служащего фактором принятия решений по прогрессу ПЦР или завершения реакции.

В качестве флуоресцентного детектора 50 может использоваться флуоресцентный детектор FLE-510 оптоволоконного типа, изготовленный компанией Nippon Sheet Glass Co., Ltd., который является очень компактной оптической системой, позволяющей быстро измерить и обнаружить флуоресценцию, независимо от того, является ли место освещенным или темным местом. Этот флуоресцентный детектор оптоволоконного типа позволяет настраивать частотную характеристику возбуждающего света/флуоресценции так, чтобы частотная характеристика соответствовала характеристике флуоресценции, испускаемой пробой 20, и, таким образом, позволяла получить оптимальную оптическую систему и систему обнаружения для образцов, имеющих различные характеристики. Дополнительно, флуоресцентный детектор оптоволоконного типа благодаря маленькому диаметру луча света, испускаемого детектором флуоресценции оптоволоконного типа, пригоден для обнаружения флуоресценции образца, находящегося в небольшой или узкой области, такой как канал.

Флуоресцентный детектор 50 оптоволоконного типа содержит оптическую головку 51, драйвер 52 флуоресцентного детектора и оптическое волокно 53, соединяющее оптическую головку 51 и драйвер 52 флуоресцентного детектора. Драйвер 52 флуоресцентного детектора содержит источник света для возбуждения света (светодиод (LED), лазер или источник света, регулируемый для излучения различных конкретных длин волн), мультиплексор/демультиплексор оптоволоконного типа и устройство фотоэлектрического преобразования (PD, APD, или детектор света, такой как фотоумножитель) (ни один из которых не показан), и т. п. и образуется драйвером и т. п. для управления ими. Оптическая головка 51 образуется оптической системой, такой как линза и имеет функцию направленного облучения образца возбуждающим светом и сбора флуоресценции, излучаемой образцом. Собранная флуоресценция отделяется от возбуждающего света, проходящего через оптоволокно 53, мультиплексором/ демультиплексором оптоволоконного типа внутри драйвера 52 флуоресцентного детектора и преобразуется в электрический сигнал элементом фотоэлектрического преобразования.

В процессоре 30 для проведения реакции, соответствующем настоящему варианту осуществления, оптическая головка 51 располагается так, что флуоресценция от образца 20, проходящей через участок области 65 (называемый "область 65 обнаружения флуоресценции") внутри области соединения, соединяющей высокотемпературную область и низкотемпературную область, может быть обнаружена. Так как реакция развивается по мере того, как образец 20 неоднократно движется возвратно-поступательным способом в канале, так что целевая ДНК, содержащаяся в образце 20, амплифицируется, и наблюдается изменение в количестве обнаруженной флуоресценции, прогресс амплификации ДНК может быть изучен в режиме реального времени. Дополнительно, в процессоре 30 для проведения реакции, соответствующем варианту осуществления, значение выхода флуоресцентного детектора 50 используется для управления движением образца 20, как описано позже. Флуоресцентный детектор не ограничивается флуоресцентным детектором оптоволоконного типа, пока флуоресцентный детектор демонстрирует функцию обнаружения флуоресценции от образца.

На фиг. 3 показана диаграмма для объяснения положения остановки образца. Как описано выше, в процессоре 30 для проведения реакции, согласно варианту осуществления, чтобы подвергнуть образец 20 термоциклированию, перемещая образец возвратно-поступательным способом в канале 12, в этом канале 12 устанавливается множество температурных областей (то есть, высокотемпературная область и низкотемпературная область), каждая из которых поддерживается при разной температуре. Чтобы должным образом подвергнуть образец 20 термоциклированию, необходимо точно останавливать образец 20 в каждой температурной области. Изменения в положении остановки могут препятствовать инициации реакции, вызывать вариабельность реакции в зависимости от положения образца, и вызывать ошибки реакции, такой как амплификация ДНК, что может привести к ошибочному заключению, принимаемому работниками и иными вовлеченными в работу лицами.

Как описано выше, оптическая головка 51 флуоресцентного детектора 50 выполнена с возможностью обнаружения флуоресценции, излучаемой пробой 20, проходящей через область 65 обнаружения флуоресценции канала 12. Флуоресцентный детектор 50 обнаруживает сигнал флуоресценции от образца 20 в области 65 обнаружения флуоресценции и передает сигнал на центральный процессор 36 каждые 0,01 секунды. Центральный процессор 36 принимает сигнал флуоресценции, выполняет арифметическую обработку, такую как сглаживание значения сигнала флуоресценции и усреднение, такое как скользящее среднее, сравнение с заданным пороговым значением (здесь далее иногда все вместе называемые как "оценка и т. п.") и т. п., и предоставляет сигнал остановки или действия системе 37 подачи текучей среды, основываясь на ее результате.

На фиг. 3 область 65 обнаружения флуоресценции располагается вблизи средней части между высокотемпературной областью и низкотемпературной областью; однако, это не является ограничением. Например, ее расположение может быть смещено в сторону высокотемпературной области или низкотемпературной области. Поскольку выход низкотемпературного нагревателя 62, расположенного в низкотемпературной области, может быть ниже, чем выход высокотемпературного нагревателя 60, расположенного в высокотемпературной области, возможно использовать части нагревателя, которые являются соответственно малыми или тонкими, и в этом случае оптическая головка 51 может также быть расположена смещенной в направлении низкотемпературной области.

На фиг. 3 показано состояние, в котором образец 20 находится в позиции X. Расстояние X образца 20 является расстояние между интерфейсом, принадлежащим торцевому участку образца 20, который является ближайшим к области 65 обнаружения флуоресценции, и центром области 65 обнаружения флуоресценции. Позиция образцы 20 обозначается, используя расстояние X от центра области 65 обнаружения флуоресценции и иногда просто обозначается как "позиция X". Дополнительно, даже когда образец находится либо в высокотемпературной области, либо в низкотемпературной области, значение X предполагается равным скалярному расстоянию от центра области 65 обнаружения флуоресценции.

Рассмотрим теперь остановку образцы 20 в целевом положении X₀ остановки. Когда образец 20 присутствует в этом целевом положении X₀ остановки, образец 20 наилучшим образом нагревается и поддерживается при заданной температуре. Целевое положение X₀ остановки определяется, основываясь на диапазоне и позиции температурной области процессора и конфигурации сосуда 10 для проведения реакции.

Как описано выше, в случае, например, когда позиция области 65 обнаружения флуоресценции смещается в направлении высокотемпературной области или низкотемпературной области, целевое положение остановки на стороне высокотемпературной области и целевое положение остановки на стороне низкотемпературной области различаются. Здесь далее, в целом, в случае, когда рассматривается целевое положение остановки, расстояние обозначается просто как X₀. Однако следует заметить, что, как описано выше, целевое положение остановки на стороне высокотемпературной области и целевое положение остановки на стороне низкотемпературной области не обязано быть одним и тем же.

Последовательность выполнения операций для остановки образца 20 описана ниже.

(1) Образец 20 проходит через область 65 обнаружения флуоресценции (флуоресцентный детектор 50 передает сигнал флуоресценции на центральный процессор 36).

(2) Центральный процессор 36 обнаруживает прохождение образцы 20, основываясь на сигнале флуоресценции от флуоресцентного детектора 50.

(3) Центральный процессор 36 передает сигнал остановки для первого насоса 39 на драйвер 41 первого насоса или передает сигнал остановки для второго насоса 40 на драйвер 42 второго насоса.

(4) Первый насос 39 или второй насос 40 останавливаются.

(5) Образец 20 останавливается.

В сосуде 10 для проведения реакции, соответствующем настоящему варианту осуществления, оптическая головка 51 флуоресцентного детектора 50 располагается около средней части между высокотемпературной областью и низкотемпературной областью и обнаруживает прохождение образца. Поэтому, чтобы остановить образец 20 в целевом положении X₀ остановки, необходимо определить, сколько времени потребуется до тех пор, пока привод управления насосом не остановится после того, как образец 20 пройдет через область 65 обнаружения флуоресценции.

Время (здесь далее упоминаемое как "время выдержки") t_d, затраченное с момента, когда прохождение образца 20 через область 65 обнаружения флуоресценции обнаруживается флуоресцентным детектором 50, до момента, когда центральный процессор 36 подаст насосу команду остановить образец 20 через драйвер насоса, может быть выражено следующим уравнением (1).

t_d = X₀/v - t_c (1)

В уравнении (1), X₀ - целевое положение остановки, v - скорость движения, когда образец 20 проходит через область 65 обнаружения флуоресценции, и t_c - постоянное время задержки, конкретное для процессора.

Объяснение приводится в отношении времени задержки t_c. Прохождение образца 20 не распознается центральным процессором 36 в то же самое время, когда прохождение обнаруживается флуоресцентным детектором 50. Обнаруженный сигнал флуоресценции от образца 20 требует обработки с усреднением сигнала, арифметической обработки для сравнения с пороговым значением (контрольным значением интенсивности сигнала флуоресценции, предопределенным, чтобы принять решение, что образец 20 присутстует в области 65 обнаружения флуоресценции) для определения и т. п. Поэтому, после того, как образец 20 фактически прошел через область 65 обнаружения флуоресценции, заранее определенное время задержки t_c формируется до тех пор, пока центральный процессор 36 не распознает прохождение.

Далее будет объяснена скорость v движения образца. На фиг. 4 показан пример изменений сигнала флуоресценции, обнаруженного флуоресцентным детектором 50 и полученного в результате такой операции, как процесс усреднения движения центральным процессором 36. На фиг. 4 по горизонтальной оси показано время, равное 0 для времени перед тем, как образец 20 входит в область 65 обнаружения флуоресценции и когда обнаружение сигнала флуоресценции запускается, а по вертикальной оси показана интенсивность выхода сигнала флуоресценции от драйвера 52 флуоресцентного детектора. Как показано на фиг. 4, то, когда образец 20 проходит через область 65 обнаружения флуоресценции, отношение между временем и сигналом флуоресценции, который обнаруживается, является таким, что сигнал флуоресценции увеличивается от нуля или базисной линии по мере того, как образец 20 входит в область 65 обнаружения флуоресценции, и сигнал флуоресценции снижается до нуля или базисной линии снова по мере того, как образец 20 покидает область 65 обнаружения флуоресценции.

Основываясь на графике, показанном на фиг. 4, получают время прохождения t_p образца 20 через область 65 обнаружения флуоресценции. Поскольку время прохождения t_p является разностью во времени, время задержки процессора не влияет на время прохождения. Например, 50 % разности между базисной линией и пиковым значением устанавливают как пороговое значение, время, соответствующее точке А на фиг. 4, которое соответствует самому раннему времени, устанавливают как время ввода (переднего конца участка) образца 20, а время, соответствующее точке B, которая соответствует самому позднему времени, устанавливают как время выхода (заднего конца участка) образца 20 из числа точек пересечения прямой линии, представляющей пороговое значение, которая параллельна горизонтальной оси и кривой сигнала флуоресценции, и разности между временем, соответствующим точке A, и временем, соответствующем точке B, устанавливают как время прохождения t_p образца 20. Специалисты в данной области техники могут произвольно и свободно устанавливать для порогового значения процент разности между пиковым значением флуоресцентного сигнала и базовой линией. Основываясь на объеме образца 20, введенного в канал, определяют длину L образца в канале. Основываясь на известной длине L образца 20 и времени прохождения t_p образца 20, центральный процессор 36 может вычислять скорость v движения образца 20, используя выражение v = L/t_p.

Время задержки t_c может быть получено экспериментально, временно устанавливая время t_d выдержки (сначала может быть равно 0 (секунд)), используя целевое положение остановки X₀ и скорость v движения образца, перемещая образец 20 возвратно-поступательным способом и получая затем разность между фактическим положением остановки X₁ и целевым положением остановки X₀ образца 20, с последующим проведением испытания по методу проб и ошибок для минимизации разности в максимально возможной степени.

Изобретатели настоящего изобретения вводили в показанный на фиг. 1 канал 12 для проведения реакции шириной 0,7 мм и глубиной 0,7 мм сосуда 10 раствор FITC (флуоресцин изотиоцианат: образец, излучающая флуоресценцию) заданной концентрации (например, 100 нМ (единица [нМ] является наномолярной концентрацией и равна наномоль/литр)), подобранный таким образом, чтобы длина образца в канале была равна 40 мм, и получили время t_c задержки, экспериментально основанное на заданном целевом положении остановки X₀ и скорости v движения (время прохождения t_p) образца 20. Что касается времени t_p прохождения образца 20, то выход насоса, служащего толкающей силой образца 20, с помощью заданной обратной связи был отрегулирован так, чтобы он оставался, по существу, постоянным (конкретно, 0,5 секунды). В результате, в сосуде 10 для проведения реакции и в процессоре 30 для проведения реакции, используемых в эксперименте, путем установки времени t_c задержки равным 0,175 секунды, разность между фактическим положением X₁ остановки и целевым положением X₀ остановки образца 20, как обнаружили, можно было минимизировать.

Далее, изобретатели использовали в качестве образца композицию реакционного раствора полимеразы ДНК SpeedSTAR HS (SpeedSTAR является зарегистрированной торговой маркой), производимого Takara Bio Inc., который является полимеразой ДНК, используемой в качестве реагента ПЦР. Эта полимераза ДНК SpeedSTAR HS сопровождалась соединениями, необходимыми для ПЦР, такими как смесь вышеупомянутых деоксирибонуклеозид трифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), буфера и т. д. и соединения были подготовлены согласно описаниям, содержащимся в руководстве, для использования в качестве образца. В результате было обнаружено, что когда движение образца управлялось, основываясь на представленном выше уравнении (1) в процессоре 30 для проведения реакции, разность между фактическим положением X₁ остановки и целевым положением X₀ остановки образца постепенно увеличивалась. Когда фактическое положение X₁ остановки и целевое положение X₀ остановки образца становится большим, существует вероятность, что управление температурой образца не сможет быть выполнено с высокой точностью.

Настоящие изобретатели приготовили две партии путем подготовки образцов, где вышеописанная полимераза ДНК SpeedSTAR HS была введена в композицию реакционного раствора, и провели эксперимент по управлению движением образца. Экспериментальные результаты на этих двух партиях показаны на фиг. 5 и 6 в качестве сравнительных примеров 1 и 2, соответственно.

На фиг. 5 и 6 на горизонтальной оси представлено количество n циклов (n - целое число, равное или больше 1) и на вертикальной оси представлено фактическое положение X₁(n) остановки, соответствующее количеству n циклов. В одном цикле образец движется из высокотемпературной области в низкотемпературную область и затем возвращается из низкотемпературной области в высокотемпературную область. На фиг. 5 и 6 сплошная линия указывает положение X^[L]₁(n), в котором образец остановился в низкотемпературной области, двигаясь из высокотемпературной области в низкотемпературную область (H → L), а пунктирная линия указывает положение X^[H]₁(n), в котором образец остановился в высокотемпературной области, двигаясь из низкотемпературной области в высокотемпературную область (L → H).

Фактические положения X^[L]₁(n) и X^[H]₁(n) остановки образца были получены путем фактического неоднократного возвратно-поступательного движения образца, увеличивая и наблюдая образец при заданном увеличении непосредственно сверху и измеряя линейкой расстояние от центра области 65 обнаружения флуоресценции к концу образца, ближнему к области 65 обнаружения флуоресценции.

Как можно видеть на фиг. 5 и 6, фактические положения X^[L]₁(n) и X^[H]₁(n) остановки образца имеют тенденцию уменьшаться по мере увеличения количества n циклов и тенденция особенно очевидна, в частности, для X^[L]₁(n) (то есть, образец имеет тенденцию приближения к области 65 обнаружения флуоресценции по мере увеличения количества n циклов). Поскольку такое явление не возникало, когда образец был основан только на растворе FITC, настоящие изобретатели в результате эксперимента с использованием метода проб и ошибок определили, что такое явление было вызвано присутствием поверхностно-активного вещества, содержащегося в полимеразе ДНК в заданном количестве. В каждую из полимераз ДНК, используемых в сравнительных примерах 1 и 2, показанных на фиг. 5 и 6, были добавлены Tween20 и Nonidet P-40 (Nonidet - зарегистрированная торговая марка), которые являются неионогенными поверхностно-активными веществами, каждое из которых в количестве 0,01 процента по весу.

В связи с эти был подготовлен образец, раствора FITC с концентрацией 100 нМ с добавлением Tween20, который является поверхностно-активным веществом, содержавшимся в вышеупомянутых полимеразах ДНК, так что концентрация Tween20 составляла 0,01 процента по весу, и эксперимент выполнялся для этогообразца. Фактические положения X^[L]₁(n) и X^[H]₁(n) остановки образца имели тенденцию уменьшения по мере возрастания количества n циклов и, в частности, тенденция была особенно заметна в положении X^[L]₁(n) остановки в низкотемпературной области, когда образец двигалась из высокотемпературной области в низкотемпературную область (H → L). Этот результат эксперимента показан на фиг. 7 в качестве сравнительного примера 3.

Изобретатели произвели улучшение способа управления движением образца, основанного на уравнении (1), с учетом ситуации, в которой происходит такое смещение образца в положении остановки (уменьшение расстояния остановки).

Далее будет дано объяснение в отношении способа управления движением в соответствии с настоящим вариантом осуществления. Здесь будет рассмотрен случай, в котором образец движется из высокотемпературной области в низкотемпературную область (H → L). Однако можно считать, что то же самое применяется в случае, когда образец движется из низкотемпературной области в высокотемпературную область (L → H).

Сначала приведенное выше уравнение (1) для получения времени выдержки переписывается в виде следующего уравнения (2), используя применяемые индексы.

t^H→L_d (n) = X ^[L] ₀ (n)/v^H→L_p (n) - t_c = X ^[L] ₀ (n) * t^H→L_p (n)/L - t_c (2)

На фиг. 8 представлена диаграмма, поясняющая термоциклирование. Как показано на фиг. 8, в одном цикле образец движется из высокотемпературной области в низкотемпературную область и останавливается и затем возвращается из низкотемпературной области в высокотемпературную область и останавливается. Центральный процессор 36 процессора 30 для проведения реакции выполнен таким образом, чтобы осуществлять управление возвратно-поступательным движением образца для множества циклов.

Подробное объяснение будет дано в отношении каждого элемента приведенного выше уравнения (2). В последующем объяснении n - целое число, равное или больше 1, и индекс H → L каждого символа представляет движение из высокотемпературной области в низкотемпературную область.

Элемент t^H→L_d (n) представляет время выдержки, когда образец движется из высокотемпературной области в низкотемпературную область в n-ом цикле, и является временем с момента, когда прохождение образца через область 65 обнаружения флуоресценции обнаруживается флуоресцентным детектором 50, до момента, когда центральный процессор 36 подаст системе 37 подачи текучей среды команду остановить образец.

Элемент X^[L]₀(n) является целевым положением остановки образца в низкотемпературной области в n-ом цикле и представляется расстоянием от центра области 65 обнаружения флуоресценции до конца образца (смотрите фиг. 3).

Элемент t^H→L_p(n) представляет время прохождения образца через область 65 обнаружения флуоресценции для движения из высокотемпературной области в низкотемпературную область в n-ом цикле (смотрите фиг. 4). Элемент V^H→L_p(n) представляет скорость движения образца через область 65 обнаружения флуоресценции для движения из высокотемпературной области в низкотемпературную область в n-ом цикле.

L представляет длину образца в канале. t_c - время задержки и является внутренней константой, основанной на технических характеристиках процессора 30 для проведения реакции, сосуда 10 для проведения реакции и т. п. Здесь принято время задержки t_c = 0,175 секунды, которое было получено экспериментально, как описано выше.

В процессоре 30 для проведения реакции при движении образца из высокотемпературной области в низкотемпературную область в n-ом цикле центральный процессор 36 подает системе 37 подачи текучей среды команду останавливать образец в то время, когда прошло время выдержки t^H→L_d(n), определенное согласно приведенному выше уравнению (2), с момента, когда прохождение образца через область 65 обнаружения флуоресценции обнаруживается флуоресцентным детектором 50.

Здесь, в процессоре 30 для проведения реакции, соответствующем настоящему варианту осуществления, целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки образца при движении из высокотемпературной области в низкотемпературную область в (n+1)-ом цикле, который является следующим циклом после n-ого цикла, корректируется для целевого положения X^[L]₀(n) остановки образца в n-ом цикле, основываясь на результате управления остановкой образца в n-ом цикле. Как показано на фиг. 5-7, существует тенденция, что когда в состав образца включается поверхностно-активное вещество, фактическое положение X^[L]₁(n) остановки образца изменяется (главным образом, приближается к области 65 обнаружения флуоресценции) по мере увеличения количества циклов. Поэтому, устанавливая целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки следующего (n+1)-ого цикл, основываясь на результате управления остановкой образца в n-ом цикле, можно останавливать образец в более точном положении. Следует заметить, что целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки в (n+1)-ом цикле может иметь не только значение, отличающееся от значения целевого положения X^[L]₀(n) остановки в n-ом цикле, но также значением, которое является тем же самым, что и значение целевого положения X^[L]₀(n) остановки в n-ом цикле, как результат коррекции.

Более конкретно, целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки образца в (n+1)-ом цикле корректируется относительно целевого положения X^[L]₀(n) остановки в n-ом цикле, основываясь на разности ∆X^[L](n) между фактическим положением X^[L]₁(n) остановки образца в n-ом цикле и расчетным целевым положением X^[L]₀₀ остановки. Расчетное целевое положение X^[L]₀₀ остановки является положением, в котором образец должна присутствовать в низкотемпературной области согласно расчету. Расчетное целевое положение остановки X^[L]₀₀ является значением, определяемым, основываясь на расчетах и конфигурациях процессора 30 для проведения реакции и сосуда 10 для проведения реакции. Само собой разумеется, что чем ближе к расчетному целевому положению X^[L]₀₀ остановки находится фактическое положение X^[L]₁(n) остановки образца, тем более правильным является фактическое положение X^[L]₁(n) остановки.

Целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки образца в (n+1)-ом цикле может быть установлено добавлением поправочного члена k^[L](n) к целевому положению X^[L]₀ (n) остановки образца в n-ом цикле, как показано в следующем уравнении (3). Начальное значение поправочного члена k^[L](n) может равняться 0.

X^[L]₀(n+1) = X^[L]₀(n) + k^[L](n) (3)

Поправочный член k^[L](n) может быть определен на основе разности ∆X^[L](n) между фактическим положением X^[L]₁(n) остановки образца в n-ом цикле и расчетным целевым положением X^[L]₀₀ остановки. Например, заранее может быть подготовлена таблица, в которой соотношение между разностью ∆X^[L](n) в n-ом цикле и поправочным членом k^[L](n) имеет вид, показанный в нижеследующей таблице 1, и поправочный член k ^[L] (n) может быть определен со ссылкой на таблицу.

Таблица 1

∆X^[L](n)
[единица: мм] k^[L](n)
[единица: мм] -99 ≤ ∆X^[L](n) < -10 +10 -10 ≤ ∆X^[L](n) < -5 +5 -5 ≤ ∆X^[L](n) ≤ 5 0 5 < ∆X^[L](n) ≤ 10 -5 10 < ∆X^[L](n) ≤ 99 -10

Приведенная выше таблица 1 определяет следующее: В последующем описании выражение "дальше, чем определенное положение X" означает "дальше от положения X, если смотреть со стороны области 65 обнаружения флуоресценции" и означает, что значение X, представляющее положение, становится больше, а выражение "ближе, чем определенное положение X" означает "ближе чем положение X, если смотреть со стороны области 65 обнаружения" и означает, что значение X, представляющее положение, становится меньше.

- Когда фактическое положение X^[L]₁(n) остановки в n-ом цикле ближе, чем расчетное целевое положение X^[L]₀₀ остановки, целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки в (n+1)-ом цикле устанавливается дальше, чем целевое положение X^[L]₀(n) остановки в n-ом цикле.

- Когда фактическое положение X^[L]₁(n) остановки в n-ом цикле является почти тем же самым, что и расчетное целевое положение X^[L]₀₀ остановки, целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки в (n+1)-ом цикле устанавливается тем же самым, что и целевое положение X^[L]₀(n) остановки в n-ом цикле.

- Когда фактическое положение X^[L]₁(n) остановки в n-ом цикле находится дальше, чем расчетное целевое положение X^[L]₀₀ остановки, целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки в (n+1)-ом цикле устанавливается ближе, чем целевое положение X^[L]₀(n) остановки в n-ом цикле.

Например, когда разность ∆X^[L](n) в n-ом цикле составляет -7 мм, поправочный член k^[L](n), основываясь на таблице, определяется равным +5 мм. В этом случае, целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки образца в (n+1)-ом цикле устанавливается как значение, полученное сложением +5 мм с целевым положением X^[L]₀(n) остановки образца в n-ом цикле. Например, когда разность ∆X^[L](n) в n-ом цикле составляет -2 мм, поправочный член k^[L](n), основываясь на таблице, определяется равным 0 мм. В этом случае, целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки образца в (n+1)-ом цикле устанавливается как то же самое значение, что и значение целевого положения X^[L]₀ (n) остановки образца в n-ом цикле.

В представленном выше описании, добавляя поправочный член k^[L](n) к целевому положению X^[L]₀(n) остановки образца в n-ом цикле, получают целевое положение X^[L]₀(n+1) остановки образца в (n+1)-ом цикле. Однако, способ установки целевого положения X^[L]₀(n+1) остановки образца в (n+1)-ом цикле не ограничивается этим способом. В дополнение к известному способу управления, такому как ПИД-управление (PID), могут учитываться или объединяться поправочные члены, отличные от используемых при добавлении, и поправочные коэффициенты.

В представленном выше описании фактическое положение X^[L]₁(n) остановки образца используется для определения поправочного члена k^[L](n). Однако, при реальном использовании процессора 30 для проведения реакции получение фактического положения X^[L]₁(n) остановки образца является проблемой. Причина в том, что датчики обнаружения положения находятся не в каждой температурной области процессоре 30 для проведения реакции. Поэтому ниже будет описан способ оценки фактического положения остановки образца в каждой температурной области.

Фактическое положение X^[L]₁(n) остановки образца в низкотемпературной области в n-ом цикле может быть оценено следующим уравнением (4). Если предполагаемое положение остановки образца записывается как X^[L]₁₁(n), то устанавливается следующее уравнение.

X^[L]₁₁(n) = L/t^L→H_p (n) * {t^L→H_mp (n) - t_c} (4)

В уравнении (4), t^L→H_p (n) - время прохождения образца через область 65 обнаружения флуоресценции при движении из низкотемпературной области в высокотемпературную область в n-ом цикле. Дополнительно, t^L→H_mp (n) - время, требующееся с момента, когда запускается система 37 подачи текучей среды, чтобы перемещать образец, до того момента, когда центральный процессор 36 распознает, что передняя часть образца достигла области 65 обнаружения флуоресценции при движении из низкотемпературной области в высокотемпературную область в n-ом цикле.

На фиг. 9-11 показаны результаты проверки правильности приведенного выше уравнения (4). На фиг. 9-11 на горизонтальной оси представлено количество n циклов, а на вертикальной оси представлено фактическое положение X^[L]₁(n) остановки (измеренное значение) образца и предполагаемое положение X^[L]₁₁(n) остановки (расчетное значение) образца в низкотемпературной области при движении из высокотемпературной области в низкотемпературную область. На фиг. 9-11 сплошная линия показывает измеренное значение X^[L]₁(n), а маркер ○ показывает расчетное значение X^[L]₁₁(n), оцененное, основываясь на уравнении (4). На фиг. 9 показан экспериментальный результат для образца, используемой в эксперименте, показанном на представленном выше фиг. 5. На фиг. 10 показан экспериментальный результат для образца, используемой в эксперименте, показанном на представленном выше фиг. 6. На фиг. 11 показан экспериментальный результат для образца, используемой в эксперименте, показанном на представленном выше фиг. 7.

Из фиг. 9-11 можно определить, что измеренное значение X^[L]₁(n) и расчетное значение X^[L]₁₁(n) почти равны (абсолютное значение разности между ними составляет самое большее 3 мм). Таким образом, оценка положения остановки, основываясь на уравнении (4), представляется почти точной и можно видеть, что X^[L]₁(n) и X^[L]₁₁(n), могут считаться приблизительно равными друг другу.

Как объяснялось выше, процессор для проведения реакции, соответствующий настоящему варианту осуществления, выполняет управление движением, которое является таким, которое называют типом управления с обратной связью, для образца после получения целевого положения X^[L]₀(n+1) остановки образца при движении из высокотемпературной области в низкотемпературную область в (n+1)-ом цикле, основываясь на времени прохождения t^H→L_p (n) образца через область 65 обнаружения флуоресценции, (предполагаемом) положении X^[L]₁₁(n) остановки образца и целевом положении X^[L]₀(n) остановки образца при движении из высокотемпературной области в низкотемпературную область в n-ом цикле. Движение образца из высокотемпературной области в низкотемпературную область, в основном, было объяснено выше. Однако, то же самое может быть применимо к движению образца из низкотемпературной области в высокотемпературную область, используя, соответственно, замену переменных индексов [L], H → L и L → H в уравнениях (2)-(4) на [H], L → H и H → L.

На фиг. 12 показана блок-схема последовательности выполнения операций способа управления движением образца в процессоре для проведения реакции в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. По этой блок-схеме последовательности выполнения операций будет объяснен способ управления, связанный с движением образца из высокотемпературной области в низкотемпературную область. Однако, то же самое также применимо к движению образца из низкотемпературной области в высокотемпературную область.

Сначала, согласно проекту, центральный процессор 36 устанавливает расчетное целевое положение X^[L]₀₀ остановки которое является положением, в котором образец должна присутствовать в низкотемпературной области (S10). X^[L]₀₀ представляется расстоянием от центра области 65 обнаружения флуоресценции и устанавливается равным, например, X^[L]₀₀ = 30 мм.

Затем центральный процессор 36 устанавливает значение n равным 1 и устанавливает целевое положение X^[L]₀(1) установки в первом цикле равным расчетному значению целевого положения X^[L]₀₀ остановки (S12).

Центральный процессор 36 в системе 37 подачи текучей среды управляет первым насосом 39, чтобы начать движение образца из высокотемпературной области в низкотемпературную область (S14). Образец проходит область 65 обнаружения флуоресценции и центральный процессор 36 измеряет интенсивность сигнала флуоресценции, чтобы получить t^H→L_p(1), основываясь на пороговом значении, и вычисляет и определяет время t^H→L_d(1) выдержки в первом цикле, основываясь на представленном выше уравнении (2) (S16). Что касается порогового значения для измерения t^H→L_p(1), то оценка может выполняться, основываясь на опыте в качестве начального значения, когда n = 1 (первый цикл), и значение может быть определено, основываясь на оценке. В случае n = 2 (второй цикл), t^H→L_p(2) может быть получено, основываясь на интенсивности сигнала флуоресценции, измеренной во время движения из высокотемпературной области в низкотемпературную область, когда n = 1, и на пороговом значении. Как описано выше, пороговое значение может составлять 50 % разности интенсивностей между интенсивностью на базисной линии и пиковой интенсивностью из числа изменений интенсивности сигнала флуоресценции. Что касается порогового значения, основанного на интенсивности сигнала флуоресценции, измеренной во время движения из высокотемпературной области в низкотемпературную область, когда n = n’ (n-ый цикл (n’ - целое число, равное 2 или больше)), то могут быть получены пороговое значение для движения из высокотемпературной области в низкотемпературную область для n = n’ + 1 ((n’ +1)-ый цикл) и пороговое значение для движения из низкотемпературной области в высокотемпературную область для n = n’ + 1 ((n’ +1)-ый цикл). Дополнительно, основываясь на интенсивности сигнала флуоресценции, измеренной во время движения из низкотемпературной области в высокотемпературную область, когда n = n’ (n’-ый цикл), могут быть получены пороговое значение для движения из высокотемпературной области в низкотемпературную область для n = n’ + 1 ((n’ +1)-ый цикл) и пороговое значение для движения из низкотемпературной области в высокотемпературную область для n = n’ + 1 ((n’ +1)-ый цикл).

В начале термоциклирования ПЦР, когда используется образец для испытания, изготовленный из фактической ДНК и т. п., ДНК и т. д. образца для испытания в недостаточной степени амплифицируется. Однако, даже в начале термоциклирования флуоресценция излучается образцом, содержащим флуоресцентную пробу, и это легко различить между базовой линией и пиком и получить пороговое значение, основываясь на изменении интенсивности флуоресцентного сигнала, которая измеряется. Таким образом, нет проблемы с измерением t^H→L_p(n) и вычислением t^H→L_d (n) (где n - целое число, равное или больше 2).

После этого центральный процессор 36 останавливает образец в низкотемпературной области в соответствии со временем t^H→L_d(1) выдержки, определенным на этапе S16 (S18). Другими словами, центральный процессор 36 подает команду системе 37 подачи текучей среды остановить образец в тот момент, когда прошло время t^H→L_d(1) выдержки, причем время прохождения образца через область 65 обнаружения флуоресценции обнаруживается флуоресцентным детектором 50.

После нагревания в течение заданного периода времени в остановленном состоянии в низкотемпературной области, образец движется из низкотемпературной области в высокотемпературную область (S20). Здесь выполняется такое же управление, которое имело место при движении из высокотемпературной области в низкотемпературную область.

Во время движения из низкотемпературной области в высокотемпературную область образец проходит через область 65 обнаружения флуоресценции. После того, как образец проходит через область 65 обнаружения флуоресценции, центральный процессор 36 получает t^L→H_p(1) и t^L→H_mp(1), получает предполагаемое положение X^[L]₁₁(1) остановки образца в низкотемпературной области в первом цикле, основываясь на представленном выше уравнении (4), и делает оценку, что фактическое положение X^[L]₁(1) остановки равно X^[L]₁₁(1) (S22).

Затем центральный процессор 36 получает разность ∆X^[L](1) между положением X^[L]₁(1) остановки образца в первом цикле и расчетным целевым положением X^[L]₀₀ остановки и определяет поправочный член k^[L](1), обращаясь к таблице, описывающей соотношение между разностью ∆X^[L](n) и поправочным членом k^[L](n), как показано в таблице 1 (S24).

В дальнейшем, центральный процессор 36 определяет целевое положение X^[L] ₀(2) остановки во втором цикле, основываясь на представленном выше уравнении (3) (S26).

После этого центральный процессор 36 определяет, достигло ли значение n заданного количества циклов (S28). Заданное количество циклов может быть определено заранее оператором и это количество составляет 30-60 циклов.

Когда значение n не достигло заданного количества циклов ("нет" на этапе S28), значение n увеличивается на 1, так что n = 2 (S30). После этого этап возвращается к S14, и время t^H→L_d (2) во втором цикле определяется на этапе S16, основываясь на представленном выше уравнении (2). Этапы S14-S26 выполняются, пока значение n не достигнет заданного количества цикла. Когда значение n достигает заданного количества циклов ("да" на этапе S28), управление прекращается.

Выше приведены подробности способа управления, когда образец 20 движется из высокотемпературной области в низкотемпературную область и останавливается в заданном положении в низкотемпературной области. Как описано выше, то же самое может быть применено к движению образца из низкотемпературной области в высокотемпературную область, до тех пор, пока используется замена изменяемых параметров в каждом процессе, переменных в каждом уравнении и индексов с [L], H → L и L → H на [H], L → H и H → L, соответственно.

Был проведен эксперимент по тому, как предполагаемое положение остановки и фактическое положение остановки образца изменяются с изменением количества циклов, используя способ управления движением образца в соответствии с настоящим вариантом осуществления. Как в случае сравнительного примера 1, так и в случае сравнительного примера 2, использовалась образец, полученная с использованием полимеразы ДНК SpeedSTAR HS.

На фиг. 13 показаны предполагаемое положение остановки и фактическое положение остановки в низкотемпературной области, когда образец движется из высокотемпературной области в низкотемпературную область. Горизонтальная ось представляет количество циклов, маркер ○ показывает фактическое положение X^[L]₁(n) остановки, измеренное для каждых пяти циклов, и сплошная линия представляет предполагаемое положение X^[L]₁₁(n) остановки. Как показано на фиг. 13, между предполагаемым положением остановки и фактическим положением остановки было получено хорошее соответствие, и даже когда количество цикла достигло 50, способ управления, соответствующий настоящему варианту осуществления, был успешен, так что X^[L]₁(n) в низкотемпературной области попадало в диапазон 26-30 мм и X^[H]₁(n) образца в высокотемпературной области также попадало в диапазон 29,5-33,5 мм (не показан). Таким образом, можно принять решение, что образец был точно остановлен в заданном положении по сравнению со сравнительными примерами 1-3, показанными на фиг. 5-7.

С другой стороны, путь образцы 20 в одном цикле в процессоре 30 для проведения реакции (двухэтапная система), имеющем области реакции, состоящие из температурных областей двух уровней, объясненных здесь, является следующим:

(a) высокотемпературная область (H) → (b) область обнаружения флуоресценции (флуоресцентный детектор) → (c) низкотемпературная область (L) → (d) область обнаружения флуоресценции (флуоресцентный детектор) → (a) высокотемпературная область (H) → … и так далее.

Заметим, что области обнаружения флуоресценции (флуоресцентные детекторы) по пп. (b) и (d) являются одинаковыми.

Что касается базиса каждого элемента такого пути и вышеупомянутых параметров, время выдержки для остановки в заданном положении в высокотемпературной области (H) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от вышеупомянутого флуоресцентного детектора по п. (d) непосредственно перед тем, как образец достигнет высокотемпературной области (H), и предполагаемое положение остановки в высокотемпературной области (H) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от вышеупомянутого флуоресцентного детектора по п. (b), сразу после того, как образец покинет высокотемпературную область (H).

Время выдержки для остановки в заданном положении в низкотемпературной области (L) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от вышеупомянутого флуоресцентного детектора по п. (b) непосредственно перед тем, как образец достигнет низкотемпературной области (L), и предполагаемое положение остановки в низкотемпературной области (L) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от вышеупомянутого флуоресцентного детектора по п. (d) сразу после того, как образец покинет низкотемпературную область (L).

То есть время выдержки для остановки в заданном положении в высокотемпературной области или в низкотемпературной области вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от флуоресцентного детектора, соответствующего области обнаружения флуоресценции, через которую образец проходит непосредственно перед тем, как достигнуть области.

Дополнительно, предполагаемое положение остановки в высокотемпературной области или в низкотемпературной области вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от флуоресцентного детектора, соответствующего области обнаружения флуоресценции, через которую образец проходит после того, как покинет область. Основываясь на этом соображении, уравнение (4) для получения предполагаемого положения X^[L]₁₁(n) остановки образца в низкотемпературной области может быть переписано как следующее уравнение (5).

X ^[L] ₁₁ (n) = L/t^L→nt_p (n) * {t^L→nt_mp (n) - t_c} (5)

В уравнении (5) t^L→nt_p (n) - время прохождения через область обнаружения флуоресценции (область 65 обнаружения флуоресценции в случае настоящего варианта осуществления), через которую образец проходит сразу после того, как покидает низкотемпературную область при движении из низкотемпературной области в следующую температурную область (высокотемпературную область, в случае настоящего варианта осуществления). t^L→nt_mp(n) является временем, требующимся с того момента, когда начинает работать система 37 подачи текучей среды, чтобы передвигать образец, до того момента, когда центральный процессор 36 распознает, что передняя часть образца достигла области обнаружения флуоресценции (области 65 обнаружения флуоресценции), через которую образец проходит непосредственно после этого для движения из низкотемпературной области в последующую температурную область (высокотемпературную область). Что касается предполагаемого положения остановки образца в высокотемпературной области, необходимо в уравнении (5) использовать замену переменных индексов с [L] и L→nt на [H] и H→nt, соответственно. Уравнение (5) может быть применено не только к процессору 30 для проведения реакции, имеющему температурные области двух уровней, описанные выше, но также и к сосуду 110 для проведения реакции, имеющему температурные области трех уровней, описанные позже.

На фиг. 14 представлено объяснение другого варианта осуществления сосуда для проведения реакции. Сосуд 10 для проведения реакции, показанный на фиг. 1A, подвергает образец термоциклированию, непрерывно осуществляя возвратно-поступательное движение образца между температурными областями двух уровней: высокотемпературная область, например, приблизительно 95 °C; и низкотемпературная область, например, приблизительно 55 °C. Сосуд 110 для проведения реакции, показанный на фиг. 14, подвергает образец термоциклированию, непрерывно совершая возвратно-поступательное движение образца между температурными областями трех уровней: высокотемпературная область, например, приблизительно 95 °C; среднетемпературная область, например, приблизительно 65°C; и низкотемпературная область, например, приблизительно 55°C. В этом случае, можно выполнять денатурацию ДНК в высокотемпературной области, ренатурацию в низкотемпературной области и удлинение в среднетемпературной области.

Канал 12 сосуда 110 для проведения реакции, показанный на фиг. 14, имеет среднетемпературную область между высокотемпературной областью и низкотемпературной областью. Таким же образом, как в высокотемпературной области и в низкотемпературной области, этот канал в среднетемпературной области формируется в виде канала извилистой формы с протяженными поворотами, сделанными, сочетая изогнутые участки и прямые участки. Канал 12 сосуда 110 для проведения реакции имеет первую область соединения, расположенную между высокотемпературной областью и среднетемпературной областью, и вторую область соединения, расположенную между среднетемпературной областью и низкотемпературной областью. Первая область соединения и вторая область соединения содержат линейные каналы. В первой области соединения и во второй области соединения, соответственно, образуются первая область 165 обнаружения флуоресценции и вторая область 166 обнаружения флуоресценции.

На фиг. 15 представлено объяснение другого варианта осуществления процессора для проведения реакции. Процессор 130 для проведения реакции, показанный на фиг. 15, является устройством для выполнения термоциклирования в сосуде 110 для проведения реакции, имеющем температурные области трех уровней, как показано на фиг. 14.

В дополнение к высокотемпературному нагревателю 60, низкотемпературному нагревателю 62, драйверу 33 высокотемпературного нагревателя и драйверу 35 низкотемпературного нагревателя, система 32 управления температурой процессора 130 для проведения реакции дополнительно содержит среднетемпературный нагреватель 61 для нагревания среднетемпературной области канала 12 и драйвер 34 среднетемпературного нагревателя для управления температурой среднетемпературного нагревателя 61.

Первый флуоресцентный детектор 251 процессора 130 для проведения реакции содержит: первую оптическую головку 151 для обнаружения флуоресценции образцы 20, проходящей через первую область 165 обнаружения флуоресценции канала сосуда 110 для проведения реакции; драйвер 152 первого флуоресцентного детектора; первое оптическое волокно 153, соединяющее первую оптическую головку 151 и драйвер 152 первого флуоресцентного детектора, и второй флуоресцентный детектор 252 содержит: вторую оптическую головку 154 для обнаружения флуоресценции образцы 20, проходящей через вторую область 166 обнаружения флуоресценции канала сосуда 110 для проведения реакции; драйвер 155 второго флуоресцентного детектора; второе оптическое волокно 156, соединяющее вторую оптическую головку 154 и драйвер 155 второго флуоресцентного детектора.

Для образца 20 в процессоре 130 для проведения реакции термоциклирование применяется в виде: высокотемпературная область → низкотемпературная область → среднетемпературная область → высокотемпературная область, как один цикл. Следует заметить, что в процессе высокотемпературная область → низкотемпературная область в процессоре 130 для проведения реакции образец проходит через среднетемпературную область в середине без остановки на какое-либо заданное время.

Ниже будет объяснена обработка образцы процессором 130 для проведения реакции.

Расчетные целевые положения X^[H]₀₀, X^[М.]₀₀ и X^[L]₀₀ остановки в высокотемпературной области, среднетемпературной области и низкотемпературной области задаются заранее. Они выражаются как начальные значения X^[H]₀(1), X^[М.]₀(1) и X^[L]₀(1). Дополнительно, таким же образом как в описанной выше двухэтапной системе, заранее определяются соответствующие пороговые значения, требующиеся для вычисления времени выдержки t^H→L_d(1), t^L→M_d(1) и t^M→H_d(1) для соответствующих температурных областей. Следует заметить, что индекс М указывает среднетемпературную область.

В системе 37 подачи текучей среды первый насос 39 работает таким образом, чтобы двигать образец 20 из высокотемпературной области (H) в низкотемпературную область (L). В двух областях обнаружения флуоресценции, расположенных между этими областями, когда образец 20 проходит через вторую область 166 обнаружения флуоресценции на стороне, ближней к низкотемпературной области, измерение времени прохождения t^H→L_2p(n) и вычисление времени выдержки t^H→L_2d(n), основанные на представленном выше уравнении (2), выполняются, основываясь на сигнале флуоресценции от второго флуоресцентного детектора 252 (индексы 1 и 2 символа t, указывающего время, означают, что соответствующие времена выдержки получаются, основываясь на прохождении через первую область 165 обнаружения флуоресценции и на прохождении через вторую область 166 обнаружения флуоресценции, соответственно, и то же самое применяется здесь далее). После кого, как прошло время выдержки t^H→L_2d(n), в течение которого образец 20 проходит через вторую область 166 обнаружения флуоресценции, подается команда остановки первого насоса 39 и образец 20 останавливается в низкотемпературной области.

Дополнительно, в двух областях обнаружения флуоресценции, когда образец проходит через первую область 165 обнаружения флуоресценции, на стороне, ближней к высокотемпературной области, выполняют измерение t^H→L_1p(n) и вычисление t^H→L_1mp(n), основываясь на сигнале флуоресценции от первого флуоресцентного детектора 251, и предполагаемое положение X^[H]₁₁(n) остановки образца в высокотемпературной области получают, основываясь на представленном выше уравнении (4), которое оценивается как фактическое положение X^[H]₁(n) остановки. Когда имеются две или более областей обнаружения флуоресценции между областями перемещения, вычисление времени выдержки для остановки образца выполняют, основываясь на сигнале флуоресценции от флуоресцентного детектора, связанного с областью обнаружения флуоресценции, ближней к области прибытия образца, и положение остановки в области выхода образцы оценивается, основываясь на сигнале флуоресценции от флуоресцентного детектора, связанного с областью обнаружения флуоресценции, ближайшей к области выхода образца.

После того, как образец 20 остановилась на заданный период времени в низкотемпературной области, в системе 37 подачи текучей среды второй насос 40 действует так, чтобы передвигать образец 20 из низкотемпературной области (L) к среднетемпературной области (M). Когда образец проходит через вторую область 166 обнаружения флуоресценции, расположенную между этими областями, измерение времени прохождения t^L→M_2p (n) и вычисление времени выдержки t^L→M_2d(n), основываясь на представленном выше уравнении (2), выполняют, основываясь на сигнале флуоресценции от второго флуоресцентного детектора 252. После того, как прошло время выдержки t^L→M_2d(n), в течение которого образец 20 проходит через вторую область 166 обнаружения флуоресценции, подается команда на остановку второго насоса 40 и образец 20 останавливается в среднетемпературной области. Дополнительно, основываясь на сигнале флуоресценции, выполняют измерение t^L→M_2p (n) и вычисление t^L→M_2mp (n) и предполагаемое положение остановки X^[L]₁₁(n) образца 20 в низкотемпературной области получают, основываясь на представленном выше уравнении (4), так чтобы оно расценивалось как фактическое положение остановки X^[L]₁(n).

После того, как образец 20 останавливается на заданный период времени в среднетемпературной области, в системе 37 подачи текучей среды второй насос 40 действует так, чтобы передвинуть образец 20 из среднетемпературной области (M) в высокотемпературную область (H). Когда образец проходит через первую область 165 обнаружения флуоресценции, расположенную между этими областями, выполняют измерение времени прохождения t^M→H_1p(n) и вычисление времени выдержки t^M→H_1d(n), основываясь на представленном выше уравнении (2), основываясь на сигнале флуоресценции от первого флуоресцентного детектора 251. После того, как прошло время выдержки t^M→H_1d(n), в течение которого образец 20 проходит через первую область 165 обнаружения флуоресценции, подают команду остановки второго насоса 40 и образец 20 останавливается в высокотемпературной области. Дополнительно выполняют измерение t^M→H_1p(n) и вычисление t^M→H_1mp(n), основываясь на сигнале флуоресценции, и предполагаемое положение остановки X^[М]₁₁(n) образцы в среднетемпературной области получают, основываясь на представленном выше уравнении (4), так чтобы оно расценивалось как фактическое положение остановки X^[М]₁(n).

С другой стороны, путь в одном цикле образцы 20 в процессоре 130 для проведения реакции (трехступенчатая система), имеющем область реакции, состоящую из температурных областей трех уровней, как объяснено здесь, является следующим:

(a) высокотемпературная область (H) → (b) первая область обнаружения флуоресценции (первый флуоресцентный детектор) → (c) вторая область обнаружения флуоресценции (второй флуоресцентный детектор) → (d) низкотемпературная область (L) → (e) вторая область обнаружения флуоресценции (второй флуоресцентный детектор) → (f) среднетемпературная область (M) → (g) первая область обнаружения флуоресценции (первый флуоресцентный детектор) → (a) высокотемпературная область (H) → … и так далее.

Хотя между пп. (b) и (c) существует среднетемпературная область (M), эта область не включается в путь, так как образец просто проходит через эту область без остановки.

Что касается базиса каждого элемента такого пути и вышеупомянутых параметров, то время выдержки при остановке в заданной позиции в высокотемпературной области (H) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от вышеупомянутого первого флуоресцентного детектора по п. (g) непосредственно перед тем, как образец достигнет высокотемпературной области (H). Дополнительно, предполагаемое положение остановки в высокотемпературной области (H) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от первого флуоресцентного детектора по п. (b) сразу после того, как образец покидает высокотемпературную область (H).

Таким же образом, время выдержки при остановке в заданном положении в среднетемпературной области (M) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от вышеупомянутого второго флуоресцентного детектора по п. (e) непосредственно перед тем, как образец достигнет среднетемпературной области (M). Дополнительно, предполагаемое положение остановки в среднетемпературной области (M) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от первого флуоресцентного детектора по п. (g) сразу после того, как образец покидает среднетемпературную область (M).

Дополнительно, время выдержки для остановки в заданном положении в низкотемпературной области (L) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от вышеупомянутого второго флуоресцентного детектора в п. (c) непосредственно перед тем, как образец достигнет низкотемпературной области (L). Дополнительно, предполагаемое положение остановки в низкотемпературной области (L) вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от второго флуоресцентного детектора по п. (e), сразу после того, как образец покинет низкотемпературная область (L).

Исходя из сказанного выше, время выдержки для остановки в заданном положении в высокотемпературной области, среднетемпературной области или низкотемпературной области вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от флуоресцентного детектора, соответствующего области обнаружения флуоресценции, через которую образец проходит непосредственно перед тем, как достигнуть области.

Дополнительно, предполагаемое положение остановки в каждой области вычисляется, основываясь на сигнале флуоресценции от флуоресцентного детектора, соответствующего области обнаружения флуоресценции, через которую образец проходит сразу после выхода из области. Поэтому, приведенное выше уравнение (5) также применимо к сосуду 110 для проведения реакции, имеющему температурные области трех уровней. Поэтому, в отношении предполагаемого положения остановки образцы в высокотемпературной области, в уравнении (5), соответственно, необходимо использовать замену переменных индексов [L] и L→nt на [H] и H→nt. Дополнительно, в отношении предполагаемого положения остановки образцы в среднетемпературной области, в уравнении (5), соответственно, необходимо использовать замену переменных индексов [L] и L→nt на [М] и М→nt.

Как описано выше, даже в случае процессора 130 для проведения реакции (трехэтапная система), имеющего область реакции, состоящую из температурных областей трех уровней, сигнал флуоресценции от флуоресцентного детектора, установленного непосредственно перед или сразу после соответствующей температурной области, и положение образца должны учитываться. Это то же самое, что и в случае процессора 30 для проведения реакции, имеющего области реакции, состоящие из температурных областей двух уровней, описанные выше.

Выше представлено объяснение настоящего изобретения, основанное на вариантах осуществления. Эти варианты осуществления предназначены служить только иллюстрацией и специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что могут быть разработаны различные модификации составляющих элементов и процессов и что такие модификации также находятся в пределах объема охраны настоящего изобретения.

Описание ссылочных позиций

10, 110 Сосуд для проведения реакции

12 Канал

14 Подложка

16 Пленка, герметизирующая канал

17 Первый порт связи

18 Второй порт связи

20 Образец

30, 130 Процессор для проведения реакции

32 Система управления температурой

33 Драйвер высокотемпературного нагревателя

34 Драйвер среднетемпературного нагревателя

35 Драйвер низкотемпературного нагревателя

36 Центральный процессор

37 Система подачи текучей среды

39 Первый насос

40 Второй насос

41 Драйвер первого насоса

42 Драйвер второго насоса

43 Первая трубка

44 Вторая трубка

45, 46 Упаковочный материал

50 Флуоресцентный детектор

51 Оптическая головка

52 Драйвер флуоресцентного детектора

53 Оптическое волокно

60 Высокотемпературный нагреватель

61 Среднетемпературный нагреватель

62 Низкотемпературный нагреватель

65 Область обнаружения флуоресценции

151 Первая оптическая головка

152 Вторая оптическая головка

153 Первое оптическое волокно

154 Вторая оптическая головка

155 Драйвер второго флуоресцентного детектора

156 Второе оптическое волокно

165 Первая область обнаружения флуоресценции

166 Вторая область обнаружения флуоресценции

251 Первый флуоресцентный детектор

252 Второй флуоресцентный детектор

Промышленная применяемость

Настоящее изобретение применимо к полимеразной цепной реакции (polymerase chain reaction, ПЦР).

Изобретение относится к процессорам для проведения реакций типа полимеразной цепной реакции. Заявлен процессор 30 для проведения реакции, снабженный сосудом 10 для проведения реакции, в котором сформирован канал 12, система 37 подачи текучей среды, система 32 управления температурой для обеспечения в канале 12 высокотемпературной области и низкотемпературной области и флуоресцентный детектор 50 для обнаружения образца 20, проходящего через область обнаружения флуоресценции в канале 12, и центральный процессор 36 для управления системой 37 подачи текучей среды, основываясь на обнаруженном сигнале. Целевое положение X[L0(n+1) остановки образца в низкотемпературной области в (n+1)-м цикле корректируется относительно целевого положения X[L]0(n) остановки образца в низкотемпературной области в n-м цикле, основываясь на результате управления остановкой образца 20 в n-м цикле. Технический результат - обеспечение технологии, способной точно останавливать образец в заданном месте в температурной области в процессоре для проведения реакции, способном подвергнуть образец термоциклированию, перемещая образец возвратно-поступательным способом в канале, в котором образованы области с различными температурами. 6 з.п. ф-лы, 15 ил., 1 табл.

1. Процессор для проведения реакции, содержащий:

сосуд для проведения реакции, в котором сформован канал, в котором движется образец;

систему подачи текучей среды, движущую и останавливающую образец в канале;

систему управления температурой, обеспечивающую множество температурных областей, каждая из которых поддерживается при разной температуре, причем множество температурных областей содержит по меньшей мере первую температурную область и вторую температурную область;

систему обнаружения, обнаруживающую образец, проходящий через область обнаружения, которая устанавливается между прилежащими температурными областями канала, причем область обнаружения содержит по меньшей мере первую область обнаружения, которая устанавливается между первой температурной областью и второй температурной областью канала; и

блок управления, управляющий системой подачи текучей среды, основываясь на сигнале, обнаруженном системой обнаружения,

в котором блок управления выполнен с возможностью управления возвратно-поступательным движением образца для множества циклов, где в одном цикле образец останавливается на установленное время в первой температурной области, перемещается из первой температурной области во вторую температурную область после прохождения через первую область обнаружения, затем останавливается на установленное время, затем возвращается к первой температурной области и после этого останавливается,

в котором, при условии, что:

время выдержки, требующееся до того времени, когда блок управления подаст системе подачи текучей среды команду остановить образец после времени, когда прохождение образца через первую область обнаружения обнаруживается системой обнаружения при движении из первой температурной области во вторую температурную область в n-м цикле (где n - целое число, равное или больше 1), обозначается как t^1→2_d (n);

целевое положение остановки образца во второй температурной области в n-м цикле обозначается как X ^[2] ₀ (n);

время прохождения образца через область обнаружения при движении из первой температурной области во вторую температурную область в n-м цикле обозначается как t^1→2_p (n);

длина образца в канале обозначается как L; и

установленный период времени, определенный для процессора для проведения реакции, обозначается как t_c,

время выдержки t^1→2_d (n) определяется следующим уравнением:

t^1→2_d (n) = X^[2]₀(n) * t^1→2_p(n)/L - t_c, и

целевое положение остановки X^[2]₀(n+1) образца во второй температурной области в (n+1)-м цикле корректируется относительно целевого положения X^[2]₀(n) остановки образца во второй температурной области в n-м цикле, основываясь на результате управления остановкой образца в n-м цикле.

2. Процессор для проведения реакции по п. 1, в котором целевое положение X^[2]₀(n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-м цикле корректируется относительно целевого положения X^[2]₀(n) остановки образца во второй температурной области в n-м цикле, основываясь на положении X^[2]₁(n) остановки образца во второй температурной области в n-м цикле и расчетном целевом положении X^[2]₀₀ остановки во второй температурной области.

3. Процессор для проведения реакции по п. 1 или 2, в котором целевое положение X^[2]₀(n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-м цикле корректируется относительно целевого положения X^[2]₀(n) остановки образца в второй температурной области в n-м цикле, основываясь на разности ∆X^[2](n) между положением X^[2]₁(n) остановки образца во второй температурной области в n-м цикле и расчетным целевым положением X^[2]₀₀ остановки во второй температурной области.

4. Процессор для проведения реакции по п. 3, в котором целевое положение X^[2]₀(n+1) остановки образца во второй температурной области в (n+1)-м цикле определяется, корректируя целевое положение X^[2]₀(n) остановки образца во второй температурной области в n-м цикле.

5. Процессор для проведения реакции по п. 4,

в котором целевое положение X^[2]₀(n+1) остановки образа во второй температурной области в (n+1)-м цикле устанавливается следующим уравнением:

X^[2]₀(n+1) = X^[2]₀(n) + k^[2](n), и

в котором поправочный член k^[2](n) определяется, основываясь на соотношении с разностью ∆X^[2](n) в n-м цикле.

6. Процессор для проведения реакции по п. 5, в котором поправочный член k^[2](n) определяется, обращаясь к таблице, описывающей соотношение между разностью ∆X^[2 (n) и поправочным членом k^[2](n) в n-м цикле.

7. Процессор для проведения реакции по любому из пп. 2-6,

в котором положение X^[2]₁(n) остановки образца во второй температурной области в n-м цикле получают как X^[2]₁₁(n), определяемое следующим уравнением:

X^[2]₁₁(n) = L/t^2→nt_p(n) * {t^2→nt_mp(n) - t_c},

где в этом уравнении t^2→nt_p(n) - время прохождения через область обнаружения, через которую образец проходит сразу после того, как покидает вторую температурную область при движении из второй температурной области в последующую температурную область, и

в котором t^2→nt_mp (n) - время, требующееся от момента, когда запускается система подачи текучей среды, чтобы передвинуть образец, до момента, когда блок управления распознает, что передняя часть образца достигла области обнаружения, через которую образец проходит сразу после этого при движении из второй температурной области в последующую температурную область.