СПОСОБ ОПТИМИЗАЦИИ КИСЛОРОДЗАВИСИМЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ СИМВАСТАТИНА ЖИВОТНЫМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2021 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и касается метаболической коррекции побочных эффектов при длительном применении симвастатина в эксперименте.

На сегодняшний день статины считаются наиболее эффективными препаратами в комплексной терапии заболеваний связанных с патологиями сердечно-сосудистой системы. Доказательств относительно положительного применения статинов достаточно (см. Сусеков А.В. Доказательная база Симвастатина (Зокор): пятнадцать лет спустя / А.В. Сусеков, Н.Б. Горнякова, М.Ю. Зубарева, С.А. Бойцов // Артериальная гипертензия. - 2010; 16 (2)); Шальнова С.А. и др. соавторы. Информированность и особенности терапии статинами у лиц с различным сердечно-сосудистым риском: исследование ЭССЕ-РФ // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2016; 15(4)). Клинические исследования свидетельствуют, что на фоне длительной статиновой терапии могут развиться патологические процессы в различных органах, и особенно обращает внимание миопатии (см. Напалков Д.А. Безопасность статинов: что нужно знать практикующему врачу ? // Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии. - 2014; 10(2)); Румянцев Н.А. Использование фармакогенетического тестирования для предотвращения нежелательных лекарственных реакций при терапии статинами Терапевтический архив. - 2017; 1; P.D. Thompson, G. Panza, A. Zaleski, В. Taylor. Statin-Associated Side Effects // J. Am. Coll. Cardiol. - 2016; 67(20)).

В настоящее время известно четыре поколения статинов, и все они в большей или меньшей степени имеют побочные эффекты, так, например, применение розувастатина (IV поколение) может спровоцировать развитие сахарного диабета и нефропатий. В связи с разнонаправленными плеотропными эффектами выбор статина для терапии подбирается индивидуально для каждого пациента. Симвастатин («Зокор») является наиболее изученным статином с точки зрения долговременной безопасности и переносимости, а также является доступным для пациентов.

Наиболее близким является способ профилактики нарушений липидного обмена разработанный Усановой А.А., Зорькиной А.В. и соавторами (см. RU 2423123 С1, 10.07.2011). Данный способ обеспечивает пролонгацию гиполипидемического эффекта ловастатина после его отмены. Для достижения цели авторы предлагают сочетать введение ловастатина в среднетерапевтической дозе и 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат в дозе 0,7 мг/кг ежедневно 1 раз в сутки в течение 10 дней.

Недостатком способа являются узкие рамки его применения (липидный обмен) и остается не ясным механизм влияния мексидола, являющегося антиоксидантом, на показатели липидограммы, при этом регистрируется высокий уровень глюкозы. Более того модель гиперхолестеринемии используемая авторами не позволяет исследовать эссенциальную гиперхолестеринемию.

В исследованиях сотрудников нашей лаборатории, проведенных в сыворотке крови и скелетных мышцах беспородных крыс-самцов при моделировании эссенциальной гиперхолестеринемии и длительном применении статинов «Зокор», в мышечной ткани и эритроцитах наблюдались биохимические изменения, которые характеризовали развитие гипоксии (Микашинович З.И., Виноградова Е.В., Белоусова Е.С. Влияние статина (Зокор) на кислородзависимые процессы в мышечной ткани и эритроцитах животных с гиперхолестеринемией // ACTA BIOMEDICA SCIENTIFIC А. - 2019; 4(3)). А также был разработан способ моделирования миопатии (см. RU 2632624 С1).

Длительное введение симвастатина животным с экспериментальной гиперхолестеринемией сопровождается неоднозначными сдвигами в мышцах и эритроцитах на уровне ключевых метаболитов гликолиза. Резкое увеличение лактата по сравнению с исходными данными в эритроцитах свидетельствуют о высокой чувствительности клеток красной крови к изменению кислородного режима. Показатели антиоксидантной защиты указывают на прооксидантное действие симвастатина дисбалансирующего глутатионзависимые ферменты (см. Микашинович З.И., Белоусова Е.С., Виноградова Е.В., Семенец И.А. Ферментативная антиоксидантная защита в мышцах крыс при длительном введении симвастатина // Медицинский вестник Башкортостана. - 2017; 1(67); Ланкин В.З. и др. соавторы. Влияние ингибитора β-гидрокси-β-метилглутарил-коэнзим-А-редуктазы и витаминов-антиоксидантов на свободнорадикальное окисление липидов печени крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007; 143(4)).

В митохондриях мышц при введении симвастатина у животных с эссенциальной гиперхолестеринемией выявлено угнетение работы дыхательной цепи на участке СДГ-ЦХО, что свидетельствует о нарушении хода кислородзависимых процессов и угнетении глутатионового звена антиоксидантной защиты (см. Микашинович З.И., Белоусова Е.С., Виноградова Е.В., Семенец И.А. Нарушение энергетического обмена в мышечной ткани как один из молекулярных механизмов статиновой миопатии // Фундаментальные и прикладные науки сегодня материалы XI международной научно-практической конференции. - 2017; 1). Однако при введении симвастатина в сочетании с липоевой кислотой в мышцах восстанавливается работа дыхательной цепи во II и IV комплексе (см. Семенец И.А. Некоторые особенности изменения обменных процессов в мышцах при длительном введении симвастатина и тиоктовой кислоты в эксперименте / Казанский медицинский журнал. - 2018; 3).

Авторами предлагаемого способа поставлена задача: разработать способ установления побочных эффектов симвастатина, и в качестве метаболического корректора избрана липоевая кислота и установлено ее действие на кислородзависимые процессы, обеспечивающие функциональную полноценность при длительном применении симвастатина.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего оптимизировать кислородзависимые процессы в организме животных при длительном введении симвастатина с использованием липоевой кислоты.

Технический результат достигается тем, что у беспородных крыс-самцов индуцируют эссенциальную гиперхолестеринемию, затем в течение двух месяцев животные получают симвастатин, 20 мг и липоевую кислоту, 600 мг в терапевтической дозировке в пересчете на 100 г массы один раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд.

Подробное описание способа.

Способ оптимизации кислородзависимых процессов при длительном введении симвастатина животным с использованием липоевой кислоты, заключается в воздействии на экспериментальное животное (крыса-самец), которому в течение двух месяцев ежедневно один раз в день вводят суспензию из комбинации препаратов через пищевой зонд.

Для приготовления водной суспензии отдельно в разных ступках растирают таблетки симвастатина «Зокор, 20 мг» и липоевой кислоты «Тиоктацид БВ, 600 мг» в мелкий порошок. Далее взвешивают крысу, и в соответствии с индивидуальным весом животного рассчитывают необходимое количество порошка для приготовления суспензии: «Зокор, 20 мг» в терапевтической дозировке в пересчете на 100 г массы (по 0,001 г/100 г) и «Тиоктацид БВ, 600 мг» в терапевтической дозировке в пересчете на 100 г массы (по 0,857 мг/ 100 г). Затем навески смешивают и разбавляют 1-2 мл дистиллированной воды и сразу вводят животному через пищеводный зонд.

Практическая реализуемость предлагаемого способа подтверждается данными экспериментального исследования проведенного на 85 животных.

Эксперимент проводился на беспородных крысах-самцах в возрасте 12-13 месяцев (300-350 г). В ходе эксперимента животных разделили на 3 группы: в первую группу входили интактным животные (контрольная) - 20 животных, которых кормили натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом №755 от 12.08.77 (см. Приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»); у крыс второй группы - 35 животных (группа сравнения) индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию путем кормления в течение трех месяцев манной кашей, сваренной на воде таким образом, что на 1 кг крупы, добавляли 2 кг тростникового сахара и 2 кг топленного сливочного масла, при этом индивидуально каждому животному давали 50 г белого несоленого свиного сала в сутки, затем эти животные получали в течение двух месяцев симвастатин (Zocor, 20 мг) по 0,001 г/100 г массы один раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд; у крыс 3 группы, также индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию таким же путем, затем в течение двух месяцев эти животные получали симвастатин (Zocor, 20 мг) в терапевтической дозировке в пересчете на 100 г массы (по 0,001 г/ 100 г) и липоевую кислоту (Тиоктацид БВ, 600 мг) в терапевтической дозировке в пересчете на 100 г массы (по 0,857 мг/ 100 г) один раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд (экспериментальная группа).

По окончанию эксперимента, т.е. через 2 месяца у животных забирали кровь для проведения биохимического анализа в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (см. Приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003).

Эритроциты получали из крови, стабилизированной гепарином (10 ед/мл), отделяли от лейкоцитов и тромбоцитов в 3% желатиновом растворе с последующим центрифугированием (320 g 15 минут). После отделения плазмы и верхнего слоя клеток эритроциты отмывали охлажденным физиологическим раствором (2-3 раза). Для получения плотного осадка при определении субстратов отмытые эритроциты центрифугировали при 640 g в течение 30 минут.

Происходящие в эритроцитах биохимические изменения оценивали по концентрации лактата и по активности ферментов глутатионпероксидазы (ГПО) (см. Справочник по лабораторным методам исследований. Под ред. Л.А. Даниловой. Издательский Дом ПИТЕР; 2003), глутатионредуктазы (ГР) (см. Юсупова Л.Б. О повышении точности определения активности глутатионредуктазы эритроцитов // Лабораторное дело. - 1989; 4).

Так как эксперимент проводили на лабораторных животных (крысах-самцах), то статистическую обработку проводили с использованием пакета прикладной программы STATISTICA версия 10.0 и Microsoft Office Excel Worksheet. После проверки распределения на нормальность о достоверности отличий учитываемых показателей сравниваемых групп судили по величине t-критерия Стьюдент, при ненормальности распределения - U критерия Манна-Уитни. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р<0,05.

Результаты, полученные при анализе биохимических изменений в крови экспериментальных групп, отражены в таблице 1.

При введении симвастатина животным с эссенциальной гиперхолестеринемией относительно контрольной группы отмечали значительное увеличение лактата на 265,40% (р<0,001), что свидетельствует о наличии метаболического ацидоза. Относительно антиоксидантной защиты в группе «гиперхолестеринемия + симвастатин» было выявлено резкое снижение активности ГПО на 87,20% (р<0,001) и ГР на 22,45% (р>0,05) относительно контрольной группы. Полученные данные отражают нарушение работы антиоксидантной защиты в форменных элементах системы крови.

При сравнении полученных результатов крови экспериментальной группы (гиперхолестеринемия + симвастатин + липоевая кислота) с группой сравнения (гиперхолестеринемия + симвастатин) регистрировали снижение уровня лактата на 69,13% (p₁<0,001), а относительно группы контроля незначительное повышение на 17,80% (р>0,05).

При анализе ферментов глутатионового звена у экспериментальной группы выявлено значительное повышение активности ГПО на 675,80% (p₁<0,001) и ГР на 44,74% (p₁<0,001) относительно группы сравнения. В то время как у группы «гиперхолестеринемия + симвастатин + липоевая кислота» выявлено увеличение активности ГР на 112,24% (р>0,05), а активность ГПО достоверно не отличалась от показателей контрольной группы.

Выявленное снижение уровня лактата, указывает на усиление вовлечения глюкозы в обмен эритроцитов. Наряду с этим изменения показателей ферментов глутатионового звена свидетельствуют о перестройках работы антиоксидантной защиты за счет нормализации активности ГР и ГПО, ответственной за устранения пероксидных соединений, что можно рассматривать как результат биохимической адаптации.

Таким образом, предлагаемый способ оптимизации кислородзависимых процессов при длительном введении симвастатина животным с использованием липоевой кислоты в эксперименте прост в исполнении, не инвазивен и обеспечивает работу адаптивных процессов, направленных на снижение побочных эффектов симвастатина (Зокор).

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что его применение позволяет устранить побочные эффекты, связанные с угнетением энергетических процессов при длительной терапии симвастатином.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для оптимизации кислородзависимых процессов при длительном введении симвастатина животным. Для этого у беспородных крыс-самцов индуцируют эссенциальную гиперхолестеринемию, а затем животное 1 раз в сутки в течение двух месяцев получает симвастатин 20 мг и липоевую кислоту 600 мг в терапевтической дозировке в пересчете на 100 г массы в виде водной суспензии через пищеводный зонд. Способ позволяет устранить побочные эффекты, связанные с угнетением энергетических процессов при длительной терапии симвастатином, за счет снижения уровня лактата и изменения показателей ферментов глутатионового звена, что свидетельствует о перестройках антиоксидантной защиты. 1 табл.

Способ оптимизации кислородзависимых процессов при длительном введении симвастатина животным с использованием липоевой кислоты заключается в том, что первоначально у беспородных крыс-самцов индуцируют эссенциальную гиперхолестеринемию, затем в течение двух месяцев животные получают симвастатин, 20 мг и липоевую кислоту, 600 мг в терапевтической дозировке в пересчете на 100 г массы один раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд.