БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ, ПОЧВЫ И ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ОТ УСТОЙЧИВЫХ К РАЗЛОЖЕНИЮ ПЕСТИЦИДОВ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/125 C12R1/01 C12R1/40 

Изобретение относится к новому биопрепарату для очистки воды, почвы и промышленных стоков, загрязненных стойкими к разложению химическими веществами, относящимися к категории опасных, таких как широко применяемые в сельском хозяйстве пестициды.

Биопрепараты-биодеструкторы и их использование для очистки почв и грунтов от нефти и нефтепродуктов, содержащие Bacillus brevis и Arthrobacter species, описаны в патентах РФ 2323970 и 2237711, а в патенте РФ 2086667 описан консорциум, включающий микроорганизмы Pseudomonas putida и Bacillus subtilis.

Известны также биопрепараты "Родер" на основе штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, «Ленойл», «Деворойл», "Экобел" на основе штаммов бактерий штаммов Pseudomonas и дрожжей, которые эффективно применяются для удаления алифатических фракций нефти.

Известно разложение хлорированных ароматических пестицидов (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты) с помощью бактерий Pseudomonas pseudoalcaligenes штамм NRRL В-18087 (патент США 4804629), детоксикация остатков фосфорорганических пестицидов и их токсичных метаболитов штаммом бактерии Agrobacterium radiobacter (авт. свид. СССР 1250572). В авт. свид. СССР 1560487 описывается способ деструкции пестицида 3,4-дихлоранилида водорослями Chlorella vulgaris БКМ-А-10 и Scenedesmus acuminalus УА-2-7а. Разложение 2-хлорбензойной кислоты бактериями Pseudomonas putida YNK-1 описывается в патенте США 4803166; фосфатных примесей и хлорированных углеводородов - микроорганизмами Moraxella и Arthrobacter отдельно или в комбинации - в патенте ФРГ 3729127. Известна деструкция таких соединений, как ДДТ, полихлорфенолы, бензопирены, диоксины, с помощью базидиального гриба Phanerochate chrysosporium (патент США 4891320). Штамм Pseudomonas putida - 106 является активным деструктором диметилфенилкарбинола и фенола (3), бактерии Pseudomonas pseudoacaligenes разрушают ароматические и гетероциклические соединения, чаше всего обнаруживаемые в сточных водах (5), а штамм Pseudomonas pseudoacaligenes разрушает ароматические соединения в твердой и жидкой среде (4). Способностью к деструкции хлоропроизводных триазина, таких как симазин и атразин, обладают некоторые музейные штаммы Nocardia, Arthrobacter, Micromonospora (6). В патенте США 6632363 описывается композиция, содержащая гидрофобный носитель и бактерии Bacillus subtilis, и способ ее использования для улучшения качества воды, содержащей, например, пестициды.

Ксенофонтова О.Ю. и др. в статье «Изменение численности почвенных микроорганизмов под действием пестицидов» (Известия Саратовского Госуниверситета, Научн. Секция «Химия, биологич. Экология», 2007, т.7, №2, с.66) описывает в качестве наиболее активных деструкторов штаммы аэробных бактерий из родов Bacillus и Pseudomonas, разрушающие следующие пестициды: хлортиазид, юглон, семихинона, нитролон, картоцид и каратэ.

В патенте РФ 2410170 описывается способ очистки загрязненного грунта от органических соединений, в том числе от пестицидов, например от дихлорбифенила (ДХБ), путем внесения сорбента, представляющего собой глаутонитовую породу, предварительно обработанную при 200-300°С, и штамма бактерий рода Rhodococcus.

Во всех описанных способах детоксикации ядохимикатов (токсичных веществ) для разложения конкретных химических соединений предлагаются определенные виды микроорганизмов. Описывается в основном разложение ядохимикатов в водной среде при использовании ксенобиотиков микроорганизмами в качестве единственного источника углерода и энергии, либо требуется дополнительное использование сорбентов.

Существенным недостатком всех вышеперечисленных культур является их узкая специфичность к определенному субстрату, и они не имеют препаративной формы и не применяются на практике для очистки загрязненных трудноразлагаемыми химическими соединениями, такими как пестициды, вод, промышленных стоков и почв.

В патенте РФ 2093478 описана ассоциация штаммов бактерий Pseudomonas putida BKM 1301, Bacillus subtilis BKM B-1742D и Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1339D в соотношении 1:1:1 для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов и полимерных добавок в буровом растворе и ее использование. Однако использование указанной ассоциации для очистки воды, почвы и промышленных стоков, загрязненных стойкими к разложению химическими веществами, такими как пестициды, ранее не было известно.

Наиболее близким к препарату настоящего изобретения по назначению является биопрепарат «Биава» (патент РФ 2248255), который способствует повышению почвенного плодородия и стимулированию естественной микрофлоры среды. Биопрепарат содержит амилолитические, протеолитические и азотфиксирующие микроорганизмы, такие как микроорганизмы рода Pseudomonas, Bacillus. Недостатком этого препарата является сложный состав, включающий более 25 видов разных микроорганизмов, не адаптированых к ассоциативным взаимодействиям, что является сложным в производстве и для поддержания штаммов. В указанном патенте также описывается способ применения биопрепарата «Биава» введением последнего в почву.

Данный препарат не является стимулятором роста растений и не обладает способностью к разложению таких стойких химических веществ, как пестициды или гербициды из ряда хлорфеноксиуксусных кислот: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5,-Т), фенола, 2,4-дихлорфенола, ХФУК и ряда других химических соединений, описываемых ниже. Данные соединения являются одними из наиболее стойких и персистентных в окружающей среде. Попадание в организм таких химических веществ может привести к тяжелым заболеваниям органов, тканей и нервной системы. Присутствие их в продуктах питания считается недопустимым (см., например, Тинсли И. Поведение химических загрязнителей в окружающей среде. Пер. С англ. М.: Мир, 1992, с.281).

Задачей настоящего изобретения является разработка нового биопрепарата для очистки (детоксикации) почвы, воды и промышленных стоков загрязненных стойкими химическими веществами, такими как пестициды, фенолы, а также способ применения препарата. Препарат ФЕНОКС согласно настоящему изобретению улучшает очистку среды от токсичных соединений и, как следствие, повышает потребительское качество продуктов, выращенных на обработанной земле. При этом происходит микробиологическая деструкции токсичных веществ клетками бактерий в почве до неопасных соединений. Биопрепарат проявляет высокую эффективность при очистке сточных вод промышленных предприятий.

Настоящее изобретение относится к биопрепарату ФЕНОКС для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению химических веществ, таких как пестициды, который представляет собой ассоциацию новых штаммов бактерий Pseudomonas putida. Bacillus subtilis и Rhodococcus erythropolis в массовом соотношении (1-2):(1-2):(1), который может дополнительно содержать сорбент или иммобилизован на сорбенте, минеральные, органические и стимулирующие добавки.

Отличием предлагаемого препарата «ФЕНОКС» от ранее известного ближайшего аналога по назначению является указанная ассоциация штаммов бактерий в указанном массовом соотношении.

Препарат особенно эффективен при использовании его для разложения устойчивых пестицидов, выбранных из группы хлорфеноксиуксусных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), 2,4-дихлорфенокси-α-пропионовая (Дихлорпроп, 2,4-ДР), 2-метил-4-хлорфенокси-α-пропионовая (Мекопроп, 2М-4ХП, МСРР), 2,4,5-трихлорфенокси-α-пропионовая (2,4,5-ТР, Silvex), 2,4-дихлорфенокси-α-масляная (2,4-ДВ); метил-[1-[(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-ил]карбамат и препарата на его основе (беномил, carbendazin, беназол); имидор, где действующим веществом является неоникотиноид имидоклаприд, imidacloprid; зонтран, где действующим веществом является метрибузин (metribuzin), ГХЦГ (гексахлорциклогексан, гексахлоран, гексатокс, долмикс, синекс), ХФУК (хлорфеноксиуксусная кислота), ФУК (феноксиуксусная кислота), гексахлорфенол, 1,1-ди(4'-хлорфенил)-2,2-дихлорэтан (ДДТ, дуст), а также 2,4-дихлорфенол и фенола. Особенно препарат эффективен при использовании его для разложения устойчивых пестицидов из группы хлорфеноксиуксусных кислот, таких как - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусной кислоты (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), а также 2,4-дихлорфенола и фенола, имидоклаприда.

Препарат настоящего изобретения также в отличие от ранее известных препаратов обладает дополнительно ростстимулирующим действием на прорастание семян и рост культурных растений, а также обладает фунгицидной активностью.

Объектом изобретения также является способ применения указанного биопрепарата «Фенокс». Способ заключается во введении в эффективном количестве препарата в загрязненный грунт, почву или промышленный сток.

Отличием предлагаемого способа применения от ранее известного ближайшего аналога является введение ассоциации указанных штаммов бактерий в указанном массовом соотношении.

Предпочтительно препарат вводят в количестве 10 кг сухого вещества в момент вспашки из расчета на 1 га земли при температуре окружающей среды, преимущественно при температуре 15-35 С°. Наиболее предпочтительны методы введения в виде водного раствора путем дождевания. Можно также осуществлять введение препарата в почву введением семян, обработанных суспензией препарата с добавлением биогенных элементов, таких как вермикомпост, или введением сухой препаративной формы препарата в виде порошка в землю в момент вспашки или высева семян.

Либо введение препарата можно осуществлять посевом в почву семян, обработанных суспензией препарата с добавлением биогенных элементов, таких как вермикомпост.

Предварительно препарат разводят в резервуаре с водой с добавлением вермикомпоста, азотно-фосфорных удобрений.

Возможно также введение сухой препаративной формы препарата в виде порошка в землю в момент вспашки или высева семян. Предлагаемый согласно настоящему изобретению препарат «ФЕНОКС» обладает стимулирующим эффектом на рост растений и штаммы препарата хорошим приживанием в почве, что обуславливает эффективную детоксикацию среды. Штаммы Pseudomonas putida и Rhodococcus erythropolis несут D-плазмиды деградации и способны передавать свойство разрушения пестицидов, а также других вредных веществ аборигенным бактериальным популяциям почвы, воды, стоков, усиливая тем самым ее очистку от загрязнителей. Преимуществом применения данного препарата является разложение пестицидов в почве до 86% и в жидкой среде до 99%.

Действующая основа препарата - ассоциация почвенных штаммов бактерий Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Rhodococcus erythropolis. Все культуры обладают полисубстратной специфичностью одновременно к нескольким ксенобиотикам: хлорфеноксиуксусным кислотам, таким как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), фенол, 2,4-дихлорфенол, ХФУК и ряда других, указанных в примерах. Их смешение дает усиление функции очистки среды от токсичных соединений. В качестве сорбентов используется каолин и мелкоразмельченный торф, который одновременно служит органической добавкой, в качестве органо-минеральной и рост-стимулирующей добавки вермикомпост, экстракт из него и хитинсодержащие субстраты. Перед применением в емкости (ведре, фляге) сухой порошок препарата хорошо перемешивают в теплой воде (25-30°С) до получения однородной суспензии. 10 г препарата размешивают в 10 л воды. Рекомендуется добавить азофоски (5 г/10 л) или компоста (5 г/10 л), периодически суспензию перемешивают для аэрации и активизации микроорганизмов в течение 1-3 часов перед использованием (полива из лейки почвы (10-20 л/10 м²) или обработки 100-150 мл/100 г семян).

Получение биопрепарата реализуется путем раздельного глубинного культивирования обычно в течение около 20-30 часов 3 штаммов указанных высокоэффективных бактерий на стандартном биотехнологическом оборудовании. Посевной материал получают выращиванием штаммов на синтетической среде с добавлением пестицида и используют этот материал для засева ферментеров большого объема.

Наращенная сухая биомасса клеток смешивается в соотношении (1-2):(1-2):1. Общий титр составляет не менее 5×10⁸ КОЕ/г сухого препарата после добавления носителя-сорбента и других добавок (исходного концентрата 10^10-11 и не менее 5×10⁸ КОЕ/мл жидкого препарата. Для промышленного производства и расфасовки предлагаемого препарата используется типовое биотехнологическое и фасовочное оборудование и материалы.

Биопрепарат устраняет поступление в растения, овощи и ягоды химических средств защиты растений, стимулирует прорастание семян и рост растений, ингибирует грибные фитопатогены.

ФЕНОКСом обрабатывают загрязненную химическими веществами, такими как пестициды, фенол, возможно нефтью воду, промышленные стоки, почву, а также семена растений.

Штаммы, входящие в Фенокс, являются новыми.

Штамм Bacillus subtilis выделен методом накопительных культур из образцов почв промышленной зоны предприятий химичекой промышленности Южного Урала. Штамм Bacillus subtilis депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В-10999.

Штамм Bacillus subtilis идентифицирован на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Нуклеотидная последовательность (длинной не меньше 500 пар оснований) фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство с заявленным видом, составляющее 99%.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Bacillus subtilis имеет типичные для этого вида Культурально-морфологические признаки. Палочки, размером 0,2-0,5 на 1,5-3 мкм, одиночные, часто в парах. Образуют овальные и округлые эндоспоры. Жгутики расположены пеитрихально. При росте на мясо-пептонном бульоне культура образует развитую матовую пленку, среда при этом остается прозрачной. При встряхивании биомассы в жидкой среде ее полного диспергирования не происходит. Колонии сухие мелкоморщинистые, край волнистый. На ломтиках картофеля рост обилен в виде колоний кремового цвета гладких, сильно крупноскладчатых. Окраска по Грамму положительная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм Bacillus subtilis хорошо растет на глюкозо-пептонной среде, LB агаре и бульоне, глюкозо-минеральной среде при температуре 28°С. Растет на средах с L-пролином, DL-лейцином, α-кетоглутаратом, DL-α-аланином, L-глутамином, D(+)-ксилозой, L-аспарагином, хитином, DL-серином, глюкозой, фенолом и хлорфеноксикарболовыми кислотами в качестве единственного источника углерода. Штамм Bacillus subtilis может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на глюкозо-пептонный агар, М9 и LB - 1 раз в 12 месяцев. При хранении на косяках с этими средами при 5°С - пересев 1 раз в 3 месяца.

Штамм Bacillus subtilis является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении белых мышей не проявляет зоопатогенных свойств.

Штамм Rhodococcus erythropolis выделен методом накопительных культур из образцов почв промышленной зоны предприятий химичекой промышленности Южного Урала. Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ Ас-1882.

Штамм Rhodococcus erythropolis идентифицирован на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Нуклеотидная последовательность (длинной не меньше 500 пар оснований) фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство с заявленным видом, составляющее 99%.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Rhodococcus erythropolis имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные, редко ветвящиеся, диаметр составляет 0,6-0,8 мкм, длина - 3-8 мкм. Клетки умеренно полиморфные, часто расположены в виде V-форм, имеют выраженный цикл развития кокк-палочка-кокк: в возрасте 24-36 часов палочковидные клетки начинают укорачиваться и увеличивается доля кокковидных и овальных клеток. Зрелые колонии пигментированные, имеют оранжевую краску. Консистенция колоний пастообразная. Окраска по Грамму положительная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм Rhodococcus erythropolis хорошо растет на глюкозо-пептонной среде, LB агаре и бульоне, глюкозо-минеральной среде при температуре 28°С. Растет на средах с L-пролином, D-арабинозой, DL-α-аланином, L-глутамином, D(+)-ксилозой, L-аспарагином, DL-серином, казеином, глюкозой, фенолом и хлорфеноксикарболовыми кислотами в качестве единственного источника углерода. Штамм Rhodococcus erythropolis может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на глюкозо-пептонный агар, М9 и LB - 1 раз в 12 месяцев. При хранении на косяках с этими средами при 5°С - пересев 1 раз в 3 месяца.

Штамм Rhodococcus erythropolis является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении белых мышей не проявляет зоопатогенных свойств.

Штамм Pseudomonas putida выделен методом накопительных культур из образцов почв промышленной зоны предприятий химической промышленности Южного Урала. Штамм Pseudomonas putida депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В-10997.

Штамм Pseudomonas putida идентифицирован на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Нуклеотидная последовательность (длиной не меньше 500 пар оснований) фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство с заявленным видом составляет 99%.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Pseudomonas putida имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки. Подвижные палочки с полярно расположенными жгутиками. Размер клеток составляет 1-4 на 1,3-5,4 мкм. Колонии на мясо-пептонном агаре сероватого цвета, в пределах колоний и с их обратной стороны наблюдается красновато-буроватый пигмент. Спор не образуется. Консистенция колоний - тягучая. Окраска по Грамму отрицательная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм Pseudomonas putida хорошо растет на глюкозо-пептонной среде, LB агаре и бульоне, глюкозо-минеральной среде при температуре 28°С. Растет на средах с DL-тирозином, DL-триптофаном, D(+)-ксилозой, D(-)-маннитом, L-глутаминовой кислотой, DL-лейцином, α-кетоглутаратом, DL-α-аланином, D-рибозой, L(+)-арабинозой, L-глутамином, целлюлозой, L-аспарагином, хитином, DL-серином, пектином, глюкозой, казеином, фенолом и хлорфеноксикарболовыми кислотами в качестве единственного источника углерода. Штамм Pseudomonas putida может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на глюкозо-пептонный агар, М9 и LB - 1 раз в 12 месяцев. При хранении на косяках с этими средами при 5°С - пересев 1 раз в 3 месяца.

Штамм Pseudomonas putida является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении кроликов не проявляет зоопатогенных свойств.

Пример 1.

Выявление плазмид деструкции пестицидов у штаммов

Деструктивные свойства бактерий могут быть детерминированы экстрахромосомными элементами [Don, Pemberton, 1985; Ghosaletal., 1985]. Такие элементы - плазмиды обнаружены у штаммов Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 и Rhodococcus erhytropolis ВКПМ Ac-1882.

Методом щелочного лизиса (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Под ред. А.А.Баева. - М.: Мир, 1984. - 480 с.) их выделяют из клеток этих штаммов и затем препараты плазмиды фракционируют в агарозном геле в стандартных условиях (Маниатис с соавт., 1984] (см. фиг.1 - Плазмидный профиль штаммов: 2-9 Pseudomonas putida ВКПМ B-10997, 10-17 Rhodococcus erhytropolis ВКПМ Ac-1882).

Пример 2.

Совместимость штаммов, входящих в состав препарата

Отсутствие антагонистического действия между штаммами бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10999, Rhodococcus erythropolis Ac-1882 и Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 препарата определяют по росту штаммов в местах контакта штрихов на среде и методом агаровых блоков.

На агаровую LB среду наносят штрих В.subtilis ВКПМ В-10999 и перпендикулярно к нему штрихи штаммов Rhodococcus erythropolis Ac-1882 и Pseudomonas putida ВКПМ B-10997.

На следующей чашке наносят штрих Rhodococcus erythropolis Ac-1882 на питательную среду и перпендикулярно к нему штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-10999 и Pseudomonas putida ВКПМ В-10997.

На третьей чашке наносят штрих Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 на среду и перпендикулярно к нему штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-10999 и Rhodococcus erythropolis Ac-1882.

В местах контактов штрихов ингибирования роста ни одного из штаммов не наблюдают.

При постановке опыта методом агаровых блоков на газон одного из штаммов на LB среде раскладывают блоки 3-суточных культур двух других штаммов.

Ни в одном из этих опытов подавления роста штаммов также не отмечают, что указывает на отсутствие между ними антагонистических взаимодействий и возможности их эффективного совместного использования.

Способ получения экстрактов компоста, вермикомпоста стандартный: замачивание вермикомпоста или компоста в воде и последующее отделение жидкой фракции. Способ позволяет получить экстракт, содержащий водорастворимые вещества (питательные микро- и макроэлементы и некоторые физиологически активные вещества), а также споры почвенных бактерий, которые при внесении в почву размножаются и способствуют обогащению почвы необходимыми для роста и развития растений веществами.

В сосуд емкостью 250 л помещают навеску в 10 кг компоста с влажностью 45%. Затем его замачивают 3-5 объемами воды (30-50 л) при температуре 30-35°С, смесь перемешивают и отстаивают 30 мин, получая водную бактериальную вытяжку, содержащую водорастворимые вещества самого вермикомпоста и суспензию почвенных микроорганизмов - микробиоценоза компоста. Вермикомпост обычно включает следующие микроэлементы: Cd, Со, Cr, Cu, Мо, Ni, Pb, Se, Zn.

При этом минеральные соли или минеральные удобрения, используемые в качестве добавок, являются стандартными, обычно используемыми при внесении в почву или грунт для повышения их качества. Используются азотные, фосфорные, калийные удобрения и минеральные соли, например Na₂HPO₄; KH₂PO₄; NaCl; NH₄Cl, KCl, (NH₄)₂HPO₄.

Примеры композиций биопрепарата Фенокс.

Пример 3.

Биопрепарат Фенокс, форма - сухой порошок

Сухая биомасса клеток (концентат) - Bacillus subtilis ВКПМ В-10999 не менее 5×10⁹ КОЕ/г, Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 не менее 5×10⁹ КОЕ/г и Rhodococcus erythropolis Ac-1882 не менее 5×10⁸ КОЕ/г в соотношении (1-2):1:(1-2) (массовая доля - 76,5-90%);

Без введения или с введением в состав сорбента - мелкоразмолотый торф - 1-10% и/или стимулирующей добавки, содержащей также минеральные соли и микроэлементы - вермикомпоста - 0,1-1%;

Вода, не более 10,0%;

Суммарный титр живых клеток не менее 10¹⁰ КОЕ/г.

Пример 4.

Биопрепарат Фенокс, форма - сухой порошок

Сухая биомасса клеток - Bacillus subtilis ВКПМ В-10999, Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 и Rhodococcus erythropolis Ac-1882 в соотношении 1:1:1 - 5-30%;

Сорбент - мелкоразмолотый торф - 1-10% и/или

стимулирующая добавка, содержащая также минеральные соли и микроэлементы - вермикомпост - 0,1-1%;

Вода, не более 10,0%;

Сорбент и наполнитель каолин - до 100%;

Суммарный титр живых клеток не менее 5×10⁸ КОЕ/г.

Пример 5.

Биопрепарат Фенокс, форма - сухой порошок

Сухая биомасса клеток - Bacillus subtilis ВКПМ В-10999, Rhodococcus erythropolis Ac-1882 и Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 в соотношении 1:1:1 в сумме - 5-30%;

Вода, не более 10,0%;

Каолин-до 100%;

Суммарный титр живых клеток не менее 5×10⁸ КОЕ/г.

Пример 6.

Биопрепарат Фенокс, жидкая форма

Клетки бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10999, Rhodococcus erythropolis Ac-1882 и Pseudomonas putida ВКПМ B-10997 в соотношении 1:1:1 (общий титр - 10⁹ КОЕ/мл) в культуральной жидкости без добавки или с добавкой биологически активных веществ (экстракт компоста или вермикомпоста - 1-5 мл/л, или мелкоразмолотого компоста, или вермикомпоста 0,1% или/и хитина или хитозана, или хитинсодержащегося сырья - 0,05-0,4%).

Хранение при 0-8°С не менее 3 месяцев, при температурах 18-25°С до 15 сут.

При хранении при температурах 18-25°С допускается снижение числа жизнеспособных клеток до титра КОЕ 10⁷/мл.

Способ применения поясняется следующими примерами.

Пример 7.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от имидаклоприда

Препарат Фенокс в виде сухого порошка следующего состава: концентрат бактериальных клеток в соотношении 1:2:1 с общим титром 5×10¹⁰ КОЕ/г (состав препарата согласно примеру 1) в количестве 100 мг вносят в 200 мл водопроводной воды, загрязненной пестицидом (инсектицидом) имидаклопридом в концентрациях 1 мг/л и 2 мг/л действующего вещества. Дополнительно в водную среду вносят добавки минеральных солей (г/л): Na₂HPO₄·7H₂O - 6,4; KH₂PO₄ - 1,5; 0,25 г/л NaCl; 0,5 г/л NH₄Cl.

Контролем служат образцы воды, загрязненной имидаклопридом в концентрациях 1 мг/л и 2 мг/л, с минеральными солями без биопрепарата. Образцы инкубируют при комнатной температуре, при постоянном перемешивании на качалке (120 об/мин). Повторность в опыте 3-кратная.

Содержание имидаклоприда в воде определяют стандартным хроматографическим методом на 1, 3, 5, 7 и 10-е сутки (Рудаков и др., 2004). Коэффициент вариации данных не более 5%.

Таблица 1 Динамика содержания имидаклоприда в воде при применении препарата Phenox Вариант Содержание имидаклоприда, мг/л 0 сутки 1 сутки 3 сутки 7 сутки 10 сутки Контроль - имидаклоприд 1 мкг/мл 1,00 0,98 0,98 0,94 0,96 Контроль - имидаклоприд 2 мкг/мл 2,00 2,09 2,01 1,93 1,95 Биопрепарат + имидаклоприд 1 мкг/мл 1,00 0,94 0,81 0,48 0,28 Биопрепарат + имидаклоприд 2 мкг/мл 2,00 1,57 1,15 0,83 0,64

Применение биопрепарата ведет к существенному снижению содержания имидоклаприда в загрязненной воде. Уменьшение концентрации пестицида при исходной контаминированности воды имидоклапридом 1 мг/л на 10 сутки составляет 0,28 мг/л, меньше на 72%. При загрязненности воды в дозе 2 мг/л внесение биопрепарата приводит к уменьшению концентрации имидоклаприда до 0,64 мг/л, снижается на 68%.

Полученные данные указывают, что биопрепарат Фенокс позволяет проводить очистку от воды от имидоклаприда.

Пример 8.

Применение биопрепарата Фенокс для очистки воды от фенола

Биопрепарат Фенокс в виде жидкой формы следующего состава: бактериальные клетки в соотношении 1:1:1 с титром 5×10⁹ КОЕ/г (состав препарата согласно примеру 1 без добавки стимулирующих компонентов) в количестве 0,01% от объема вносят в загрязненную фенолом воду (содержание фенолов 100 мг/л). Дополнительно в водную среду вносят минеральное азотно-фосфорное удобрение в количестве 0,5 г/л. Для аэрации и перемешивания в резервуар с загрязненной водой периодически подается воздух с помощью насоса. Температуру воды поддерживают около 22-25°С. Определение содержания фенола в воде проводят стандартным фотометрическим методом (Рудаков и др., 2004). Повторность в опытах 3-кратная. Коэффициент вариации данных не более 7%.

Таблица 2 Динамика содержания фенола при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация фенола, мг/л 0 сутки 100,0 1 сутки 73,0 3 сутки 67,0

При использовании препарата Фенокс концентрации фенола в воде в течение первых суток снижается на 27%, а к 3-м суткам - на 33% (табл.2).

Пример 9.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от дихлорфенола

Опыт проводят согласно примеру 8, но используют соотношение штаммов 2:1:1 и воду, загрязненную дихлорфенолом 2,4-ДХФ (содержание дихлорфенола 100 мг/л).

Таблица 3 Динамика содержания дихлорфенола при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация 2,4-ДХФ, мг/л 0 сутки 100,0 1 сутки 30,0 3 сутки 21,9

При применении препарата Фенокс для очистки воды от дихлорфенола концентрация 2,4-ДХФ снижается уже к 1-м суткам инкубации на 70% (табл.3).

Пример 10.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от 4-хлорфеноксиуксусной кислоты

Опыт проводят согласно примеру 8, но используют соотношение штаммов 1:2:1 и воду, загрязненную 4-хлорфеноксиуксусной кислотой 4-ХФУК (содержание 4-ХФУК 100 мг/л).

Таблица 4 Динамика содержания 4-хлорфеноксиуксусной кислоты при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация 4-ХФУК, мг/л 0 сутки 100,0 1 сутки 96,3 3 сутки 95,8 5 сутки 94,1 7 сутки 92,5 9 сутки 90,0 11 сутки 68,7 13 сутки 63,9 15 сутки 62,0

Использование препарата Фенокс для очистки воды от 4-хлорфеноксиуксусной кислоты к 9-м суткам снижает концентрацию 4-ХФУК в воде на 10%, а к 15-м суткам - на 38,0% (табл.4).

Пример 11.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

Опыт проводят согласно примеру 8, но используют воду, загрязненную 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой 2,4-Д (содержание 2,4-Д 100 мг/л).

Таблица 5 Динамика содержания 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация 2,4-Д, мг/л 0 сутки 100,0 1 сутки 95,3 3 сутки 89,4 5 сутки 81,5 7 сутки 74,3 9 сутки 70,0 11 сутки 68,6 13 сутки 66,9 15 сутки 65,0

При использовании препарата Фенокс для очистки воды от 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты содержание 2,4-Д постепенно падает к 3-м суткам на 11%, к 9-м суткам - на 30% и к 15-м суткам - на 35%.

Пример 12.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты

Опыт проводят согласно примеру 8, но используют воду, загрязненную 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислотой 2,4,5-Т (содержание 2,4,5-Т 100 мг/л).

Таблица 6 Динамика содержания 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация 2,4-ДХФ, мг/л 0 сутки 100,0 1 сутки 96,3 3 сутки 85,0 5 сутки 64,8 8 сутки 55,0

При использовании препарата Фенокс для очистки воды от 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты концентрации 2,4,5-Т к 3-м суткам снижается на 15%, к 8-м суткам - на 45% от начального уровня (табл.6).

Пример 13.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от фенола

Опыт проводят согласно примеру 12, но применяют препарат Фенокс в виде сухого порошка (по примеру 3, с титром 5×10¹¹ КОЕ/г и введением вермикомпоста - 0,1%).

Таблица 7 Динамика содержания фенола при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация фенола, мг/л 0 сутки 100,0 1 сутки 70,0 3 сутки 45,0

При применении препарата Фенокс для в виде сухого порошка со стимулирующей добавкой для очистки воды от фенола его содержание снижается к концу 1-х суток на 30%, к концу 3-х суток на 55% от начального уровня (табл.7).

Пример 14.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

Опыт проводят согласно примеру 13, но используют препарат по примеру 3, без вермикомпоста с титром 10¹¹ КОЕ/г и воду, загрязненную 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой 2,4-Д (содержание 2,4-Д 100 мг/л).

Таблица 8 Динамика содержания 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация 2,4-Д, мг/л 0 сутки 100,0 2 сутки 81,3 4 сутки 64,2 6 сутки 61,8 8 сутки 60,5 10 сутки 59,0

Применение препарата Фенокс для очистки воды от 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты приводит к постепенному снижению концентрации 2,4-Д, на 10-е сутки она падает до 59% от исходного значения (табл.8).

Пример 15.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от дихлорфенола

Опыт проводят согласно примеру 13, но используют воду, загрязненную дихлорфенолом 2,4-ДХФ (содержание дихлорфенола 100 мг/л).

Таблица 9 Динамика содержания дихлорфенола при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация   2,4-ДХФ, мг/л 0 сутки 100,0 2 сутки 96,2 4 сутки 91,4 6 сутки 86,9 8 сутки 80,5 10 сутки 75,7 12 сутки 70,1 14 сутки 64,9 16 сутки 60,8 18 сутки 58,7 20 сутки 56,6 22 сутки 53,0

При применении препарата Фенокс для очистки воды от дихлорфенола концентрация 2,4-ДХФ составляет к 22 суткам 53% от начальной (табл.9).

Пример 16.

Применение препарата Фенокс для очистки воды от 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты

Опыт проводят согласно примеру 8, но используют препарат со стимулирующими добавками и титром 10⁹ КОЕ/г и воду, загрязненную 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислотой 2,4,5-Т (содержание 2,4,5-Т 100 мг/л).

Таблица 10 Динамика содержания 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты при очистке воды с применением препарата Фенокс Время инкубации Концентрация 2,4,5-Т, мг/л 0 сутки 100,0 2 сутки 70,0 4 сутки 35,2 6 сутки 33,8 8 сутки 33,1 10 сутки 32,6 12 сутки 31,0 14 сутки 31,9 16 сутки 38,7 18 сутки 35,8 20 сутки 28,6 22 сутки 30,1 24 сутки 31,4 26 сутки 18,3 28 сутки 16,0

Содержание 2,4,5-Т в воде последовательно снижается после применения препарата Фенокс - ко 2-м суткам на 30%, и далее к 12-м - на 69%, а к 28-м суткам - на 84% (табл.10).

Пример 17.

Использование биопрепарата Фенокс для очистки промышленных стоков от фенолов

Биопрепарат Фенокс в виде сухого порошка следующего состава: сухая биомасса клеток - Bacillus subtilis ВКПМ В-10999, Rhodococcus erythropolis Ac-1882 и Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 в соотношении 1:1:1 в сумме - 10%; вермикомпост - 1%, вода, не более 10,0%, каолин - до 100%; титр живых клеток - 2×10⁹ КОЕ/г (приготовлен согласно примеру 4).

Перед применением в емкости (ведре, фляге) сухой порошок препарата хорошо перемешивают в теплой воде (25-30°С) до получения однородной суспензии.

В емкость с рабочим объемом, оборудованную мешалкой или устройством для барботажа воздуха, вносят 1,0 кг биопрепарата, 0,5 кг диаммофоски (азофоски) и добавляют 200 л теплой технической воды. Для активирования микроорганизмов суспензия перемешивается или продувается воздухом в течение 24 часов. Затем готовят рабочую суспензию препарата, добавляют в резервуар со сточными водами объемом 10 м³ стоков, 10 кг минеральных удобрений (азофоски) и 1 кг извести. Резервуар со стоками ежедневно продувают воздухом.

Загрязнение сточных вод ОАО «Уфахимпром» фенольными соединениями составляет 30,4 мг/л. Эффективность очистки сточных вод от фенолов биопрепаратом Фенокс оценивают без добавки и с добавкой минеральных удобрений в сточные воды (табл.11).

Таблица 11 Динамика очистки промышленных стоков от фенолов при применении биопрепарата Фенокс   Период после внесения штамма в стоки биопрепарата Фенокс, сут Вариант Содержание фенола, мг/л Эффективность очистки стоков от фенолов, %   0 2 5 7 0 2 5 7 Стоки 30,4 10,2 0,01 0,01 0 66,400 99,970 99,970 Стоки с добавкой минеральных солей 30,4 3,2 0,001 0,001 0 89,500 99,997 99,997

Степень очистки сточных вод от фенолов на 2-е сутки после внесения биопрепарата Фенокс достигает 66,4%, а к 5-м суткам составляет более чем 99%. Эффективность использования биопрепарата Фенокс для очистки от фенолов возрастает при добавлении в стоки минеральных солей, уже к 2-м суткам степень очистки стоков от фенола достигает 89,5%, а к 7 суткам - стоки освобождались от фенолов более чем на 99,997% (табл.11).

Пример 18.

Использование биопрепарата Фенокс для очистки промышленных стоков от фенолов.

Очистку промышленных стоков проводят согласно предыдущему примеру без добавки минеральных удобрений, но используют стоки ООО «Ново-Уфимского НПЗ» и ОАО «Дубитель».

Таблица 12 Динамика очистки промышленных стоков от фенолов при применении штамма биопрепарата Фенокс Вариант Период после внесения штамма биопрепарата Фенокс в стоки, сут Содержание фенола, мг/л Эффективность очистки стоков     от фенолов, % 0 1 3 7 0 1 3 7 Стоки нефтехимического предприятия 0,096 0,064 0,012 0,012 0 66,7 87,5 87,5 Стоки дубильного производства 0,750 - 0,155 0,155 0 - 79,4 79,4

Степень очистки сточных вод нефтехимического предприятия от фенолов на 1-е сутки после внесения биопрепарата Фенокс составляет 66,7%, а к 3-7-м суткам достигает 87,5%. Эффективность использования биопрепарата Фенокс для очистки от фенолов стоков дубильного производства составляет к 3-7 суткам 79,4% (табл.12).

Пример 19.

Применение препарата Фенокс для деструкции нефти в водной среде

Препарат в виде сухого порошка (состав согласно примеру 3) с титром 1×10⁹ КОЕ/г в количестве 100 мг вносят в 200 мл воды, загрязненной сырой нефтью (в концентрации 1%) с добавлением солей (K₂HPO₄ - 0,05%, NH₄Cl - 0,05%, СаСО₃ - 0,001%). Загрязненную нефтью воду после инокуляции препарата и минеральных солей азота, фосфора, калия и извести инкубируют в течение 10 суток при комнатной температуре в статических условиях, с ежедневным перемешиванием. Контролем служит вариант без внесения препарата. Повторность в опыте 3-кратная.

На поверхности воды в варианте с препаратом к 3-м суткам отмечают темные хлопья в объеме воды и более мелкие пятна нефти на поверхности, чем в контроле. На 5-е сутки в варианте с препаратом наблюдают небольшое количество пятен нефти на поверхности воды, примерно наполовину разрушена пленка нефти на стенках колбы. К 10-м суткам опыта отмечают небольшое количество нефти на поверхности воды и стенках емкости.

Массовую концентрацию нефтепродуктов в образцах измеряют на 10-е сутки на концентратомере КН-2 (производство ООО НЭП СИБЭКОПРИБОР, г.Новосибирск) спектрофотометрическим методом по уровню избирательного поглощения нефтепродуктами в инфракрасной области спектра на длине волны 3,42 микрометра [Методика выполнения измерений массовой концентрации НП в пробах питьевых, природных и сточных вод методом ИК-спектрофотометрии ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000, Новосибирск 1998, 17 с.]. Коэффициент вариации данных не более 5%.

Применение препарата снижает содержание нефти в воде на 28% (с 2652 мг/л в контроле до 1915 мг/мл в варианте биопрепаратом).

Пример 20.

Приживаемость бактериальных штаммов препарата в почве

Динамику популяции штаммов бактерий препарата в почве изучают в модельных экспериментах. Суспензию клеток в количестве 3×10⁸ клеток на 1 г почвы вносят в стеклянные флаконы с 50 г выщелоченного чернозема. Опыт включал 3 варианта: без ксенобиотика (контроль) и 2,4-Д в концентрациях, равных 100 и 10000 ПДК. ПДК для 2.4-Д в почвах - 0,1 мг/кг. Влажность почвы составляет 60% от полной влагоемкости. Периодически проводят выделение штаммов препарата Фенокс на минимальную солевую агаризованную среду М9 с добавлением 2.4-Д в качестве единственного источника углерода и энергии.

Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) штаммов бактерий в контрольной почве возрастает в течение 30 сут, а затем наблюдают падение плотности популяции этих бактерий (табл.13). В загрязненной 2,4-Д плотность популяции бактерий выше в течение первых 2,5 недель после внесения, чем в контроле, а затем постепенно снижается. В наиболее загрязненной почве численность бактерий Фенокса резко возрастает и в 10-50 раз превышает плотность популяции этого штамма в контроле. Такой подъем численности бактерий Фенокса обусловлен использованием ксенобиотика в качестве источника питания. Снижение количества бактерий Фенокса в почве этого варианта происходит после 30 суток. К 52 суткам плотность популяции внесенного штаммов на сходном уровне во всех вариантах, что свидетельствует о снижении в загрязненных почвах концентрации 2,4-Д, а также и возможном вовлечении в деградацию пестицида и других микроорганизмов.

Выявлена хорошая адаптации микроорганизмов к почвам. Аналогичные данные получают в опытах с почвами других типов - серой лесной, подзолистой почвой и ксенобиотиком в трех концентрациях, равных 100 ПДК, 1000 ПДК, 10000 ПДК. ПДК для 2.4-Д в почвах - 0,1 мг/кг.

Показана принципиальная возможность применения препарата настоящего изобретения в указанных типах почв.

Таблица 13 Динамика численности штаммов препарата Фенокс при внесении в загрязненный 2,4-Д пестицидом выщелоченный чернозем Период Динамика численности популяции клеток, КОЕ времени ×10⁵/г почвы Чистая почва Почва с 2,4-Д 100 ПДК Почва с 2,4-Д 1000 ПДК Почва с 2,4-Д 10000 ПДК 0 суток 0,00 0,00 0,00 0,00 9 суток 0,37 4,33 4,33 0,66 19 суток 13,40 50,50 4,30 700,00 30 суток 70,00 55,40 9,00 340,50 52 суток 1,70 3,00 2,70 0,98

Пример 21.

Использование биопрепарата Фенокс для очистки почвы от пестицида 2,4,5-Т (трихлорфеноксиуксусной кислоты)

Почву (100 г) из пахотного горизонта просеивают через сито диаметром 2 мм и помещают в стеклянные флаконы на 500 мл. В почву вносят 2,4,5-Т в количестве 100 мг/г и тщательно перемешивают.

Биопрепарат Фенокс с титром 10⁹ КОЕ/г (согласно примеру 5) инокулируют во флакон с почвой, увлажняют до 60% от полной влагоемкости и также перемешивают. Флаконы закрывают ватными пробками с парафилмом и инкубируют при постоянной влажности и температуре 25°С в термостате.

Определение 2,4,5-Т в почве проводят стандартным методом (ссылка). Повторность в опытах 3-кратная. Коэффициент вариации данных не более 8%.

Таблица 14 Динамика очистки почвы от 2,4,5-Т при применении биопрепарата Фенокс Показатель Время после обработки почвы, сут. 1 5 10 14 21 30 48 Содержание 2,4,5-Т в почве, мг/г 100 95,0 87,6 85,0 72,6 68,1 33,5 Степень очистки к контролю, % 0 5,0 12,4 15,0 27,4 31,9 66,5

Степень очистки почвы от 2,4,5-Т при использовании штамма биопрепарата Фенокс составляет через 14 сут - 15%, на 21 сут - 27,4% и 30 сут - 31,9% и достигает к 48 сут - 66,5%. Скорость разложения 2,4,5-Т существенно возрастает после 30 сут инкубации почвы с биопрепаратом Фенокс (табл.14).

Пример 22.

Применение препарата Фенокс для разложения пестицида (фунгицида) ТМТД в почве

Место проведения опыта: бетонная площадка, примыкающая к складу хранения пестицидов (Алтайский край, г.Бийск, ул. Пригородная, д.4).

В летний период на открытой бетонированной площадке устраивают делянку площадью 3 м² (размером 1×3 м), разграниченную деревянными перегородками высотой 20 см на 3 участка (повторности) размером 1×1 м. Дно делянок выкладывают полиэтиленовой пленкой для предотвращения распространения поллютантов из почвы в бетонную площадку. Делянки заполняют слоем черноземной почвы толщиной 15 см. На высоте 60 см от земли делянки закрывают нетканым укрывным материалом (спанбонд). В почву вносят пестицид (фунгицид) тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД) из расчета 50 г/м², вермикомпост в количестве 50 г/м², минеральное азотно-фосфорное удобрение, обогащенное микроэлементами, - 100 г/м² и органическое удобрение на основе торфа - 400 г/м² и тщательно перемешивают.

Препарат Фенокс в виде сухого порошка следующего состава: бактериальные клетки - 10%, вермикомпост - 1%, каолин - 89% с титром 5×10⁹ КОЕ/г (согласно примеру 4) в количестве 300 г растворяют в 15 литрах воды (25-30°С) и выдерживают 24 часа с периодическим перемешиванием для улучшения аэрации и активирования микроорганизмов. Суспензию биопрепарата наносят на поверхность делянки из расчета 5 л/м² путем дождевания с помощью лейки. Поверхность делянки дополнительно поливают водой в количестве 5 л/м² почвы.

Почву, загрязненную ТМТД, после обработки препаратом Phenox рыхлят для улучшения аэрации и осуществляют мульчирование тонким слоем древесных опилок. При необходимости и отсутствии дождей почву на делянке периодически рыхлят и увлажняют до 60-70% от полной влагоемкости. Для оценки эффективности очистки почвы от ТМТД методом усредненной пробы отбирают образцы через 1,5 и 3 месяца. Количественное содержание ТМТД в образцах определяют хроматографически. Коэффициент вариации данных не более 5%.

Через 1,5 месяца после обработки препаратом Phenox содержание ТМТД в почве снижается на 53%, через 3 месяца - на 75%.

Пример 23.

Применение препарата Фенокс для разложения пестицида (гербицида) дихлоральмочевина в почве

Опыт проводят аналогично примеру 22. В почву вносят пестицид (гербицид) дихлоральмочевина из расчета 50 г/м².

Через 1,5 месяца после обработки препаратом Phenox содержание ТМТД в почве снижается на 59%, через 3 месяца - на 78%.

Пример 24.

Применение препарата ФЕНОКС (Phenox) для очистки почвы от хлорароматических соединений

Место проведения опыта: Ростовская область, Сальский район.

Характеристика участка: земля сельскохозяйственного назначения, загрязненная хлорароматическими соединениями.

В летний период на открытой площадке размечают делянку площадью 530 м² (размером 66 м × 8 м), разграниченную на участки площадью 170 м² защитными полосами 0,5 м. Повторность в опыте 3-кратная.

В загрязненную почву вносят вермикомпост в количестве 100 г/м², минеральное азотно-фосфорное удобрение из расчета 10 г/м².

Препарат Фенокс (Phenox) в виде сухого порошка следующего состава: бактериальные клетки - 10%, вермикомпост - 1%, каолин - 89% с титром 5×10⁹ КОЕ/г (согласно примеру 4) в количестве 10 г/м² для получения рабочего раствора растворяют в емкости (ведре, фляге) и хорошо перемешивают в теплой воде (25-30°С) до получения однородной суспензии.

Рабочую суспензию препарата Phenox наносят на поверхность почвы из расчета 10 л/ м. Нанесение осуществляют путем дождевания с помощью любых предназначенных для этого машин и агрегатов. Обработку осуществляют при среднесуточных температурах почвы не ниже +5°С и не выше +30°С.

Внесенные биопрепарат и удобрения заделывают в верхний загрязненный слой почвы путем вспашки, перекапывания, культивации или другим приемам агрообработки.

Почву периодически рыхлят для улучшения аэрации и увлажняют до 60-70% от полной влагоемкости (при необходимости, отсутствии дождей). Почву на участке через две недели перепахивают и увлажняют.

Для оценки эффективности очистки почвы от хлорароматических соединений методом усредненной пробы отбирают образцы через 1,5 и 3 месяца. Количественное содержание хлорароматических соединений в образцах определяют стандартным методом (Рудаков и др., 2004). Коэффициент вариации данных не более 9%.

Через 1,5 месяца после обработки препаратом ФЕНОКС (Phenox) содержание хлорароматических соединений в почве снижается на 35%, через 3 месяца - на 68%.

Пример 25.

Оценка фунгицидной активности препарата

Фунгицидную активность штаммов бактерий В.subtilis ВКПМ В-10999, Rhodococcus erythropolis Ac-1882 и Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 препарата определяют стандартным методом агаровых блоков (Егоров, 1976).

Чашку Петри с твердой питательной средой засевают газоном грибной фитопатогенной культуры. Используют штаммы грибов, вызывающие поражения корней, увядания, пятнистость, корневые гнили - Fusarium oxysporum, Alternaria tennuisima, Alternaria alternata и серую гниль на листьях и плодах растений - Botrytis cinerea, гнили сельскохозяйственной продукции - Geotrichum candidum.

Каждую культуру засевают на 2 чашки со средой Чапека и на поверхность раскладывают блоки бактериальных штаммов, вырезанные с 5-суточного газона бактерий, на стандартном LB-агаре. Раскладывают по 4 блока бактериального штамма на каждую среду, засеянную фитопатогенным грибом. Чашки инкубируют в течение 2-х суток при 5°С (для диффузии антибиотических веществ в агар), а затем - при 25°С и устанавливают наличие зон подавления роста грибов.

Таблица 15 Фунгицидная активность штаммов бактерий препарата Бактериаль
ный штамм Размер зоны подавления гриба на 3 сут, мм Fusarium oxysporum Alternaria alternata Alternaria tennuisima Botrytis cinerea Geotrichum candidum Bacillus subtilis 1 3 -* 1 - Rhodococcus erythropolis 1 2 - 2 2 Pseudomonas putida 1 2 2 3 2 * - нет зоны подавления

Фунгицидную активность по отношению ко всем испытанным в опыте фитопатогенным грибам устанавливают у штамма Pseudomonas putida ВКПМ В-10997 и у штаммов В.subtilis ВКПМ В-10999, Rhodococcus erythropolis Ac-1882 к грибам, вызывающим преимущественно корневые инфекции и гнили (табл.15). То есть бактериальный препарат обладает фунгицицидной активность к патогенам, обусловливающим различные грибные заболевания растений.

Стимулирующая рост растений активность препарата

Пример 26.

Применение препарата для стимуляции роста растений редиса (СОСТАВ ПРЕПАРАТА?)

Препарат в виде сухого порошка следующего состава: бактериальные клетки - 10%, вермикомпост - 1%, каолин - 89% с титром 5×10⁹ КОЕ/г растворяют в 10 мл дистиллированной воды (разведение 1:10) и далее готовят последовательные разведения 1:100 и 1:1000. Семена редиса сорта Розово-красный с белым кончиком раскладывают на фильтровальную бумагу в чашки Петри по 25 штук на чашку Петри. Повторность в опыте 4-кратная. Семена обрабатывают суспензией препарата в количестве 2 мл на чашку Петри при помощи автоматического дозатора. Контролем служат варианты семян, прорастающие в дистиллированной воде, и семена, обработанные 0,05% раствором индолилмаслянной кислоты (ИМК) - стимулятором роста растений ауксинового типа. Чашки Петри с обработанными семенами инкубируют при естественном освещении и комнатной температуре во влажной камере.

Длину корней, длину проростков и сухую массу растений определяют на 5 сутки. Коэффициент вариации данных не более 5%.

Таблица 16 Показатели роста растений редиса при применении препарата Вариант обработки Показатель длина корня, мм длина проростка, мм сухая масса (воздушно-       сухой вес), г Контроль (вода) 69 30 0,27 Контроль (ИМК) 70 37 0,35 Препарат разведение 1:10 61 41 0,34 Препарат разведение 1:100 81 42 0,37 Препарат разведение 1:1000 58 38 0,32

Суспензии препарата стимулируют рост редиса красного и накопление биомассы. Максимальный эффект наблюдают от водной суспензии препарата 1:100. Препарат в разведении 1:100 увеличивает длину корней 5-суточного редиса с 69 до 81 мм (на 17%), длину проростков с 30 до 42 мм (на 40%), а сухая масса растений на 37%, с 0,27 до 0,37 г (табл.16).

Пример 27.

Применение препарата для стимуляции роста растений капусты

Опыт проводят аналогично примеру 26. Разведениями препарата обрабатывают семена капусты сорта Слава. Длину корней и проростков растений определяют через 5 суток.

Таблица 17 Показатели роста капусты сорта Слава при применении препарата Вариант обработки Показатель длина корня, мм длина проростка, мм Контроль(вода) 46 31 Контроль (ИМК) 52 36 Препарат разведение 1:10 64 35 Препарат разведение 1:100 69 37 Препарат разведение 1:1000 63 37

Водная суспензия препарата (при всех испытанных разведениях) увеличивает длину корней до 50% - с 46 до 63-69 мм и длину проростков на 19% - с 31 до 37 мм при разведении 1:100 и 1:1000 (табл.17). Полученные данные указывают на сильный стимулирующий эффект препарата на рост корней капусты сорта Слава.

Пример 28.

Применение препарата для стимуляции прорастания семян и роста растений клевера

Опыт проводят аналогично примеру 26. Разведениями препарата обрабатывают семена красного клевера. Через 5 суток определяют длину корня и длину проростка, всхожесть и сухую массу растений.

Таблица 18 Показатели роста красного клевера при применении препарата Вариант обработки Показатель длина корня, мм длина проростка, мм всхожесть, % сухая масса, г Контроль(вода) 18 30 88 0,07 Контроль (ИМК) 23 33 91 0,09 Препарат разведение 1:10 34 40 84 0,12 Препарат разведение 1:100 24 33 100 0,15 Препарат разведение 1:1000 25 36 96 0,12

Препарат в разведении 1:10 увеличивает линейные размеры растений - длину корня на 89% (с 18 до 34 мм) и длину проростка на 33% (с 30 до 40 мм). Препарат в разведении 1:100 способствует повышению всхожести на 14% - с 88 до 100% и накоплению сухой массы на 114% - с 0,07 до 0,15 г (табл.18). Итак, препарат оказывает сильный стимулирующий эффект на рост корней и накопление массы растений клевера.

Пример 29.

Применение препарата для стимуляции роста растений огурца

Опыт проводят аналогично примеру 26. Разведениями препарата обрабатывают семена огурца сорт Русская рубашка F1. Длину корней и проростков, всхожесть и сухую массу растений определяют через 6 суток.

Таблица 19 Показатели роста растений огурца при применении препарата Вариант обработки Показатель длина корня, мм длина проростка, мм всхожесть, % сухая масса, г Контроль(вода) 46 33 84 0,46 Контроль (ИМК) 59 38 92 0,55 Препарат разведение 1:10 74 41 96 0,72 Препарат разведение 1:100 71 41 100 0,70 Препарат разведение 1:1000 64 36 92 0,63

Водные суспензии препарата оказывают стимулирующее действие на рост огурца сорт Русская рубашка F1. Например, в водном разведении 1:10 препарат увеличивает длину корня на 61% - с 46 до 74 мм, длину проростка на 24% - с 33 до 41 мм, всхожесть на 14% - с 84 до 96% и сухую массу растений на 37% - с 0,46 до 0,63 г (табл.19). Препарат наиболее сильный эффект имеет на рост корней огурцов.

Пример 30.

Применение препарата для стимуляции прорастания семян свеклы

Опыт проводят аналогично примеру 26. Разведениями препарата обрабатывают семена свеклы сорт Детройт. Всхожесть семян определяют на 7 сутки.

Таблица 20 Всхожесть семян свеклы при применении препарата Вариант обработки Показатель всхожесть, % Контроль (вода) 92 Контроль (ИМК) 95 Препарат разведение 1:10 96 Препарат разведение 1:100 99 Препарат разведение 1:1000 96

Препарат в разведении 1:100 способствует повышению всхожести семян свеклы на 8% - с 92 до 99% (табл.20).

Пример 31.

Применение препарата для стимуляции роста растений лука

Опыт проводят аналогично примеру 26. Препаратом в разведениях 1:100 и 1:1000 обрабатывают семена лука сорт Кармен. Длину корней и проростков, всхожесть и сухую массу растений определяют через 10 суток.

Таблица 21 Показатели роста растений лука при применении препарата Вариант обработки Показатель длина корня, мм длина проростка, мм сухая масса, г Контроль (вода) 30 57 0,19 Контроль (ИМК) 33 61 0,21 Препарат разведение 1:100 34 69 0,28 Препарат разведение 1:1000 37 62 0,25

Препарат в разведении 1:1000 увеличивает длину корня на 23% - с 30 до 37 мм, длину проростка на 9% - с 57 до 62 мм и накопление растениями сухой массы на 32% - с 0,19 до 0,25 г (табл.21).

Пример 32.

Применение препарата для стимуляции роста растений моркови

Опыт проводят аналогично примеру 31. Разведениями препарата обрабатывают семена моркови сорт Красный великан. Через 10 суток определяют сухую массу растений.

Таблица 22 Вариант обработки Показатель сухая масса, г Контроль (вода) 0,03 Контроль (ИМК) 0,05 Фенокc+BL-5 разведение 1:10 0,04 Фенокс+BL-5 разведение 1:100 0,04 Фенокс+BL-5 разведение 1:1000 0,05

Препарат в разведении 1:1000 увеличивает сухую массу проростков моркови на 67% - с 0,03 до 0,05 г (табл.22).

Наличие пестицидов в почве, воде и промышленных стоках проводилось с помощью газохроматического метода определения пестицидов, описанного Рудаковым О.Б. и др. (Спутник хроматографиста. - Воронеж: Водолей, 2004. - 528 с.).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении нового биопрепарата для очистки воды, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси-α-масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола. Биопрепарат представляет собой ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-10997, Bacillus cubtilis ВКПМ В-10999 u Rhodococcus erythropolis ВКПМ - Ac-1882 в массовом соотношении (1-2):(1-2):1. При этом биопрепарат, как правило, содержит дополнительно сорбент, органические, минеральные и стимулирующие добавки и обладает стимулирующей рост растений активностью и фунгицидными свойствами. Полученный биопрепарат вводят в виде водного раствора путем дождевания в загрязненный грунт, почву или промышленный сток в эффективном количестве. Изобретение позволяет повысить очистку воды, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 22 табл., 1 ил., 29 пр.

1. Биопрепарат для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси-α- пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси-α-масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола, представляющий собой ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-10997, Bacillus cubtilis ВКПМ В-10999, u Rhodococcus erythropolis ВКПМ-Ac-1882 в массовом соотношении (1-2):(1-2):1.

2. Биопрепарат по п.1, содержащий дополнительно сорбент и возможно минеральные, органические и стимулирующие добавки.

3. Биопрепарат по п.1 или 2 для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот, таких как -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусной кислоты (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), а также 2,4-дихлорфенола и фенола, имидоклаприда.

4. Биопрепарат по п.1, дополнительно обладающий ростстимулирующим и фунгицидным действием.

5. Способ применения биопрепарата для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси-α-масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола, введением в загрязненный грунт, почву или промышленный сток препарата по любому из пп.1 или 2 в эффективном количестве.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что препарат вводят в количестве 10 кг сухого вещества в момент вспашки из расчета на 1 га земли.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что препарат вводят в виде водного раствора путем дождевания.