ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ Российский патент 2016 года по МПК B09C1/10 C12N1/26 C12N1/20 C12Q1/02 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв от нефтезагрязнений.

Сущность: представлен препарат для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащий биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10.

Препарат позволяет в сравнительно короткий срок произвести эффективную очистку почв от нефтезагрязнений.

Известен биопрепарат «Путидойл» (1. Авторское свидетельство СССР № 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), используемый для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Pseudomonas putida 36 (2. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. - 1990, №9. - С. 148-151). Его недостатком является сложная технология приготовления препарата, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование бактерий и, как следствие, их гибель или потерю необходимой активности вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий авторы применяют сложный комплекс мер: подогрев большого количества воды (5 м³) до +18+28°С, перемешивание, аэрирование и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно.

Известен способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в котором в качестве биопрепарата используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м² (3. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Автор(ы): Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ"), где ризоторфин - землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов.

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18+22°С, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+4+8°С).

Известен способ очистки почвы с использованием биопрепарата "Деворойл", содержащего консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica. Этот способ предусматривает при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин) (4. Патент RU 2114071. Способ очистки почвы, природных и сточных вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием биопрепаратов. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/26, C12Q 1/02. Заявка: 97107716/13, 22.05.1997. Опубликовано: 27.06.1998. Заявитель: Борзенков Игорь Анатольевич. Авторы: Борзенков И.А., Беляев С.С., Ибатуллин P.P., Поспелов М.Е., Свитнев А.И. Патентообладатель: Борзенков Игорь Анатольевич). Недостатком является то, что несмотря на добавление к бактериальной суспензии защитных веществ численность микроорганизмов снижается независимо от температуры хранения.

Известен бактериальный препарат, состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий (Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5-7,0·10⁹ кл./г. В качестве субстрата-носителя для иммобилизации микроорганизмов используют гамма-стерильный торф с рН 6,8-7,0 в количестве 40-45 мас. % и воду в количестве 58,95-53,25 мас. %. С целью поддержания нефтеокисляющей активности в процессе хранения в препарат дополнительно вводят питательные субстраты: аммоний щавелевокислый (0,05-1,0 мас. %) и нормальные парафины (1,0-1,5 мас. %). Срок годности биопрепарата - 6 месяцев при температуре 10-15°С с момента его изготовления (5. Патент RU 2053205. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. C1, C02F 3/34, C09K 3/32, В09С 1/10, В09С 101:00. Заявка: 94034274/13, 29.09.1994. Опубликовано: 27.01.1996. Заявитель: Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт. Авторы: Белонин М.Д., Рогозина Е.А., Свечина P.M., Хотянович А.В., Орлова Н.А. Патентообладатель: Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт). Биопрепарат содержит нефтеокисляющие бактерии, для поддержания жизнедеятельности которых требуется рН среды 6.8-7.0 и большое количество воды (около 60% воды), что снижает его эффективность во времени.

Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта-Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (6. Патент RU 2193464. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1:01. Заявка: 2001130686/13, 14.11.2001. Опубликовано: 27.11.2002. Заявители: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть". Авторы: Ившина И.Б., Костарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Патентообладатели: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть"). Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что не применимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудно восстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.

Нетрудоемким и наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ очистки почв от нефтяных углеводородов, предусматривающий иммобилизацию выделенных с конкретных загрязненных объектов углеводородокисляющих микроорганизмов на природном цеолите месторождения Хонгуруу и внесение его в почву, загрязненную нефтяными углеводородами. При этом степень деструкции осуществляется за 4 месяца (7. Ерофеевская Л.А., Бурмистрова Т.И., Алексеева Т.П., Терещенко Н.Н. // Цеолит как незаменимый компонент в реабилитации нарушенных земель. Биологические науки. Новое слово в науке и практике: гипотезы, апробация результатов исследований. 2013, №3. - С. 7-9).

Одним из недостатков данного способа является его относительно невысокая скорость (4 месяца) очистки загрязненных почв от нефти, что не всегда приемлемо в условиях короткого северного лета. Кроме того, получение препарата на основе выделенных с конкретных загрязненных объектов углеводородокисляющих микроорганизмов не всегда удобно при быстром реагировании для устранения аварийного разлива нефти в полевых условиях и требует дополнительного времени и выполнения дополнительных исследований: выезд на место аварийного разлива, отбор проб почвы для выделения микроорганизмов, культивирование и выделение микроорганизмов, контроль нефтеокисляющей способности выделенных культур микроорганизмов, накопление биомассы, иммобилизацию микроорганизмов на сорбент-носитель, высушивание полученного биопрепарата, контроль полученного препарата и т.д. Все эти этапы продлевают сроки подготовки почв к самовосстановлению. Следует также подчеркнуть, что в процессе окисления нефти практическое использование микробной деградации нефти определяется составом биопрепарата, что определяет жизнеспособность бактерий, их количеством и технологией использования препаратов в практических целях.

Еще одним недостатком данного способа является то, что он применим для очистки почв от свежих нефтезагрязнений и не применим для очистки почв с застарелыми нефтезагрязнениями (до 10 лет).

Задачей изобретения является ускорение процессов деструкции как свежего, так и застарелого нефтезагрязнения и сокращение сроков подготовки почв к самовосстановлению.

Технический результат заключается в снижении уровня нефтезагрязнения в почвах до 83% за 80 суток в почвах с застарелым нефтезагрязнением (10 лет) и до 53-55% за 60 суток - в почвах со свежим нефтезагрязнением.

Задача выполняется, а технический результат достигается созданием препарата для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащего биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10.

Характеристика штаммов.

1) Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D

Штамм Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D выделен из мерзлотного грунта (Якутск, Центральная Якутия).

Штамм характеризуется следующими признаками: грамположительные, неподвижные палочки. В односуточной культуре на минеральной среде Мюнца образует короткие толстые палочки. При делении наблюдается характерное расположение клеток под углом друг к другу.

На МПА формирует гладкие колонии, кремовато-розового цвета, диаметром 1-5 мм.

Штамм растет при температуре +4+30±1°С в аэробных условиях и слабо в анаэробных условиях. Оптимум роста +4+20±1°С.

Оксидазаотрицательный, не декарбоксилирует лизин, декарбоксирует орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен. Сероводород не продуцирует. Не активен в отношении инозита. Уреаза отрицателен. Тест с β-галактозидазой отрицателен. Не ферментирует лактозу, глюкозу, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии нефтяные УВ.

Устойчив к амоксиклаву, ампициллину, каотиму, амоксициллину, пефлоксацину, амосину. Слабоустойчив к левомицетину. Чувствителен к бензилпенициллину, мозивару, оксациллину, цефатоксиму, цефтриаксону, полимиксину, фуразолидону, метранидазолу.

При секвенировании вариабельных участков 16SpPHK получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16SpPHK тестируемый штамм отнесен к виду Rhodococcus sp.

Результаты обработки секвенсов представлены в таблице 1.

Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм наиболее близок к роду Rhodococcus, причем гомология с видами R. qingshengii и R. jialingiae составляет 100%.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).

Условия хранения:

1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°С.

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.

Штамм идентифицирован и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН (г. Пущино, Московской обл., пр. Науки, дом 5). Коллекционный номер ВКМ Ac-2626D.

2) Serratia plymuthica VKM B-2819D

Штамм Serratia plymuthica VKM B-2819D выделен из почвы, загрязненной арктическим дизельным топливом (Чапчылган, Центральная Якутия).

Штамм характеризуется следующими признаками: грамотрицательные, палочковидные, перитрихиальные, аспорогенные, хемороганотрофные, факультативно-анаэробные бактерии.

Растет при температуре +4+25±1°С, оптимум роста +4+15±°С в аэробных условиях, но может расти при температуре +30°С и в анаэробных условиях, однако теряет пигмент.

На МПА формирует влажные от малинового до оранжевого цвета колонии диаметром 1-3 мм. На минеральной среде Мюнца с нефтью растет в виде пастообразных колоний малинового цвета.

Оксидазаположительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен. Сероводород не продуцирует. Активен в отношении инозита. Уреазаположителен. Тест с β-галактозидазой положительный. Ферментирует сахарозу, маннит, сорбит, мальтозу. Не ферментирует лактозу, ацетат натрия, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии нефтяные УВ.

Устойчив к каотиму, амоксициллину, пефлоксацину, амоксиклаву, левомицетину, цефатоксиму, цефтриаксону, полимиксину, фуразолидону, метранидазолу, амосину. Слабоустойчив к бензилпенициллину, мозивару, оксациллину, ампициллину.

При секвенировании вариабельных участков 16SpPHK получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16SpPHK тестируемый штамм отнесен к виду Serratia plymuthica. Результаты обработки секвенсов представлены в таблице 2.

Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм наиболее близок к виду Serratia plymuthica (99,77%).

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).

Условия хранения:

1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°С.

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.

Штамм идентифицирован и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН (г. Пущино, Московской обл., пр. Науки, дом 5). Коллекционный номер VKM B-2819D.

Характеристика субстрата-носителя.

По мнению многих авторов для иммобилизации УОМ предпочтительны естественные минеральные и органические материалы. При этом сорбент-носитель, используемый для иммобилизации клеток УОМ, должен обладать следующими основными свойствами: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью.

Наиболее полно этим требованиям отвечает природный цеолит месторождения Хонгуруу (Западная Якутия) - каркасный аллюмосиликат, светло-зеленого цвета, в структуре которого имеются сообщающиеся полости, занятые крупными ионами различных элементов и молекулами воды, имеющими значительную свободу движения, благодаря чему происходят ионный обмен и обратимая дегидратация (8. Колодезников К.Е., Новгородов П.Г., Степанов В.В. Типы цеолитового сырья месторождения Хонгуруу // Перспективы применения цеолитовых пород месторождения Хонгуруу: Сб. науч. Тр. - Якутск: ЯНЦ СО РАН, 1993. - С. 5-13).

Кристаллическая решетка цеолитов сформирована тетраидами с хорошо развитой внутренней поверхностью, что обеспечивает сорбционную способность минералу и хорошую адгезию микробным клеткам, позволяя закрепляться нефтедеструкторам не только на поверхности носителя, но и внутри, что позволяет его использование в качестве сорбента - носителя для иммобилизации УОМ.

Установлено, что насыщение цеолита месторождения Хонгуруу нефтью происходит практически сразу после погружения образца в нефть. Через 1 минуту нефтеемкость образца достигает 0,4-0,5 г/г и не меняется в течение шести часов, что соответствует литературным источникам других исследователей (9. Аренс В.Ж., Саушин А.З., Гридин О.М., Гридин А.О. Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений. - М., Изд-во «Интербук», 1999. - 371 с.; 10. Новгородов П.Г., Ерофеевская Л.А., Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И. Влияние цеолита на деструкцию нефтяных углеводородов // Химия нефти и газа. - Тезисы докладов VII Международной конференции. - Томск - 2009. - С. - 843-846).

Являясь катализатором реакций деструкции нефтяных углеводородов, цеолит при внесении его в нефтезагрязненные почвы способствует и формированию в загрязненном грунте центров активной деструкции нефтяных углеводородов благодаря сорбции на его поверхности нефтеусваивающих культур микроорганизмов (11. Терещенко Н.Н., Лушников С.В., Пышьева Е.В. Рекультивация нефтезагрязненных почв // Экология и промышленность России. - 2002. - №10. - С. 17-20).

Внесение цеолита в нефтезагрязненную почву может усилить также ее азотфиксирующую способность за счет наличия в цеолите таких микроэлементов, как Мо и Fe, которые активируют нитрогеназный ферментный комплекс азотфиксирующих микроорганизмов (в частности, бактерии рода Azotobacter и цианобактерий) (12. Терещенко Н.Н., Лушников С.В., Пышьева Е.В. Биологическая азотфиксация как фактор ускорения микробной деструкции нефтяных углеводородов в почве и способы ее стимулирования // Биотехнология. - 2004. - №5. - С. 41-45).

Химический состав цеолита месторождения Хонгуруу позволяет использовать его как источник макро- и микроэлементов, необходимых для активации и питания нефтеокисляющих микроорганизмов почвы (13. Новгородов П.Г., Ерофеевская Л.А., Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И. Влияние цеолита на деструкцию нефтяных углеводородов // Химия нефти и газа. - Тезисы докладов VII Международной конференции. - Томск - 2009. - С. - 843-846) (таблица 3).

Физические характеристики цеолита месторождения Хонгуруу соответствуют значениям таблицы 4.

Таким образом, природный цеолит является перспективным сорбентом-носителем, используемым для иммобилизации клеток УОМ, так как обладает перечисленными выше основными свойствами, а именно: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью.

На основании выше изложенных результатов исследований был составлен препарат для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащий биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10.

Параметры и характеристики биопрепарата должны соответствовать значениям таблицы 5.

Технология приготовления препарата для очистки почв от нефтезагрязнений

- Получение маточной культуры

Для получения маточных культур используют агаровые культуры штаммов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D. Эти культуры являются посевным материалом, используемым для засева в ферментеры.

Для каждого бактериального изолята, являющегося на данном этапе производственным штаммом, готовят отдельный посевной материал и проводят культивирование в отдельном ферментере. При этом учитываются индивидуальные видовые и штаммовые особенности бактериального деструктора. Для получения маточной культуры используют минеральную среду (14. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки // Микробиология, 1963, №5, С. 1024-1030) следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7Н₂О - 0,08; NaCl - 0,1; K₂ HPO₄ - 0,14; KH₂ PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды.

Культуры изолятов, выращенные на скошенном ГРМ-агаре, основой которого является гидролизат рыбной муки либо мясо-пептонный агар (МПА) промышленного производства, смывают физиологическим раствором, готовят суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять 1×10⁹ кл/см^-3 по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича; объем - не менее 25-50 см³.

- Культивирование посевного материала в колбах

Питательную минеральную среду того же состава разливают по 150 см³ в колбы вместимостью 500 см³, в среду засевают 15-25 см³ бактериальной суспензии, приготовленной методом смыва. Туда же вносят 1,5 см³ стерильной нефти. Посевы в колбах инкубируют в УВМТ в течение 72 часов при 200 об/мин, температуре выращивания 29+1°С.

- Получение посевного материала для иммобилизации

Выращивание бактерий, составляющих основу препарата, проводят на той же среде; в качестве единственного источника углерода используют стерильную сырую нефть, концентрация углеводородсодержащих продуктов в ферментационной жидкости составляет не менее 1% (по объему). Процесс ферментации осуществляют при интенсивном перемешивании при температуре 29+1°С в течение 36-48 часов.

По окончании процесса культивирования наработанную жидкость сливают в стерильные емкости и используют для иммобилизации сорбента-носителя.

- Иммобилизация штаммов на сорбент-носитель

Посевной материал для иммобилизации смешивают в аппарате с мешалкой с цеолитовой крошкой фракции 1-3 мм, в соотношении 1:10 (1 часть бактериальной суспензии: Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D на 10 частей цеолитового сырья). После пропитки цеолита посевным материалом для иммобилизации его высушивают контактным способом при температуре 37°С до постоянной массы или при комнатной температуре в течение 2-х суток. Препарат готов к использованию. Сухой биопрепарат помещают в кеги или двухслойные полиэтиленовые мешки и запаивают. Препарат вносят в количестве 100 г на 10 кг почвы.

Параметры и характеристики препарата должны соответствовать значениям таблицы 5.

Требования к условиям производства и техники безопасности

Помещения для работы с микроорганизмами должны отвечать Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

К работам на оборудовании при работе с микроорганизмами и изготовлении сорбента-носителя должны допускаться лица, достигшие 18-летнего возраста, прошедшие обучение.

Все работающие должны проходить периодические медицинские осмотры в порядке, установленном органами здравоохранения (15. Приказ Минздравмедпрома России от 14.03.96 №90 «О порядке проведения предварительных и периодических медицинских осмотров работников и медицинских регламентах допуска к профессии»; Приказ Минздравсоцразвития России от 16.08.04 №83 «Об утверждении перечней вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся предварительные и периодические медицинские осмотры (обследования), и порядка проведения этих осмотров (обследований)» (с изменениями от 16 мая 2005 г.).

Выполнение требований техники безопасности должно обеспечиваться соблюдением соответствующих утвержденных инструкций и правил по технике безопасности при осуществлении соответствующих работ.

Технология биоремедиации нефтезагрязненных почв с применением препарата.

Препарат вносят в почву без предварительной подготовки, в том виде, в котором он поступил на объект, под поверхностную обработку из расчета 100 г препарата на 10 кг почвы.

Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах почвы выше +4°С. Допустимый уровень кислотности рН 5,0-8,0. Влажность почвы в пределах 40-60%. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата в почву - 30-45 суток.

Через 30-45 суток проводится повторный отбор почвенных проб на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.

Качество очистки почв от нефтезагрязнений контролируется весовым методом согласно инструкции по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома (16. РД 39-0147098-90. Инструкция по охране окружающей среды при строительстве скважин на нефть и газ на суше, 1990 г.).

Ускорение сроков восстановления (рекультивации почв) с применением препарата для очистки почв от нефтезагрязнений

Процесс самовосстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем в регионах с благоприятными климатическими условиями занимает 10-25 лет, в то время как деструкция нефти и ее производных в условиях Севера составляет минимум 50 лет (17. Оборин А.А., Калачникова И.Г., Масливец Т.А. и др. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: Сб. науч. Тр. М.: Наука, 1988. - С. 140-159). При соблюдении требований по условиям хранения, транспортировки и использованию предлагаемого препарата для очистки почв от нефтезагрязнений концентрация нефтепродуктов в почве не более 10%; глубина проникновения нефти до 20 см; температура не ниже +4°С; рН среды 5,0-8,0; влажность не менее 40-60%; аэрация почвы путем рыхления, поскольку в препарат входят аэробные бактерии, работающие при доступе кислорода воздуха, внесение препарата в нефтезагрязненную почву способствует созданию оптимальных условий для размножения и функционирования аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов, устойчивости растений к неблагоприятным факторам, что обуславливает стимулирование разложения нефти в почве и ведет к сокращению сроков восстановления нарушенных земель (до 3-5 лет). При низких концентрациях до 3% этот срок может быть сокращен до 1 года.

Для ускоренной рекультивации нефтезагрязненных почв необходимо соблюдение следующих мероприятий мероприятий:

1) нефтезагрязненные почвы необходимо смешать с чистым плодородным почвенным слоем или торфом;

2) по результатам агрохимических исследований (при необходимости) - внесение в расчетных дозах недостающих в почве минеральных компонентов в виде удобрений. Обычно в сельском хозяйстве для основного, предпосевного и местного внесения при посеве или для подкормки растений применяют азотно-фосфорно-калийные удобрения (нитроаммофорску, аммофоску или азофоску), Данные удобрения универсальны и используются на всех типах почв и под все сельскохозяйственные культуры. При основном внесении на черноземных и тяжелых глинистых почвах удобрения целесообразно вносить осенью, а на легких почвах - весной. Нормы внесения зависят от плодородия почвы и в среднем составляют 35-45 кг на гектар;

3) увеличение кратности обработки почв препаратом до 3-4 раз за 1 вегетационный сезон;

4) рыхление почвы не реже 1 раза в неделю;

5) поддержание оптимальной влажности и рН почвы;

6) посев многолетних нефтетолерантных трав (овсяница, пырей ползучий, пырейник сибирский, тимофеевка луговая, осот полевой, костер безостый, клевер луговой).

Использование предлагаемого препарата для очистки почв от нефтезагрязнений подтверждается конкретными примерами.

Пример 1. Очистка почвы от застарелых нефтезагрязнений

Препарат был испытан для очистки суглинистой почвы от застарелого нефтезагрязнения на территории нефтебазы, расположенной в Центральной Якутии. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до внесения биопрепарата составило 50294 мг/кг. Срок нефтезагрязнения 10 лет. Эффективность применения препарата оценивали по степени деградации нефтезагрязнения, динамике численности основных групп почвенных микроорганизмов и фитотоксичности почвы.

Содержание нефти в почве определялось весовым методом согласно инструкции по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома (18. РД 39-0147098-90. Инструкция по охране окружающей среды при строительстве скважин на нефть и газ на суше, 1990 г.).

Установлено, что степень биодеградации застарелого нефтезагрязнения в экспериментальном участке через 80 суток после внесения в почву препарата составила 83,58% (таблица 6).

Динамика биодеградации нефтезагрязнения согласовывалась с динамикой накопления гетеротрофных микроорганизмов, в том числе нефтедеструкторов, численность которых через 80 суток после внесения биопрепарата в почву увеличилась в среднем на 2 порядка (таблица 7).

Биотестирование показало, что в процессе очистки от застарелого нефтезагрязнения в почве экспериментального участка снизилась фитотоксичность, о чем свидетельствует увеличение процента прорастаемости семян тест-растений с 30 до 90%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности предлагаемого препарата для очистки почв от застарелого нефтезагрязнения.

Пример 2. Очистка почвы от свежих нефтезагрязнений

Препарат был испытан для очистки суглинистой почвы от свежего нефтезагрязнения в условиях лабораторного опыта. Эффективность применения препарата оценивали по степени деградации нефтезагрязнения и динамике численности основных групп почвенных микроорганизмов.

Содержание нефти в почве определялось весовым методом аналогично примеру 1.

Для эксперимента почву помещали в специальные емкости и добавляли необходимый объем нефти, после чего тщательно перемешивали для равномерного распределения. Затем в каждую емкость вносили препарат.

В качестве контроля использовалась почва, загрязненная нефтью, без добавления биопрепарата. Каждый опыт проводили в трех повторностях. Экспонирование опытов составило 60 суток при комнатной температуре. Схема модельного эксперимента представлена в таблице 8.

Установлено, что степень биодеградации свежего нефтезагрязнения за одно внесение в почву препарата через 60 суток составила 53,42-55,32% (таблица 11).

Динамика биодеградации нефтезагрязнения согласовывалась с динамикой накопления гетеротрофных микроорганизмов, в том числе нефтедеструкторов, численность которых через 60 суток после внесения биопрепарата в почву значительно увеличилась (таблица 9).

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности препарата для очистки почв от свежего нефтезагрязнения.

Таким образом, преимуществом предлагаемого препарата для очистки почв от нефтезагрязнений, является наличие в его составе биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ AC-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованных на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10, позволяющим в сравнительно короткий промежуток времени (60-80 суток) стимулировать в почвах как со свежим, так и с застарелым нефтезагрязнением (до 10 лет) микробиологическую деградацию нефтепродуктов (НП) и снижать фитотоксичность по отношению к высшим растениям.

Способ приготовления и использования предлагаемого препарата экономически выгоден, так как для своего осуществления не требует сложного технологического оборудования. А цеолит, служащий в данном способе носителем для микроорганизмов, является одновременно и доступным, и дешевым сырьем, поскольку цеолиты имеют поверхностное залегание и разрабатываются открытым способом. На месторождении Хонгуруу утверждены запасы 11462 тыс. тонн. По стоимости природные цеолиты в 20-200 раз дешевле субститутов.

Очистка почвы от нефтезагрязнений предлагаемым препаратом позволяет предотвратить распространение веществ-загрязнителей на сопряженные ландшафты и добиться устранения пятен загрязненного грунта, что значительно улучшает санитарно-экологическое состояние нарушенной территории.

Предлагаемый препарат для очистки почвы от нефтезагрязнений является экологически безопасным, поскольку основой для его приготовления являются природные образования - не патогенные микроорганизмы в составе: Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D и природный цеолит месторождения Хонгуруу (Западная Якутия).

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв от нефтезагрязнений. Препарат содержит биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на поверхности субстрата-носителя. В качестве субстрата-носителя используется природный цеолит месторождения Хонгуруу. Изобретение позволяет ускорить процесс деструкции нефтезагрязнений и сократить сроки восстановления почвы. 9 табл., 2 пр.

Препарат для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащий биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2626D и Serratia plymuthica ВКМ В-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10.