ПРИМЕНЕНИЕ ВОДНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ РАСТВОРЕНИЯ БИОМОЛЕКУЛ ИЗ ОБРАЗЦА ТКАНИ Российский патент 2021 года по МПК C12N15/10 A01N1/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению водной композиции для растворения биомолекул из образца ткани и к способу применения водной композиции для растворения биомолекул из образца ткани. Кроме того, настоящее изобретение относится к системе для приготовления образца ткани животного.

Уровень техники

Бирки для отбора образцов ткани в настоящее время обычно используют для маркировки животных поголовья домашнего скота и в то же время для забора образца у указанного животного. Впоследствии такой образец анализируют в лаборатории на наличие или отсутствие определенных генетических признаков, патогенов или для генотипирования указанного животного. В альтернативном случае образец просто хранится для отслеживания происхождения животного, у которого он был взят.Образцы тканей могут быть получены с помощью бирки для отбора образцов ткани или устройства для отбора проб ткани, такого как игла для биопсии. Бирки для отбора образцов ткани широко известны и предлагаются на рынке, например, заявителем Allflex Europe S.A. («Альфлекс Юроп С.А.»).

Для дальнейшего анализа образца его необходимо дополнительно обработать. Обработку обычно выполняют в лаборатории, куда образец транспортируют после забора у животного. В документе WO 99/12475 описана капсула для проб ушной бирки, которая содержит неуказанные реагенты для дальнейшей обработки пробы. В документе ЕР 1088212 описана ушная бирка, которая содержит контейнер для помещения образца, в котором содержится материал для инактивации белковой части образца ткани. Примеры такого материала для инактивации белковой части образца ткани: протеиназа К, сильнощелочной раствор, молекулярное сито и другие компоненты, обеспечивающие инактивацию белковой части в образце. В соответствии с этим подходом образец ткани содержится в контейнере, где его белковая часть инактивирована. Образец транспортируют в лабораторию, где выполняют его фактический анализ. Процедура, описанная в предшествующем уровне техники, является трудоемкой и продолжительной по времени. Она состоит из нескольких этапов клинических исследований в лаборатории и в конечном итоге может привести к полной утрате образца.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение было разработано для усовершенствования способа, известного из уровня техники. Соответственно, задачей настоящего изобретения является предложить методику, обеспечивающую более быструю обработку образцов ткани. Кроме того, задачей настоящего изобретения является разработка методики, которая позволит хранить образец ткани в течение более длительных периодов времени, и при этом, в то же время, позволяет выполнить быстрый анализ образца с точки зрения конкретных генетических признаков, его генотипа, наличия или отсутствия определенных патогенов, таких как вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV).

Все эти задачи решаются с помощью применения водной композиции для растворения биомолекул, выбранных из нуклеиновых кислот, предпочтительно ДНК, и белков, из образца ткани животного и для последующей

a) консервации указанных биомолекул или

b) дополнительной обработки указанных биомолекул, причем такое применение включает в себя следующие этапы:

- забор образцов ткани животного для приготовления образца ткани указанного животного и

- сразу после забора образцов воздействие на указанный образец ткани водной композицией путем осуществления контакта указанного образца с указанной композицией в течение заданного периода времени, где указанная композиция содержит

- буфер, обеспечивающий забуферивание при pH от 7 до 9 при температуре 25°C, необязательно включающий в себя регулятор pH, например, подкислитель или подщелачивающий агент,

- детергент

- соль с концентрацией 5-10 мас. %,

- хелатирующий агент и воду,

при этом образец указанной ткани животного берут с использованием бирки для отбора образцов ткани, предпочтительно ушной бирки, или иглы для биопсии для отбора образцов ткани, и при этом указанный образец приводят в контакт с указанной композицией путем введения указанного образца в указанную композицию, причем с помощью воздействия указанной композицией на указанный образец в композиции растворяют биомолекулы из указанного образца ткани, выбранные из нуклеиновых кислот и белков, для приготовления раствора биомолекул,

- использование указанного раствора биомолекул для консервации указанных биомолекул или для дополнительной их обработки, такой как обнаружение патогена (патогенов), например, вируса диареи крупного рогатого скота, или для генотипирования, секвенирования, анализа гибридизации или количественной ПНР в режиме реального времени; или использование указанного раствора биомолекул для обнаружения маркерных белков или маркерных нуклеиновых кислот, лекарственных средств, гормонов или метаболитов,

- необязательное использование части указанной водной композиции для хранения указанного образца ткани для последующего использования.

В одном варианте изобретения указанную водную композицию содержат в подходящем контейнере, при этом такой контейнер предпочтительно перед отбором образцов ткани составляет часть указанной бирки или иглы для биопсии, причем такой контейнер является, тем не менее, отделяемой частью указанной бирки или иглы для биопсии, и после отбора образцов ткани может и/или будет отсоединен от них.

В одном варианте изобретения указанный этап воздействия происходит в течение периода времени от 0,1 до 10 секунд после отбора образцов, предпочтительно от 0,1 до 5 секунд после отбора образцов.

В одном варианте изобретения указанная водная композиция также содержит подщелачивающий агент, такой как гидроксид щелочного металла, более предпочтительно NaOH или КОН.

В одном варианте изобретения указанной солью является NaCl, который присутствует в концентрации от 1М до 2М, предпочтительно от 1М до 1,5М, более предпочтительно от 1,3М до 1,5М, еще более предпочтительно 1,4М.

В одном варианте изобретения в указанной водной композиции отсутствует протеиназа K, предпочтительно, отсутствует любая протеиназа.

В одном варианте изобретения указанный детергент в указанной композиции представляет собой N-лауроилсаркозин, предпочтительно натриевую соль N-лауроилсаркозина.

В одном варианте изобретения указанным буфером является Трис и/или указанным хелатирующим агентом является ЭДТА, предпочтительно дигидрат двунатриевой соли ЭДТА.

В одном варианте изобретения указанная водная композиция содержит, а предпочтительно состоит из следующих компонентов:

и, необязательно, краситель, указывающий на присутствие биомолекул, предпочтительно, нуклеиновых кислот.

В одном варианте изобретения указанная водная композиция содержит, а предпочтительно состоит из следующих компонентов:

В одном варианте изобретения указанный раствор биомолекул используют для дополнительной обработки указанных биомолекул, причем указанная дополнительная обработка представляет собой обнаружение BVDV в указанном растворе биомолекул и, таким образом, в указанном образце ткани, при этом указанное обнаружение BVDV предпочтительно осуществляют с помощью амплификации нуклеиновых кислот и обнаружения указанных амплифицированных нуклеиновых кислот или с помощью обнаружения белков BVDV на основе антител, такого как ELISA (иммуносорбентный ферментный анализ) белков BVDV.

Задачи настоящего изобретения также решаются с помощью системы для приготовления образца ткани животного для последующего

a) генотипирования указанной ткани,

b) обнаружения патогена в указанной ткани или

c) хранения и консервации указанного образца ткани для последующего использования,

при этом указанная система содержит бирку для отбора образцов ткани, предпочтительно ушную бирку для отбора образцов ткани, или иглу для биопсии для отбора образцов ткани, и водную композицию для растворения биомолекул из образца ткани животного, при этом указанная композиция помещена в контейнер и имеет определенный выше состав.

В одном варианте изобретения указанная водная композиция помещена в подходящий контейнер, который предпочтительно перед отбором образцов ткани включен в указанную бирку для отбора образцов ткани или иглу для биопсии для отбора образцов ткани, при этом такой контейнер является, тем не менее, отделяемой частью указанной бирки или иглы, и после отбора образцов ткани может и/или будет отсоединен от них.

Термин «система для подготовки образца ткани животного» в контексте настоящего документа относится к комбинации продуктов, функционально связанных друг с другом. Продуктами, входящими в такую систему, является бирка для отбора образцов ткани, предпочтительно ушная бирка для отбора образцов ткани, или, вместо бирки для отбора образцов ткани, игла для биопсии для отбора образцов ткани, и функционально связанная с ней водная композиция для растворения биомолекул из образца ткани по настоящему изобретению. Термин «функционально связан», в контексте настоящего документа, может относиться к физической связи между биркой для отбора образцов ткани или иглой для биопсии для отбора образцов, с одной стороны, и водной композицией, с другой стороны, или он может относиться к схеме, в которой использована водная композиция по настоящему изобретению таким образом, что после отбора образца ткани такой образец ткани может быть немедленно контактирован с водной композицией по настоящему изобретению, причем композиция не находится в физическом контакте с биркой для отбора образцов ткани или ее частями. Например, в одном варианте изобретения указанная водная композиция может содержаться в подходящем контейнере, при этом такой контейнер до отбора образцов ткани предпочтительно образует часть бирки или иглы или системы для отбора образцов ткани, при этом такой контейнер является, тем не менее, отделяемой частью указанных бирки, или иглы, или системы, и после отбора образцов ткани может и/или будет отсоединен от нее. Термин «контактировать с», как использовано в настоящем документе и в контексте контакта образца с композицией, может относиться к действию, с помощью которого образец ткани вводится в физическую связь с водной композицией. Таким действием может быть промывание, вымачивание, впитывание, погружение, окунание, обмакивание или полное или частичное покрытие образца ткани указанной водной композицией. Термин «бирка для отбора образцов ткани», при использовании в настоящем документе, относится к устройству, которое выполнено с возможностью обеспечения животного меткой или маркировкой (которая остается на животном, с животным или прикрепленной к животному иным путем), одновременно с получением образца ткани от животного для последующего использования. Термин «устройство для отбора образцов ткани» или синонимичный ему термин «игла для биопсии для отбора образцов ткани», как использовано в настоящем документе, означает инструмент, с помощью которого, например, путем соскабливания, перфорирования, разрыва или другого действия, может быть получен образец ткани от животного, но без прикрепления к животному бирки или метки, например бирки, изготовленной из пластмассы, металла или дерева.

Задачи настоящего изобретения также решаются способом применения водной композиции для растворения биомолекул, выбранных из нуклеиновых кислот, предпочтительно ДНК, и белков, из образца ткани животного и для последующей

a) консервации указанных биомолекул или

b) дополнительной обработки указанных биомолекул, при этом указанный способ включает в себя этапы:

- отбор образцов ткани животного для получения образца ткани указанного животного и

- сразу после отбора воздействие на указанный образец ткани водной композицией путем осуществления контакта указанного образца с указанной композицией в течение заданного периода времени, где указанная композиция содержит

- буфер, обеспечивающий забуферивание при pH от 7 до 9 при температуре 25°C, необязательно включающий в себя регулятор рН, например, подкислитель или подщелачивающий агент,

- детергент

- соль с концентрацией 5-10 мас. %,

- хелатирующий агент и воду, при этом образец указанной ткани животного берут с использованием бирки для отбора образцов ткани, предпочтительно ушной бирки, или иглы для биопсии для отбора образцов ткани, и при этом указанный образец приводят в контакт с указанной композицией путем введения указанного образца в указанную композицию, причем с помощью воздействия указанной композицией на указанный образец в композиции растворяют биомолекулы из указанного образца ткани, выбранные из нуклеиновых кислот и белков, для приготовления раствора биомолекул,

- использование указанного раствора биомолекул для консервации указанных биомолекул или для дополнительной их обработки, такой как обнаружение патогена (патогенов), например, BVDV, или для генотипирования, секвенирования, анализа гибридизации или количественной ПЦР в режиме реального времени; или использование указанного раствора биомолекул для обнаружения маркерных белков или маркерных нуклеиновых кислот, лекарственных средств, гормонов или метаболитов,

- необязательное использование указанной водной композиции для хранения указанного образца ткани для последующего использования.

В одном варианте изобретения указанная водная композиция содержится в подходящем контейнере, при этом такой контейнер до отбора образцов ткани предпочтительно образует часть указанной бирки для отбора образцов ткани или иглы для биопсии для отбора образцов ткани, причем такой контейнер является, тем не менее, отделяемой частью указанных бирки или иглы, и после отбора образцов ткани может и/или будет отсоединен от них.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что можно инициировать обработку образца ткани сразу же после его забора у животного, путем немедленного воздействия на него подходящей водной композицией по настоящему изобретению. В соответствии с вариантами настоящего изобретения такая подходящая водная композиция характеризуется высокими концентрациями соли, по меньшей мере 5-10 мас. % или по меньшей мере 1 М, присутствием детергента, хелатирующего агента и буфера. После забора образца ткани у животного образец ткани немедленно подвергается воздействию водной композиции по настоящему изобретению. Термин «немедленно», при использовании в настоящем документе, означает период времени, который составляет от 0,5 секунды до 2 минут, предпочтительно от 0,5 секунд до 20 секунд, более предпочтительно от 0,5 секунд до 5 секунд. Время последующего воздействия, в течение которого образец подвергается воздействию указанной водной композиции, может представлять собой любой период от 5 мин до нескольких часов, например, 1, 2, 3, … 12, … 24, … 48, … 72, … 120, … 168, 336, 720 часов. Водная композиция в соответствии с настоящим изобретением не только помогает хранить и/или консервировать образец, но также растворять биомолекулы из такого образца, выбранные из нуклеиновых кислот и белков, в композицию, которая, таким образом, может быть впоследствии использована напрямую без каких-либо дополнительных этапов клинических исследований. В соответствии с настоящим изобретением водная композиция содержит буфер, который может обеспечить забуферивание при рН от 7 до 9 при температуре 25°C, детергент, соль с концентрацией по меньшей мере 5-10 мас. % или по меньшей мере 1 М, хелатирующий агент и воду и, необязательно, регулятор рН, например, подкислитель или подщелачивающий агент. В одном варианте концентрация указанной соли находится в диапазоне от 5 до 10 мас. % или от 1 М до 3 М, предпочтительно 1-2 М, более предпочтительно 1-1,5 М. Пригодные буферы очень разнообразны. Хорошим примером является Трис.

Термин «буфер», как использовано в настоящем документе, означает понятие, понятное специалисту в данной области техники. Более конкретно, это относится к сочетанию слабой кислоты и ее соль с сильным основанием или слабого основания и его соль с сильной кислотой, и такое сочетание при растворении в воде может поддерживать значение рН в определенном диапазоне. Такой «буфер» также может быть именоваться «буферной системой». Подходящие буферы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают в себя, помимо прочего, TAPS, бицин, Трис, трицин, TAPSO, HEPES, TES и MOPS.

Не связывая себя какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что водная композиция по настоящему изобретению может забирать в себя биомолекулы из образца ткани животного после воздействия указанной водной композиции на указанный образец ткани. Возможно, эти биомолекулы вытекают из образца ткани из-за механического лизиса/разрыва некоторых клеток в образце ткани в результате манипуляции по отбору образца ткани, такой как отщипывание, срезание или соскребание, или, возможно, некоторые из биомолекул выделяются из образца ткани из-за присутствия детергента в водной композиции по изобретению. «Биомолекулами», которые инкорпорируются в водную композицию по изобретению, предпочтительно растворены в ней, могут быть нуклеиновые кислоты, белки или оба, из указанных образцов ткани. Дополнительно или альтернативно такими «биомолекулами» могут быть метаболиты или посторонние вещества, такие как лекарственные средства, которые содержались в образце ткани. «Биомолекулами» могут быть биомолекулы животного, у которого был взят образец ткани, или это могут быть биомолекулы, обусловленные патогеном, воздействующим на животное. В предпочтительном варианте изобретения биомолекулами, забранными водной композицией по настоящему изобретению, являются нуклеиновые кислоты. В другом варианте изобретения такими биомолекулами являются белки. В дополнительном варианте изобретения такие биомолекулы представляют собой сочетание как нуклеиновых кислот, так и белков.

«Нуклеиновыми кислотами», как использовано в настоящем документе, являются ДНК, РНК или их смесь.

В качестве детергента указанной композиции могут использоваться различные средства. Подходящие примеры включают в себя SDS или N-лауроилсаркозин, предпочтительно его натриевая соль. Существует также множество примеров хелатирующих агентов, подходящим является ЭДТА, предпочтительно ЭДТА ⋅ 2 Na⋅2H₂O. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что водная композиция позволяет насколько это возможно сохранить ткань неповрежденной, для потенциального будущего использования, что, таким образом, облегчает ее дальнейший анализ в лаборатории, поскольку композиция растворяет биомолекулы, получаемые из образца. Такие биомолекулы присутствуют в водной композиции в достаточно высоких концентрациях для обеспечения возможности дальнейшей обработки такого (жидкого) раствора биомолекул в водной композиции. Таким образом, например, нуклеиновые кислоты и/или белки животного, а также патоген, поражающий указанное животное, например, вирус, например, BVDV, можно выделить из ткани после воздействия водной композиции на образец. Это может быть выполнено всего за несколько минут, т.е. когда образец перевозят с фермы в лабораторию. При использовании в настоящем документе термин «животное» означает любой скот или сельскохозяйственных животных, предпочтительно крупный рогатый скот, овец, свиней, лошадей и других соответствующих животных поголовья домашнего скота.

Водная композиция в соответствии с настоящим изобретением также может быть использована для консервации растворенных в нем биомолекул. Таким образом, водная композиция в соответствии с настоящим изобретением служит не только для немедленной дополнительной обработки растворенной в нем биомолекулы (биомолекул), но также для длительного хранения либо образца ткани, который помещен в него, либо биомолекул, которые были растворены в водной композиции. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что биомолекулы, растворенные в указанной водной композиции, могут храниться в ней в течение длительного времени, например, от нескольких недель до нескольких месяцев. Аналогичным образом, образец ткани можно хранить в водной композиции по настоящему изобретению в течение длительного времени, например, от нескольких недель до нескольких месяцев. Примерный период такого хранения биомолекул или образца ткани составляет от 1 недели до 12 месяцев, например, 2, 3, 4 недели, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев.

В одном варианте изобретения водная композиция не содержит протеиназу К, предпочтительно, вообще не содержит какую-либо протеиназу. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что, несмотря на отсутствие протеиназы К или любой другой протеиназы, все-таки возможно получить достаточно высокие концентрации нуклеиновой кислоты и достаточную степень ее чистоты для дополнительной обработки, например, для генотипирования или обнаружения патогенов, например, BVDV.

В одном варианте изобретения соль присутствует в водной композиции по изобретению в высоких концентрациях, предпочтительно в диапазоне от 1 М до 3 М, предпочтительно от 1 М до 2 М, более предпочтительно от 1 до 1,5 М, более предпочтительно от 1,3 М до 1,5 М, еще более предпочтительно около 1,4 М. В одном варианте изобретения такой солью является NaCl.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что использование высоких концентраций соли в водной композиции в сочетании с биркой для отбора образцов ткани или иглой для биопсии для отбора образцов ткани позволяет обрабатывать и, при желании, хранить/законсервировать образец ткани в течение длительного времени без больших сложностей. В частности, водная композиция, содержащая высокие концентрации соли по изобретению, сама может быть использована для дальнейшего анализа после ее воздействия на образец ткани. Для многих способов последующего применения присутствие высоких концентраций соли не влияет на дальнейший анализ биомолекул, содержащихся в такой водной композиции с высоким содержанием соли. В тех случаях, когда наличие высоких концентраций соли в водной композиции препятствует последующему использованию, такие высокие концентрации соли могут быть легко удалены с помощью простого этапа обессоливания или этапа диализа без влияния на содержание биомолекул в композиции. Например, обессоливание можно легко выполнить при помощи подходящих обессоливающих колонок, доступных на рынке, например, обессоливающих колонок PD-10 от компании GE Healthcare.

В водной композиции по настоящему изобретению могут присутствовать различные детергенты. Предпочтительным детергентом является N-лауроилсаркозин, предпочтительно его натриевая соль. Как представляется, N-лауроилсаркозин особенно подходит в случае высокой концентрации соли, присутствующей в указанной водной композиции. В настоящем изобретении предпочтительным буфером является Трис, а предпочтительным хелатирующим агентом является ЭДТА, предпочтительно дигидрат двунатриевой соли ЭДТА.

В настоящем изобретении водная композиция может быть использована для консервации биомолекул или образцов тканей на продолжительное время и/или для последующей обработки указанных биомолекул и/или образцов тканей. Такой дополнительной обработкой может быть диагностический тест на геномную ДНК образца ткани, взятого у животного, который может включать генотипирование такого образца ткани, т.е. обнаружение наличия или отсутствия определенных генетических признаков. Такое генотипирование может включать в себя идентификацию полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP), обнаружение случайной амплифицированной полиморфной геномной ДНК (RAPD), обнаружение полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLPD), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), секвенирование ДНК, зонды аллель-специфического олигонуклеотида (ASO), гибридизацию с микрочипами нуклеиновых кислот или сферами. В некоторых вариантах изобретения дополнительная обработка также или альтернативно может включать в себя обнаружение патогенов. Такими патогенами могут быть вирусы, бактерии или эукариотические одноклеточные или многоклеточные организмы, например, паразиты. Обнаружение таких патогенов может быть выполнено через их нуклеиновые кислоты или их белки. Обнаружение нуклеиновых кислот выполняют в уже описанном порядке, с использованием соответствующей технологии нуклеиновых кислот, например, подходящей методологии амплификации/детектирования, например, экспериментов по гибридизации, ПЦР в режиме реального времени, гибридизации на микрочипе, или чипе, или сфере, на которых иммобилизуются соответствующие зонды нуклеиновых кислот, и т.д. Типичным примером такого иммуносорбентного анализа является ELISA. Используя в качестве примера BVDV, можно обнаружить его детектированием его соответствующей нуклеиновой кислоты (кислот) или специфических белков, типичных для него. В одном варианте изобретения обнаружение белков BVDV выполняют при помощи любого белка, пригодного для этой цели, который присутствует в BVDV, например, белка, выбранного из Npor, капсидного белка, гликобелка оболочки, такого как ERNS, Е1 или Е2, неструктурных белков, таких как р7, NS2, NS3, NS4A, NS4B и т.д.

В дополнительном варианте изобретения раствор биомолекул в водной композиции по настоящему изобретению также может быть дополнительно использован для обнаружения других агентов, например, наличия или отсутствия специфических маркеров, наличия или отсутствия лекарственных веществ, ранее или предположительно введенных животному, наличия или отсутствия определенных гормонов и/или наличия или отсутствия метаболитов в образце ткани и, следовательно, у животного.

Согласно одному варианту настоящего изобретения указанную водную композицию используют для обнаружения патогенов, в частности, BVDV, в образце ткани животного. Такое обнаружение может быть осуществлено с использованием любых подходящих средств на растворе биомолекулы, полученном из указанного образца ткани, и на нем можно использовать любую подходящую методологию амплификации/детектирования, например, эксперименты по гибридизации, количественную ПЦР в режиме реального времени, гибридизацию на микрочипе или чипе или сфере, на которых иммобилизуются соответствующие им зонды нуклеиновых кислот, проточную цитометрию, иммуногистохимическое исследование и другие подходящие методики. Водная композиция по настоящему изобретению может быть залита в подходящий контейнер, и в таком подходящем контейнере любой полученный образец ткани будет подвергаться воздействию такой водной композиции. Такой подходящий контейнер в одном варианте изобретения может быть функционально связан с биркой для отбора образцов ткани или иглой для биопсии для отбора образцов ткани или системой отбора образцов ткани. Например, контейнер может быть отделяемой частью указанных бирки, или иглы, или системы отбора образцов ткани, при этом такой контейнер позволяет вводить образец ткани в указанный контейнер немедленно после забора/отбора, и такой контейнер затем может быть отделен или отсоединен, или высвобожден или извлечен из указанных бирки, или иглы, или из указанной системы для отбора образцов ткани для последующей дополнительной обработки или исследования, или хранения указанного образца ткани. Во время использования водной композиции образец ткани подвергают воздействию указанной водной композиции сразу после отбора пробы в порядке, описанном выше.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 показаны результаты воздействия на образцы ткани, полученные у крупного рогатого скота, водной композиции по настоящему изобретению и последующего их анализа с помощью гель-электрофореза.

На Фиг. 2 показаны результаты экстракции образцов тканей, полученных у крупного рогатого скота, которые хранили в водной композиции по настоящему изобретению в течение двух недель (т.е. выполнено архивирование образцов), при этом образцы затем повторно подвергали воздействию свежеприготовленной водной композиции из примера 1, а затем анализировали раствор, полученный после такого повторного воздействия.

Как и на Фиг. 1, результаты, показанные на Фиг. 2, представлены в форме фотографии геля растворенных нуклеиновых кислот.

На Фиг. 3 показаны результаты разделения гель-электрофорезом геномной ДНК образцов, хранящихся в течение 12 месяцев в композиции, приготовленной в соответствии с примером 1.

Осуществление изобретения

Кроме того, в настоящем описании делается ссылка на следующие примеры, которые приведены для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1; Водная композиция в соответствии с настоящим изобретением

Один литр водной композиции по изобретению получают смешиванием следующих веществ:

1,576 грамма ТРИС

0,342 грамма гранул NaOH

0,744 грамма ЭДТА.2Na.2H2O

2 грамма натриевой соли N-лауроилсаркозина

81,82 грамма NaCl

долить ультрачистой воды до получения объема 1 литр

в молярных концентрациях:

Трис MS 121,14 - 1,576 г/л ≡ 13 мМ

NaOH MW 39,997 - 0,342 г/л ≡ 8,55 мМ

ЭДТА 2 Na 2H₂O MW 372,24 - 0,744 г/л ≡ 1,999 мМ

Натриевая соль N-лауроилсаркозина MW 293,38 - 2 г/л ≡ 6,81 мМ

NaCl MW 58,44 81,82 г/л ≡ 1,4 М

долить ультрачистой воды до получения объема 1 литр

Пример 2: Испытание водной композиции в соответствии с примером 1 при помощи бирки для отбора образца ткани (TST) и устройства для отбора образца ткани (TS U) компании Allflex

Бирки для отбора образцов тканей (TST) и устройства для отбора образцов ткани (TSU) также предлагаются на рынке, например, заявителем Allflex Europe S.A.

Цель исследования в этом примере состоит в проверке, может ли бирка для отбора образцов тканей (TST) и устройство для отбора образцов ткани (TSU)) (= игла для биопсии для отбора образцов ткани) Allflex обеспечить получение достаточной ДНК для анализа при помощи BeadChip (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), используя только водную композицию из примера 1, в которой сохраняется образец, вместо самого образца ткани.

Материалы и методы

Шесть неповрежденных ушей были получены на бойне для тестирования. Все образцы были получены несколькими отщипываниями, и для подтверждения результатов теста были включены положительные и отрицательные контрольные образцы. В исследование были включены и TST, и TSU, которые тестировались независимо.

Аликвоты композиции по изобретению (пример 1) отбирали из образцов через 0, 3, 19, 24, 48, 72, 168, 336, 720 часов. Для тестирования стабильности композиции было выполнено исследование с пополнением, в котором пять недель подряд добавляли новую водную композицию к 6 образцам, сливая оставшийся в пробирке буфер.

Все образцы были протестированы на GGP LD Bovine BeadChip (GeneSeek, Линкольн, Небраска, США). Для определения качества данных использовались сгенерированные уровни распознаваний. В качестве действительного результата теста принимается уровень распознавания > 0,85.

Результаты

Всего было успешно генотипировано 156 образцов. Три образца не соответствовали критерию получения уровня распознавания > 0,85. Повторное тестирование образцов не выполняли. В среднем, наблюдаемый уровень распознавания, без учета неудачных образцов, составил 0,985.

Результаты исследования стабильности показывают средний уровень распознавания 0,993 для системы TSU и 0,953 для образцов TST. Исследование с пополнением позволило выявить некоторое снижение уровня распознавания после пополнения состава в четвертый раз для образцов TSU, а также TST. Тем не менее, все образцы по-прежнему отвечают критериям включения уровня распознавания > 0,85.

Выводы

Настоящее исследование показывает, что использование водной композиции по настоящему изобретению в технологии отбора образцов ткани Allflex (TSU и TST) в качестве источника ДНК может быть использовано на практике для успешного генотипирования при помощи Illumina BeadChip.Обе системы, TSU и TST, дают сопоставимые уровни распознавания при использовании для анализа Illumina.

Не наблюдалось существенных различий между образцами, анализируемыми через 0-720 часов. Непосредственно после отбора образцов ушей водную композицию по настоящему изобретению можно использовать для последующих применений. Вследствие этого система абсолютно применима для прямого тестирования генетических признаков и заболеваний.

Пример 3: Испытание экстракцией, архивированием и генотипированием нуклеиновых кислот

Водную композицию по настоящему изобретению оценивали на предмет ее пригодности для растворения и/или экстракции, и/или консервации нуклеиновых кислот из образцов тканей. Набор образцов ткани, полученных от крупного рогатого скота с использованием устройства для отбора образцов ткани Allflex (= иглы для биопсии для отбора образцов ткани) (TSU), подвергали воздействию водной композиции по примеру 1 («буфер TSU»), помещая соответствующий образец ткани в такую композицию сразу после отбора образцов. Были получены следующие результаты:

Из таблицы и Фиг. 1 видно, что получены достаточно высокие концентрации нуклеиновой кислоты. «Qubit conc.» означает концентрацию нуклеиновой кислоты, определенную при помощи количественного определения Qubit® (Thermo Fisher Scientific). Результаты воздействия также можно увидеть на прилагаемой Фиг. 1, где четко показана полоса (геномной) нуклеиновой кислоты для образцов на геле. (М = маркерная ДНК). Числа над полосами указывают номера образцов.

Кроме того, набор образцов тканей, полученных с использованием устройства для отбора образцов ткани (TSU), хранили в водной композиции по примеру 1 в течение двух недель. Затем композицию заменяли, и затем эти ткани повторно подвергали воздействию свежеприготовленной композиции по примеру 1. Результаты такого повторного воздействия можно обобщить в следующей таблице и на Фиг. 2:

Таким образом, из этих данных очевидно, что водная композиция по настоящему изобретению не только пригодна для растворения нуклеиновых кислот из образца сразу после отбора образцов, но и для хранения в ней образца ткани и последующего использования такого образца для дальнейшего повторного воздействия свежеприготовленной водной композицией по настоящему изобретению.

Пример 4: Долгосрочное хранение образцов тканей в водной композиции по настоящему изобретению

100 образцов, полученных отщипыванием тканей ушей, были собраны из обоих ушей только что забитого крупного рогатого скота при помощи системы щипцов Allflex и иглы для биопсии для отбора образцов ткани Allflex (TSU). Образцы запечатали в пластиковые контейнеры, заполненные водной композицией по примеру 1. Такая водная композиция по настоящему изобретению также иногда указана в настоящем примере 4 как «Жидкость D» или «консервант Жидкость D» (см. более подробно ниже). Компанией Allflex были выполнены сбор образцов, маркировка контейнеров с образцами и немедленная доставка с помощью курьерской службы. Через один день образцы были получены в лаборатории в безупречном состоянии с точки зрения оптических свойств. После получения эти образцы отсортировали, как показано на маркировке образцов и в таблице 1, и хранили в темноте в водной композиции по примеру 1.

Как показано в таблице 1, первый этап подготовки и изучения 5 образцов выполнили на следующий день после получения образцов (таблица времени «0 месяцев»), все последующие исследования производили с трехмесячными интервалами (таблица времени «3, 6, 9 и 12 месяцев»).

Экстракция ДНК из образцов тканей и определение качества и количества

Все лабораторные процедуры и исследования выполняли в соответствии со стандартизованными протоколами.

Пять образцов извлекали из контейнеров для хранения (24°C, 4°C, -20°C) приблизительно за 30 минут до экстракции ДНК и выдерживали до достижения ими комнатной температуры. Как правило, для экстракции ДНК использовали одну часть (около 1/3) каждого образца, полученного отщипыванием ткани уха.

Выделение геномной ДНК из образцов тканей выполняли в соответствии с традиционным протоколом в условиях умеренного лизиса с использованием лизиса с NaOH и/или протеиназой. Выделенную ДНК растворяли в 100 мкл буфера Трис (10 мМ).

Количество применяемого материала образца

В начале проекта сравнивали два варианта количества образцов для лабораторной процедуры.

В варианте 1 использовали все образцы, полученные отщипыванием ткани уха. Вариант 2 выполняли на основе части образца, полученного отщипыванием ткани уха (около одной трети образцов, полученных отщипыванием ткани уха). Как выяснилось, это сравнение имело большое значение из-за требования, чтобы обработка образцов во время рутинных процедур была в обязательном порядке непрерывной и воспроизводимой. Вполне возможно, что совокупность образцов, полученных отщипыванием ткани уха, может быть взята сразу и, таким образом, обработана быстрее с одновременным поддержанием концентрации ДНК в более узком диапазоне концентраций, что исключает субъективные эффекты. В отличие от этого, во время обычной процедуры, использованной в этом примере, только часть исходного зонда использовали для сохранения резервной копии.

Фотометрическая оценка концентрации и чистоты ДНК

Все образцы измеряли фотометрией Nanodrop. Каждый образец показал чистый спектр ДНК с максимумом поглощения при 260 нм и небольшим загрязнением, вызванным наличием белка, растворителя и соли (230 нм, 280 нм). В таблице 2 приведен обзор значений Nanodrop для Варианта 2 количества, таблицы времени «0 месяцев» в двух разных условиях хранения.

Концентрация ДНК для Варианта 1 количества с использованием всех образцов, полученных отщипыванием ткани уха, варьировалась от 191 до 829 нг/мкл (данные не показаны) и для Варианта 2 количества с использованием примерно 1/3 образцов, полученных отщипыванием ткани уха, составляла от 55 до 323 нг/мкл. Это показывает значительно более высокий выход ДНК при использовании всех образцов, но также более высокое распределение значений измерений. По этой причине было решено использовать только часть образцов (1/3) для всех последующих анализов.

В таблицах 3-6 приведены соответствующие данные после хранения образцов ткани в течение 3, 6, 9 и 12 месяцев. Из каждого образца выделили достаточное количество геномной ДНК. Концентрация ДНК показала следующие диапазоны: 59-213 нг/мкл (3 месяца), 204-663 нг/мкл (6 месяцев), 98-524 нг/мкл (9 месяцев) и 70-654 нг/мкл (12 месяцев), соответственно

Полученные образцы после хранения в течение 0, 3, 6, 9 и 12 месяцев обрабатывали (т.е. подвергли лизису), как описано выше, подвергали гель-электрофоретическому разделению и проанализировали. Примерные результаты такого гель-электрофоретического анализа показаны на Фиг. 3, где показано гель-электрофоретическое разделение геномной ДНК для образцов, которые хранились в течение 12 месяцев в водной композиции по настоящему изобретению. Становится очевидно, что эти образцы показывают четко заметную полосу высокомолекулярной ДНК, что указывает на наличие геномной ДНК, что позволяет сделать вывод, что хранение образцов в любом из тестируемых вариантов хранения обеспечило очень хорошее качество ДНК для последующей молекулярно-генетической диагностики даже после хранения в течение 12 месяцев. Таким образом, водная композиция по настоящему изобретению также пригодна для длительного хранения образцов тканей, которые затем могут быть использованы после хранения для последующей дополнительной обработки и анализа.

Характеристики и признаки настоящего изобретения, раскрытые в описании, формуле изобретения и/или на прилагаемых чертежах как отдельно, так и в форме любого их сочетания, могут служить для реализации изобретения в различных его формах.

Группа изобретений относится к применению водной композиции для растворения биомолекул из образца ткани и к системе для приготовления образца ткани животного. Применение водной композиции для растворения биомолекул, выбранных из нуклеиновых кислот, предпочтительно ДНК, и белков, из образца ткани животного включает получение образца ткани животного и сразу после этого воздействие на указанный образец водной композицией, которая включает буфер, обеспечивающий забуферивание при рН от 7 до 9 при температуре 25°С, предпочтительно включающий в себя регулятор рН, такой как подкислитель или подщелачивающий агент, детергент, соль с концентрацией 1-3 М, хелатирующий агент и воду, причем указанная водная композиция не содержит протеиназы. При этом образец указанной ткани животного отбирают с использованием бирки для отбора образцов ткани, предпочтительно ушной бирки или иглы для биопсии для отбора образцов ткани. Полученный раствор биомолекул используют для консервации или для дополнительной обработки указанных биомолекул, например для обнаружения патогена (патогенов), или для генотипирования, секвенирования, анализа гибридизации или количественной ПЦР в режиме реального времени. Изобретения позволяют обрабатывать и хранить/законсервировать образец ткани в течение длительного времени, например от нескольких недель до нескольких месяцев, без больших сложностей. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Применение водной композиции для растворения биомолекул, выбранных из нуклеиновых кислот, предпочтительно ДНК, и белков, из образца ткани животного, и для последующей

a) консервации указанных биомолекул или

b) дополнительной обработки указанных биомолекул,

где применение включает в себя этапы:

- отбор образцов ткани животного для получения образца ткани указанного животного и

- сразу после отбора образцов воздействие на указанный образец ткани водной композицией путем контактирования указанного образца с указанной композицией в течение заданного периода времени, где указанная композиция включает в себя

- буфер, обеспечивающий забуферивание при рН от 7 до 9 при температуре 25°С, предпочтительно включающий в себя регулятор рН, такой как подкислитель или подщелачивающий агент,

- детергент,

- соль с концентрацией 1-3 М,

- хелатирующий агент и воду,

- причем указанная водная композиция не содержит протеиназы,

- при этом образец указанной ткани животного отбирают с использованием бирки для отбора образцов ткани, предпочтительно ушной бирки, или иглы для биопсии для отбора образцов ткани, и при этом указанный образец приводят в контакт с указанной композицией путем введения указанного образца в указанную композицию, причем в результате воздействия указанной композиции на указанный образец, биомолекулы из указанного образца ткани, выбранные из нуклеиновых кислот и белков, растворяются в указанной водной композиции с получением раствора биомолекул,

- использование указанного раствора биомолекул для консервации указанных биомолекул или для дополнительной обработки указанных биомолекул.

2. Применение по п. 1, в котором указанной солью является NaCl, который присутствует в концентрации от 1 М до 2 М, предпочтительно от 1 М до 1,5 М, более предпочтительно от 1,3 М до 1,5 М, еще более предпочтительно 1,4 М.

3. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный детергент в указанной композиции представляет собой N-лауроилсаркозин, предпочтительно натриевую соль N-лауроилсаркозина.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором указанным буфером является Трис и/или указанным хелатирующим агентом является ЭДТА, предпочтительно дигидрат двунатриевой соли ЭДТА, и/или указанным регулятором рН является гидроксид щелочного металла, предпочтительно NaOH или KOH.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная водная композиция содержит, а предпочтительно состоит из следующих компонентов:

6. Применение по п. 5, в котором указанная водная композиция дополнительно содержит краситель, указывающий на присутствие биомолекул, предпочтительно нуклеиновых кислот.

7. Применение по п. 5, в котором указанная водная композиция содержит, а предпочтительно состоит из следующих компонентов:

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный образец ткани хранят в указанной композиции для последующего использования.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная дополнительная обработка указанных биомолекул выбрана из группы, состоящей из обнаружения патогена (патогенов), таких как BVDV, или генотипирования, секвенирования, анализа гибридизации или количественной ПЦР в режиме реального времени, и использования указанного раствора биомолекул для обнаружения маркерных белков или маркерных нуклеиновых кислот, лекарственных средств, гормонов или метаболитов.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный раствор биомолекул используют для дополнительной обработки указанных биомолекул, где дополнительная обработка представляет собой обнаружение BVDV в указанном растворе биомолекул и, таким образом, в указанном образце ткани, при этом предпочтительно указанное обнаружение BVDV выполняют путем амплификации нуклеиновых кислот и обнаружения указанных амплифицированных нуклеиновых кислот или способом обнаружения белков BVDV на основе антител, более предпочтительно с помощью анализа ELISA белков BVDV.

11. Система для подготовки образца ткани животного для последующего

a) генотипирования указанной ткани,

b) обнаружения патогена в указанной ткани или

c) хранения и консервации указанного образца ткани для последующего использования,

где указанная система содержит бирку для отбора образцов ткани, предпочтительно ушную бирку для отбора образцов ткани, или иглу для биопсии для отбора образцов ткани, и водную композицию для растворения биомолекул из образца ткани животного, причем указанная композиция содержится в контейнере, и представляет собой композицию, содержащую:

- буфер, обеспечивающий забуферивание при рН от 7 до 9 при температуре 25°С, предпочтительно включающий в себя регулятор рН, такой как подкислитель или подщелачивающий агент,

- детергент,

- соль с концентрацией 1-3 М,

- хелатирующий агент и воду,

- причем указанная водная композиция не содержит протеиназы К, предпочтительно не содержит никакой протеиназы.

12. Система по п. 11, в которой указанная водная композиция содержит, а предпочтительно состоит из следующих компонентов:

13. Система по п. 12, в которой указанная водная композиция содержит, а предпочтительно состоит из следующих компонентов: