ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2021 года по МПК A61K39/395 C07K16/28 A61P35/00 

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к новому медицинскому использованию антител к MRAP2 или их фрагментов, например, в качестве терапевтических и/или профилактических средств для злокачественной опухоли.

Уровень техники

[0002]

В последние годы появились различные антительные лекарственные средства для лечения злокачественных опухолей, которые направлены на антигенные белки на клетках злокачественной опухоли. Антительные лекарственные средства, используемые в качестве специфичных терапевтических средств злокачественных опухолей, проявляют лекарственный эффект в определенной степени, и, таким образом, они привлекают внимание. Однако многие целевые антигенные белки также экспрессированы на многих нормальных клетках. В результате введения антител можно повреждать не только клетки злокачественной опухоли, но также нормальные клетки, на которых экспрессирован целевой антиген, тем самым вызывая побочный эффект, который становится проблемой. Таким образом, ожидают, что, если становится возможным идентифицировать антигены, злокачественной опухоли, которые специфически экспрессированы на поверхности клетки злокачественной опухоли, и использовать антитела, направленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, то можно реализовать лечение антительными лекарственными средствами, которые вызывают меньшие побочные эффекты.

[0003]

Вспомогательный белок 2 рецептора меланокортина 2 (MRAP2), трансмембранный белок 1 типа или 2 типа, участвует в управлении активностью рецептора меланокортина (MCR) и выполняет функции в энергетическом метаболизме in vivo (непатентная литература 1). Также сообщалось о том, что мыши с дефицитом MRAP2 получали ожирение, несмотря на отсутствие переедания, и в отношении человека также сообщалось, что некоторые пациенты с тяжелым ожирением имеют мутацию в гене MRAP2 (непатентная литература 2). Однако ни в одном из предыдущих сообщений не показано, что белок MRAP2 обладает индуцирующей иммунитет активностью против клеток злокачественной опухоли и, тем самым, полезен для лечения или предотвращения злокачественных опухолей.

Литература известного уровня техники

Непатентная литература

[0004]

Непатентная литература 1: Jackson DS. et al., Front. Neurosci, 9:213 (2015)

Непатентная литература 2: Asai M. et al., Science, 341:275-278 (2013)

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0005]

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы идентифицировать антигенные белки злокачественной опухоли, специфично экспрессируемые на поверхности клеток злокачественной опухоли, и обеспечивать использование антител, направленных на такие белки, в качестве терапевтических и/или профилактических средств для злокачественной опухоли.

Решение проблемы

[0006]

В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения теперь получили кДНК, кодирующую белок, который связывается с антителом, присутствующим в сыворотке от опухоленесущего организма, с помощью способа SEREX, используя библиотеки кДНК, полученные из ткани семенника собаки, и сыворотки от собак с лейкозом. С использованием полученных генов собаки и гомологов генов от человека, кошки и мыши теперь получены белки MRAP2, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, и антитела против белков MRAP2. Кроме того, авторы настоящего изобретения теперь обнаружили, что MRAP2 специфично экспрессирован в клетках лейкоза, злокачественной лимфомы, злокачественной опухоли легких, опухоли головного мозга, злокачественной опухоли толстой кишки, меланомы, нейробластомы, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли почки, мастоцитомы или перианальной аденокарциномы и что части белков MRAP2 специфично экспрессированы на поверхности таких клеток злокачественной опухоли. Кроме того, авторы настоящего изобретения теперь обнаружили, что антитела против частей MRAP2, экспрессированных на клеточных поверхностях злокачественной опухоли, могут повреждать клетки злокачественной опухоли, экспрессирующие MRAP2. Эти находки привели к выполнению настоящего изобретения.

[0007]

Следовательно, настоящее изобретение включает следующие с (1) до (11).

(1) Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с белком MRAP2, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью или с фрагментом белка MRAP2, содержащим 7 или больше последовательных аминокислот.

(2) Фармацевтическая композиция в соответствии с (1), которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с частичным полипептидом белка MRAP2, частичный полипептид представляет собой полипептид, состоящий из 7 или больше последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID с четными номерами №№ с 10 до 24, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.

(3) Фармацевтическая композиция в соответствии с (1) или (2), где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую MRAP2 на клеточной поверхности.

(4) Фармацевтическая композиция в соответствии с любым одним из (1)-(3), где злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из лейкоза, злокачественной лимфомы, злокачественной опухоли легких, опухоли головного мозга, злокачественной опухоли толстой кишки, меланомы, нейробластомы, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли почки, мастоцитомы и перианальной аденокарциномы.

(5) Фармацевтическая композиция в соответствии с любым одним из (1)-(4), в которой антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.

(6) Фармацевтическая композиция в соответствии с любым одним из (1)-(5), в которой антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

(7) Антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с N-концевым частичным полипептидом белка MRAP2, частичный полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID № 10, 14, 18 или 22, или аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.

(8) Антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с C-концевым частичным полипептидом белка MRAP2, частичный полипептид представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID № 12, 16, 20 или 24, или аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.

(9) Антитело или его фрагмент в соответствии с (7) или (8), в где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

(10) Фармацевтическая комбинация для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит фармацевтическую композицию в соответствии с любым одним из (1)-(6) и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

(11) Способ лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, который включает введение, субъекту, антитела или его фрагмента, обладающих иммунологической реактивностью с белком MRAP2, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью или со фрагментом белка MRAP2, содержащим 7 или больше последовательных аминокислот.

[0008]

Это описание включает целиком или частично содержание, раскрытое в японской патентной заявке № 2016-064033, в отношении которой в настоящей заявке испрашивают приоритет.

Полезные эффекты изобретения

[0009]

Антитела против MRAP2, используемые в настоящем изобретении, повреждают клетки злокачественной опухоли. Следовательно, такие антитела против MRAP2 можно использовать для лечения или предотвращения злокачественных опухолей.

Краткое описание фигур

[0010]

На фиг. 1 представлены профили экспрессии идентифицированного гена MRAP2 собаки в опухолевых тканях собаки.

На фиг. 2 представлены профили экспрессии идентифицированного гена MRAP2 в каждой из тканей и клеточных линий злокачественных опухолей человека. На фиг. 2A представлены профили экспрессии ген MRAP2 человека в каждой из тканей человека. На фиг. 2B представлены профили экспрессии гена MRAP2 человека в каждой из клеточных линий злокачественных опухолей человека.

На фиг. 3 представлены профили экспрессии идентифицированного гена MRAP2 мыши в каждой из клеточных линий злокачественных опухолей мыши.

На фиг. 4 представлена цитотоксическая активность поликлональных антител к MRAP2 (поликлональное антитело против N-концевой части MRAP2 и поликлональное антитело против C-концевой части MRAP2) против клеточной линии лейкоза (K562) и клеточной линии злокачественной лимфомы (Namalwa), экспрессирующих ген MRAP2. На этой фиг. контроль-1 показывает цитотоксическую активность против клеток K562 после добавления контрольного поликлонального антитела, против N-концевой части-1 показывает цитотоксическую активность против клеток K562 после добавления поликлонального антитела против N-концевой части MRAP2 и против C-концевой части-1 показывает цитотоксическую активность против клеток K562 после добавления поликлонального антитела против C-концевой части MRAP2. Контроль-2 показывает цитотоксическую активность против клеток Namalwa после добавления контрольного поликлонального антитела, против N-концевой части-2 показывает цитотоксическую активность против клеток Namalwa после добавления поликлонального антитела против N-концевой части MRAP2 и против C-концевой части-2 показывает цитотоксическую активность против клеток Namalwa после добавления поликлонального антитела против C-концевой части MRAP2.

Описание вариантов осуществления

[0011]

Настоящее изобретение относится к использованию антитела или его фрагмента (предпочтительно антигенсвязывающего фрагмента) к белку MRAP2 или его фрагменту для лечения и/или предотвращения злокачественных опухолей.

[0012]

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с белком MRAP2, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей (предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей, более предпочтительно 95% или большей и особенно предпочтительно 99% или большей, например, 99,5% или большей) идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью или с фрагментом белка MRAP2, содержащим 7 или больше (от 7 до каждой полноразмерной последовательности, предпочтительно от 7 до 150 и более предпочтительно от 7 до 50) последовательных аминокислот.

[0013]

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с частичным полипептидом белка MRAP2, частичный полипептид представляет собой полипептид, состоящий из 7 или больше (от 7 до каждой полноразмерной последовательности, предпочтительно от 7 до 40, более предпочтительно от 7 до 20, например, от 7 до 12 или от 8 до 11) последовательных аминокислот аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID с четными номерами №№ с 10 до 24, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей (предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей, более предпочтительно 95% или большей и особенно предпочтительно 97% или большей) идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.

[0014]

Противоопухолевая активность антитела или его фрагмента к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или ко фрагменту полипептида, используемых в настоящем изобретении, можно оценивать посредством проверки ингибирования опухолевого роста in vivo у животного-опухоленосителя или, как описано ниже, посредством проверки in vitro, проявляется ли или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид. Аналогичным образом, противоопухолевая активность антитела или его фрагмента против полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID с четными номерами №№ с 10 до 24, или фрагмента полипептида, используемых в настоящем изобретении, можно оценивать посредством проверки in vivo ингибирования опухолевого роста у животного-опухоленосителя или, как описано ниже, посредством проверки in vitro, проявляется ли или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

[0015]

Кроме того, нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID №№ 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, и 24, представлены в SEQ ID №№ 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23, соответственно.

[0016]

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 4 в списке последовательностей, раскрытом в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой аминокислотную последовательность MRAP2, которую выделяли, посредством способа SEREX с использованием библиотек кДНК, полученных из ткани семенника собаки, и сывороток от собак с лейкозом, в качестве полипептида, способного к связыванию с антителами, специфично существующими в сыворотках от опухоленесущих собак; аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 2, представляет собой аминокислотную последовательность MRAP2, выделенную в качестве гомолога человека для указанного полипептида собаки; аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 6, представляет собой аминокислотную последовательность MRAP2, выделенную в качестве гомолога кошки для указанного полипептида собаки; и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 8, представляет собой аминокислотную последовательность белка MRAP2, выделенную в качестве гомолога мыши для указанного полипептида собаки (см. пример 1, описанный далее).

[0017]

В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно используют антитело, которое связывается с частью, экспрессированной на поверхностях клеток злокачественной опухоли, в белке MRAP2. Его конкретные примеры включают антитела к полипептидам, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 10 (человек), 14 (собака), 18 (кошка) или 22 (мышь), которая представляет собой N-концевую часть белка MRAP2, или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 12 (человек), 16 (собака), 20 (кошка) или 24 (мышь), которая представляет собой C-концевую часть белка MRAP2, или фрагментам полипептидов (предпочтительно, каждый из фрагментов состоит из 7 или больше последовательных аминокислот любой одной из аминокислотных последовательностей) или полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей, предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей, более предпочтительно 95% или большей и особенно предпочтительно 99% или большей идентичностью последовательностей с любым одним из этих полипептидов. Антитела по настоящему изобретению включают все антитела, способные связываться с вышеуказанными полипептидами и обладающие противоопухолевой активностью.

[0018]

Антитела к MRAP2, которые можно использовать в настоящем изобретении, как описано выше, могут относиться к любым их типам, пока они могут проявлять противоопухолевую активность. Их примеры могут включать моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFV). Антитела, используемые в настоящем изобретении, также включают фрагменты антител, например, антигенсвязывающие фрагменты, такие как Fab и F(ab')₂. Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, известными специалистам в данной области. В настоящем изобретении желательны антитела, способные специфически связываться с белком MRAP2 или его фрагментами. Такие антитела предпочтительно представляют собой моноклональные антитела; однако до тех пор, пока можно стабильно получать гомогенные антитела, поликлональные антитела также можно использовать. Кроме того, если субъектом является человек, антитело человека или гуманизированное антитело является желательным, чтобы избегать или ингибировать иммунное отторжение.

[0019]

Фраза «специфически связывается с белком MRAP2 или его фрагментами», как используют в настоящем описании, обозначает, что антитело, представляющее интерес, специфически связывается с белком MRAP2 или его фрагментами и по существу не связывается с другими белками.

[0020]

Противоопухолевую активность антитела, используемого в настоящем изобретении, можно оценивать посредством проверки in vivo ингибирования опухолевого роста у животного-опухоленосителя или, как описано ниже, проверки in vitro, проявляется ли или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

[0021]

Кроме того, субъектами, нуждающимися в лечении и/или предотвращении злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением, являются млекопитающие, такие как человек, домашние животные, сельскохозяйственные животные, спортивные животные или экспериментальные животные. Предпочтительным субъектом является человек.

[0022]

Получение антигенов, получение антител и фармацевтических композиций, относящихся к настоящему изобретению, объяснены далее.

[0023]

<Получение антигенов, используемых для получения антител >

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антител к MRAP2, используемые в настоящем изобретении, не ограничены в отношении их происхождения, например, животных, включая, например, человека, собаку, кошку, мышь, корову, лошадь, крысу и курицу. Однако такие белки или их фрагменты предпочтительно выбирают ввиду совместимости с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Получемые от млекопитающих белки в целом являются предпочтительными и получаемые от человека белки являются особенно предпочтительными. Например, если MRAP2 представляет собой MRAP2 человека, можно использовать белок MRAP2 человека, его частичный полипептид или клетки, способные экспрессировать MRAP2 человека.

[0024]

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности MRAP2 человека и его гомологов можно получать посредством, например, обращения к веб-сайту GenBank (NCBI, USA) и использования алгоритма, такого как BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

[0025]

В соответствии с настоящим изобретением, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID № 1) или аминокислотную последовательность (SEQ ID № 2) MRAP2 человека используют в качестве основной последовательности, целевыми являются нуклеиновые кислоты или белки, каждое состоит из последовательности, обладающей от 70% до 100%, предпочтительно от 80% до 100%, более предпочтительно от 90% до 100% и более предпочтительно от 95% до 100% (например, от 97% до 100%, от 98% до 100%, от 99% до 100% или от 99,5% до 100%) идентичностью последовательностей с нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью ORF или зрелой части основной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности. Термин «% идентичности последовательностей», как используют в настоящем описании, обозначает процентную долю (%) числа идентичных аминокислот (или нуклеотидов) относительно общего числа аминокислот (или нуклеотидов) в случае, когда две последовательности выравнивают так, что максимального сходства можно достичь при введении пропусков или без него.

[0026]

Фрагменты белка MRAP2 имеют длины в диапазоне от длины эпитопа в аминокислотах (или антигенной детерминанты), которая является наименьшей единицей антигена, распознаваемой антителом, до меньше чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих и предпочтительно у человека. Наименьшая единица эпитопа состоит из приблизительно от 7 до 12 аминокислот и, например, от 8 до 11 аминокислот. Его конкретный пример представляет собой полипептид, состоящих из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей, предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей и более предпочтительно 95% или большей идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью белка MRAP2.

[0027]

Полипептиды, содержащие указанный выше белок MRAP2 человека, и его частичные пептиды можно синтезировать в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (способ с флуоренилметилоксикарбонилом) или способ tBoc (способ с т-бутилоксикарбонилом) (Japanese Biochemical Society (ред.), «Biochemical Experimentation Course (Seikagaku Jikken Koza) 1», Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Kagaku-dojin Publishing Company, Inc. (Japan), 1981). Также их можно синтезировать общими способами, используя различные коммерчески доступные пептидные синтезаторы. Кроме того, полипептиды, представляющие интерес, можно получать посредством получения полинуклеотидов, кодирующих вышеуказанные полипептиды, встраивания каждого из полинуклеотидов в экспрессирующий вектор и введения вектора в клетку-хозяина, тем самым позволяя клетке-хозяину продуцировать полипептид, используя известные способны генной инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2-е изд., Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3-е изд, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, и т.д.).

[0028]

Полинуклеотиды, кодирующие указанные выше полипептиды, можно легко получать с помощью известных способов генной инженерии или общих способов, используя коммерчески доступные синтезаторы нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID № 1, можно получать посредством ПЦР с использованием библиотеки ДНК или кДНК хромосом человека в качестве матрицы и пары праймеров, разработанных для того, чтобы сделать возможной амплификацию нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID № 1. Условия ПЦР можно определять надлежащим образом. Например, такие условия могут включать проведение 30 циклов из стадий реакции, состоящих из: 94°C, 30 с (денатурация); 55°C, от 30 с до 1 минуты (отжиг); и 72°C, 1 минута (элонгация) с использованием термостабильной ДНК полимеразы (например, полимеразы Taq) и Mg²⁺-содержащего ПЦР буфера, после чего следует реакция при 72°C в течение 7 минут после завершения 30 циклов. Однако условия ПЦР не ограничены условиями ПЦР, приведенными выше в качестве примера. Способы и условия ПЦР описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3-е изд., A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, гл. 15).

[0029]

Кроме того, желаемую ДНК можно выделять посредством получения подходящих зондов и праймеров на основании информации о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, представленных в SEQ ID №№ с 1 до 8 в списке последовательностей в настоящей заявке, и скрининга библиотеки кДНК, например, человека с использованием таких зондов и праймеров. Предпочтительно, такую библиотеку кДНК получают из клетки, органа или ткани, в которой экспрессирован белок с SEQ ID № 2, 4, 6 или 8. Примеры клетки или ткани включают, но не ограничиваясь этим, клетки или ткани из злокачественных опухолей или опухолей, например, головного мозга, лейкоз, злокачественная лимфома, злокачественная опухоль легких, опухоль головного мозга, злокачественная опухоль толстой кишки, меланома, нейробластома, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль печени, злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль пищевода, злокачественная опухоль почки, мастоцитома и перианальная аденокарцинома. Операции, такие как получение зондов или праймеров, конструирование библиотек кДНК, скрининг библиотек кДНК и клонирование генов, представляющих интерес, как описано выше, известны специалистам в данной области, и их можно осуществлять, например, в соответствии со способами, описанными в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2-е изд., Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (там же). ДНК, кодирующую белок MRAP2 человека и его частичные пептиды, можно получать из ДНК, полученной таким образом.

[0030]

Описанные выше клетки-хозяева могут представлять собой любые клетки до тех пор, пока они могут экспрессировать описанные выше полипептиды. Пример прокариотической клетки-хозяина включает, но не ограничиваясь этим, Escherichia coli. Примеры эукариотических клеток-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны (COS1), клетки яичника китайского хомяка (CHO), линия клеток почки эмбриона человека (HEK293) и линия клеток кожи эмбриона мыши (NIH3T3), дрожжевые клетки, такие как клетки почкующихся дрожжей и делящихся дрожжей, клетки тутового шелкопряда и клетки яиц Xenopus laevis.

[0031]

Когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, можно использовать экспрессирующий вектор, предпочтительно имеющий точку начала репликации в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ауксотрофный комплементарный ген, репортерный ген или тому подобное. В качестве примеров экспрессирующих векторов для Escherichia coli можно привести векторы pUC, pBluescriptII, экспрессирующие системы pET, экспрессирующие системы pGEX и т. п. ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид, встраивают в такой экспрессирующий вектор, прокариотическую клетку-хозяина трансформируют вектором и затем полученную таким образом трансформированную клетку культивируют с тем, чтобы можно было экспрессировать полипептид, кодируемый с помощью ДНК, в прокариотической клетке-хозяине. В этот момент полипептид также можно экспрессировать в виде слитого белка с другим белком.

[0032]

Когда эукариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, можно использовать экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, предпочтительно имеющие промотор, область сплайсинга, сайт добавления поли(A) или тому подобное. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3.1, pSecTag (A, B, C) и pYES2. С помощью процедур, схожих с теми, которые указаны выше, ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, встраивают в такой экспрессирующий вектор, эукариотическую клетку-хозяина трансформируют вектором и затем полученную таким образом трансформированную клетку культивируют с тем, чтобы можно было экспрессировать полипептид, кодируемый вышеуказанной ДНК, в эукариотической клетке-хозяине. Когда pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобное используют в качестве экспрессирующего вектора, вышеуказанный полипептид можно экспрессировать в виде слитого белка с меткой, такой как метка His (например, от (His)₆ до (His)₁₀), метка FLAG, метка myc, метка HA или GFP.

[0033]

Для введения экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно использовать хорошо известные способы, такие как электропорация, способ с фосфатом кальция, липосомный способ, способ с DEAE декстраном, микроинъекция, вирусная инфекция, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

[0034]

Выделение и очистку полипептида, представляющего интереса, из клеток-хозяев можно осуществлять с использованием известных способов выделения в комбинации. Примеры способов выделения и очистки включают, но не ограничиваясь этим, обработку с использованием денатурирующего средства, такого как мочевина, или поверхностно-активного средства, обработки ультразвуком, ферментативного расщепления, высаливания, фракционирования растворителей и преципитации, диализа, центрифугирования, ультрафильтрования, гель-фильтрации, SDS-PAGE, электрофореза с изоэлектрическим фокусированием, ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, аффинной хроматографии и хроматографии с обращенной фазой.

[0035]

<Структура антитела>

В целом, антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Между тем, другой класс антител, за исключением IgM, представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины (приблизительно 150 кДа), каждый содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью через одну ковалентную дисульфидную связь. Однако число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая из тяжелой цепи и легкой цепи также имеет внутрицепную дисульфидную связь(и). Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном ее конце, с которым последовательно связаны несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном ее конце и имеет одну константную область на ее противоположном конце. Константная область легкой цепи выравнивается с первой константной областью тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи выравнивается с вариабельным доменом тяжелой цепи. Специфичная область вариабельного домена антитела, которую называют «определяющей комплементарность областью (CDR)», проявляет специфичную вариабельность с тем, чтобы придавать антителу специфичность связывания. Относительно консервативную часть в вариабельной области называют «каркасной областью (FR)». Полный вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи содержит 4 FR, соединенные друг с другом через 3 CDR. Такие CDR называют «CDRH1», «CDRH2» и «CDRH3», соответственно, в таком порядке от N-конца в тяжелой цепи. Аналогичным образом, для легкой цепи их называют «CDRL1», «CDRL2» и «CDRL3», соответственно. CDRH3 играет наиболее важную роль в отношении специфичности связывания антитело-антиген. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживается с помощью областей FR в состоянии, когда они очень близки друг к другу, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающего участка антитела вместе с CDR в соответствующей цепи. Константные области не вносят непосредственного вклада в связывание антитело-антиген. Однако они проявляют различные эффекторные функции, такие как вовлечение в антителозависимую цитотоксичность (активность ADCC), фагоцитоз через связывание с рецептор Fcγ, время полужизни/уровень клиренса через неонатальный рецептор Fc (FcRn) и комплемент-зависимая цитотоксичность (активность CDC) через компонент C1q в каскаде комплемента.

[0036]

<Получение антител >

Термин «антитело против MRAP2», используемый в настоящем изобретении, относится к антителу, обладающему иммунологической реактивностью с полноразмерным белком MRAP2 или его фрагментом, описанным выше.

[0037]

Термин «иммунологическая реактивность», используемый в настоящем описании, указывает на характеристики связывания антитела in vivo или in vitro с антигеном MRAP2. Функцию повреждения опухоли или опухолевых клеток (например, гибель, ингибирование или регрессия) можно проявлять через такое связывание. В частности, антитело любого типа можно использовать в настоящем изобретении до тех пор, пока антитело может связываться с белком MRAP2, чтобы повреждать опухоль, предпочтительно злокачественную опухоль, экспрессирующую (или имеющую) белок MRAP2 на клеточной поверхности, такую как лейкоз, злокачественная лимфома, злокачественная опухоль легких, опухоль головного мозга, злокачественная опухоль толстой кишки, меланома, нейробластома, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль печени, злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль пищевода, злокачественная опухоль почки, мастоцитома или перианальная аденокарцинома.

[0038]

Примеры таких антител включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела. Примеры таких антител также включают фрагменты антител (например, антигенсвязывающие фрагменты, такие как Fab и F(ab')₂). Кроме того, антитела могут относиться к любому классу молекул иммуноглобулинов, таких как IgG, IgE, IgM, IgA, IgD и IgY, или любому их подклассу, такому как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

[0039]

В дополнение к гликозилированию, антитела дополнительно можно модифицировать через ацетилирование, формилирование, амидирование, фосфорилирование или пегилирование (PEG).

[0040]

Примеры получения для различных антител описаны далее.

[0041]

Поликлональные антитела, которые можно использовать в настоящем изобретении, можно получать описанным далее образом.

[0042]

Сыворотку получают посредством иммунизации небольших животных, таких как мыши, продуцирующие антитело человека мыши или кролики, с использованием встречаемого в природе белка MRAP2, рекомбинантного белка MRAP2, который экспрессировали в виде белка, слитого с GST или тому подобным, в микроорганизме, таком как Escherichia coli, или его частичного пептида. Сыворотку очищают через преципитацию с сульфатом аммония, колоночную хроматографию на белке A/белке G, DEAE ионообменную хроматографию, аффинную колоночную хроматографию с использованием колонки, с которой связан белок MRAP2 или синтетический пептид, или тому подобное, для получения поликлональных антител. В примерах, описанных далее, получали поликлональное антитело мыши против домена, экспрессированного на поверхностях клеток злокачественной опухоли в аминокислотной последовательности белка MRAP2, и подтверждали его противоопухолевых эффекты.

[0043]

Другие примеры антител, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают моноклональные антитела. Например, моноклональные антитела можно получать таким образом, который описан далее. Например, клетки, экспрессирующие белок MRAP2 на своих поверхностях (такие как клеточная линия лейкоза K562 или клеточная линия злокачественной лимфомы Namalwa), вводят мышам для иммунизации, после чего следует извлечение селезенок у мышей. Клетки выделяют из каждой селезенки и затем сливают с миеломными клетками мыши. Клоны, способные продуцировать антитело, обладающее действием ингибирования роста клеток злокачественной опухоли, выбирают из полученных слитых клеток (гибридом). Продуцирующую моноклональное антитело гибридому, обладающую действием ингибирования роста клеток злокачественной опухоли, выделяют и культивируют. Антитело, представляющее интерес, можно получать через очистку от культурального супернатанта с помощью общего способа аффинной очистки.

[0044]

Также продуцирующую моноклональное антитело гибридому можно получать, например, описанным далее образом. Сначала животное иммунизируют сенсибилизирующим антигеном с помощью известного способа. В общем способе иммунизацию осуществляют посредством интраперитонеальной или подкожной инъекции сенсибилизирующего антигена млекопитающему. В частности, сенсибилизирующий антиген до подходящего получаемого количества разводят и суспендируют в PBS (фосфатно-солевой буфер), физиологическом растворе или тому подобном. При желании, при этом смешивают подходящее количество стандартного адъюванта (например, полного адъюванта Фрейнда). После эмульсификации получаемое вводят млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Кроме того, можно использовать подходящий носитель для иммунизации сенсибилизирующим антигеном.

[0045]

Как описано выше, после иммунизации млекопитающего и подтверждения увеличения до желаемого уровня антитела в сыворотке, иммуноциты собирают у млекопитающего и подвергают слиянию клеток. Особенно предпочтительными примерами иммуноцитов являются спленоциты.

[0046]

Миеломные клетки млекопитающих используют в качестве релевантных родительских клеток, подвергаемых слиянию с вышеуказанными иммуноцитами. В качестве миеломных клеток предпочтительно используют следующие различные примеры известных клеточных линий: P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3 × 63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3 × 63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

[0047]

В основном, слияние клеток иммуноцитов и миеломных клеток, описанных выше, можно осуществлять в соответствии с известным способом, таким как способ Kohler и Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

[0048]

Более конкретно, слияние клеток, описанное выше, осуществляют, например, в присутствии ускорителя слияния клеток в культуральном растворе, содержащем стандартные питательные вещества. Примеры ускорителя слияния, подлежащего использованию, включают полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай (HVJ: японский гемагглютинирующий вирус). При желании, вспомогательное средство, такое как диметилсульфоксид, дополнительно можно добавлять для повышения эффективности слияния.

[0049]

Долю используемых иммуноцитов относительно используемых миеломных клеток можно определять произвольно. Например, число используемых иммуноцитов предпочтительно составляет в 1-10 раз больше числа миеломных клеток. Примеры культурального раствора, который можно использовать для слияния клеток, описанных выше, включает культуральный раствор RPMI1640 и культуральный раствор MEM, достаточные для роста вышеуказанных линий миеломных клеток, а также другие стандартные культуральные растворы, используемые для клеточных культур этого типа. Кроме того, раствор заменителя сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка (FCS), можно использовать в комбинации с ними.

[0050]

Для слияния клеток, вышеуказанные иммуноциты и миеломные клетки достаточно смешивают в предварительно определяемых количествах в культуральном растворе. Раствор PEG (например, усредненная молекулярная масса: приблизительно от 1000 до 6000), который предварительно нагревали приблизительно до 37°C, добавляют туда в концентрации в целом от 30% до 60% (масс./об.), после чего следует смешивание. Это ведет к формированию гибридом, представляющих интерес. Впоследствии, последовательное добавление подходящего культурального раствора и удаление супернатанта через центрифугирование повторно осуществляют для того, чтобы удалять средство(а) для слияния клеток и т. п., которые не являются предпочтительными для роста гибридом.

[0051]

Полученные таким образом гибридомы культивируют в стандартном культуральном растворе для отбора, таким как культуральный раствор HAT (культуральный раствор, содержащий гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для отбора. Культивирование в таком культуральном растворе HAT осуществляют непрерывно в течение достаточного периода времени (в целом от нескольких суток до нескольких недель) для гибели клеток (не слитых клеток), отличных от гибридом, представляющих интерес. Затем стандартный способ предельного разведения используют для скрининга гибридом, продуцирующих антитела, представляющие интерес, и осуществления одиночного клонирования.

[0052]

Кроме того, подобно получению вышеуказанных гибридом через иммунизацию не относящихся к человеку животных с использованием антигенов, также возможно получать гибридомы, которые продуцируют антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, активность ингибирования клеточного роста), посредством сенсибилизации лимфоцитов человека (например, лимфоцитов человека, инфицированных вирусом EB) in vitro с использованием белка, экспрессирующих белок клеток или их лизата и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с происходящими от человека миеломными клетками, обладающими способностью перманентно делиться, например, U266 (№ доступа TIB196).

[0053]

Продуцирующие моноклональное антитело гибридомы, получаемые как указано выше, можно пассировать в стандартный культуральный раствор. Кроме того, их можно сохранять в жидком азоте в течение длительного периода времени.

[0054]

В частности, иммунизацию осуществляют с использованием желаемого антигена или клеток, экспрессирующих желаемый антиген, в качестве сенсибилизирующего антигена(ов) в соответствии со стандартным способом иммунизации. Получаемые иммуноциты сливают с известными родительскими клетками с помощью стандартного способа слияния клеток. Затем осуществляют скрининг продуцирующих моноклональное антитело клеток (гибридом) с помощью стандартного способа скрининга. Таким образом, можно осуществлять получение антитела.

[0055]

Известная продуцирующая антитело человека мышь, используемая в настоящем описании, представляет собой, например, KM Mouse (Kirin Pharma/Medarex) или XenoMouse (Amgen) (например, WO02/43478 и WO02/092812). Когда таких мышей иммунизируют белками MRAP2 или их фрагментами, из крови можно получать полные поликлональные антитела человека. Кроме того, полные моноклональные антитела человека можно получать с помощью способа слияния спленоцитов, собранных у иммунизированных мышей, с миеломными клетками.

[0056]

Получение антигена можно осуществлять в соответствии со способом, таким как способ с использованием клеток животного (публикация патента JP (Kohyo) № 2007-530068A) или способ с использованием бакуловируса (например, WO98/46777). Если иммуногенность антигена низка, антиген, связанный с макромолекулой, обладающей иммуногенностью, такой как альбумин, можно использовать для иммунизации.

[0057]

Кроме того, возможно использовать генетически сконструированный антител, получаемый посредством клонирования гена антитела из гибридомы, встраивания клона в подходящий вектор, введения вектора в организм-хозяин и предоставления организму-хозяину возможности продуцировать антитело, используя способы генетической инженерии (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, опубликовано в Соединенном королевстве в MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-области) антитела синтезируют из мРНК гибридомы с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей V-область антитела, представляющего интерес, такую ДНК лигируют в желаемую ДНК, кодирующую константную область антитела (C-область). Получаемое встраивают в экспрессирующий вектор. Альтернативно, ДНК, кодирующую V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующий вектор, содержащий ДНК C-области антитела. Такую ДНК встраивают в экспрессирующий вектор таким образом, что ее экспрессируют под управлением области управления экспрессией, такой как энхансер или промотор. Затем клетки-хозяева трансформируют таким экспрессирующим вектором, тем самым делая возможно экспрессию антитела.

[0058]

Моноклональные антитела включают моноклональные антитела человека и моноклональные антитела животных, не относящихся к человеку (например, моноклональные антитела мыши, моноклональные антитела крысы, моноклональные антитела кролика и моноклональные антитела курицы). Моноклональные антитела можно получать посредством культивирования гибридом, получаемых через слияние миеломных клеток и спленоцитов от млекопитающих, не относящихся к человеку (например, мышей или продуцирующих антитело человека мышей), иммунизированных белками MRAP2 или их фрагментами.

[0059]

Химерное антитело представляет собой антитело, продуцируемое посредством объединения последовательностей от различных животных. Примером этого является антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела мыши и константных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека. Такое химерное антитело можно получать с помощью известного способа. Например, химерное антитело можно получать посредством лигирования ДНК, кодирующей V-область антитела, с ДНК, кодирующей C-область антитела человека, встраивания получаемого в экспрессирующий вектор, введения вектора в организм-хозяин и предоставления организму-хозяину возможности продуцировать антитело.

[0060]

Поликлональные антитела включают антитела, получаемые посредством иммунизации продуцирующих антитело человека животных (например, мышей) белками MRAP2 или их фрагментами.

[0061]

Гуманизированное антитело представляет собой сконструированное антитело, и его иногда обозначают как «реконструированное антитело человека». Гуманизированное антитело конструируют посредством трансплантации CDR антитела, полученного у иммунизированного животного, в определяющие комплементарность области антитела человека. Также для этого известны общие способы генетической инженерии.

[0062]

В частности, последовательность ДНК, разработанная для лигирования CDR антитела мыши с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют способом ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, полученных так, чтобы иметь части, перекрывающиеся друг с другом на своих концах. Гуманизированное антитело можно получать посредством лигирования ДНК, полученной выше, с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, встраивания получаемого в экспрессирующий вектор, введения вектора в организм-хозяин и предоставления организму-хозяину возможности продуцировать антитело (см. EP-A-239400 и WO96/02576). FR антитела человека, подлежащие лигированию друг с другом через CDR выбирают при условии, что определяющие комплементарность области могут формировать хороший антигенсвязывающий участок. В случае необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельной области антитела можно замещать таким образом, что определяющие комплементарность области в реконструированном антителе человека формируют подходящих антигенсвязывающий участок (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, каркасные области можно замещать на каркасные области из различных антител человека (см. WO99/51743).

[0063]

После получения химерного антитела или гуманизированного антитела аминокислоты в вариабельной области (например, FR) или константной области, например, можно заменять на другие аминокислоты.

[0064]

Здесь замена аминокислоты представляет собой замену, например, меньше чем 15, меньше чем 10, не больше чем 8, не больше чем 7, не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3 или не больше чем 2 аминокислот, предпочтительно от 1 до 5 аминокислот и более предпочтительно 1 или 2 аминокислот. Антитело с заменой должно быть функционально эквивалентно незамещенному антителу. Замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену, которая представляет собой замену между аминокислотами, обладающими схожими характеристиками в отношении заряда, боковых цепей, полярности, ароматичности и т.п. Например, аминокислоты, обладающие схожими характеристиками, можно разделять на следующие типы: основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин); кислые аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин); неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); аминокислоты с разветвленной цепью (треонин, валин, изолейцин); и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).

[0065]

Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой модифицированные антитела. Примером модифицированного антитела является антитело, связанное с такой молекулой, как полиэтиленгликоль (PEG). В отношении модифицированного антитела по настоящему изобретению, вещества, которые связывают с антителом, не ограничены. Такое модифицированное антитело можно получать посредством химической модификации полученного антитела. Способ такой модификации уже признан в области, связанной с настоящим изобретением.

[0066]

Выражение «функционально эквивалентный», используемое в настоящем описании, указывает на ситуацию, в которой антитело, представляющее интерес, обладает биологической или биохимической активностью, схожими с таковыми у антитела по настоящему изобретению. В частности, такое антитело имеет функцию повреждения опухолей и по существу не вызывает реакцию отторжения при применении у человека. Примером такой активности является активность ингибирования клеточного роста или связывающая активность.

[0067]

Известным способом получения полипептида, функционально эквивалентного заданному полипептиду, который хорошо известен специалистам в данной области, является способ, который включает введение мутации в полипептид. Например, специалист в данной области может в достаточной мере вводить мутацию в антитело по настоящему изобретению с использованием способа сайт-специфического мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; или Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) или тому подобное. Таким образом, можно получать антитело, функционально эквивалентное антителу по настоящему изобретению.

[0068]

Антитело, способное распознавать эпитоп белка MRAP2, распознаваемый указанным выше антителом против MRAP2, можно получать способом, известным специалистам в данной области. Например, его можно получать с помощью: способа, включающего определение эпитопа белка MRAP2, распознаваемого антителом против MRAP2, с помощью общего способа (например, картирования эпитопов) и получение антитела с использованием полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащуюся в эпитопе, в качестве иммуногена; или способа, включающего определение эпитопа продуцируемого антитела с помощью общего способа и отбор антитела, имеющего эпитоп, идентичный эпитопу антитела против MRAP2. Здесь термин «эпитоп» относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих и предпочтительно у человека. Его наименьшая единица состоит из приблизительно от 7 до 12 аминокислот и предпочтительно от 8 до 11 аминокислот.

[0069]

Константа сродства Ka (kon/koff) антитела по настоящему изобретению предпочтительно составляет по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5 × 10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5 × 10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5 × 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5 × 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1 или по меньшей мере 10¹³ M^-1.

[0070]

Антитело по настоящему изобретению можно конъюгировать с противоопухолевым средством. Связывание между антителом и противоопухолевым средством можно осуществлять через спейсер, имеющий группу, способную реагировать с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксигруппой, тиоловой группой, или тому подобное (например, имидилсукцинатную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксигруппу).

[0071]

Примеры противоопухолевых средств включают следующие противоопухолевые средства, известные из источников или тому подобного: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтаминоксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихимицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, роторубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглютетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамида гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиния ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармакологически приемлемые соли или производные.

[0072]

Альтернативно также возможно связывать радиоактивный изотоп, такой как ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu или ¹⁷⁶Lu, известные из источников и т. п., с антителом по настоящему изобретению. Желательно, чтобы такие радиоактивные изотопы были эффективны для лечения или диагностирования опухолей.

[0073]

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью с MRAP2, или антитело, способно специфически распознавать MRAP2. Такое антитело должно представлять собой антитело, имеющее структуру, которая позволяет субъекту-животному, которому вводят антитело, полностью или почти полностью избегать реакции отторжения. Если субъектом-животным является человек, примеры таких антител включают антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела человека-мыши), одноцепочечные антитела и биспецифические антитела. Такое антитело представляет собой рекомбинантное антитело, имеющее вариабельные области, полученные из тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека, рекомбинантное антитело, имеющее вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, каждая состоит из определяющих комплементарность областей (CDR1, CDR2 и CDR3), полученных из антитела животного, не относящегося к человеку, и каркасных областей, полученных из антитела человека, или рекомбинантное антитело, имеющее вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, полученные из антитела животного, не относящегося к человеку, и константные области тяжелой цепи и легкой цепи, полученные из антитела человека. Первые два антитела являются предпочтительными.

[0074]

Вышеуказанное рекомбинантное антитело можно получать описанным далее образом. ДНК, кодирующую моноклональное антитело против MRAP2 человека (например, моноклональное антитело человека, моноклональное антитело мыши, моноклональное антитело крысы, моноклональное антитело кролика или моноклональное антитело курицы) клонируют из антителопродуцирующей клетки, такой как гибридома. ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи антитела получают посредством способа RT-ПЦР или тому подобного, используя полученный клон в качестве матрицы. Затем, последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи или последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 определяют с помощью системы нумерации Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[0075]

Кроме того, такую ДНК, кодирующую вариабельные области, или ДНК, кодирующую CDR, получают способами генетической инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или с помощью синтезатора ДНК. Здесь вышеуказанную гибридому, продуцирующую моноклональное антитело человека, можно получать посредством иммунизации продуцирующего антитело человека животного (например, мыши) с использованием MRAP2 человека и слияния спленоцитов, удаленных у животного, с миеломными клетками. В дополнение к вышеуказанному, в случае необходимости, ДНК, кодирующую вариабельные области, полученные из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека, и константные области получают способами генетической инженерии или с помощью синтезатора ДНК.

[0076]

В случае гуманизированного антитела, получают ДНК, в которой кодирующие CDR последовательности в ДНК, кодирующей вариабельную область, полученную из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека, заменены на соответствующие кодирующие CDR последовательности антитела от животного, не относящегося к человеку (например, мыши, крысы или курицы). ДНК, получаемую, как указано выше, лигируют с ДНК, кодирующей константную область, полученную из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека. Таким образом, можно получать ДНК, кодирующую гуманизированное антитело.

[0077]

В случае химерного антитела, ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела от не относящегося к человеку животного (например, мыши, крысы или курицы) лигируют с ДНК, кодирующей константную область, полученную из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека. Таким образом, можно получать ДНК, кодирующую химерное антитело.

[0078]

Одноцепочечное антитело представляет собой антитело, в котором вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи линейно лигируют друг с другом через линкер. ДНК, кодирующую одноцепочечное антитело, можно получать посредством лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи, вместе. Здесь вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи представляют собой таковые из антитела человека или таковые из антитела человека, в которых только CDR заменены на CDR антитела от животного, не относящегося к человеку (например, мыши, крысы или курицы). Кроме того, линкер состоит из 12-19 аминокислот. Его примером является (G₄S)₃, состоящий из 15 аминокислот (G. -B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

[0079]

Биспецифическое антитело (диатело) представляет собой антитело, способное к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами. ДНК, кодирующую биспецифическое антитело, можно получать посредством, например, лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A вместе, в таком порядке (при условии, что ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи B, лигируют друг с другом через ДНК, кодирующую линкер, описанный выше). Здесь и вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи представляют собой таковые из антитела человека или таковые из антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела от животного, не относящегося к человеку (например, мыши, крысы или курицы).

[0080]

Рекомбинантную ДНК, получаемую как указано выше, встраивают в один или множество подходящих векторов. Каждый такой вектор вводят в клетку-хозяина (например, клетку млекопитающего, клетку дрожжей или клетку насекомого) для (совместной) экспрессии. Таким образом, можно получать рекомбинантное антитело. См., P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice., 1993 ACADEMIC PRESS.

[0081]

Вышеуказанные антитела предпочтительно обладают цитотоксической активностью, тем самым проявляя противоопухолевые эффекты.

[0082]

Кроме того, получают гибридому, способную продуцировать другое антитело человека или антитело животного, не относящегося к человеку, (например, антитело мыши) против MRAP2 человека. Собирают моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой. Затем определяют, является ли или нет полученное антитело антителом, представляющим интерес, используя, в качестве индикаторов, активность иммунологического связывания с MRAP2 человека и цитотоксическую активность. Таким образом, идентифицируют продуцирующую моноклональное антитело гибридому, представляющую интерес. После этого, как описано выше, ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела, представляющего интерес, получают из гибридомы и секвенируют. ДНК используют для получения различных антител.

[0083]

Кроме того, вышеуказанное антитело по настоящему изобретению может иметь замену, делецию или добавление одной или нескольких (и предпочтительно 1 или 2) аминокислот, в частности, в последовательности каркасной области и/или последовательности константной области, до тех пор, пока оно обладает специфичностью специфического распознавания MRAP2. Здесь, термин «несколько аминокислот» обозначает 2-5 и предпочтительно 2 или 3 аминокислоты.

[0084]

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, также предусмотрена ДНК, кодирующая вышеуказанное антитело по настоящему изобретению, ДНК, кодирующая тяжелую цепь или легкую цепь антитела, или ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела.

[0085]

Определяющие комплементарность области (CDR), кодируемые с помощью ДНК вышеуказанных последовательностей, представляют собой области, которые определяют специфичность антитела. Следовательно, последовательности, кодирующие другие области (т. е. константные области и каркасные области) в антителе, могут представлять собой последовательности из другого антитела. Здесь различные антитела включают антитела из организмов, не относящихся к человеку. Однако, ввиду снижения побочных эффектов, происходящие от человека антитела являются предпочтительными. То есть в вышеуказанной ДНК области, кодирующие каркасные области и константные области тяжелых и легких цепей, предпочтительно содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие релевантные аминокислотные последовательности из антитела человека.

[0086]

ДНК по настоящему изобретению можно получать с помощью, например, указанных выше способов или следующих способов. Сначала получают общую РНК из гибридомы, связанной с антителом по настоящему изобретению, с использованием коммерчески доступного набора для экстрагирования РНК. Затем синтезируют кДНК с использованием обратной транскриптазы и случайных праймеров или тому подобного. Затем кДНК, кодирующую антитело, амплифицируют с помощью способа ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды, имеющие последовательности, консервативные в вариабельных областях известных генов тяжелой цепи и легкой цепи антитела мыши. Последовательности, кодирующие константные области, можно получать посредством амплификации известных последовательностей с помощью способа ПЦР. Нуклеотидную последовательность ДНК можно определять с помощью общего способа, включающего, например, встраивание в плазмиду или фаг для определения последовательности.

[0087]

Полагают, что противоопухолевые эффекты антитела против MRAP2, используемого в настоящем изобретении, оказываемые на MRAP2-экспрессирующие клетки злокачественной опухоли, проявляются через опосредованную эффекторными клетками активность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) против MRAP2-экспрессирующих клеток или активность комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) против MRAP2-экспрессирующих клеток.

[0088]

Соответственно, активность антитела против MRAP2, используемого в настоящем изобретении, можно оценивать через определение in vitro активности ADCC или активности CDC в отношении MRAP2-экспрессирующих клеток злокачественной опухоли, как конкретно описано в примерах, приведенных далее.

[0089]

Антитело против MRAP2, используемое в настоящем изобретении, связывается с MRAP2-белком на клетке злокачественной опухоли и проявляет противоопухолевые эффекты на основании вышеуказанной активности. Следовательно, полагают, что такое антитело можно использовать для лечения или предотвращения злокачественных опухолей. В частности, в соответствии с настоящим изобретением, предоставлена фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело против MRAP2. Когда антитело против MRAP2 используют с целью введения антитела человеку (лечение антителом), его предпочтительно используют в форме антитела человека или гуманизированного антитела для того, чтобы снижать иммуногенность.

[0090]

Кроме того, поскольку аффинность связывания между антителом против MRAP2 и белком MRAP2 на поверхности клеток злокачественной опухоли становится выше, антитело против MRAP2 может проявлять более сильную противоопухолевую активность. Следовательно, если можно получать антитело против MRAP2, обладающее высокой аффинностью связывания с белком MRAP2, можно ожидать проявления еще более сильных противоопухолевых эффектов. Соответственно, становится возможным использовать такое антитело в качестве фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли. Как описано выше, для высокой аффинности связывания, константа сродства Ka (kon/koff) предпочтительно составляет по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5 × 10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5 × 10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5 × 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5 × 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1 или по меньшей мере 10¹³ M^-1.

[0091]

<Связывание с клетками, экспрессирующими антиген>

Способность антитела к связыванию с MRAP2 можно определять через анализ связывания с использованием, например, ELISA, способа Вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции или анализа проточной цитометрии, как описано в примерах.

[0092]

<Иммуногистохимическое окрашивание>

Антитело, которое распознает MRAP2, можно тестировать в отношении реакционной способности с MRAP2 посредством иммуногистохимического способа, общеизвестного специалистам в данной области, используя замороженный тканевой срез, фиксированный параформальдегидом или ацетоном, или погруженный в парафин тканевой срез, фиксированный параформальдегидом. Такой срез получают из ткани, получаемой от пациента во время хирургического вмешательства, ткани костного мозга, лимфатического узла, периферических клеток крови или клеток костного мозга пациента или ткани, получаемой от животного, несущего ткань ксенотрансплантата, которое инокулировали клеточной линией, которая экспрессирует MRAP2 естественно или после трансфекции им.

[0093]

Для иммуногистохимического окрашивания антитело, иммунологически реактивное к MRAP2, можно окрашивать различными способами. Например, его можно визуализировать посредством реакции с антителом козы против мыши или антителом козы против кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена.

[0094]

<Фармацевтическая композиция>

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию (или лекарственное средство), содержащую антитело по настоящему изобретению, т.е. антитело против MRAP2 или его фрагмент (предпочтительно антигенсвязывающий фрагмент), описанные выше. Фармацевтическая композиция (или лекарственное средство) по настоящему изобретению обычно содержит эффективное количество антитела против MRAP2 или его фрагмента (предпочтительно, антигенсвязывающего фрагмента), описанных выше.

[0095]

Мишень фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли по настоящему изобретению конкретно не ограничена до тех пор, пока мишень представляет собой злокачественную опухоль (клетку), экспрессирующую ген MRAP2 (обычно, на клеточной поверхности).

[0096]

Оба термина «опухоль» и «злокачественная опухоль», используемые в настоящем описании, относятся к озлокачествленному новообразованию, и, таким образом, их используют взаимозаменяемым образом.

[0097]

Злокачественная опухоль, которая может быть мишенью в настоящем изобретении, представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую ген, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или частичную последовательность, состоящую из 7 или больше последовательных аминокислот из указанной аминокислотной последовательности, и предпочтительно представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую такой полипептид на клеточной поверхности. Злокачественная опухоль, которая может быть мишенью в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой лейкоз, злокачественную лимфому, злокачественную опухоль легких, опухоль головного мозга, злокачественную опухоль толстой кишки, меланому, нейробластому, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль почки, мастоцитому или перианальную аденокарциному. Конкретные примеры этих злокачественных опухолей включают, но не ограничиваясь этим, острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, T-клеточный лейкоз взрослых, алейкемический лейкоз, лейкоцитемический лейкоз, базофильный лейкоз, бластный лейкоз, коровий лейкоз, хронический миелолейкоз, гемодермию, эмбриональный лейкоз, эозинофильный лейкоз, лейкоз Гросса, лейкоз с клетками Ридера, лейкоз Шиллинга, стволовоклеточный лейкоз, сублейкемический лейкоз, лейкоз с недифференцированнымми клетками, волосатоклеточный лейкоз, гемобластный лейкоз, гемоцитобластный лейкоз, гистиоцитарный лейкоз, стволовоклеточный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, лейкопенический лейкоз, лимфатический лейкоз, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, лимфотропный лейкоз, лимфоидный лейкоз, лейкоз с клетками лимфосаркомы, тучноклеточный лейкоз, мегакариоцитарный лейкоз, микромиелобластный лейкоз, моноцитарный лейкоз, миелобластный лейкоз, миелолейкоз, миелоидный гранулоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, лейкоз Негели, лейкоз с плазматическими клетками, плазмоцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, неходжкинскую лимфому (лимфому Беркитта (BL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому/хронический лимфоцитарный лейкоз (SLL/CLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLCL), лимфому маргинальной зоны (MZL), волосатоклеточный лейкоз (HCL), лимфоплазмоцитарный лейкоз (LPL), внеузловую B-клеточную лимфому маргинальной зоны в лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми (MALT), средостенную крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфобластный лейкоз/лимфому из предшественников B-клеток, лимфому из предшественников T-клеток и NK-клеток (лимфобластную лимфому из предшественников T-клеток, лимфобластную лимфому из NK-клеток), новообразования из зрелых T- и NK-клеток (включая периферическую T-клеточную лимфому и лейкоз (PTL)), T-клеточный лейкоз взрослых/T-клеточную лимфому и лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов, хронический T-клеточный лимфоцитарный лейкоз/пролимфоцитарный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз из больших гранулярных T-клеток, агрессивный NK-клеточный лейкоз, внеузловую T-/NK-клеточную лимфому, T-клеточную лимфому энтеропатического типа, печеночно-селезеночную T-клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), ангиоцентрическую и ангиоиммунобластную T-клеточную лимфому, фунгоидный микоз/синдром Сезари, T-клеточную лимфому кожи (CTCL)), лимфому Ходжкина, немелкоклеточную злокачественную опухоль легких, плоскоклеточную карциному (эпидермоидную злокачественную опухоль), аденокарциному легких, крупноклеточную злокачественную опухоль легких, мелкоклеточную злокачественную опухоль легких, глиому, астроцитому, глиому ствола головного мозга, эпендимому, олигодендроглиому, неглиальную опухоль, акустическую неврилеммому, краниофарингиому, медуллобластому, менингиому, пинеоцитому, пинеобластому, первичную лимфому головного мозга, опухоль из половых клеток, поверхностную злокачественную опухоль толстой кишки, выступающую злокачественную опухоль толстой кишки, ульцеративную инфильтрирующую злокачественную опухоль толстой кишки, диффузную инфильтрирующую злокачественную опухоль толстой кишки, базальноклеточную злокачественную опухоль, шиповатоклеточную злокачественную опухоль, меланому, поверхностную распространяющуюся меланому, узловую меланому, меланому из озлокачествленного лентиго, акральную лентигинозную меланому, нейробластому, ганглионейробластому, ганглиому, инсулиному, гастриному, глюкагоному, ВИПому, соматостатин-секретирующую опухоль, карциноид, опухоль из островковых клеток, выступающую злокачественную опухоль желудка, ульцеративную локализованную злокачественную опухоль желудка, ульцеративную инфильтрирующую злокачественную опухоль желудка, диффузную инфильтрирующую злокачественную опухоль желудка, гепатоцеллюлярнУю злокачественную опухоль и гепатобластому, эпителиальную злокачественную опухоль яичников, пограничную опухоль, опухоль из половых клеток, стромальную опухоль, серозную аденокарциному, светлоклеточную аденокарциному, эндометриоидную аденокарциному, переходноклеточную злокачественную опухоль, аденокарциному слизистой, смешанную злокачественную опухоль яичника, плоскоклеточную карциному, аденокарциному пищевода, злокачественную опухоль клеток почки, аденокарциному почки, гипернефрому, фибросаркому почки, переходноклеточную злокачественную опухоль (почечной лоханки и/или мочеточнка), мастоцитому, перианальную аденому и перианальную аденокарциному.

[0098]

Кроме того, субъект-животное по настоящему изобретению представляет собой млекопитающее. Его примеры включают млекопитающих, таких как приматы, домашние животные, сельскохозяйственные животные, спортивные животные и экспериментальные животные. Человек, собаки и кошки особенно предпочтительны.

[0099]

Когда антитело, используемое в настоящем изобретении, используют в фармацевтической композиции, его можно формулировать с помощью способа, известного специалистам в данной области. Например, его можно использовать парентерально в форме инъекции, которая представляет собой асептический раствор или жидкую суспензию в воде или другом фармакологически приемлемом растворе. Например, в одном возможном случае его можно формулировать при комбинированном использовании фармакологически приемлемого носителя или среды или добавки и, в частности, стерилизованной воды, физиологического раствора, растительного масла, эмульсификатора, суспендирующего средства, поверхностно-активного средства, стабилизатора, ароматизатора, эксципиента, носителя, консерванта, связывающего средства или тому подобного подходящим образом посредством смешивания в стандартной дозированной форме, необходимой для общепринятого фармацевтического состава. Количество активного ингредиента в составе определяют так, что можно достичь подходящей дозы в указанном диапазоне.

[0100]

Асептическую композицию для инъекционных целей можно формулировать в соответствии с общей практикой формулирования с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекционных целей.

[0101]

Примеры водного раствора для инъекционных целей включают физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу и другие вспомогательные средства, такие как D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия. Такой раствор можно использовать вместе с подходящим солюбилизирующим средством, например, спиртами, такими как этанол и многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), и неионные поверхностно-активные средства, такие как полисорбат 80TM и HCO-60.

[0102]

Примеры масляной жидкости включают сезамовое масло и соевое масло. Такую масляную жидкость можно использовать в комбинации с бензилбензоатом или бензиловым спиртом в качестве солюбилизирующего средства. Кроме того, ее можно смешивать с буферным средством, таким как раствор фосфатного буфера, раствор натрий-ацетатного буфера, успокаивающим средством, таким как прокаина гидрохлорид, стабилизатором, таким как бензиловый спирт, фенол и/или антиоксидант. В целом, сформулированный инъекционный раствор вводят в достатке.

[0103]

Введение осуществляют перорально или парентерально и предпочтительно парентерально. Конкретные примеры дозированных форм включают инъецируемые дозированные формы, интраназальную дозированную форму, транспульмональную дозированную форму и чрескожную дозированную форму. Например, инъецируемую дозированную форму можно вводить системно или локально через внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию, или подкожную инъекцию. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению можно вводить непосредственно в опухоль с помощью местного введения, такого как инъекция, инфузия или имплантация состава с замедленным высвобождением, в опухоль.

[0104]

Кроме того, способ введения можно надлежащим образом определять, например, в зависимости от возраста, массы, пола и/или симптомов пациента. Например, однократную дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, можно выбирать в диапазоне от 0,0001 мг до 1000 мг на кг массы тела. Альтернативно дозу можно выбирать, например, в диапазоне от 0,001 до 100000 мг на организм пациента; однако она не обязательно ограничена этим. Доза и способ введения варьируют, например, в зависимости от возраста, массы, пола и симптомов пациента. Однако специалисты в данной области могут надлежащим образом выбирать дозу и способ.

[0105]

Злокачественную опухоль, описанную выше, в частности, злокачественную опухоль, экспрессирующую MRAP2 на клеточной поверхности, предпочтительно лейкоз, злокачественную лимфому, злокачественную опухоль легких, опухоль головного мозга, злокачественную опухоль толстой кишки, меланому, нейробластому, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль почки, мастоцитому или перианальную аденокарциному можно лечить и/или предотвращать посредством введения антитела по настоящему изобретению или его фрагмента или фармацевтической композиции, содержащей его, субъекту.

[0106]

Кроме того, способ лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, который включает введение, субъекту, фармацевтической композиции (или лекарственного средства) по настоящему изобретению в комбинации с противоопухолевым средством, как перечислено выше, или фармацевтической композиции (или лекарственного средства), содержащей противоопухолевое средство, также включен в настоящее изобретение. Целевая злокачественная опухоль представляет собой то же, что и выше. Антитело или его фрагмент в соответствии с настоящим изобретением и противоопухолевое средство можно вводить субъекту параллельно или отдельно. В случае их отдельного введения, любую из фармацевтических композиций можно вводить первой или последней, и их интервалы дозирования, дозы, пути введения и число доз может надлежащим образом выбирать врач-специалист. В случае их параллельного введения, например, в настоящее изобретение также включена фармацевтическая композиция в дозированной форме, получаемой посредством смешивания антитела или его фрагмента в соответствии с настоящим изобретением и противоопухолевего средства в фармакологически приемлемом носителе (или среде) для состава. Описание прописи, состава, путей введения, доз, злокачественных опухолей и т.д., касающихся фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих антитела по настоящему изобретению можно, применять ко всем фармацевтическим композициям и дозированным формам, содержащим противоопухолевые средства.

[0107]

Соответственно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической комбинации для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство, как перечислено выше, и способу лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, который включает их введение. Кроме того, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит антитело или его фрагмент в соответствии с настоящим изобретением и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем и/или добавкой.

Примеры

[0108]

Настоящее изобретение далее описано более подробно со ссылкой на следующие примеры, хотя объем настоящего изобретения не ограничен этим.

[0109]

Пример 1: идентификация нового антигенного белка злокачественной опухоли способом SEREX

(1) Конструирование библиотеки кДНК

Общую РНК экстрагировали из ткани семенника здоровой собаки способом с кислым гуанидинием-фенолом-хлороформом и затем очищали полиA РНК в соответствии с протоколами, включенными в Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).

[0110]

Фаговую библиотеку кДНК семенника собаки синтезировали с использованием полученной таким образом мРНК (5 мкг). Фаговую библиотеку кДНК конструировали с использованием cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit и ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE) в соответствии с протоколами, включенными в наборы. Размер сконструированной таким образом фаговой библиотеки кДНК составлял 1 × 10⁶ БОЕ/мл.

[0111]

(2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки

Иммунный скрининг осуществляли с использованием сконструированной выше фаговой библиотеки кДНК семенника собаки. В частности, организм-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') инфицировали фагом на чашке с агарозой NZY (Φ90 × 15 мм) с тем, чтобы получать приблизительно 2500 клонов. Клетки E. coli культивировали при 42°C в течение от 3 до 4 часов для того, чтобы формировать бляшки. Чашку накрывали нитроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science), импрегнированной с использованием IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид), при 37°C на 4 часа с тем, чтобы индуцировать, экспрессировать и затем перенести белок на мембрану. Потом брали мембрану и затем погружали в TBS (10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl и pH 7,5), содержащий 0,5% порошковое снятое молоко, после чего следовало встряхивание в течение ночи при 4°C, и тем самым подавляли неспецифическую реакцию. Проводили реакцию фильтра с 500-кратно разведенной сывороткой пациента-собаки при комнатной температуре в течение от 2 до 3 часов.

[0112]

В качестве вышеуказанной сыворотки пациента-собаки использовали сыворотку, собранную у пациента-собаки с лейкозом. Эти сыворотки хранили при -80°C и затем подвергали предварительной обработке незамедлительно перед использованием. Способ предварительной обработки сыворотки представляет собой следующее. В частности, организм-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') инфицировали с использованием фагаλ ZAP Express, в который не вставляли чужеродный ген, и затем культивировали в течение ночи на среде NZY для чашек при 37°C. Впоследствии в чашку добавляли буфер (0,2 M NaHCO₃ и pH 8,3), содержащий 0,5 M NaCl, чашку оставляли стоять при 4°C в течение 15 часов, и затем собирали супернатант в виде экстракта Escherichia coli/фага. Затем собранный таким образом экстракт Escherichia coli/фага наносили на NHS-колонку (GE Healthcare Bio-Science) с тем, чтобы иммобилизовать белок, полученный из Escherichia coli•фага. Сыворотку пациента-собаки наносили на колонку с иммобилизованным белком для реакции и затем антитела, адсорбированные на Escherichia coli и фаге, удаляли из сыворотки. Фракцию сыворотки, которая проходила через колонку, разводили 500-кратно в TBS, содержащем 0,5% порошковое снятое молоко. Получаемое использовали в качестве материала иммунного скрининга.

[0113]

Вышеуказанную мембрану, на которую переносили промакиванием обработанную сыворотку и белок, промывали 4 раза в TBS-T (0,05% Tween20/TBS) и затем проводили реакцию с IgG козы против собаки (Goat anti-Dog IgG-h+L HRP conjugated (BETHYL Laboratories)), разведенным 5000-кратно в TBS, содержащем 0,5% порошковое снятое молоко, в качестве вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре. Обнаружение осуществляли через ферментативную цветную реакцию с использованием реакционного раствора NBT/BCIP (Roche). Колонии, которые соответствовали участкам, положительным по цветной реакции, собирали с чашки с агарозой NZY (Φ90 × 15 мм) и затем лизировали в 500 мкл буфера SM (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO₄, 50 мМ Tris-HCl, 0,01% желатин и pH 7,5). Пока не унифицировали колонии, положительные по цветной реакции, вторичный скрининг и третичный скрининг повторяли с тем, чтобы осуществлять скрининг приблизительно 10000 фаговых клонов, реагирующих с IgG сыворотки, с помощью способа, схожего с приведенным выше. Таким образом, выделяли 1 положительный клон.

[0114]

(3) Поиск гомологии для выделенного гена антигена

Для анализа нуклеотидной последовательности 1 положительного клона, выделенного вышеуказанным способом, осуществляли процедуру превращения из фаговых векторов в плазмидные векторы. В частности, получали 200 мкл раствора, содержащего организм-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') с тем, чтобы поглощение OD600 составляло 1,0. Раствор смешивали со 100 мкл раствора очищенного фага и затем с 1 мкл хелперного фага ExAssist (STRATAGENE), после чего следовало 15 минут реакции при 37°C. Добавляли три (3) мл среды LB и затем осуществляли культивирование при 37°C в течение от 2,5 до 3 часов. Незамедлительно после культивирования температуру раствора поддерживали на 70°C с помощью водяной бани в течение 20 минут, осуществляли центрифугирование при 4°C и 1000 ×g в течение 15 минут и затем супернатант собирали в виде раствора фагмиды. Впоследствии получали 200 мкл раствора, содержащего организм-хозяин фагмиды Escherichia coli (SOLR) с тем, чтобы поглощение OD600 составляло 1,0. Раствор смешивали с 10 мкл раствора очищенного фага, после чего следовало 15 минут реакции при 37°C. Раствор (50 мкл) высевали на агаровую среду LB, содержащую ампициллин (конечная концентрация 50 мкг/мл) и затем культивировали в течение ночи при 37°C. Собирали одну трансформированную SOLR колонию и затем осуществляли культивирование в среде LB, содержащей ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл), при 37°C. ДНК плазмиды, содержащей вставку, представляющую интерес, очищали с использованием QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN).

[0115]

Очищенную плазмиду подвергали анализу последовательности полноразмерной вставки с помощью способа прогулки праймеров, используя праймер T3 с SEQ ID № 25 и праймер T7 с SEQ ID № 26. В результате анализа последовательности получали последовательность гена SEQ ID № 3. Осуществляли программу поиска идентичности последовательностей, поиск BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), с использованием нуклеотидной последовательности гена и его аминокислотной последовательности. В результате этого поиска идентичности последовательностей в известных генах обнаружено, что полученный ген представлял собой ген MRAP2. Идентичность последовательностей с MRAP2 человека, гомологом человека для MRAP2 собаки, составляла 91% в отношении нуклеотидной последовательности и 94% в отношении аминокислотной последовательности. Идентичность последовательностей с MRAP2 кошки составляла 95% в отношении нуклеотидной последовательности и 96% в отношении аминокислотной последовательности. Идентичность последовательностей с MRAP2 мыши, гомологом мыши для MRAP2 собаки, составляла 84% в отношении нуклеотидной последовательности и 88% в отношении аминокислотной последовательности. Нуклеотидная последовательность MRAP2 человека представлена в SEQ ID № 1 и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID № 2. Нуклеотидная последовательность MRAP2 кошки представлена в SEQ ID № 5 и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID № 6. Нуклеотидная последовательность MRAP2 мыши представлена в SEQ ID № 7 и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID № 8.

[0116]

(4) Анализ экспрессии генов в каждой ткани

Экспрессию гена, полученного вышеуказанным способом, в различных нормальных тканях, различных опухолевых тканях и различных клеточных линиях злокачественных опухолей собаки, человека и мыши исследовали с помощью способа RT-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Реакцию обратной транскрипции осуществляли следующим образом. В частности, общую РНК экстрагировали из каждой ткани (от 50 мг до 100 мг) и каждой клеточной линии (от 5 до 10 × 10⁶ клеток) с использованием реактива TRIZOL (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколами, приложенными к нему. кДНК синтезировали с использованием общей РНК и Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR ((Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколами, включенными в набор. Gene Pool cDNA (Thermo Fisher Scientific), QUICK-Clone cDNA (Clontech Laboratories, Inc.) и Large-Insert cDNA Library (Clontech Laboratories, Inc.) использовали как кДНК из нормальных тканей человека (головного мозга, семенника, ободочной кишки и плаценты). ПЦР осуществляли следующим образом с использованием праймеров со специфичностью к полученному гену (праймеры собаки: SEQ ID №№ 27 и 28, праймеры человека: SEQ ID №№ 29 и 30, праймеры мыши: SEQ ID №№ 31 и 32). В частности, ПЦР осуществляли посредством повторения 30 раз цикла из 94°C/30 с, 55°C/30 с и 72°C/1 минута с использованием Thermal Cycler (BIO RAD), и реакционный раствор корректировали до общего количества 25 мкл через добавление каждого реактива и приложенного буфера (0,25 мкл образца кДНК, полученной с помощью реакции обратной транскрипции, вышеуказанные праймеры (2 мкМ каждого), dNTP (0,2 мМ каждого) и 0,65 Ед полимеразы ExTaq (Takara Shuzo)). В результате, как показано на фиг. 1, наблюдали сильную экспрессию гена MRAP2 собаки в мастоцитоме и перианальной аденокарциноме в случае опухолевых тканей собаки (фиг. 1). Кроме того, экспрессию гена MRAP2 человека не наблюдали почти во всех здоровых тканях человека (фиг. 2A). С другой стороны, сильную экспрессию гена MRAP2 человека наблюдали в клеточных линиях лейкоза, злокачественной лимфомы, злокачественной опухоли легких, опухоли головного мозга, злокачественной опухоли толстой кишки, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли пищевода и злокачественной опухоли почки в случае клеток злокачественной опухоли человека (фиг. 2B). Кроме того, экспрессию гена MRAP2 мыши обнаруживали в клеточных линиях лейкоза, меланомы и нейробластомы (фиг. 3).

[0117]

Пример: 2 получение белка MRAP2 человека

(1) Клонирование полноразмерной кДНК, кодирующей MRAP2 человека, и кДНК, кодирующей внеклеточную область MRAP2 человека (далее в настоящем описании обозначаемую как hN-концевая часть MRAP2 или hC-концевая часть MRAP2, соответственно)

Полноразмерную кДНК, кодирующую MRAP2 человека, клонировали с помощью следующего способа на основании гена с SEQ ID № 1, полученного в примере 1. ПЦР осуществляли посредством повторения 30 раз цикла из 98°C/10 с, 55°C/15 с и 72°C/1 минута с использованием Thermal Cycler (BIO RAD), и реакционный раствор корректировали до общего количества 50 мкл через добавление каждого реактива и приложенного буфера (1 мкл кДНК (каждая из различных кДНК, извлеченных из тканей/клеток, которые получали в примере 1, и для которых наблюдали экспрессию с помощью RT-ПЦР), праймеров 2 типов (0,4 мкМ каждого; SEQ ID №№ 33 и 34), содержащих последовательности расщепления рестрикционных ферментов EcoRI и NotI, 0,2 мМ dNTP, 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo). Вышеуказанные праймеры 2 типов использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность с SEQ ID № 2. После ПЦР, амплифицированную таким образом ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и затем фрагмент ДНК приблизительно 0,6 т. п. о. очищали с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Полученный таким образом продукт ПЦР амплификации вставляли в pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) (далее в настоящем описании получаемое обозначают как MRAP2 человека/pcDNA3.1). Продукт амплификации также подтверждали посредством секвенирования с использованием секвенатора ДНК, чтобы иметь последовательность кДНК, кодирующую MRAP2 человека. Последовательность, представленная в SEQ ID № 1, представляет собой нуклеотидную последовательность гена MRAP2 человека, а последовательность, представленная в SEQ ID № 2, представляет собой аминокислотную последовательность белка MRAP2 человека.

[0118]

Кроме того, ПЦР осуществляли на основании SEQ ID № 1 посредством повторения 30 раз цикла из 98°C/10 с, 55°C/15 с и 72°C/30 с, используя Thermal Cycler (BIO RAD), и реакционный раствор корректировали до общего количества 50 мкл через добавление каждого реактива и приложенного буфера (праймеры 2 типов (0,4 мкМ каждого; SEQ ID №№ 35 и 36), содержащие последовательности расщепления рестрикционных ферментов KpnI и EcoRI, 0,2 мМ dNTP, 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo)). Вышеуказанные праймеры 2 типов использовали для амплификации области, кодирующей аминокислотную последовательность (SEQ ID № 10) внеклеточной области (N-концевой) белка MRAP2, в SEQ ID № 1. После ПЦР, амплифицированную таким образом ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и затем фрагмент ДНК приблизительно в 130 п. о. очищали с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Полученный таким образом продукт ПЦР амплификации лигировали в pSecTagB (Thermo Fisher Scientific), имеющую вставку кДНК, кодирующей белок IgG2a Fc мыши, чтобы получать экспрессирующий вектор, кодирующий N-концевую внеклеточную область MRAP2 человека/слитый белок IgG2a Fc мыши (далее в настоящем описании обозначают как hN-концевая MRAP2-mIgG2aFc) (далее в настоящем описании получаемый экспрессирующий вектор обозначают как pSecB-hN-концевая MRAP2-mIgG2aFc). Продукт амплификации также подтверждали посредством секвенирования с использованием секвенатора ДНК, чтобы иметь последовательность кДНК, кодирующую hN-концевую MRAP2-mIgG2aFc. Последовательность, представленная в SEQ ID № 37, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую hN-концевую MRAP2-mIgG2aFc, и последовательность, представленная в SEQ ID № 38, представляет собой аминокислотную последовательность hN-концевой MRAP2-mIgG2aFc.

[0119]

Кроме того, осуществляли ПЦР на основании SEQ ID № 1 посредством повторения 30 раз цикла из 98°C/10 с, 55°C/15 с и 72°C/30 с, используя Thermal Cycler (BIO RAD), и реакционный раствор корректировали до общего количества 50 мкл через добавление каждого реактива и приложенного буфера (праймеры 2 типов (0,4 мкМ каждого; SEQ ID №№ 39 и 40), содержащие последовательности расщепления рестрикционных ферментов KpnI и EcoRI, 0,2 мМ дНТФ, 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo)). Вышеуказанные праймеры 2 типов использовали для амплификации области, кодирующей аминокислотную последовательность (SEQ ID № 12) внеклеточной области (C-концевой) белка MRAP2, в SEQ ID № 1. После ПЦР, амплифицированную таким образом ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и затем фрагмент ДНК приблизительно в 400 п. о. очищали с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Полученный таким образом продукт ПЦР амплификации лигировали в pSecTagB (Thermo Fisher Scientific), имеющую вставку кДНК, кодирующей белок IgG2a Fc мыши, чтобы получать экспрессирующий вектор, кодирующий C-концевую внеклеточную область MRAP2 человека/слитый белок IgG2a Fc мыши (далее в настоящем описании обозначают как hC-концевая MRAP2-mIgG2aFc) (далее в настоящем описании получаемый экспрессирующий вектор обозначают как pSecB-hC-концевая MRAP2-mIgG2aFc). Продукт амплификации также подтверждали посредством секвенирования с использованием секвенатора ДНК, чтобы иметь последовательность кДНК, кодирующую hC-концевую MRAP2-mIgG2aFc. Последовательность, представленная в SEQ ID № 41, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую hC-концевую MRAP2-mIgG2aFc, и последовательность, представленная в SEQ ID № 42, представляет собой аминокислотную последовательность hC-концевой MRAP2-mIgG2aFc.

[0120]

(2) Получение hN-концевой MRAP2-mIgG2aFc

hN-концевую MRAP2-mIgG2aFc получали в качестве иммунизирующего антигена для получения антител к MRAP2.

[0121]

Экспрессирующий вектор pSecB-hN-концевая MRAP2-mIgG2aFc вводили способом липофекции в линию клеток почки эмбриона человека HEK293 и осуществляли очистку hN-концевой MRAP2-mIgG2aFc от культурального супернатанта, получаемого через 7 суток после введения. Культуральный супернатант наносили на колонку Hi Trap Protein A HP (GE Healthcare Bio-Science), которую затем промывали связывающим буфером (20 мМ фосфат натрия (pH 7,0)), после чего следовало элюирование с использованием элюирующего буфера (0,1 M глицин-HCl (pH 2,7)). Элюаты незамедлительно нейтрализовали посредством элюирования в пробирку с добавлением буфера для нейтрализации (1 M Tris-HCl (pH 9,0)). Затем буфер в элюатах, полученных вышеуказанным способом, заменяли на физиологический фосфатный буфер (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), используя ультрафильтрование NANOSEP 10K OMEGA (PALL). Стерильное фильтрование осуществляли с использованием 0,22-мкм HT Tuffryn Acrodisc (PALL) и затем получаемое использовали для следующих экспериментов.

[0122]

(3) Получение hC-концевой MRAP2-mIgG2aFc

hC-концевую MRAP2-mIgG2aFc получали в качестве иммунизирующего антигена для получения антител к MRAP2.

[0123]

Экспрессирующий вектор pSecB-hC-концевая MRAP2-mIgG2aFc вводили способом липофекции в линию клеток почки эмбриона человека HEK293 и осуществляли очистку hC-концевой MRAP2-mIgG2aFc от культурального супернатанта, получаемого через 7 суток после введения. Культуральный супернатант наносили на колонку Hi Trap Protein A HP (GE Healthcare Bio-Science), которую затем промывали связывающим буфером (20 мМ фосфат натрия (pH 7,0)), после чего следовало элюирование элюирующим буфером (0,1 M глицин-HCl (pH 2,7)). Элюаты незамедлительно нейтрализовали посредством элюирования в пробирку с добавлением буфера для нейтрализации (1 M Tris-HCl (pH 9,0)). Затем буфер в элюатах, получаемых вышеуказанным способом, заменяли на физиологический фосфатный буфер (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) с использованием ультрафильтрования NANOSEP 10K OMEGA (PALL). Стерильное фильтрование осуществляли с использованием 0,22-мкм HT Tuffryn Acrodisc (PALL) и затем получаемое использовали для следующих экспериментов.

[0124]

Пример 3: получение поликлонального антитела, связывающегося со внеклеточной областью MRAP2

(1) Получение поликлонального антитела к N-концевой части MRAP2

Чтобы достичь связывания антитела с N-концевой внеклеточной областью MRAP2, hN-концевую MRAP2-mIgG2aFc (0,1 мг), полученную как описано выше, в качестве антигена смешивали с раствором полного адъюванта Фрейнда (CFA) в количестве, эквивалентом ей. Смесь подкожно вводили мыши 4 раза каждые 2 недели. Впоследствии кровь собирали с тем, чтобы получать антисыворотку, содержащую поликлональное антитело. Кроме того, антисыворотку очищали с использованием носителя белка G (GE Healthcare Bio-Sciences) и затем получали поликлональное антитело против hN-концевой MRAP2-mIgG2aFc. Кроме того, антитело, полученное посредством очистки сыворотки мышей, которым не вводили антиген, с использованием носителя белка G описанным выше образом, обозначали как контрольное антитело.

[0125]

(2) Получение поликлонального антитела к C-концевой части MRAP2

Чтобы достигать связывания антитела с C-концевой внеклеточной областью MRAP2, hC-концевую MRAP2-mIgG2aFc (0,1 мг), полученную как описано выше, в качестве антигена смешивали с раствором полного адъюванта Фрейнда (CFA) в количестве, эквивалентном ей. Смесь подкожно вводили мыши 4 раза каждые 2 недели. Впоследствии кровь собирали с тем, чтобы получать антисыворотку, содержащую поликлональное антитело. Кроме того, антисыворотку очищали с использованием носителя белка G (GE Healthcare Bio-Sciences) и затем получали поликлональное антитело против hC-концевой MRAP2-mIgG2aFc. Кроме того, антитело, полученное посредством очистки сыворотки мышей, которым не вводили антиген, с использованием носителя белка G, описанным выше образом, обозначали как контрольное антитело.

[0126]

(3) Создание клеток, стабильно экспрессирующих полноразмерный MRAP2 человека

MRAP2 человека/pcDNA3.1, полученную как описано выше, вводили способом липофекции в клетки CHO-K1 (ATCC) и затем осуществляли отбор с использованием 500 мкг/мл G418 (Nacalai Tesque, Inc.) для создания клеточной линии CHO, стабильно экспрессирующей полноразмерный MRAP2 человека (CHO-MRAP2 человека). Клетки, полученные посредством введения экспрессирующего вектора (далее в настоящем описании обозначаемого как emp/pcDNA3.1), не имеющего вставки кДНК, кодирующей MRAP2, и последующего проведения отбора описанным выше образом, обозначали как контрольные клетки (далее в настоящем описании обозначаемые как CHO-emp).

[0127]

(4) Анализ экспрессии антигенного белка на клеточной поверхности

Исследовали, реагировало ли или нет поликлональное антитело, полученное выше в (1), специфически с MRAP2, экспрессированным на поверхности клеток, стабильно экспрессирующих полноразмерный MRAP2 человека, созданных выше в (3). Клетки CHO-MRAP2 человека или клетки CHO-emp (10⁶ каждых клеток) центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Туда добавляли поликлональное антитело против N-концевой части MRAP2 (2 мкг в 5 мкл), полученное выше в (1). Получаемое дополнительно суспендировали в PBS, содержащем 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, получаемое суспендировали в PBS, содержащем FITC-меченное антитело козы против IgG мыши (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (5 мкл) и 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (FBS) (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Между тем, процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли с использованием контрольного антитела, полученного выше в (1), вместо поликлонального антитела против MRAP2, чтобы получать контроль. Как результат, обнаруживали увеличение интенсивности флуоресценции 215% в клетках CHO-MRAP2 человека, к которым добавляли поликлональное антитело против N-концевой части MRAP2, по сравнению с контролем. Между тем, процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли для клеток CHO-emp. Как результат, обнаруживали увеличение интенсивности флуоресценции 0% в клетках CHO-emp, к которым добавляли поликлональное антитело против N-концевой части MRAP2, по сравнению с контролем. На основании вышеуказанного обнаружено, что поликлональное антитело против N-концевой части MRAP2 способно специфически связываться с белком MRAP2, экспрессированным на поверхностях клеточных мембран. Кроме того, степень увеличения интенсивности флуоресценции представляют с помощью степени увеличения средней интенсивности флуоресценции (значение MFI) в клетках. Ее вычисляли с помощью следующего уравнения.

[0128]

Степень увеличения средней интенсивности флуоресценции (степень увеличения интенсивности флуоресценции) (%)=((значение MFI для клеток, реагировавших с антителом против MRAP2 человека) - (контрольное значение MFI))/(контрольное значение MFI) × 100

[0129]

Далее исследовали, реагировало ли или нет поликлональное антитело, полученное выше в (2), специфически с MRAP2, экспрессированным на поверхностях клеток, стабильно экспрессирующих полноразмерный MRAP2 человека, созданных выше в (3). Клетки CHO-MRAP2 человека или клетки CHO-emp (10⁶ каждых клеток) центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Туда добавляли поликлональное антитело против C-концевой части MRAP2 (2 мкг в 5 мкл), полученное выше в (2). Получаемое дополнительно суспендировали в PBS, содержащем 0,1% эмбриональную телячью сыворотка (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, получаемое суспендировали в PBS, содержащем FITC-меченное антитело козы против IgG мыши (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (5 мкл) и 0,1% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Между тем, процедуру, схожую и вышеуказанным, осуществляли с использованием контрольного антитела, полученного выше в (2), вместо поликлонального антитела против MRAP2, чтобы получать контроль. Как результат, обнаруживали увеличение интенсивности флуоресценции 223% в клетках CHO-MRAP2 человека, к которым добавляли поликлональное антитело против C-концевой части MRAP2, по сравнению с контролем. Между тем, процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли для клеток CHO-emp. Как результат, обнаруживали увеличение интенсивности флуоресценции 0% в клетках CHO-emp, к которым добавляли поликлональное антитело против C-концевой части MRAP2, по сравнению с контролем. На основании вышеуказанного обнаружено, что поликлональное антитело против C-концевой части MRAP2 способно специфически связываться с белком MRAP2, экспрессированным на поверхностях клеточных мембран. Кроме того, степень увеличения интенсивности флуоресценции представлена степенью увеличения средней интенсивности флуоресценции (значение MFI) в клетках. Ее вычисляли с помощью следующего уравнения.

[0130]

Степень увеличения средней интенсивности флуоресценции (степень увеличения интенсивности флуоресценции) (%)=((значение MFI для клеток, реагировавших с антителом против MRAP2 человека) - (контрольное значение MFI))/(контрольное значение MFI) × 100

[0131]

Далее исследовали, экспрессирован ли или нет белок MRAP2 на клеточных поверхностях клеточных линий лейкоза 2 типов (K562 и THP-1) и клеточной линии злокачественной лимфомы (Namalwa), в которых наблюдали сильную экспрессию гена MRAP2. Каждую клеточную линию человека (10⁶ клеток), в которых наблюдали экспрессию гена, как описано выше, центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Туда добавляли поликлональное антитело против C-концевой части MRAP2 (2 мкг в 5 мкл), полученное выше в (2). Получаемое дополнительно суспендировали в PBS, содержащем 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, получаемое суспендировали в PBS, содержащем FITC-меченное антитело козы против IgG мыши (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (5 мкл) и 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (FBS) (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Между тем, процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли с использованием контрольного антитела, полученного выше в (2), вместо поликлонального антитела против C-концевой части MRAP2, чтобы получать контроль. Как результат, обнаруживали интенсивность флуоресценции по меньшей мере на 30% сильнее во всех клетках, к которым добавляли поликлональное антитело против C-концевой части MRAP2, чем таковая в контрольных клетках. В частности, наблюдали следующие увеличения интенсивности флуоресценции: K562: 197%, THP-1: 123% и Namalwa: 104%. На основании вышеуказанного обнаружено, что белок MRAP2 экспрессирован на поверхностях клеточных мембран вышеуказанных клеточных линий злокачественных опухолей человека. Кроме того, степень увеличения интенсивности флуоресценции представляют с помощью степени увеличения средней интенсивности флуоресценции (значение MFI) в клетках. Ее вычисляли с помощью следующего уравнения.

[0132]

Степень увеличения средней интенсивности флуоресценции (степень увеличения интенсивности флуоресценции) (%)=((значение MFI для клеток, реагировавших с антителом против MRAP2 человека) - (контрольное значение MFI))/(контрольное значение MFI) × 100

[0133]

Пример 4: противоопухолевые эффекты (активность ADCC) поликлонального антитела против MRAP2 на клетках злокачественной опухоли

Далее исследовали, способно ли или нет поликлональное антитело против MRAP2 повреждать MRAP2-экспрессирующие опухолевые клетки. Оценку осуществляли с использованием поликлонального антитела против N-концевой части MRAP2 человека или C-концевой части MRAP2 человека, полученного в примере 3. Клеточную линию лейкоза человека K562 или клеточную линию злокачественной лимфомы человека Namalwa (10⁶ клеток), в которых подтверждали экспрессию MRAP2, отдельно собирали в 50-мл центрифужную пробирку. Туда добавляли хром-51 (100 мкКи), после чего следовала инкубация при 37°C в течение 2 часов. После этого клетки промывали 3 раза в среде RPMI1640, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку, и добавляли в лунки (10³ клеток на лунку) в 96-луночные планшеты с V-образным дном. Туда добавляли каждое вышеуказанное поликлональное антитело против MRAP2 человека (1 мкг на лунку). Кроме того, туда добавляли лимфоциты, выделенные из периферической крови мыши (2 × 10⁵ клеток на лунку), после чего следовало культивирование в условиях 37°C и 5% CO₂ в течение 4 часов. После культивирования в каждом культуральном супернатанте определяли уровень хрома (Cr) 51, высвобождаемого из поврежденных опухолевых клеток. Затем вычисляли активность ADCC поликлонального антитела против N-концевой части MRAP2 человека или C-концевой части MRAP2 человека в отношении клеток злокачественной опухоли. Как результат, наблюдали активности ADCC против клеток K562 (15,7% и 16,3%, соответственно) и клеток Namalwa (14,8% и 14,0%, соответственно) (см. фиг. 4). Между тем, по существу не наблюдали активность против каждой клеточной линии в случае, когда процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли с использованием контрольного антитела, полученного из периферической крови мыши, которую не иммунизировали антигеном (пример 3), или в случае, когда не добавляли антитело (см. фиг. 4). Соответственно, обнаружено, что MRAP2-экспрессирующие опухолевые клетки можно повреждать посредством индукции активности ADCC с использованием антитела против MRAP2.

[0134]

Кроме того, для цитотоксической активности (активности ADCC) на фиг. 4, антитело против MRAP2, используемое в настоящем изобретении, лимфоциты мыши и 10³ клеток вышеуказанных клеточных линий, содержащих хром 51, смешивали вместе и культивировали в течение 4 часов и затем определяли уровень хрома-51, высвобождаемого в среду, как описано выше. Цитотоксическую активность клеточной линии лейкоза вычисляли с помощью следующих уравнений.

[0135]

*Уравнение: цитотоксическая активность (%)=[(уровень хрома-51, высвобождаемого из K562, к которым добавляли антитело против MRAP2 и лимфоциты мыши)/(уровень хрома-51, высвобождаемого из целевых клеток, к которым добавляли 1 Н соляную кислоту)] × 100

Промышленная применимость

[0136]

Антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предотвращения злокачественных опухолей.

[0137]

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с белком MRAP2, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью или с фрагментом белка MRAP2, содержащим 7 или больше последовательных аминокислот. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 пр., 4 ил.

1. Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с белком MRAP2, экспрессированным на клеточной поверхности, где указанный белок MRAP2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с частичным полипептидом белка MRAP2, где частичный полипептид представляет собой полипептид, состоящий из 7 или больше последовательных аминокислот аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID №№ 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 24, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, в которой злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую MRAP2 на клеточной поверхности.

4. Фармацевтическая композиция по любому одному из пп. 1-3, в которой злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из лейкоза, злокачественной лимфомы, злокачественной опухоли легких, опухоли головного мозга, злокачественной опухоли толстой кишки, меланомы, нейробластомы, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли почки, мастоцитомы и перианальной аденокарциномы.

5. Фармацевтическая композиция по любому одному из пп. 1-4, в которой антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.

6. Фармацевтическая композиция по любому одному из пп. 1-5, в которой антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

7. Фармацевтическая комбинация для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит фармацевтическую композицию по любому одному из пп. 1-6 и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

8. Способ лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, который включает введение субъекту антитела или его фрагмента, обладающих иммунологической реактивностью с белком MRAP2, экспрессированным на клеточной поверхности, где указанный белок MRAP2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8.