ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ Российский патент 2018 года по МПК A61K39/395 C07K16/30 A61P35/00 A61P35/02 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против злокачественной опухоли.

Уровень техники

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном с помощью хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии и иммунологии злокачественных опухолей, были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).

Для уменьшения неблагоприятных явлений терапии злокачественной опухоли, желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках и специфически существовали в злокачественных клетках. В 1991 году, Boon et al. (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцируемыми в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). Согласно этому способу были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, проводятся клинические испытания клеточной терапии с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапии, специфичной в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин и т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей.

В последние годы во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является отрицательным результатом и приводит к неблагоприятным реакциям. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, тогда эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше неблагоприятных реакций.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен как внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и формирует внутриклеточные стрессовые гранулы с РНК в клетках для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток, и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2).

Список литературы

Патентная литература

Патентный документ 1: Патент США 5698396

Патентный документ 2: WO 2010/016526.

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 55-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan)

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genenet. 6: 33-3 9, 1997.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Задачей настоящего изобретения является получение антитела, которое нацелено на CAPRIN-1, специфически экспрессируемый на поверхности злокачественных клеток, и которое имеет улучшенную противоопухолевую активность по сравнению с общепринятыми антителами, и обеспечение применения антитела в качестве терапевтического и/или профилактического средства против злокачественной опухоли.

Решение проблемы

Настоящее изобретение имеет следующие аспекты.

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, и к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей их в качестве активного ингредиента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

В альтернативном варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело).

Настоящее описание включает содержание патентной заявки Японии № 2011-171300, на основе которой испрашивается приоритет настоящей заявки.

Преимущественные эффекты изобретения

Антитело против CAPRIN-1, используемое согласно настоящему изобретению, повреждает злокачественные клетки. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 применимо при лечении и/или профилактике злокачественной опухоли.

Описание вариантов осуществления

Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое распознает и связывает заданный частичный полипептид CAPRIN-1 и обладает противоопухолевой активностью. Более конкретно, антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое распознает (т.е. обладает иммунологической реактивностью в отношении) частичный полипептид белка CAPRIN-1 (частичный полипептид CAPRIN-1), состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Сущность настоящего изобретения заключается в том, что это антитело проявляет противоопухолевую активность. Настоящее изобретение относится ко всем антителам, которые связываются с фрагментами белка CAPRIN-1, как описано выше, и проявляют противоопухолевую активность.

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению может представлять собой любой тип антитела, который может проявлять противоопухолевую активность и включает, например, рекомбинантные антитела, например, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), антитела человека и фрагменты этих антител, например, Fab, F(ab')₂ и Fv. Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, известными специалистам в данной области. Желательно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению обладало иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1 или его частичного полипептида, т.е. связывалось с белком CAPRIN-1 через взаимодействие антиген-антитело, предпочтительно, специфично связывалось с белком CAPRIN-1. В этом контексте выражение "специфическое связывание с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1, по существу не связываясь с другими белками. Антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Альтернативно, антитело согласно настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело, при условии, что могут стабильно продуцироваться гомогенные антитела. В случае, когда субъектом является человек, желательно антитело человека или гуманизированное антитело для предотвращения или подавления отторжения.

Антитело против полипептида CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Субъектом, которому проводят лечение и/или профилактику злокачественной опухоли согласно настоящему изобретению, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.

Далее настоящее изобретение описано более подробно.

Получение антигена для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению, не ограничиваются видом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие от млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие от человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов доступны, например, в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

В настоящем изобретении, в тех случаях, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2 или 4) CAPRIN-1 человека используют в качестве основной последовательности, мишенью в виде CAPRIN-1 являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно, на 80%-100%, более предпочтительно, на 90%-100% и, еще более предпочтительно, на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. В этом контексте термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или нуклеотидных оснований), от общего числа аминокислот (или нуклеотидных оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства (или идентичность), с внесением пропусков или без него.

В качестве фрагментов каждого белка CAPRIN-1 можно использовать фрагменты, содержащие эпитоп (или антигенную детерминанту), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, и имеющие длину в диапазоне от длины аминокислотной последовательности эпитопа до менее чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, имеющему антигенность или иммуногенность у млекопитающих, предпочтительно у человека. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот. Фрагменты белка CAPRIN-1 для применения при получении антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой фрагменты, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, распознаваемой антителом по настоящему изобретению, или содержащую по меньшей мере эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 последовательно расположенных аминокислот, например, 8-11 последовательно расположенных аминокислот, в любой из этих аминокислотных последовательностей.

Полипептидные фрагменты, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) или способ tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти пептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов.

Альтернативно, можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием подходов генной инженерии, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.), и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева, так чтобы в клетках-хозяевах продуцировались полипептиды. Таким путем можно получать представляющие интерес белки CAPRIN-1 человека или их полипептидные фрагменты.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью подходов генной инженерии, известных в данной области, или общепринятых способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, можно получать с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но, не ограничиваясь ими, 30 циклов, каждый из которых вовлекает стадии реакции, состоящие из: 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг); и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимераза, Pfu-полимераза и т.п.) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР, с последующим взаимодействием при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также можно получать соответствующие зонды и праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях гена CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностях белка CAPRIN-1 и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак поджелудочной железы и рак ободочной и прямой кишки. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены согласно способам, описанным, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.

Клетки-хозяева, в которые вводят экспрессирующие векторы, могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но, не ограничиваясь ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но, не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся клетки дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.

В тех случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используемый экспрессирующий вектор может иметь ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.п. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессирующие системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, и затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом полипептиды могут быть экспрессированы в качестве слитых белков с другими белками.

В случаях использования эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев можно использовать экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.п. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогичным путем, как описано выше, ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, и затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы, такие как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в виде различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP и т.п.

Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев комбинацией способов разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но, не ограничиваясь ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и хроматографию с обращенной фазой.

Для получения антитела согласно настоящему изобретению, антигены, полученные таким образом, можно использовать в качестве сенсибилизирующих антигенов, как описано ниже.

Структура антитела

В основном, антитела (иммуноглобулины) представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый из которых содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Иммуноглобулины, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи расположена параллельно первой константной области тяжелой цепи, в то время как вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", демонстрируют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельной области называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 наиболее важна для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вблизи друг от друга FR областями, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточноопросредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.

Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента. В частности, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению представляет собой антитело, иммунологически связывающееся с частичным полипептидом белка CAPRIN-1 (частичный полипептид CAPRIN-1), который представляет собой пептид, содержащий эпитоп и состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно распознает эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 последовательно расположенных аминокислот, например, 8-11 последовательно расположенных аминокислот, в аминокислотой последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Это антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению может специфически связываться полноразмерным белком CAPRIN-1. Антитело по настоящему изобретению можно получать путем отбора антитела, иммунологически связывающегося с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, согласно общепринятому способу, из антител, полученных с помощью белка CAPRIN-1 или его фрагментов в качестве антигенов.

В этом контексте "иммунологическая реактивность" означает свойство связывания антитела с антигеном CAPRIN-1 (полноразмерный белок CAPRIN-1 или его частичный полипептид) in vivo. Посредством такого связывания антитела по настоящему изобретению с CAPRIN-1 антитело проявляет функцию повреждения (например, гибель, подавление или регрессию) опухолевых клеток. Антитело по настоящему изобретению может повреждать опухоли, такие как рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки (например, рак толстой кишки), рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфома, фибросаркома, мастоцитома или меланома, в результате связывания с белком CAPRIN-1.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой любой тип антитела. Примеры типа антитела согласно настоящему изобретению включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Также антитело представляет собой любой класс молекулы иммуноглобулина, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любой подкласс, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Кроме того, антитело может быть модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием и т.п., в дополнение к гликозилированию.

Далее представлены примеры получения различных антител.

Когда антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, например, клеточную линию рака молочной железы SK-BR-3, экспрессирующую CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. Из этих мышей извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток (гибридомы). Альтернативно, можно отбирать клоны, продуцирующие антитела, связывающиеся с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, или гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против полипептидов SEQ ID NO:5 и т.д., выделяют и культивируют. Антитело по настоящему изобретению можно получать путем очистки из культурального супернатанта согласно общему способу аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом. Сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно включает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разводят или суспендируют в PBS (забуфернный фосфатом солевой раствор), физиологическом растворе и т.п. до получения в результате подходящего количества, и затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования их вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые 4-21 суток. Альтернативно, для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.

После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке животного (как правило, млекопитающего), иммунизированного таким образом, иммуноциты собирают от животного и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

В качестве родительских клеток-партнеров, подлежащих слиянию с иммуноцитами, можно использовать, например, клетки миеломы млекопитающих. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные клеточные линии, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы можно проводить в основном согласно способу, известному в данной области, например, способом Kohler и Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии фактора, стимулирующего слияние клеток, в общепринятой питательной среде. Например, в качестве фактора, стимулирующего слияние клеток, используют полиэтиленгликоль (PEG) и японский гемагглютинирующий вирус (HVJ). При желании, для повышения эффективности слияния можно дополнительно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между иммуноцитами и используемыми клетками миеломы может быть выбрано произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно выбирают так, чтобы оно превышало количество клеток миеломы в 1-10 раз. Примеры среды, которую можно использовать для слияния клеток, включают среду RPMI1640 и среду MEM, пригодные для роста линий клеток миеломы, а также другие общепринятые среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Кроме того, в комбинации с этими средами можно использовать добавку на основе сыворотки, такую как фетальная телячья сыворотка (FCS).

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы тщательно перемешивают в заранее определенном количестве среды. Обычно к смеси добавляют раствор PEG (средняя молекулярная масса приблизительно 1000-6000), предварительно нагретый

приблизительно до 37°C, в концентрации 30%-60% (масс./об.), и перемешивают с ним для образования представляющих интерес гибридом. После этого предпочтительно осуществляют повторяющиеся действия, состоящие в последовательном добавлении соответствующей среды и удалении супернатанта центрифугированием для удаления агентов слияния клеток и т.п., которые не являются благоприятными для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в общепринятой селективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для селекции. Культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (как правило, от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Затем проводят скрининг гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело, и клонирование в виде единичных клонов общепринятым способом лимитирующих разведений.

В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не являющихся человеком животных антигенами, гибридомы, продуцирующие антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, активностью ингибирования роста клеток), можно получать путем сенсибилизации лимфоцитов человека, например, инфицированных вирусом EB лимфоцитов человека, белками, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с полученными от человека клетками миеломы, способными постоянно делиться, например, U266 (номер доступа № TIB196).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные таким образом, можно субкультивировать в общепринятой среде, а также можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

В частности, желаемые антигены или клетки, экспрессирующие желаемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов при иммунизации согласно общепринятому способу иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в данной области, согласно общепринятому способу слияния клеток. Клетки (гибридомы), продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу общепринятым способом скрининга для получения гибридом, продуцирующих представляющие интерес антитела.

Другим примером антитела, которое можно использовать в настоящем изобретении, является поликлональное антитело. Поликлональное антитело можно получать, например, следующим образом.

Получают сыворотку небольших животных, таких как мыши, мыши, продуцирующие антитела человека, или кролики, иммунизированные природным белком CAPRIN-1 или рекомбинантным белком CAPRIN-1, экспрессируемым в виде слитого белка с GST, и т.п. в микроорганизмах, таких как E. coli, или его частичными пептидами. Альтернативно, можно получать сыворотку млекопитающих, иммунизированных фрагментами полипептидов CAPRIN-1, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью (предпочтительно, полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5), или полипептидами, каждый из которых содержит (предпочтительно, состоит из) эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 последовательно расположенных аминокислот, например, 8-11 последовательно расположенных аминокислот, в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательностью, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, в качестве сенсибилизирующих антигенов. Эти сыворотки очищают с использованием, например, преципитацией с сульфатом аммония, колонок с белком A или белком G, ионообменной хроматографии с DEAE или аффинных колонок, с которыми связаны белки CAPRIN-1 или синтетические пептиды, с получением поликлонального антитела против CAPRIN-1. Поликлональное антитело по настоящему изобретению включает антитела, полученные из животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), иммунизированных белком CAPRIN-1.

В этом контексте, например, мыши KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) или мыши XenoMouse (Amgen Inc.) известны в качестве мышей, продуцирующих антитела человека (например, международные публикации № WO02/43478 и WO02/092812). Из крови таких мышей, иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, можно получить полные поликлональные антитела человека. Альтернативно, из мышей, иммунизированных таким образом, можно выделять клетки селезенки и подвергать слиянию с клетками миеломы. Таким образом, можно получать моноклональные антитела человека.

Антигены можно получать, например, способом с использованием клеток животных (публикация патента Японии (Kohyo) № 2007-530068 A (2007)) или способом с использованием бакуловируса (например, международная публикация № WO98/46777). Антигены, обладающие низкой иммуногенностью, могут быть связаны с иммуногенными макромолекулами, такими как альбумин, для иммунизации. Антигены можно вводить с адъювантами для иммунизации.

Альтернативно, антитела по настоящему изобретению можно получать в качестве рекомбинантных антител, которые получают с использованием способов генной инженерии, которые вовлекают клонирование генов антител из гибридом; встраивание генов антител в соответствующие векторы; и введение векторов в хозяев (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-область) антитела синтезируют из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей представляющие интерес V-области, ДНК лигируют с ДНК, кодирующей желаемые константные области антитела (C-области). Полученные в результате продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы. Альтернативно, ДНК, кодирующие V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК С-области антитела. Эти ДНК встраивают в экспрессирующие векторы таким образом, чтобы они экспрессировались под контролем областей контроля экспрессии, например, энхансера или промотора. Далее, клетки-хозяева можно трансформировать полученными экспрессирующими векторами и давать им возможность экспрессировать антитела.

Антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Альтернативно, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело, полученное способами генной инженерии антитело (химерное антитело, гуманизированное антитело и т.д.) и т.п.

Моноклональное антитело включает моноклональные антитела человека, моноклональные антитела не являющихся человеком животных (например, моноклональные антитела мыши, крысы, кролика и курицы), химерные моноклональные антитела и т.п. Моноклональное антитело можно получать путем культивирования гибридом, полученных слиянием между клетками селезенки от не являющихся человеком животных (например, мышей или мышей, продуцирующих антитела человека, кур и кроликов), иммунизированных белком CAPRIN-1 или его фрагментами, и клетками миеломы. Альтернативно, гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из клеток селезенки не являющихся человеком животных (например, мышей, мышей, продуцирующих антитела человека, кур и кроликов), иммунизированных белком CAPRIN-1 или его фрагментами, можно встраивать через линкеры в фагмидные векторы, которые затем вводят в E. coli так, чтобы экспрессировались одноцепочечные антитела через хелперные фаги, с получением представляющих интерес антител. Химерное антитело представляет собой антитело, полученное из комбинации последовательностей, полученных от различных животных, и представляет собой, например, антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антител мыши и константных областей тяжелых и легких цепей антител человека. Химерное антитело можно получать с использованием способа, известного в данной области, который включает, например: лигирование ДНК, кодирующих V-области антитела, с ДНК, кодирующими C-области антител человека; включение полученных продуктов лигирования в экспрессирующие векторы; и введение векторов в хозяев, так чтобы продуцировались антитела.

Моноклональные антитела, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, и обладают противоопухолевым эффектом, получают способами, описанными ниже в разделе "Примеры". Каждое из этих моноклональных антител содержит, например, вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, 19, 58, 63, 69 или 77, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, 23, 53, 62, 65, 73 или 81. В этих моноклональных антителах, VH-область может содержать CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, 16, 55, 66 или 74, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, 17, 56, 67 или 75, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, 18, 57, 68 или 76, и VL-область может содержать CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, 20, 50, 59, 70 или 78, CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, 21, 51, 60, 64, 71 или 79, и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, 22, 52, 61, 72 или 80.

Гуманизированное антитело, также называемое реконструированным антителом человека, представляет собой антитело, полученное способами инженерии. Гуманизированное антитело конструируют путем пересадки CDR антитела, полученного от иммунизированного животного, в определяющие комплементарность области антитела человека. Общий подход рекомбинации генов для этого также известен.

В частности, например, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, чтобы связать CDR антител мыши, кролика и курицы с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют с помощью ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, полученных таким образом, чтобы они имели концевые части, перекрывающиеся друг с другом. Полученные ДНК лигируют с ДНК, кодирующими константные области антител человека. Затем полученные продукты лигирования встраивают в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в хозяев для продукции антител для получения представляющего интерес антитела (см. публикацию патентной заявки Европы № EP239400 и международную публикацию № WO96/02576). FR антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы CDR в полученном в реконструированном антителе человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, эти каркасные области могут быть заменены каркасными областями, происходящими из различных антител человека (см. международную публикацию № WO99/51743).

Каркасные области антитела человека, соединенные через CDR, выбирают так, чтобы определяющие комплементарность области образовывали подходящий антигенсвязывающий центр. При необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельных областей антитела могут быть заменены таким образом, чтобы определяющие комплементарность области полученного реконструированного антитела человека образовывали соответствующие антигенсвязывающие центры (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Аминокислоты в вариабельных областях (например, FR) или константных областях химерного антитела или гуманизированного антитела, полученного таким образом, можно заменять, например, другими аминокислотами.

Аминокислотная замена представляет собой замену, например, менее 15, менее 10, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее аминокислот, предпочтительно, 1-5 аминокислот, и более предпочтительно, 1 или 2 аминокислот. Антитело с заменой должно быть функционально эквивалентным антителу без замены. Замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену, которая представляет собой замену между аминокислотами, имеющими сходные свойства, такие как заряд, боковые цепи, полярность и ароматичность. С точки зрения сходства свойств, аминокислоты могут быть подразделены, например, на: основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин); кислые аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, цистеин и тирозин); неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); аминокислоты с разветвленной цепью (лейцин, валин, изолейцин) и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).

Примеры модифицированных антител могут включать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). В модифицированном антителе по настоящему изобретению вещество, подлежащее присоединению, не ограничено. Для получения такого модифицированного антитела, полученное антитело может быть химически модифицированным. Способ для этого уже разработан в данной области.

В этом контексте выражение "функционально эквивалентный" означает, что рассматриваемое антитело обладает биологической или биохимической активностью, сходной с активностью антитела по настоящему изобретению, в частности, рассматриваемое антитело обладает функцией повреждения опухоли и по существу не вызывает отторжения при применении, например, у человека. Примеры такой активности могут включать активность ингибирования роста клеток и активность связывания.

Способ получения полипептида, функционально эквивалентного определенному полипептиду, который включает внесение мутации в полипептид, хорошо известен специалистам в данной области. Например, специалисты в данной области могут соответствующим образом вносить мутацию в антитело по настоящему изобретению с использованием сайтнаправленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., и Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. и Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; и Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) и т.п., тем самым получая антитело, функционально эквивалентное антителу по настоящему изобретению.

Антитело, которое распознает эпитоп белка CAPRIN-1, описанный выше, или фрагмент полипептида CAPRIN-1, включающий его, можно получать способом, в основном известным специалистам в данной области. Например, антитело можно получать способом, который включает определение эпитопа белка CAPRIN-1, распознаваемого антителом против CAPRIN-1, обладающим эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, полученным описанным выше общепринятым способом (например, картированием эпитопа или способом идентификации эпитопа, как описано ниже), и получение антитела с использованием полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащуюся в эпитопе, в качестве иммуногена, или способа, который включает определение эпитопа антитела, полученного общепринятым способом, и селекцию антитела, которое распознает тот же эпитоп, что и у антитела против CAPRIN-1. В этом контексте, "эпитоп" относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих, предпочтительно людей. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, предпочтительно 8-11 аминокислот.

Антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении CAPRIN-1, антитело, специфически распознающее CAPRIN-1, или антитело, специфично связывающееся с CAPRIN-1, и оно проявляет цитотоксическую активность или эффект ингибирования роста опухоли в отношении злокачественной опухоли. Антитело предпочтительно имеет структуру, которая дает возможность полностью или почти полностью избежать реакции отторжения у реципиентных животных. Примеры таких антител включают антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела человека-мыши), одноцепочечные антитела и биспецифические антитела, когда реципиентными животными являются люди. Эти антитела имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей, полученные из антитела человека, или имеют вариабельные области тяжелой и легкой цепей, состоящие из определяющих комплементарность областей (CDR1, CDR2 и CDR3), полученных из антитела не являющегося человеком животного, и каркасных областей, полученных из антитела человека. Альтернативно, эти антитела представляют собой рекомбинантные антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, полученные из антитела не являющегося человеком животного, и константные области тяжелой и легкой цепей, полученные из антитела человека. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой первые два из этих антител.

Такие рекомбинантные антитела можно получать следующим образом: ДНК, кодирующие моноклональные антитела (например, моноклональные антитела человека, мыши, крысы, кролика и курицы) против CAPRIN-1 человека, клонируют из антителопродуцирующих клеток, таких как гибридомы, и используют в качестве матриц для получения ДНК, кодирующей вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, способом ОТ-ПЦР и т.п. Соответствующие последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей и соответствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой области определяют с помощью системы нумерации Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

ДНК, кодирующую каждую вариабельную область, или ДНК, кодирующую каждую CDR, получают с использованием способов генной инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или устройства для синтеза ДНК. Приведенные выше гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела человека, можно получать путем иммунизации животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), посредством CAPRIN-1 человека, и затем слияния клеток селезенки, извлеченных из иммунизированных животных, с клетками миеломы. Отдельно, при необходимости, ДНК, кодирующие вариабельные и константные области легкой или тяжелой цепей антитела человека, получают с использованием способов генной инженерии или устройства для синтеза ДНК.

Для гуманизированного антитела, ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, можно получать путем получения ДНК, в которых последовательности, кодирующие CDR в ДНК, кодирующих вариабельные области легкой или тяжелой цепей, полученные из антитела человека, заменены на соответствующие кодирующие последовательности CDR антитела, полученного от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), и лигирования полученных ДНК с ДНК, кодирующими полученные из антител человека константные области легкой или тяжелой цепей, соответственно.

Для химерного антитела, ДНК, кодирующую химерное антитело, можно получать путем лигирования ДНК, кодирующих вариабельные области легкой или тяжелой цепи антитела, полученного от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы), с ДНК, кодирующими константные области, полученные из легкой или тяжелой цепей антитела человека.

Одноцепочечное антитело означает антитело, в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепей линейно связаны друг с другом через линкер. ДНК, кодирующую одноцепочечное антитело, можно получать путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. В этом контексте, вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепи получают из антитела человека или получают из антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела, полученного от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы). Линкер состоит из 12-19 аминокислот. Его примеры включают (G₄S)₃ из 15 аминокислот (G.B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

Биспецифическое антитело (диантитело) означает антитело, способное специфически связываться с двумя различными эпитопами. ДНК, кодирующую биспецифическое антитело, можно получать, например, путем лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A, в указанном порядке, где ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи B, лигированы через ДНК, кодирующую линкер, как описано выше. В этом контексте, все из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи получают из антитела человека или получают из антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела, полученного от не являющегося человеком животного (например, мыши, крысы, кролика или курицы).

Полученные таким образом рекомбинантные ДНК можно встраивать в один или несколько подходящих векторов, которые затем вводят в клетки-хозяева (например, клетки млекопитающих, клетки дрожжей и клетки насекомых), и ДНК (ко)экспрессируются, продуцируя рекомбинантные антитела (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; и J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Примеры антитела по настоящему изобретению, полученного любым из способов, описанных выше, включают следующие антитела (a)-(g), полученные согласно примерам, описанным ниже:

(a) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:6, 7 и 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:10, 11 и 12 (например, антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:9 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:13);

(b) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:16, 17 и 18, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:20, 21 и 22 (например, антитело, сконструированное с использованием вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:19 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:23);

(c) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:6, 7 и 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:50, 51 и 52 (например, антитело, сконструированное с использованием вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:9 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:53);

(d) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:55, 56 и 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:59, 60 и 61 (например, антитело, сконструированное с использованием вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:58 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:62);

(e) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:55, 56 и 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:59, 64 и 61 (например, антитело, сконструированное с использованием вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:63 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:65);

(f) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:66, 67 и 68, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:70, 71 и 72 (например, антитело, сконструированное с использованием вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:69 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:73);

(g) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:74, 75 и 76, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:78 79 и 80 (например, антитело, сконструированное с использованием вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:77 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:81).

В этом контексте, аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO:6, 7 и 8, и SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи, полученной из антитела мыши. Аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO:10, 11 и 12, SEQ ID NO:20, 21 и 22, и SEQ ID NO:50, 51 и 52 соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи, полученной из антитела мыши. Аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO:55, 56 и 57, SEQ ID NO:66, 67 и 68, и SEQ ID NO:74, 75 и 76, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области тяжелой цепи, полученной из антитела курицы. Аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO:59, 60 и 61, SEQ ID NO:59, 64 и 61, SEQ ID NO:70, 71 и 72, и SEQ ID NO:78, 79 и 80, соответствуют CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, вариабельной области легкой цепи, полученной из антитела курицы.

Примеры гуманизированного антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела или биспецифического антитела по настоящему изобретению включают антитела, описанные ниже. Следующие антитела представляют собой иллюстративные варианты осуществления антитела (a), однако также могут существовать сходные варианты осуществления для других антител (b)-(g):

(i) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6, 7 и 8, и аминокислотные последовательности каркасных областей, полученных из антител человека, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, и аминокислотные последовательности каркасных областей, полученных из антител человека;

(ii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6, 7 и 8, и аминокислотные последовательности каркасных областей, полученных из антител человека, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, и аминокислотные последовательности каркасных областей, полученных из антител человека, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из антитела человека;

(iii) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из антитела человека, вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из антитела человека.

Последовательности константных и вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела человека доступны, например, от NCBI (USA; GenBank, UniGene и т.д.). Например, могут быть приведены следующие последовательности: последовательность с номером доступа J00228 для константной области тяжелой цепи IgG1 человека; последовательность с номером доступа J00230 для константной области тяжелой цепи IgG2 человека; последовательность с номером доступа X03604 для константной области тяжелой цепи IgG3 человека; последовательность с номером доступа K01316 для константной области тяжелой цепи IgG4 человека; последовательности с номерами доступа V00557, X64135 и X64133 для константной области легкой цепи κ человека; и последовательности с номерами доступа X64132 и X64134 для константной области легкой цепи λ человека.

Предпочтительно, эти антитела обладают цитотоксической активностью и, тем самым, могут проявлять противоопухолевый эффект.

Представленные выше конкретные последовательности вариабельных областей и CDR тяжелой и легкой цепи в приведенных выше антителах предоставлены только для иллюстративных целей, и очевидно, что антитело по настоящему изобретению не ограничивается конкретными последовательностями. Гибридомы, способные продуцировать антитела человека против CAPRIN-1 человека или антитела не являющегося человеком животного (например, антитела мыши), отличные от антител, конкретно описанных выше, получают, и моноклональные антитела, продуцированные гибридомами, выделяют и определяют, являются ли выделенные антитела представляющими интерес антителами, с использованием иммунологической активности связывания с CAPRIN-1 человека и цитотоксической активности в качестве показателей. Тем самым идентифицируют представляющие интерес гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело. Затем из гибридом получают ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепи в представляющих интерес антителах, и секвенируют, как описано выше. ДНК используют для получения различных антител.

Антитело, описанное выше, может представлять собой любое из антител (a)-(g) и т.д., имеющее замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот, в частности, в области, отличной от CDR, например, в последовательности каркасной области и/или последовательности константной области, при условии, что антитело обладает такой специфичностью, что оно может специфично распознавать CAPRIN-1. В настоящем описании термин "несколько" предпочтительно означает от 2 до 5, более предпочтительно 2 или 3.

Антитело по настоящему изобретению имеет константу аффинности Ka (k_on/k_off) в отношении белка CAPRIN-1 или его фрагмента предпочтительно по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M-1 или по меньшей мере 10¹³ M^-1.

Антитело по настоящему изобретению может быть конъюгировано с противоопухолевым средством. Конъюгацию антитела с противоопухолевым средством можно проводить через спейсер, имеющий группу (например, сукцинимидильную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксигруппу), взаимодействующую с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксигруппой, тиольной группой и т.п.

Примеры противоопухолевого средства включают следующие противоопухолевые средства, известные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилолмеламин, буллатацин, буллатицинон, каптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретамина оксид гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, триамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены (например калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон), аминоглютетимид, митотан, трилостан, фролиновую кислоту, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновую кислоту, енилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиум ацетат, эпотилон, этоглюцин, лентинан, лонидамин, маитансин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраерин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновую кислоту, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазониевую кислоту, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевую кислоту, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли или производные.

Альтернативно, антитело по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с противоопухолевым средством для достижения более высокого терапевтического эффекта. Этот подход является адаптируемым для пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей CAPRIN-1, либо до, либо после хирургической операции. Этот подход можно применять, в частности, после хирургической операции для экспрессирующей CAPRIN-1 злокачественной опухоли, которую традиционно лечат противоопухолевым средством отдельно, для обеспечения более высокой профилактики рецидива злокачественной опухоли и продления времени выживания.

Примеры противоопухолевых средств, используемых для комбинированного введения с антителом по настоящему изобретению, включают следующие противоопухолевые средства, известные из литературы, и т.д.: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкриастатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлолрнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднемустин, трофосфамид, урацил мустард, кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглутетимид, митотан, трилостан, фролиновую кислоту, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновую кислоту, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демекольцин, диазиквон, эльфорнитин, эллиптиния ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновую кислоту, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновую кислоту, триазиквон, роридин A, ангвидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибиторы топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевую кислоту, капецитабин и их фармацевтически приемлемые соли (известные в данной области) и производные (известные в данной области). Среди этих противоопухолевых средств особенно предпочтительно используют циклофосфамид, паклитаксел, доцетаксел или винорелбин.

Антитело по настоящему изобретению может быть связано с радиоактивным изотопом, известным из литературы и т.д., таким как ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu или ¹⁷⁶Lu. Предпочтительно, используют радиоактивный изотоп, эффективный для лечения или диагностики опухоли. Такой радиоактивный изотоп также включен в объем противоопухолевых средств согласно настоящему изобретению.

Идентификация эпитопа

Антитело по настоящему изобретению распознает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5, в качестве эпитопа, как показано ниже в разделе "Примеры". Один пример способа подтверждения эпитопа для антитела по настоящему изобретению включает иммобилизацию полипептида SEQ ID NO:5 (эпитоп) на планшет и оценку антитела на его реактивность в отношении этого эпитопа. В частности, полипептид SEQ ID NO:5 иммобилизуют на планшете реакцией с электрофильной функциональной группой, присоединенной через спейсер, например из олигоэтиленгликоля, к планшету, и затем взаимодействием с антителом по настоящему изобретению. Например, меченное HRP (пероксидаза хрена) вторичное антитело, способное связываться с антителом по настоящему изобретению, может быть подвергнуто взаимодействию с ним для оценки реактивности антитела (для подтверждения эпитопа для антитела по настоящему изобретению). Полипептид SEQ ID NO:5, подлежащий иммобилизации на планшете, можно использовать в форме, состоящей из последовательности SEQ ID NO:5, или частично модифицированной форме (например, модифицированной форме полипептида по N- или C-концевому остатку любыми несколькими аминокислотами или белком, таким как KLH, или модифицированной белком MAP форме полипептида), при условии, что антитело по настоящему изобретению связывается с этими полипептидными формами.

Некоторые антитела по настоящему изобретению могут не взаимодействовать с полипептидом SEQ ID NO:5 (т.е. эпитоп не подтверждается) в описанном выше способе. В таком случае, эпитоп для антитела по настоящему изобретению может быть подтвержден путем взаимодействия антитела с антигеном в условиях раствора, которые способствуют связыванию антиген-антитело, как описано в примере 2 получения образовавшегося комплекса антиген-антитело способом иммунопреципитации, и затем выделения полипептидной части, связанной с антителом, и определения ее аминокислотной последовательности. Антиген может представлять собой полипептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO:5, его частично модифицированной последовательности или белка CAPRIN-1, при условии, что то, что эпитоп является реактивным в отношении антитела по настоящему изобретению, может быть подтверждено для них приведенными выше способами.

Противоопухолевый эффект

Считается, что противоопухолевый эффект антитела против CAPRIN-1, подлежащего применению в настоящем изобретении, на экспрессирующих CAPRIN-1 злокачественных клетках, обуславливается следующим механизмом: антителозависимая опосредуемая эффекторными клетками цитотоксичность (ADCC) против клеток, экспрессирующих CAPRIN-1, и комплементзависимая цитотоксичность (CDC) против клеток, экспрессирующих CAPRIN-1. Однако объем настоящего изобретения не ограничивается этим механизмом.

Известно, что противоопухолевый эффект, основанный на этом механизме, коррелирует с количеством антигенсвязывающих молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток (Niwa R., Clinical Cancer Research (2005) Mar 15; 11 (6): 2327-2336). Количество молекул-мишеней, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток, можно исследовать с использованием существующего набора для анализа, способного измерять количество молекул на клеточной поверхности. В частности, количество связываемых антителом молекул-мишеней можно определять путем: взаимодействия злокачественных клеток, например, с антителами против молекул-мишеней в качестве первичных антител; взаимодействия с ними флуоресцентно меченых антител против первичных антител, вместе с гранулами для калибровочной кривой с предварительно известным количеством молекул; измерения средней интенсивности флуоресценции в образцах; и определения количества молекул-мишеней на основе полученной калибровочной кривой.

Таким образом, антитело против CAPRIN-1, предназначенное для применения в настоящем изобретении, можно анализировать в отношении его активности путем определения активности ADCC или активности CDC ex vivo против экспрессирующих CAPRIN-1 злокачественных клеток, или путем исследования количества молекул CAPRIN-1, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток, в случае использования антитела против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению в качестве первичного антитела, в частности, как показано ниже в примерах.

Антитело против CAPRIN-1, предназначенное для использования в настоящем изобретении, связывается с белками CAPRIN-1 на злокачественных клетках и проявляет противоопухолевый эффект через свою активность. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению считается пригодным для лечения или профилактики злокачественной опухоли. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело против CAPRIN-1 в качестве активного ингредиента. Антитело против CAPRIN-1, предназначенное для использования в целях введения в организм человека (антительная терапия), предпочтительно представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело для снижения иммуногенности.

Антитело против CAPRIN-1 с более высокой аффинностью связывания в отношении белка CAPRIN-1 на поверхности злокачественных клеток проявляет более высокую противоопухолевую активность. Таким образом, можно ожидать, что антитело согласно настоящему изобретению будет обладать более высоким противоопухолевым эффектом вследствие высокой аффинности связывания с белком CAPRIN-1, и, таким образом, его можно использовать в качестве фармацевтической композиции для применения в целях лечения и/или профилактики злокачественной опухоли. Предпочтительно, антитело согласно настоящему изобретению обладает высокой аффинностью связывания с константой ассоциации (константа аффинности) Ka (k_on/k_off) предпочтительно по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5×10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1 или по меньшей мере 10¹³ M^-1, как описано выше.

Большее количество молекул CAPRIN-1, которые могут связываться с антителами против CAPRIN-1 на поверхности злокачественных клеток, обеспечивает более высокую противоопухолевую активность. Желательно, для обеспечения ожидаемого противоопухолевого эффекта количество молекул CAPRIN-1, с которым связываются антитела, составляет 10⁴ или более, предпочтительно 10⁵ или более молекул CAPRIN-1 на злокачественную клетку при измерении с использованием антитела против CAPRIN-1 по настоящему изобретению. Опухоль (злокачественные клетки), имеющая большое количество молекул CAPRIN-1 на ее клеточной поверхности, является особенно предпочтительной в качестве злокачественной опухоли, предназначенной для введения антитела по настоящему изобретению.

Связывание с экспрессирующими антиген клетками

Способность антитела связываться с CAPRIN-1 может быть определена с использованием анализа связывания, например, ELISA, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции и проточной цитометрии, как описано в разделе "Примеры".

Иммуногистохимическое окрашивание

Антитело, которое распознает CAPRIN-1, можно исследовать на его реактивность в отношении CAPRIN-1 иммуногистохимическим способом, хорошо известным специалистам в данной области, с использованием замороженного среза ткани, фиксированного параформальдегидом или ацетоном, или заключенного в парафин среза ткани, фиксированного параформальдегидом, полученного от пациента во время хирургической операции или от животного с ксенотрансплантированной тканью, которому была инокулирована клеточная линия, экспрессирующая CAPRIN-1 либо самопроизвольно, либо после трансфекции.

Для иммуногистохимического окрашивания, антитело, реактивное в отношении CAPRIN-1, можно окрашивать различными способами. Например, антитело можно визуализировать путем взаимодействия с конъюгированным с пероксидазой хрена антителом козы против антител мыши, антителом козы против антител кролика или антителом козы против антител курицы.

Фармацевтическая композиция и способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли

Мишень для фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли по настоящему изобретению конкретно не ограничена, при условии, что этой мишенью является злокачественная опухоль (клетка), экспрессирующая ген CAPRIN-1.

Термины "опухоль" и "злокачественная опухоль", используемые в контексте настоящего изобретения, относятся к злокачественному новообразованию и их используют взаимозаменяемо.

Нацеленной злокачественной опухолью в настоящем изобретении является злокачественная опухоль, экспрессирующая ген, кодирующий белок CAPRIN-1, и предпочтительно представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

Конкретные примеры этих злокачественных опухолей включают, но не ограничиваются ими, аденокарциному молочной железы, аденокарциному молочной железы комплексного типа, злокачественную смешанную опухоль молочной железы, внутрипротоковую папиллярную аденокарциному, аденокарциному легких, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак, крупноклеточный рак, глиому, которой является опухоль нейроэпителиальной ткани, вентрикулярную эпендимому, нейрональную опухоль, эмбриональную нейроэктодермальную опухоль, неврилеммому, нейрофиброму, менингиому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому, желудочно-кишечную лимфому, алиментарную лимфому, лимфому от мелкоклеточного до среднеклеточного типа, рак слепой кишки, рак восходящей толстой кишки, рак нисходящей толстой кишки, рак поперечноободочной толстой кишки, рак сигмовидной толстой кишки, рак прямой кишки, эпителиальный рак яичников, герминогенную опухоль, опухоль стромальных клеток, карциному протоков поджелудочной железы, инвазивную карциному протоков поджелудочной железы, аденокарциному поджелудочной железы, карциному ацинарных клеток, железисто-плоскоклеточную карциному, гигантоклеточную опухоль, внутрипотоковое папиллярно-слизистое новообразование, слизистое кистозное новообразование, панкреатобластому, серозную цистаденокарциному, солидную папиллярную опухоль, гастриному, глюкагоному, инсулиному, множественное эндокринное новообразование типа 1 (синдром Вермера), опухоль нефункциональных островковых клеток, соматостатиному и ВИПому.

Субъектом (пациентом) в качестве реципиента предпочтительно являются млекопитающие, например млекопитающие, включая приматов, домашних животных, скот и спортивных животных, и особенно предпочтительно люди, собаки и кошки.

При использовании антитела по настоящему изобретению в фармацевтической композиции, фармацевтическая композиция может быть составлена способом, известным специалистам в данной области. Например, фармацевтическую композицию можно использовать в форме парентеральной инъекции асептического раствора или суспензии с водой или любой другой фармацевтически приемлемой жидкостью. Например, фармацевтическую композицию можно составлять с антителом, которое смешивают в единичную дозированную форму, требуемую для общепринятой фармацевтической практики, в комбинации с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, стерилизованной водой, физиологическим солевым раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим веществом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, вкусовой добавкой, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и т.д., соответствующим образом. Количество активного ингредиента в таком препарате определяют так, чтобы можно было достигнуть соответствующей дозы в заданном диапазоне.

Асептическую композицию для инъекции можно составлять в соответствии с общей фармацевтической практикой с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекций.

Примеры водных растворов для инъекции включают физиологический раствор, изотоничные растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннитол и хлорид натрия. Эти растворы можно использовать в комбинации с соответствующим солюбилизатором, например, спиртом (в частности этанолом) или полиспиртом (например, пропиленгликолем и полиэтиленгликолем), или неионным поверхностно-активным веществом, например, полисорбатом 80 (TM) или HCO-60.

Примеры масляных растворов включают растворы, в которых используется кунжутное масло или соевое масло. Растворы можно использовать в комбинации с солюбилизатором, таким как бензилбензоат или бензиловый спирт. Кроме того, в растворы можно добавлять буфер (например, забуференный фосфатом солевой раствор или натрий-ацетатный буферный раствор), смягчающее средство (например, гидрохлорид прокаина), стабилизатор (например, бензиловый спирт или фенол) и антиоксидант. Инъецируемыми растворами, полученными таким образом, обычно заполняют подходящие ампулы.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят перорально или парентерально, предпочтительно парентерально. Конкретные примеры ее дозированных форм включают инъекции, средства для интраназального введения, средства для транспульмонального введения и средства для чрескожного введения. Примеры инъекций включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию и подкожную инъекцию, посредством которых фармацевтическую композицию можно вводить системно или локально.

Также способ введения может быть соответствующим образом выбран, в зависимости от возраста, массы тела, пола, симптомов и т.д. пациента. Дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть выбрана из диапазона, например, от 0,0001 до 1000 мг/кг массы тела на дозу. Альтернативно, дозу может быть выбрана из диапазона, например, от 0,001 до 100000 мг/организм пациента, хотя доза необязательно ограничивается этими числами. Хотя доза и способ введения варьируют в зависимости от массы тела, возраста, пола, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбрать дозу и способ.

Фармацевтическую композицию, содержащую антитело по настоящему изобретению или его фрагменты, можно вводить исследуемому субъекту для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, предпочтительно рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака ободочной и прямой кишки, рака легких, опухоли головного мозга, рака желудка, рака шейки матки, рака яичников, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкоза, лимфомы, фибросаркомы, мастоцитомы или меланомы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающему введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению в комбинации с противоопухолевым средством, как проиллюстрировано выше, или фармацевтической композиции, содержащей противоопухолевое средство, субъекту. Антитело по настоящему изобретению или его фрагмент можно вводить субъекту одновременно с противоопухолевым средством или отдельно от него. В случае введения этих фармацевтических композиций по отдельности, любое из них можно вводить первым или последующим. Интервалы между их введением, дозы, пути введения и количество доз могут быть соответствующим образом выбраны специалистом. Другие фармацевтические дозированные формы, подлежащих одновременному введению, также включают, например, фармацевтические композиции, которые составлены путем смешения антитела по настоящему изобретению или его фрагмента или противоопухолевого средства в фармацевтически приемлемом носителе (или среде). Представленное выше описание о композиции, составлении, путях введения, дозах, злокачественной опухоли и т.д. в отношении фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих антитело по настоящему изобретению, также применимы к любой из приведенных выше фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих противоопухолевое средство.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической комбинации для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающей фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство, как проиллюстрировано выше, и к способу лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающему ее введение. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем.

Полипептид и ДНК

Кроме того, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, или ее фрагменту (связывающий фрагмент антитела). ДНК может представлять собой ДНК, кодирующую тяжелую и/или легкую цепи антитела или может представлять собой ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи антитела. ДНК также может представлять собой ДНК, кодирующую каждую из определяющих комплементарность областей антитела или их комбинацию. Такая ДНК включает, например, ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6, 7 и 8, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, содержащую нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, в случае указанного выше антитела (a).

Определяющие комплементарность области (CDR), кодируемые ДНК, имеющей эти последовательности, служат в качестве областей, которые определяют специфичность антитела. Последовательности, кодирующие другие области (т.е. константные области и каркасные области) антитела, таким образом, могут представлять собой последовательности, полученные из других антител. В этом контексте, "другие антитела" также включают антитела, полученные из не являющихся человеком организмов, но предпочтительно представляют собой антитела, полученные от человека, с точки зрения снижения неблагоприятных явлений. В частности, в ДНК по настоящему изобретению, области, кодирующие каждую каркасную область и каждую константную область в тяжелой и легкой цепях предпочтительно содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности, полученные из антител человека.

Следующие примеры ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, включают ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, в случае указанного выше антитела (a). В этом контексте, примером нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:14. Примером нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, является нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:15. Когда такая ДНК содержит области, кодирующие константные области тяжелой и легкой цепей, каждая из областей предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующую аминокислотную последовательность, полученную из антитела человека (аминокислотная последовательность каждой константной области тяжелой и легкой цепей).

Эти ДНК антител можно получать, например, способами, описанными выше, или следующим способом. Сначала получают тотальные РНК из гибридом, продуцирующих антитело по настоящему изобретению, с использованием коммерчески доступного набора для экстракции РНК, и из них синтезируют кДНК с использованием обратной транскриптазы и случайных праймеров, и т.п. Затем кДНК, кодирующие антитела, амплифицируют способом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров для консервативных последовательностей вариабельных областей в генах тяжелой или легкой цепей известных антител мыши. Последовательности, кодирующие константные области, можно получать путем амплификации способом ПЦР известных последовательностей. Нуклеотидная последовательность ДНК может быть встроена, например, в плазмиду или фаг для секвенирования, и определена в соответствии с общепринятым способом.

Кроме того, настоящее изобретение относится к следующим полипептидам и ДНК, имеющим отношение к указанным выше антителам (a)-(g):

(i) полипептиду, содержащему любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:9, 19, 58, 63, 69 и 77, и ДНК, кодирующей этот полипептид (например, ДНК, содержащей любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:14 и 24);

(ii) полипептиду, содержащему любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:13, 23, 53, 62, 65, 73 и 81, и ДНК, кодирующей этот полипептид (например, ДНК, содержащей любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:15, 25 и 54);

(iii) полипептидам CDR тяжелой цепи, выбранным из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:6, 7 и 8, SEQ ID NO:16, 17 и 18, SEQ ID NO:55, 56 и 57, SEQ ID NO:66, 67 и 68, и SEQ ID NO:74, 75 и 76, и ДНК, кодирующей эти полипептиды; и

(iv) полипептидам CDR легкой цепи, выбранным из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:10, 11 и 12, SEQ ID NO:20, 21 и 22, SEQ ID NO:50, 51 и 52, SEQ ID NO:59, 60 и 61, SEQ ID NO:59, 64 и 61, SEQ ID NO:70, 71 и 72, и SEQ ID NO:78, 79 и 80, и ДНК, кодирующей эти полипептиды.

Эти полипептиды и ДНК могут быть получены с использованием способов генной инженерии, как описано выше.

Сущность настоящего изобретения

Аспекты настоящего изобретения, описанные выше, обобщенно представлены ниже.

(1) Антитело или его фрагмент, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью.

(2) Антитело или его фрагмент согласно (1), где антитело или его фрагмент обладает цитотоксической активностью в отношении злокачественной клетки, экспрессирущей белок CAPRIN-1.

(3) Антитело или его фрагмент согласно (1) или (2), где антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

(4) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(3), где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

(5) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(4), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:6, 7 и 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:10, 11 и 12, и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(6) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(4), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:16, 17 и 18, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:20, 21 и 22, и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(7) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(4), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:6, 7 и 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:50, 51 и 52, и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(8) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(4), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:55, 56 и 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:59, 60 и 61, и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(9) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(4), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:55, 56 и 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:59, 64 и 61, и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(10) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(4), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:66, 67 и 68, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:70, 71 и 72, и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(11) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(4), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:74, 75 и 76, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность области SEQ ID NO:78, 79 и 80, и обладают иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(12) Антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(11), где антитело или его фрагмент конъюгированы с противоопухолевым средством.

(13) Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащая антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(12) в качестве активного ингредиента.

(14) Фармацевтическая композиция согласно (13), где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

(15) Фармацевтическая комбинация для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающая фармацевтическую композицию согласно (13) или (14) и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

(16) ДНК, кодирующая антитело или его фрагмент согласно любому из (1)-(11).

(17) Способ лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, включающий введение антитела или его фрагмента согласно любому из (1)-(12), фармацевтической композиции согласно (13) или (14), или фармацевтической комбинации согласно (15) субъекту.

Примеры

Далее настоящее изобретение описано конкретно с помощью примеров. Однако предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими конкретными примерами.

Пример 1: Анализ экспрессии CAPRIN-1 в каждой ткани

Экспрессию гена CAPRIN-1 в нормальных тканях собаки и человека и различных клеточных линиях исследовали с помощью ОТ-ПЦР согласно примеру 1(4) WO2010/016526. В результате, наблюдали высокую экспрессию в семенниках среди здоровых тканей собаки, и в то же время экспрессию наблюдали в тканях рака молочной железы и аденокарциномы собаки. Кроме того, в результате исследования экспрессии в тканях человека, экспрессию наблюдали только в яичке среди нормальных тканей, как и для гена CAPRIN-1 собаки. Напротив, экспрессия была выявлена во многих типах злокачественных клеточных линий, включая 8 клеточных линий рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1) и 4 клеточных линии рака поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPc-3), среди злокачественных клеток. Эти результаты продемонстрировали, что экспрессия CAPRIN-1 не встречается в нормальных тканях, отличных от семенника, в то время как CAPRIN-1 экспрессируется в клеточных линиях рака молочной железы и клеточных линиях рака поджелудочной железы.

Пример 2: Получение моноклонального антитела мыши против CAPRIN-1

(1) Получение моноклонального антитела мыши против CAPRIN-1

100 мкг белка CAPRIN-1 человека (имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2), полученного по примеру 3 WO2010/016526, смешивали с равным количеством адъюванта MPL+TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Полученную смесь использовали в качестве антигенного раствора для мышей. Антигенный раствор вводили внутрибрюшинно каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель (получены от Japan SLC Inc.). Затем проводили 7 введений раз в 1 неделю для завершения иммунизации. Через трое суток после последней иммунизации селезенку каждой мыши извлекали и растирали между двумя стерильными предметными стеклами. Процессы промывания PBS(-) (изготовленный Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и центрифугирования при 1500 об./мин. в течение 10 минут для удаления супернатанта повторяли три раза с получением клеток селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы мыши SP2/0 (приобретены от ATCC) в соотношении 10:1. Раствор PEG, полученный смешением 200 мкл среды RPMI1640, содержавшей 10% FBS, которую нагревали до 37°C с 800 мкл PEG1500 (изготовленный Boehringer Ingelheim GmbH), добавляли к клеточной смеси и затем оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта путем центрифугирования при 1700 об./мин. в течение 5 минут, клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI1640, содержащей 15% FBS, дополненной 2% эквивалентом раствора HAT (Gibco) (селективная среда HAT). Полученную суспензию высевали в пятнадцать 96-луночных планшетов (Nunc) в количестве 100 мкл/лунка. Клетки селезенки и клетки миеломы подвергали слиянию путем культивирования в течение 7 суток при 37°C, 5% CO₂, с получением гибридом.

Полученные гибридомы подвергали скринингу на аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1, в качестве индикатора. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученного по примеру 3 WO2010/016526, добавляли в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем к нему добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) (изготовленный Sigma-Aldrich Corp.) в количестве 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке удаляли, и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем к нему добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной как описано выше, в количестве 100 мкл/лунка, и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (изготовленные Invitrogen Corp.), разведенные в 5000 раз PBS, в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лукну промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (изготовленный Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития окраски реакцию останавливали добавлением 1н. серной кислоты в количестве 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было выбрано несколько гибридом, продуцирующих антитела, обладающих высоким поглощением.

Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет в количестве 0,5 клеток/лунка и культивировали в планшете. Через одну неделю наблюдали гибридомы, образующие единичные колонии в лунках. Клетки в этих лунках далее культивировали, и клонированные гибридомы подвергали скринингу на аффинность связывания антител, продуцируемых гибридомами, в отношении белка CAPRIN-1, в качестве индикатора. 1 мкг/мл раствора белка CAPRIN-1, полученных по примеру 3 WO2010/016526, добавляли в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли 0,5% раствор BSA в количестве 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку промывали три раза 400 мкл PBS-T. Затем добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (изготовленные Invitrogen Corp.), разведенные в 5000 раз PBS, в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (изготовленный Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 15-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 1н. серной кислоты в количестве 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате было получено 88 линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, реактивные в отношении белков CAPRIN-1.

Далее полученные моноклональные антитела подвергали скринингу в отношении антител, реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10⁶ клеток клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 100 мкл культурального супернатанта гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG мыши (изготовленные Invitrogen Corp.), разведенные в 500 раз с помощью PBS, содержащего 0,1% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, такую же операцию, как описано выше, проводили с использованием сыворотки каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель, которой не проводили введение, разведенной в 500 раз средой для культивирования гибридом, вместо антител, для получения контроля. В результате было отобрано одно моноклональное антитело (#1), обладающее более высокой интенсивностью флуоресценции, чем у контроля, т.е. реактивное в отношении поверхности клеток рака молочной железы.

(2) Идентификация эпитопа CAPRIN-1, распознаваемого моноклональным антителом #1 против CAPRIN-1

Реактивное в отношении поверхности злокачественных клеток моноклональное антитело #1 против CAPRIN-1, полученное согласно разделу (1), использовали для идентификации области эпитопа CAPRIN-1, распознаваемое им. 100 мкг рекомбинантного белка CAPRIN-1 растворяли в буфере для растворения, не содержащим ингибиторов белков, и подвергали взаимодействию с моноклональным антителом мыши #1. К раствору добавляли гидролизующий фермент трипсин или химотрипсин для проведения реакции расщепления при подходящей температуре. После реакции, к реакционной смеси добавляли носитель на основе белка белок G с Sepharose, подвергали взаимодействию и осаждали центрифугированием. После удаления супернатанта носитель промывали буфером для растворения и PBS и растворяли в 0,1% муравьиной кислоте, и супернатант выделяли. Выделенный образец супернатанта наносили на колонку с обращенной фазой (HLB Extraction Cartridge (Oasis)) для удаления антитела и получения раствора образца. Полученный образец подвергали жидкостной хроматографии с обращенной фазой (Chromatography Nanosystem (KYA Tech Corp.)) для выделения раствора, содержащего только пептиды, который затем помещали в тандемный масс-спектрометр квадрупольный-TOF масс-спектрометр (Waters-MicroMass) для анализа МС/МС для выявления пептидов, содержащихся в образце. В результате был идентифицирован полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, распознаваемой моноклональным антителом #1 против CAPRIN-1.

(3) Получение моноклональных антител мыши #2 и #3

Аналогичным путем, как описано в разделе (1), слитый белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, идентифицированный в разделе (2) и белок-носитель KLH (гемоцианин лимфы улитки) смешивали в качестве иммуногена с равным количеством адъюванта TiterMax Gold^(R) (CytRx Corp.), и полученную смесь подкожно вводили в дозе 20 мкг/инъекция каждой мыши с интервалами 7 суток. После введения всего четырех инъекций получали клетки селезенки мыши через 3 суток после последней иммунизации и подвергали их слиянию с клетками миеломы мыши аналогично тому, как описано в разделе (1), с получением гибридом. Затем антитела подвергали скринингу на реактивность антител, содержащихся в культуральных супернатантах полученных гибридом, в отношении раствора 1 мкг/мл белка CAPRIN-1, полученного по 3 WO2010/016526, или слитого белка (используемого в качестве иммуногена) из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 и белка-носителя KLH, в качестве индикатора. Каждый из раствора 1 мкг/мл белка CAPRIN-1, полученного по примеру 3 WO2010/016526, и слитого белка (30 мкг/мл) из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 и белка-носителя KLH добавляли в количестве 100 мкл/лунка в 96-луночные планшеты и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли раствор Blockace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) в количестве 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 часов. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (изготовленные Invitrogen Corp.), разведенные в 5000 раз PBS, в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (изготовленный Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 5-30 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета, реакцию завершали добавлением 1н. серной кислоты в количестве 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате отбирали гибридомы, продуцирующие антитела, обладающие высоким поглощением.

Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет в количестве 0,3 клеток/лунка и культивировали в планшете. Через одну неделю наблюдали гибридомы, образующие единичные колонии. Клетки в этих лунках далее культивировали, и клонированные гибридомы подвергали скринингу аналогично тому, как описано выше, в отношении аффинности связывания антител, продуцируемых гибридомами, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5 в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, в качестве индикатора, с получением гибридом, продуцирующих антитела против аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5.

Моноклональные антитела, продуцируемые полученными гибридомами, подвергали скринингу на антитела, реактивные в отношении поверхности клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 10⁶ клеток клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 100 мкл культурального супернатанта гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG мыши (изготовленные Invitrogen Corp.), разведенные в 500 раз PBS, содержащим 0,1% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны такие же операции, как описано выше, проводили для получения образца с использованием сыворотки каждой мыши Balb/c в возрасте 6 недель, не подвергавшейся введению, разведенной в 500 раз средой для культивирования гибридомы, или для получения образца отрицательного контроля путем взаимодействия только с вторичными антителами, вместо антител. В результате было получено 2 моноклональных антитела (#2 и #3), обладающих более высокой интенсивностью флуоресценции, чем отрицательный контроль, т.е. реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы.

Полученные моноклональные антитела мыши #2 и #3 исследовали в отношении их специфической реакции с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5 в качестве частичной последовательности CAPRIN-1, используемой в качестве иммуногена. Раствор 30 мкг/мл каждого из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, приготовленный с 0,1М водным раствором карбоната натрия, и частичной последовательности CAPRIN-1, не содержащей аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, добавляли в 96-луночный планшет Immobilizer Amino для ELISA (Nunc) в количестве 100 мкг/мл и подвергали взаимодействию в течение одного целого дня и ночи при 4°C для связывания пептидов с лунками. В лунки с присоединенным пептидом добавляли 0,1M водный раствор карбоната натрия, содержащий 10 мМ этаноламин, и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор в каждой лунке удаляли, и затем каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли раствор Blockace в количестве 400 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке извлекали и каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли культуральный супернатант, содержащий моноклональное антитело мыши #2 в количестве 50 мкл/лунка и подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем каждую лунку промывали PBS-T, и добавляли меченные HRP антитела против IgG мыши (H+L) (изготовленные Invitrogen), разведенные в 5000 раз раствором Blockace, в количестве 50 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку тщательно промывали PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата TMB (изготовленный Thermo Fisher Scientific Inc.) в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 5-30 минут для обеспечения цветной реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 1н. серной кислоты в количестве 100 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 450 нм и 595 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате моноклональные антитела мыши #2 и #3 не реагировали с частичной последовательностью CAPRIN-1, не содержащей аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, но специфически реагировали только с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5. Эти результаты продемонстрировали, что полипептид SEQ ID NO:5 содержит область эпитопа для антител #2 и #3 против CAPRIN-1.

Пример 3

Получение моноклонального антитела курицы против CAPRIN-1

Моноклональные антитела курицы получали с использованием в качестве иммуногена слитого белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, идентифицированной согласно примеру 2(2) с белком-носителем KLH (гемоцианин лимфы улитки). 300 мкг иммуногена смешивали с равным количеством полного адъюванта Фрейнда. Полученную смесь использовали в качестве раствора антигена для кур. Раствор антигена внутрибрюшинно вводили каждой из кур в возрасте 7 недель. Затем проводили 7 введений каждые 4 недели для завершения иммунизации. Через четверо суток после последней иммунизации селезенку каждой курицы извлекали и растирали между двумя стерилизованными предметными стеклами. Промывание PBS(-) (изготовленный Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) и центрифугирование при 1500 об./мин. в течение 10 минут для удаления супернатанта повторяли три раза для получения клеток селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками миеломы курицы с дефектом легкой цепи, полученными от кур путем трансформации с использованием вируса ретикулоэндотелиоза птиц, в соотношении 5:1. К клеточной смеси добавляли раствор PEG, полученный путем смешения 200 мкл среды IMDM, содержавшей 10% FBS, который нагревали до 37°C, с 800 мкл PEG1500 (изготовленный Boehringer Ingelheim GmbH), и затем его оставляли стоять в течение 5 минут для слияния клеток. После удаления супернатанта центрифугированием при 1700 об./мин. в течение 5 минут клетки суспендировали в 300 мл среды IMDM, содержавшей 10% FBS, дополненную 2% эквивалентом раствора HAT (Gibco) (селективная среда HAT). Полученную суспензию высевали в тридцать 96-луночных планшетов (Nunc) в количестве 100 мкл/лунка. Клетки селезенки и клетки миеломы курицы подвергали слиянию путем культивирования в течение 7 суток при 37°C, 5% CO₂, с получением гибридом. Затем антитела подвергали скринингу на реактивность антитела, содержащегося в культуральных супернатантах полученных гибридом, в отношении раствора CAPRIN-1, полученного, как описано в примере 3 WO2010/016526, или слитого белка (используемого в качестве иммуногена) из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 и белка-носителя BSA, в качестве индикатора. В частности каждый из раствора 1 мкг/мл белка CAPRIN-1, полученного по примеру 3 WO2010/016526, и слитого белка (1 мкг/мл) из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 и белка-носителя KLH добавляли в количестве 50 мкл/лунка в 96-луночные планшеты и оставляли стоять при 4°C в течение 18 часов. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли раствор Blockace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) в количестве 300 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор в каждой лунке удаляли и каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли культуральный супернатант каждой гибридомы, полученной, как описано выше, в количестве 50 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали PBS-T. Затем добавляли меченные HRP антитела против IgY курицы (изготовленные KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.), разведенные в 1000 раз PBS, в количестве 100 мкл/лунка и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали три раза PBS-T. Затем добавляли раствор субстрата OPD в количестве 50 мкл/лунка и оставляли стоять в течение 5-15 минут для обеспечения цветовой реакции. После развития цвета реакцию завершали добавлением 2н. серной кислоты в количестве 50 мкл/лунка. Поглощение измеряли при 490 нм и 630 нм с использованием абсорбционного спектрометра. В результате отобрали несколько гибридом, продуцирующих антитела, обладающие высоким поглощением.

Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет в количестве 0,5 клеток/лунка и культивировали в планшете. Через одну неделю наблюдали гибридомы, образующие единичные колонии в лунках. Клетки в этих лунках дополнительно культивировали, и клонированные гибридомы подвергали скринингу в отношении аффинности связывания антител, продуцируемых гибридомами, с белком CAPRIN-1 или реактивности антител против слитого белка (используемого в качестве иммуногена) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5 с белком-носителем BSA, в качестве индикатора, с получением моноклональных антител курицы.

Далее полученные моноклональные антитела подвергали скринингу в отношении антител, реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. В частности, 2×10⁵ клеток клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231V центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Добавляли 50 мкл культурального супернатанта каждой гибридомы, полученной, как описано выше, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченные FITC антитела козы против IgG курицы (H+L) (изготовленные SouthernBiotech), разведенные в 100 раз PBS, содержащем 0,5% FBS, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны такие же операции, как описано выше, проводили с использованием среды для культивирования гибридомы для получения образца отрицательного контроля. В результате было получено 4 моноклональных антитела курицы (моноклональные антитела курицы #1, #2, #3 и #4), обладающих более высокой интенсивностью флуоресценции, чем контроль, т.е. реактивных в отношении поверхности клеток рака молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1. Эти антитела могут связываться с CAPRIN-1, экспрессируемым на поверхности клеток рака молочной железы.

Пример 4. Характеризация выбранного моноклонального антитела

(1) Характеризация моноклонального антитела мыши

Фрагменты амплификации генов, кодирующих вариабельные области моноклональных антител мыши, полученных в примере 2, получали в соответствии со способом, описанным в примере 5 WO2010/016526, и анализировали в отношении их последовательностей генов и аминокислотных последовательностей, кодируемых ими. Полученная последовательность гена, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи полученного от мыши моноклонального антитела #1 представлена в SEQ ID NO:24, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:19; и последовательность гена, кодирующая ее вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO:25, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:23. Полученная последовательность гена, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи полученного от мыши моноклонального антитела #2, представлена в SEQ ID NO:14, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:9; и последовательность гена, кодирующая его вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO:15, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:13. Полученная последовательность гена, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи полученного от мыши моноклонального антитела #3, представлена в SEQ ID NO:14, и аминокислотная последовательность представлена SEQ ID NO:9; и последовательность гена, кодирующая его вариабельную область легкой цепи, представлена в SEQ ID NO:54, и аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:53.

Иными словами, было обнаружено, что моноклональное антитело мыши #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:19 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:23, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:20, 21 и 22, соответственно. Было обнаружено, что моноклональное антитело мыши #2 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:9, и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:13, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:6, 7 и 8, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно. Было обнаружено, что моноклональное антитело мыши #3 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:9 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:53, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:6, 7 и 8, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:50, 51 и 52, соответственно.

(2) Характеризация моноклонального антитела курицы

Фрагменты амплификации генов, кодирующих вариабельные области моноклональных антител курицы (моноклональные антитела курицы #1, #2, #3 и #4), полученных в примере 3, получали в соответствии со способом, описанным в примере 4 WO2011/096519, и анализировали в отношении их последовательностей генов и аминокислотных последовательностей, кодируемых ими. Полученная аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела мыши #1 представлена в SEQ ID NO:58, и аминокислотная последовательность его вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:62. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела курицы #2 представлена в SEQ ID NO:63, и аминокислотная последовательность его вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO:65. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела курицы #3 представлена в SEQ ID NO:69, и аминокислотная последовательность его вариабельной области легкой цепи представлена SEQ ID NO:73. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела курицы #4 представлена в SEQ ID NO:77, и аминокислотная последовательность его вариабельной области легкой цепи представлена SEQ ID NO:81.

Иными словами, было обнаружено, что моноклональное антитело курицы #1 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:58 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:62, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:55, 56, и 57, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:59, 60 и 61, соответственно. Было обнаружено, что моноклональное антитело курицы #2 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:63 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:65, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:55, 56 и 57, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:59, 64 и 61, соответственно. Было обнаружено, что моноклональное антитело курицы #3 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:69 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:73, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:66, 67 и 68, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:70, 71 и 72, соответственно. Было обнаружено, что моноклональное антитело курицы #4 содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:77 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:81, где вариабельная область тяжелой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:74, 75 и 76, соответственно, и вариабельная область легкой цепи имела CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:78, 79 и 80, соответственно.

Пример 5. Получение поликлонального антитела против частичного полипептида CAPRIN-1, присутствующего на поверхности злокачественных клеток

Для получения поликлональных антител против частичных полипептидов CAPRIN-1, присутствующих на клеточной поверхности, синтезировали полипептид (происходящий из CAPRIN-1 пептид, представленный в SEQ ID NO:5), содержащий области эпитопа для моноклональных антител против CAPRIN-1 #1, #2 и #3, полипептид, имеющий область из аминокислотных остатков 50-98 в аминокислотной последовательности CAPRIN-1 человека SEQ ID NO:2, и полипептид, имеющий область из аминокислотных остатков 233-305 SEQ ID NO:2. 1 мг каждого из этих пептидов смешивали в качестве антигена с равным объемом раствора неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Полученную смесь подкожно вводили кролику четыре раза каждые две недели. Затем проводили взятие его крови для получения антисыворотки, содержащей поликлональное антитело против каждого антигена. Далее антисыворотку очищали с использованием носителя в виде белка G (изготовленный GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.), с последующей заменой на PBS, с получением поликлональных антител против частичных полипептидов CAPRIN-1, присутствующих на поверхности злокачественных клеток. Кроме того, получали сыворотку кролика, которому не вводили антиген, путем очистки с использованием носителя в виде белка G аналогично тому, как описано выше, и использовали в качестве контрольного антитела.

Пример 6. Анализ экспрессии белка CAPRIN-1 на злокачественных клетках

Далее, 8 клеточных линий рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), для которых выявлено, что они обладают высоким уровнем экспрессии гена CAPRIN-1, исследовали в отношении их экспрессии белка CAPRIN-1 на их клеточной поверхности. 5×10⁵ клеток каждой из клеточных линий рака молочной железы человека, для которых ранее было выявлено, что они обладают экспрессией гена, центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. После добавления 2 мкг (5 мкл) поликлональных антител против полученных из CAPRIN-1 пептидов, полученных, как описано выше в примере 5, клетки далее смешивали с 95 мкл PBS, содержащего 0,1% эмбриональную телячью сыворотку, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS, полученный раствор смешивали с 2 мкл меченных Alexa 488 антител козы против IgG кролика (изготовленных Invitrogen Corp.) и 98 мкл PBS, содержащего 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (FBS), и оставляли стоять в течение 30 часов на льду. После промывания PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). С другой стороны, такие же операции, как описано выше, проводили с использованием контрольных антител, полученных, как описано выше в примере 5, вместо поликлональных антител против полученных из CAPRIN-1 пептидов, для получения контроля. В результате все из злокачественных клеток, обработанных антителами против CAPRIN-1, проявляли интенсивность флуоресценции, по меньшей мере на 35% превышающую интенсивность флуоресценции контроля. Это продемонстрировало, что белок CAPRIN-1 экспрессируется на поверхности клеточной мембраны злокачественных клеточных линий человека. Степень усиления интенсивности флуоресценции выражали как степень усиления средней интенсивности флуоресценции (величина MFI) в соответствующих клеточных линиях, которую вычисляли по следующей формуле.

Степень повышения интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%)=((MFI клеток, прореагировавших с антителами против CAPRIN-1)-(контрольная MFI))/(контрольная MFI)×100.

Также интенсивность флуоресценции измеряли для 3 клеточных линий рака почки (Caki-1, Caki-2 и A498), клеточной линии рака мочевого пузыря (T24), клеточной линии рака яичников (SKOV3), клеточной линии рака легких (QG56), клеточной линии рака предстательной железы (PC3), клеточной линии рака шейки матки (HeLa), клеточной лини фибросаркомы (HT1080), 2 клеточных линий опухоли головного мозга (T98G и U87MG), клеточной линии рака желудка (MNK28), клеточной линии рака ободочной и прямой кишки (Lovo) и клеточных линий рака поджелудочной железы (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 и BxPC-3) с использованием такого же подхода, как указано выше. В результате все злокачественные клетки имели интенсивность флуоресценции, по меньшей мере на 35% более высокую, чем контроль.

Как и в случае результатов, полученных выше, экспрессию CAPRIN-1 также подтверждали с использованием моноклонального антитела против CAPRIN-1 (моноклональное антитело мыши #1), имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:19 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:23, моноклонального антитела против CAPRIN-1 (моноклональное антитело мыши #2), имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:9 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:13, и моноклонального антитела против CAPRIN-1 (моноклональное антитело мыши #3), имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:9 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:53, которые были получены в примере 2, и моноклонального антитела курицы #1 против CAPRIN-1, имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:58 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:62, моноклонального антитела курицы #2 против CAPRIN-1, имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:63 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:65, моноклонального антитела курицы #3 против CAPRIN-1, имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:69 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:73, и моноклонального антитела курицы #4 против CAPRIN-1, имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:77 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:81 (моноклональные антитела курицы #1-#4), которые были получены в примере 3.

Пример 7. Иммуногистохимическое окрашивание

(1) Экспрессия CAPRIN-1 в нормальных тканях мыши и собаки

Мышь (Balb/c, самка) и собаку (бигль, самка) обескровливали под анестезией простым эфиром и под анестезией смесью кетамин/изофлуран и проводили лапаротомию. Затем каждый орган (желудок, печень, глазное яблоко, тимус, мышцу, костный мозг, матку, тонкий кишечник, пищевод, сердце, почку, слюнную железу, толстый кишечник, молочную железу, головной мозг, легкое, кожу, надпочечник, яичник, поджелудочную железу, селезенку и мочевой пузырь) переносили на 10-см чашку, содержавшую PBS. Каждый орган рассекали в PBS и фиксировали при перфузии в течение ночи в 0,1М забуференном фосфатом солевом растворе (pH 7,4), содержавшем 4% параформальдегид (PFA). Перфузат удаляли и тканевую поверхность каждого органа промывали PBS. Каждую ткань помещали в раствор PBS, содержавший 10% сахарозу, в 50 мл центрифужной пробирке, и встряхивали при 4°C в течение 2 часов с использованием ротора. Раствор заменяли раствором PBS, содержавшим 20% сахарозу, и полученный раствор оставляли стоять при 4°C до тех пор, пока ткань не оседала. Затем раствор заменяли раствором PBS, содержавшим 30% сахарозу, и полученный раствор оставляли стоять при 4°C до тех пор, пока ткань не оседала. Ткань извлекали, и необходимые фрагменты отрезали хирургическим ножом. Далее соединение OCT (Tissue Tek) выливали на поверхность ткани и распределяли по поверхности. Затем ткань помещали на Cryomold. Cryomold помещали на сухой лед для быстрого замораживания ткани, и затем ткань нарезали на срезы толщиной 10-20 мкм с использованием криостата (изготовленного Leica Biosystems), и сушили на воздухе вместе с предметным стеклом в течение 30 минут с использованием фена, с получением предметного стекла с помещенным на него срезом ткани. Далее предметное стекло помещали в бутылку для окрашивания, заполненную PBS-T (физиологический раствор, содержащий 0,05% Tween 20), и три раза проводили замену PBS-T на свежий PBS-T каждые 5 минут. Излишнюю воду вокруг каждого среза вытирали с помощью Kimwipe. Срез на предметном стекле обводили с помощью ручки Dako (изготовленная Dako Japan Inc.). Затем наносили блокирующий реагент Ig мыши MOM (Vectastain) для тканей мыши и раствор PBS-T, содержащий 10% FBS, для тканей собак в качестве блокирующих растворов, и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа во влажной камере.

Далее реактивное в отношении поверхности злокачественных клеток поликлональное антитело против происходящего из CAPRIN-1 пептида (SEQ ID NO:5), полученное в примере 5, приготавливали в растворе 10 мкг/мл с блокирующим раствором, и полученный раствор наносили на предметное стекло. Предметное стекло оставляли стоять в течение ночи при 4°C во влажной камере. После промывания PBS-T в течение 10 минут три раза, на него наносили меченные биотином антитела против IgG MOM (Vectastain), разведенные в 250 раз блокирующим раствором, и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа во влажной камере. После промывания PBS-T в течение 10 минут три раза, на него наносили реагент авидин-биотин ABC (Vectastain), и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 5 минут во влажной камере. После промывания PBS-T в течение 10 минут три раза, на него наносили раствор DAB для окрашивания (10 мг DAB+10 мкл 30% H₂O_2/50 мл 0,05М tris-HCl (pH 7,6)), и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 30 минут во влажной камере. После промывания дистиллированной водой на него наносили реагент гематоксилин (изготовленный Dako Japan Inc.), и предметное стекло оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 минуты и затем промывали дистиллированной водой. Предметное стекло помещали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола в указанном порядке в течение 1 минуты для каждого раствора, и затем оставляли стоять в течение ночи в ксилоле. Предметное стекло извлекали и помещали в среду для заливки Glycergel Mounting Medium (изготовленную Dako Japan Inc.), и затем проводили наблюдение. В результате внутриклеточная экспрессия CAPRIN-1 в незначительной степени выявлялась в соответствующих тканях слюнной железы, почки, толстого кишечника и желудка. Однако его экспрессия не выявлялась на клеточной поверхности этих тканей. Кроме того, не было выявлено экспрессии в тканях, полученных из других органов.

(2) Экспрессия CAPRIN-1 в ткани рака молочной железы собаки

Замороженные ткани рака молочной железы собак, которые патологически диагностировали как рак молочной железы, использовали для получения замороженных срезов и иммунологического окрашивания с использованием поликлональных антител против происходящего из CAPRIN-1 пептида (SEQ ID NO:5), полученного в примере 5, аналогично тому, как описано выше. В результате экспрессию CAPRIN-1 выявили в тканях рака молочной железы собаки.

(3) Экспрессия CAPRIN-1 в различных тканях злокачественной опухоли человека

Заключенные в парафин различные образцы наборов тканей злокачественных опухолей человека (изготовленные US Biomax, Inc.) использовали при иммуногистохимическом окрашивании с использованием поликлональных антител (полученных в примере 5) против происходящего из CAPRIN-1 пептида (SEQ ID NO:5) аналогично тому, как описано выше. В результате экспрессию CAPRIN-1 наблюдали в раке пищевода, раке толстого кишечника, раке прямой кишки, раке легких, раке поджелудочной железы, раке почки, раке мочевого пузыря и раке шейки матки.

Пример 8. Получение химерного моноклонального антитела человека-мыши

Фрагмент амплификации гена, полученный в примере 4, содержащий последовательность (SEQ ID NO:14) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела мыши #2, обрабатывали на обоих концах ферментом рестрикции, затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA4/myc-His (изготовленный Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки лидерной последовательности, полученной из антитела мыши, и константной области H-цепи IgG₁ человека, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48. Также фрагмент амплификации гена, содержащий последовательность (SEQ ID NO:15) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела мыши #2, обрабатывали на обоих концах ферментом рестрикции, затем очищали и встраивали в соответствии с общепринятым способом в вектор pcDNA3.1/myc-His (изготовленный Invitrogen Corp.), уже имеющий генные вставки лидерной последовательности, полученной из антитела мыши, и константной области L-цепи IgG₁ человека, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:49.

Далее рекомбинантный вектор, имеющий вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO:14) моноклонального антитела мыши #2, и рекомбинантный вектор, имеющий вставку нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO:15) моноклонального антитела мыши #2, вводили в клетки CHO-K1 (полученные от Riken Cell Bank). В частности, 2×10⁵ клеток CHO-K1 культивировали в среде Хэма F12 (изготовленная Invitrogen Corp.), содержащей 1 мл 10% FBS на лунку культурального планшета с 12 лунками, и промывали PBS(-). Затем добавляли свежую среду Хэма F12, содержащую 1 мл 10% FBS на лунку. 250 нг каждого из векторов в 30 мкл OptiMEM (изготовленная Invitrogen Corp.), смешивали с 30 мкл реагента для трансфекции Polyfect (изготовленный Qiagen N.V.), и полученную смесь добавляли в каждую лунку. Клетки CHO-K1, котрансфицированные рекомбинантными векторами, культивировали в среде Хэма F12, содержащей 10% добавку FBS с 200 мкг/мл зеоцина (изготовленный Invitrogen Corp.) и 200 мкг/мл генетицина (изготовленный Roche Diagnostics K.K.), и затем высевали в 96-луночный планшет в количестве 0,5 клеток/лунка с получением клеточной линии, стабильно продуцирующей химерное моноклональное антитело человека-мыши #1 (#1), имеющее вариабельные области моноклонального антитела мыши #1. Также получали клеточные линии, стабильно продуцирующие химерное моноклональное антитело человека-мыши #2 (#2) или химерное моноклональное антитело человека-мыши #3 (#3), аналогично тому, как описано выше в отношении моноклональных антител мыши #2 и #3.

Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150 см² колбе в количестве 5×10⁵ клеток/мл в 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (изготовленная Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих #1, #2 или #3.

Также получали клеточные линии, стабильно продуцирующие сравнительные химерные антитела человека-мыши 1-11, аналогично тому, как описано выше, соответственно, на основе следующих моноклональных антител мыши против CAPRIN-1, описанных в WO2010/016526, в качестве сравнительных антител: сравнительное антитело 1, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:26 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:27; сравнительное антитело 2, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:28 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:29; сравнительное антитело 3, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:30 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:31; сравнительное антитело 4, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:32 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:33; сравнительное антитело 5, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:34 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:35; сравнительное антитело 6, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:36 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:37; сравнительное антитело 7, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:38 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:39; сравнительное антитело 8, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:40 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:41; сравнительное антитело 9, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:42 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:43; сравнительное антитело 10, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:44 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:45; и сравнительное антитело 11, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:46 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:47. Каждую полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150-см² колбе в количестве 5×10⁵ клеток/мл в 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (изготовленная Invitrogen Corp.) с получением культуральных супернатантов, содержащих соответствующие сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши 1-11.

Пример 9. Получение химерного моноклонального антитела человека-курицы

На основе моноклонального антитела курицы #1, полученного в примере 3, получали клеточную линию, стабильно продуцирующую химерное антитело человека-курицы #1, имеющее вариабельные области моноклонального антитела мыши #1, в соответствии со способом, описанным в примере 4(2) WO2011/096519. Полученную клеточную линию культивировали в течение 5 суток в 150 см² колбе в количестве 5×10⁵ клеток/мл в 30 мл бессывороточной среды OptiCHO (изготовленная Invitrogen Corp.) с получением культурального супернатанта, содержащего химерное антитело человека-курицы #1.

Также на основе моноклональных антител курицы #2, #3 и #4 получали клеточные линии, стабильно продуцирующие химерное антитело человека-мыши #2, #3 или #4 с использованием того же подхода, как указано выше. Каждую полученную клеточную линию использовали для получения культуральных супернатантов, содержащих химерное антитело человека-курицы #1, #2, #3 или #4.

Пример 10. Анализ экспрессии CAPRIN-1 на поверхности различных злокачественных клеток с использованием моноклональных антител мыши #1, #2 и #3 и моноклональных антител курицы #1, #2, #3 и #4

Далее клеточные линии рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), клеточные линии рака почки (Caki-1, Caki-2, A498 и ACHN), клеточную линию рака мочевого пузыря (T24), клеточную линию рака яичников (SKOV3), клеточную линию рака легких (QG56 и A549), клеточные линии рака поджелудочной железы (Capan-2 и MIAPaCa-2), клеточную линию рака предстательной железы (PC3), клеточную линию рака шейки матки (SW756), клеточную линию фибросаркомы (HT1080), клеточные линии опухоли головного мозга (T98G, U87MG, U251, SNB19 и U373), клеточные линии рака желудка (MNK28 и MNK45), клеточные линии рака ободочной и прямой кишки (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 и HCT116), клеточную линию лейкоза (AML5) и клеточную линию лимфомы (Ramos), для которых было выявлено, что они обладают экспрессией гена CAPRIN-1, исследовали в отношении их экспрессии белков CAPRIN-1 на клеточной поверхности с использованием культуральных супернатантов, соответственно, содержащих #1, #2 или #3, полученные в примере 2, и моноклональные антитела курицы #1, #2, #3 и #4, полученные в примере 3. 10⁶ клеток каждой клеточной линии центрифугировали в каждой 1,5 мл микроцентрифужной пробирке. В пробирку добавляли каждый культуральный супернатант (100 мкл), содержащий любое из антител #1, #2 и #3 и моноклональных антител курицы #1, #2, #3 и #4, и оставляли стоять в течение 1 часа на льду. После промывания PBS добавляли меченые FITC антитела козы против IgG мыши (H+L) (изготовленные Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), разведенные PBS, содержащим 0,1% FBS, для полученных из мыши антител или меченные FITC антитела козы против IgG курицы (H+L) (изготовленные SouthernBiotech), разведенные в 100 раз PBS, содержащим 0,1% FBS, для полученных из курицы антител, и оставляли стоять при 4°C в течение 30 минут. После промывания PBS измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Используемый отрицательный контроль представлял собой клетки, реагировавшие только с вторичными антителами. В результате все клетки, обработанные любыми из антител #1, #2 и #3 и моноклональных антител курицы #1-#4, обладали интенсивностью флуоресценции, по меньшей мере на 35% превышающей интенсивность флуоресценции отрицательного контроля. Это продемонстрировало, что белки CAPRIN-1 экспрессируются на поверхности клеточной мембраны злокачественных клеточных линий человека. Указанные выше степени усиления интенсивности флуоресценции выражали в качестве степеней усиления средней интенсивности флуоресценции (величина MFI) в соответствующих клеточных линиях, которые вычисляли по следующей формуле.

Степень повышения интенсивности флуоресценции (степень усиления интенсивности флуоресценции) (%)=((MFI клеток, прореагировавших с антителами против CAPRIN-1)-(контрольная MFI))/(контрольная MFI)×100.

Пример 11. Противоопухолевая активность антитела против происходящего из CAPRIN-1 пептида (SEQ ID NO:5) в отношении злокачественных клеток

Для оценки антител против происходящего из CAPRIN-1 пептида (SEQ ID NO:5) в отношении силы их цитотоксичности против злокачественных клеток, экспрессирующих CAPRIN-1, определяли активность ADCC. Для этой оценки использовали поликлональные антитела (полученные в примере 5) против пептида, представленного в SEQ ID NO:5. Сходную оценку проводили с использованием поликлональных антител против других полученных из CAPRIN-1 человека пептидов (поликлональные антитела против аминокислотных остатков 50-98 в аминокислотной последовательности CAPRIN-1 человека и поликлональные антитела против аминокислотных остатков 233-305 в аминокислотной последовательности CAPRIN-1 человека, которые получали в примере 5) в качестве антител для сравнения или полученных из сыворотки кролика контрольных антител, полученных в примере 5, в качестве отрицательного контроля.

10⁶ клеток каждой из клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы MIAPaCa-2, клеточной линии рака почки человека Caki-2 и клеточной линии рака легких человека QG56, для которых было выявлено, что они обладают экспрессией CAPRIN-1, собирали в 50 мл центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 100 мкКи хрома 51 и затем инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки промывали три раза средой RPMI 1640, содержавшей 10% FBS, и добавляли в количестве 2×10³ клеток/лунка в каждый 96-луночный планшет с V-образным дном для получения клеток-мишеней. Добавляли каждое из поликлональных антител против происходящего из CAPRIN-1 человека пептида (SEQ ID NO:5) и двух типов поликлональных антител против других полученных из CAPRIN-1 человека пептидов (поликлональные антитела против аминокислотных остатков 50-98 CAPRIN-1 человека и поликлональные антитела против аминокислотных остатков 233-305 CAPRIN-1 человека) в количестве 1 мкг/лунка. Далее добавляли лимфоциты, выделенные из лимфоцитов периферической крови человека в соответствии с общепринятым способом, в количестве 4×10⁵ клеток/лунка и культивировали в течение 4 часов при 37°C, 5% CO₂. После культивирования в культуральном супернатанте измеряли количество хрома (Cr) 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток, для вычисления активности ADCC против злокачественных клеток, обусловленной поликлональными антителами против полученных из CAPRIN-1 человека пептидов. В результате все поликлональные антитела, полученные путем иммунизации частичными пептидами CAPRIN-1 человека, имеющими аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков 50-98 или аминокислотных остатков 233-305 CAPRIN-1 человека, имели активность менее 10% против клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы человека MIAPaCa-2, клеточной линии рака почки человека Caki-2 и клеточной линии рака легких человека QG56. Напротив, группы клеток, обработанных поликлональными антителами против происходящего из CAPRIN-1 человека пептида (SEQ ID NO:5), проявляли 25% или более высокую цитотоксическую активность против всех злокачественных клеточных линий. Отрицательные контрольные антитела обладали активностью менее 4% против всех злокачественных клеток. Эти результаты показали, что антитела против CAPRIN-1, представленные в SEQ ID NO:5, проявляют высокую цитотоксическую активность против злокачественных клеток, экспрессирующих CAPRIN-1.

Эти результаты получали путем определения цитотоксической активности, как описано выше, посредством смешения антитела против CAPRIN-1, используемого в настоящем изобретении, лимфоцитов и 2×10³ клеток каждой злокачественной линии с включенным хромом 51; культивирования клеток в течение 4 часов; измерения после культивирования количества хрома 51, высвободившегося в среду; и вычисления цитотоксической активности против каждой злокачественной клеточной линии по следующей формуле*.

*Формула: Цитотоксическая активность (%)=[количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней обработанных антителом против CAPRIN-1 и лимфоцитов]/[Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней, обработанных 1н. хлористоводородной кислотой]×100.

Химерные моноклональные антитела человека-мыши #1, #2 и #3, полученные в примере 8, и химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4, полученные в примере 9, оценивали в отношении их цитотоксической активности против злокачественных клеток человека. Культуральный супернатант каждой клеточной линии, продуцирующей любое из #1, #2 и #3, и химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4, очищали с использованием Hitrap Protein A Sepharose FF (изготовленная GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). После замены PBS(-) раствор фильтровали через 0,22-мкм фильтр (изготовленный Millipore Corp.). Полученное антитело использовали для анализа активности. 10⁶ клеток каждой из клеточной линии рака молочной железы человека MCF7, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки человека HCT-116, клеточной линии рака поджелудочной железы MIAPaCa-2, клеточной линии рака почки человека Caki-2 и клеточной линии рака легких человека QG56, собирали в 50 мл центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 100 мкКи хрома 51, и затем инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки промывали три раза средой RPMI 1640, содержавшей 10% FBS, и добавляли в количестве 2×10³ клеток/лунка в каждый 96-луночный планшет с V-образным дном для получения клеток-мишеней. Добавляли каждое из очищенных антител (химерные моноклональные антитела человека-мыши #1, #2 и #3 и химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4) и химерных сравнительных моноклональных антител человека-мыши 1-11, полученных в примере 8, в количестве 1,3 мкг/лунка. Клеточную популяцию, содержащую NK-клетки человека, выделяли с использованием общепринятого способа из лимфоцитов периферической крови человека, полученных общепринятым способом. Клеточную популяцию, содержащую NK-клетки человека, которые использовали при этой оценке, получали следующим образом: мононуклеарные клетки периферической крови человека, выделенные с использованием раствора для разделения по удельной плотности Histopaque для выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (Sigma-Aldrich Corp.), подвергали взаимодействию с меченными флуоресцентным красителем FITC антителами (антитело против CD3 человека, антитело против CD20 человека, антитело против CD19 человека, антитело против CD11c человека и антитело против HLA-DR человека (Becton, and Dickinson and Company)), и клеточную популяцию, содержащую NK-клетки, не окрашенные антителами, выделяли с использованием клеточного сортера (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company)) или клеточную популяцию выделяли с использованием набора для выделения NK-клеток человека (изготовленный Miltenyi Biotec K.K.). Выделенную клеточную популяцию, содержащую NK-клетки, добавляли в планшет в количестве 2×10⁵ клеток/лунка и культивировали в течение 4 часов при 37°C, 5% CO₂. После культивирования в культуральном супернатанте измеряли количество хрома 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток, для вычисления цитотоксической активности каждого антитела против CAPRIN-1 в отношении злокачественных клеток. Используемый отрицательный контроль представлял собой клетки, обработанные изотипическими контрольными антителами. В результате используемые изотипические контрольные антитела и сравнительные химерные моноклональные антитела человека-мыши 1-11 имели цитотоксическую активность менее 5% в отношении MCF7, менее 3% в отношении HCT-116, 7% в отношении MIAPaCa-2, менее 8% в отношении Caki-2 и менее 5% в отношении QG56. Напротив, химерное моноклональное антитело человека-мыши #1 и химерные моноклональные антитела человека-курицы #1-#4 имели цитотоксическую активность 30% или более против MCF7, 19% или более против HCT-116, 28% или более против MIAPaCa-2, 34% или более против Caki-2 и 10% или более против QG56. Также химерные моноклональные антитела человека-мыши #2 и #3 имели цитотоксическую активность 32% или более против MCF7, 18% или более против HCT-116, 32% или более против MIAPaCa-2, 18% или более против Caki-2 и 10% или более против QG56. Аналогично, используемые изотипические контрольные антитела и сравнительные антитела 1-11 имели цитотоксическую активность менее 4% против других злокачественных клеток: клеточных линий рака молочной железы ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V и MRK-nu-1, клеточных линий глиомы T98G и U373, клеточной линии рака легких A549, клеточных линий рака почки Caki-1 и ACHN, клеточной лини рака шейки матки SW756, клеточной линии рака мочевого пузыря T24, клеточных линий рака желудка MKN28 и MKN45, клеточной линии рака ободочной и прямой кишки SW480, клеточной линии лейкоза AML5 и клеточной линии лимфомы Ramos. Напротив, было выявлено, что химерные моноклональные антитела человека-мыши #1, #2 и #3 и химерные моноклональные антитела человека-мыши #1, #2, #3 и #4 обладают 10% или более цитотоксической активностью против этих клеточных линий. Эти результаты показали, что полученные моноклональные антитела #1, #2 и #3 и химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 против CAPRIN-1 повреждают экспрессирующие CAPRIN-1 злокачественные клетки через их активность ADCC, и было продемонстрировано, что химерные моноклональные антитела человека-мыши #1, #2 и #3 и химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 проявляют более высокую цитотоксическую активность против злокачественных клеток человека, чем сравнительные антитела 1-11.

Также химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 оценивали аналогично тому, как описано выше, в отношении их цитотоксической активности против клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-436, клеточной линии рака почки человека Caki-1, клеточной линии рака легких человека A549, клеточной линии рака поджелудочной железы человека Panc-1 и клеток рака ободочной и прямой кишки DLD-1, для которых было выявлено, что они обладают экспрессией гена CAPRIN-1. Кроме того, химерные антитела человека-курицы #1 и #2 против CAPRIN-1, описанные в примере 4 WO2011/096517, использовали в качестве сравнительных антител 12 и 13, соответственно; химерное антитело человека-курицы #1 против CAPRIN-1, описанное в примере 4 WO2011/096519, использовали в качестве сравнительного антитела 13; химерное антитело человека-курицы #1 и моноклональные антитела мыши #2, #3, #4, #5 и #6 против CAPRIN-1, описанные в примере 4 WO2011/096528, использовали в качестве сравнительных антител 14, 15, 16, 17, 18 и 19, соответственно; моноклональные антитела мыши #1, #2 и #3 против CAPRIN-1, описанные в примере 3 WO2011/096533, использовали в качестве сравнительных антител 20, 21 и 22, соответственно; и моноклональные антитела мыши #1, #2 и #3 против CAPRIN-1, описанные в примере 3 WO2011/096534, использовали в качестве сравнительных антител 23, 24 и 25, соответственно, для оценки цитотоксической активности. В частности, 10⁶ клеток клеточной линии рака ободочной и прямой кишки человека DLD-1 собирали в 50 мл центрифужную пробирку, и в нее добавляли 100 мкКи хрома 51, и затем проводили инкубацию при 37°C в течение 1 часа. Затем клетки промывали три раза средой RPMI 1640, содержавшей 10% FBS, и добавляли в количестве 2×10³ клеток/лунка в каждый 96-луночный планшет с V-образным дном для получения клеток-мишеней. Далее добавляли каждое из химерных моноклональных антител человека-курицы #1-#4 и сравнительных антител 12-25 в количестве 1 мкг/лунка. Далее добавляли клеточную популяцию, содержащую NK-клетки человека, полученную согласно общепринятому способу, в количестве 10⁵ клеток/лунка и культивировали в течение 4 часов при 37°C, 5% CO₂. После культивирования в культуральном супернатанте измеряли количество хрома 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток, для вычисления цитотоксической активности каждого антитела против CAPRIN-1 в отношении злокачественных клеток. Цитотоксичность против MDA-MB-436, Caki-1, A549 и Panc-1 также оценивали аналогично тому, как описано выше. В результате все сравнительные антитела 12-25 имели 5% или менее цитотоксическую активность в отношении MDA-MB-436, в то время как химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 проявляли 18% или более цитотоксическую активность в отношении этой клеточной линии. Все сравнительные антитела 12-25 имели 5% или менее цитотоксическую активность в отношении Caki-1, в то время как химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 проявляли 14% или более цитотоксическую активность в отношении этой клеточной линии. Все сравнительные антитела 12-25 имели 5% или менее цитотоксическую активность против A549, в то время как химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 проявляли 12% или более цитотоксическую активность против этой клеточной линии. Все сравнительные антитела 12-25 имели 5% или менее цитотоксическую активность против Panc-1, в то время как химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 проявляли 18% или более цитотоксическую активность в отношении этой клеточной линии. Все сравнительные антитела 12-25 имели 7% или менее цитотоксическую активность в отношении DLD-1, в то время как химерные моноклональные антитела человека-курицы #1, #2, #3 и #4 проявляли 15% или более цитотоксическую активность в отношении этой клеточной линии.

Эти результаты получали путем определения цитотоксической активности, как описано выше, посредством смешения антитела против CAPRIN-1, используемого в настоящем изобретении, лимфоцитов (клеточная популяция, содержащая NK-клетки), и 2×10³ клеток каждой злокачественной линии с включенным хромом 51; культивирования клеток в течение 4 часов; измерения после культивирования количества хрома 51, высвободившегося в среду; и вычисления цитотоксической активности против каждой злокачественной клеточной линии по следующей формуле*.

*Формула: Цитотоксическая активность (%)=[количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней обработанных антителом против CAPRIN-1 и лимфоцитов]/[Количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней, обработанных 1н. хлористоводородной кислотой]×100.

Пример 12: Количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных злокачественных клеток, распознаваемых моноклональными антителами #1, #2 и #3 против CAPRIN-1

Клеточные линии рака молочной железы человека (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V и MRK-nu-1), клеточные линии рака почки (Caki-1, Caki-2, A498 и ACHN), клеточную линию рака мочевого пузыря (T24), клеточную линию рака яичников (SKOV3), клеточные линии рака легких (QG56 и A549), клеточные линии рака поджелудочной железы (MIAPaCa-2 и Capan-2), клеточную линию рака предстательной железы (PC3), клеточную линию рака шейки матки (SW756), клеточную линию фибросаркомы (HT1080), клеточные линии опухоли головного мозга (T98G, U87MG, U251, SNB19 и U373), клеточные линии рака желудка (MNK28 и MNK45), клеточные линии рака ободочной и прямой кишки (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 и HCT116), клеточную линию лейкоза (AML5) и клеточную линию лимфомы (Ramos) исследовали с использованием набора для анализа количества молекул "QIFIKIT" (изготовленный Dako Japan Inc.) в отношении количества молекул CAPRIN-1 на их клеточной поверхности, распознаваемых моноклональными антителами #1, #2 и #3, полученными в примере 2. Аналогично, количество молекул CAPRIN-1 на поверхности этих различных злокачественных клеток также исследовали с использованием сравнительных моноклональных антител 1-11.

В частности, в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, каждое антитело (моноклональные антитела мыши #1, #2 и #3 и сравнительные антитела 1-11) разводили PBS до конечной концентрации 5 мкг/мл, и полученное разведение добавляли к каждой клеточной линии и подвергали взаимодействию в течение 30 минут. После промывания PBS к каждой клеточной линии добавляли флуоресцентно меченные антитела против IgG мыши, прилагаемые к набору, вместе с калибровочными гранулами, прилагаемыми к набору, и оставляли стоять в течение 45 минут на льду. Каждую клеточную линию и калибровочные гранулы промывали PBS. Затем измеряли интенсивность флуоресценции с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company) с получением средней величины интенсивности флуоресценции (среднее значение) для всех из антител, описанных выше. Использованный отрицательный контроль представлял собой клетки, подвергнутые взаимодействию с изотипическими контрольными антителами, а также получали среднее значение. Каждую среднюю величину интенсивности флуоресценции (среднее значение) использовали для вычисления количества молекул согласно протоколу, прилагаемому к набору. В результате количество молекул CAPRIN-1 на поверхности различных клеточных линий, распознаваемых моноклональными антителами мыши #1, #2 и #3, составляло 10⁵ или более на клетку для всех исследованных злокачественных клеточных линий человека. С другой стороны, количество молекул, распознаваемых сравнительными антителами 1-11, составляло менее 10⁵ на клетку.

Промышленная применимость

Антитело по настоящему изобретению пригодно для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его связывающему фрагменту, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1. Также раскрыты конъюгат, а также фармацевтическая композиция и фармацевтическая комбинация для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1. Изобретение также относится к способу лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1 с использованием вышеуказанного антитела или его фрагмента, конъюгата, композиции или комбинации. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение или профилактику злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1. 14 н. и 5 з.п. ф-лы, 12 пр.

1. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где указанное антитело получено иммунизацией животного указанным полипептидом.

2. Моноклональное антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где указанное антитело получено иммунизацией животного указанным полипептидом.

3. Антитело или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2, где антитело или его связывающий фрагмент обладают цитотоксической активностью против злокачественной клетки, экспрессирующей белок CAPRIN-1.

4. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно.

5. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 20, 21 и 22, соответственно.

6. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 50, 51 и 52, соответственно.

7. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 55, 56 и 57, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 59, 60 и 61, соответственно.

8. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRl, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 55, 56 и 57, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRl, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 59, 64 и 61, соответственно.

9. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRl, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 66, 67 и 68, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRl, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 70, 71 и 72, соответственно.

10. Антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRl, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 74, 75 и 76, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRl, CDR2 и CDR3, состоящие из SEQ ID NO: 78, 79 и 80, соответственно.

11. Конъюгат для использования в лечении или профилактике злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, содержащий антитело или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2, и противоопухолевое средство.

12. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп. 1-10 или конъюгата по п. 11 в качестве активного ингредиента для лечения или профилактики указанной злокачественной опухоли.

13. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, содержащая эффективное количество антитела или его связывающего фрагмента, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1 и обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, где антитело или его связывающий фрагмент обладают цитотоксической активностью против клеток злокачественной опухоли, экспрессирующей белок CAPRIN-1.

14. Фармацевтическая композиция по п. 12 или 13, где антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

15. Фармацевтическая композиция по п. 12 или 13, где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.

16. Фармацевтическая композиция по п. 12, где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

17. Фармацевтическая композиция по п. 13, где злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

18. Фармацевтическая комбинация для лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, включающая фармацевтическую композицию по п. 12, 13, 16 или 17 и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.

19. Способ лечения или профилактики злокачественной опухоли, экспрессирующей CAPRIN-1, включающий введение антитела или его связывающего фрагмента по любому из пп. 1-10, конъюгата по п. 11 или фармацевтической композиции по п. 12, 13, 16 или 17, или фармацевтической комбинации по п. 18 субъекту.