Способ эрадикации бактерий Helicobacter pylori при экспериментальном хеликобактериозе у конвенциональных белых мышей и средство для его осуществления Российский патент 2021 года по МПК G09B23/28 A61K35/74 A61K35/66 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и гастроэнтерологии, медицинской микробиологии, инфектологии и может быть использовано для полного освобождения (эрадикации) организма млекопитающих от бактерий Helicobacter pylori - этиологического агента хеликобактериоза, предотвращения развития сопутствующих ему патологических изменений в желудке и кишечнике, а также для оценки возможности профилактики канцерогенеза язв желудка и двенадцатиперстной кишки и колоректальных новообразований.

Хеликобактериоз - инфекционное заболевание с фекально - оральным механизмом передачи, вызываемое бактериями Helicobacter pylori, имеющими выраженную тропность к эпителию слизистой оболочки желудка. Уровень инфицирования хеликобактером детей составляет около 10%, в то время как взрослое население инфицировано практически на 100%. Со времени открытия (Goodwin C.S., Armstrong J.A., Marshall B.J. Campylobacter pylori, gastritis, and peptic ulcer // J. Clin. Pathol. 1986; 39:353-365) Helicobacter pylori рассматривается в качестве возбудителя хронического воспаления желудка - хеликобактериоза и сопутствующих ему гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и последующей малигнизации изъязвлений.

Найден микроорганизм - Streptococcus gallolyticus, subsp. gallolyticus, который «специализируется» исключительно на онкогенезе: взаимодействует со стенкой кишки и вызывает перерождение ткани. Streptococcus gallolyticus оказывает влияние не здоровые клетки, превращая их в «заготовки» раковых опухолей. Streptococcus gallolyticus - это оппортунистический патоген (условно-патогенный микроб), который может вызывать бактериемию и эндокардит. Он относится к комплексу Streptococcus bovis - Streptococcus equinus и ранее был известен как биотип Streptococcus bovis I. Бактерии Streptococcus gallolyticus колонизируют слизистую оболочку кишки и каждая бактериальная колония создаёт вокруг себя среду жизни раковой опухоли и тем самым способствует пролиферации раковых клеток толстой (или прямой) кишки и росту опухоли. Экспериментально установлено, что среди видов Streptococcus pasteurianus, Streptococcus macedonicus, Streptococcus infantis бактерии Streptococcus gallolyticus демонстрируют самую высокую связь с канцерогенезом: инициация роста опухоли происходит в 7 раз чаще, чем другими видами бактерий.

О таком свойстве бактерий Streptococcus gallolyticus, как канцерогенез, знали и раньше, но только в последние годы Streptococcus gallolyticus привлёк к себе пристальное внимание тем, что практически во всех опухолях прямой кишки и желудка человека наряду с бактериями Streptococcus gallolyticus обнаружены бактерии Helicobacter pylori. Микробиологические и гистологические находки стрептококка и хеликобактера в тканях прямой кишки и желудка свидетельствуют, во-первых, об адгезивной способности обоих возбудителей как атрибуте видов, во-вторых, о биосовместимости двух возбудителей, в-третьих, о синергизме их онкогенного действия, в-четвёртых, о практически идентичной картине патоморфологических проявлений (изъязвление и малигнизация язвы) локусов первичной адгезии возбудителей к стенке прямой кишки и желудка.

Обращает на себя внимание бессимптомность носительства бактерий Streptococcus gallolyticus, что в значительной мере затрудняет постановку диагноза и отодвигает во времени начало лечения. Нечто подобное имеет место в случае с хеликобактером, но настороженность гастроэнтерологов по данной инфекции позволяет выявить в организме бактерии Helicobacter pylori и начать лечение по одному из легитимных протоколов. Можно предположить, что бактерии Helicobacter pylori первично заселяют слизистую оболочку желудка, расчищая место для адгезии бактерий Streptococcus gallolyticus. Такое содружество представителей двух бактериальных видов, обладающих потенциалом канцерогенеза, способствует развитию опухоли. Мощный комплекс факторов патогенности обеспечивает возбудителю Helicobacter pylori выживаемость в кислой среде и колонизацию, образованию патологической биоплёнки на поверхности слизистой оболочки желудка, в которой бактерии Streptococcus gallolyticus спокойно выживают вместе с хеликобактером. В дальнейшем с кишечным содержимым ассоциация двух возбудителей достигает прямой кишки, где существуют эпителиальные клетки, близкие по структуре клеткам желудка, и где проявляются патогенные свойства обоих возбудителей; возможно поэтому их выделяют вместе из опухоли прямой кишки. Условия толстой кишки, по-видимому, более благоприятные для бактерии Streptococcus gallolyticus, которые «освобождаются из-под опеки» хеликобактера и выходят из патологической биоплёнки, начиная самостоятельно процесс малигнизации клеток эпителия толстой кишки.

Вполне очевидно, что инфекция, вызванная Streptococcus gallolyticus, как и хеликобактериоз, является хронической инфекцией и протекает она в течение длительного периода времени. И если доказано, что самопроизвольного излечения Helicobacter pylori-инфекции не происходит, то и со Streptococcus gallolyticus-инфекцией дело обстоит аналогичным образом. Следовательно, задача эрадикации бактерий Helicobacter pylori при хеликобактериозе является актуальной в плане предупреждения малигнизации длительно незаживающих язв желудка и двенадцатиперстной кишки, которая становится ещё более актуальной с учётом данных о сопутствующем хеликобактеру микробе Streptococcus gallolyticus, ответственному за инициацию колоректального рака.

Хеликобактер приспособился к длительному пребыванию в желудке, в антральной части которого он скапливается в большом количестве. Именно здесь относительно мало клеток, секретирующих соляную кислоту, что способствует выживанию хеликобактера на поверхности эпителия желудка. Длительная персистенция Helicobacter pylori в слизисто - бикарбонатном барьере патологической биопленки желудка создает известные трудности в диагностике и лечении хликобактериоза (Нижевич А.А., Хасанов Р.Ш. Helicobacter pylori: введение в патогенез и патобиохимию гастрита // Материалы VIII тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori, 18 мая 1999г, Уфа. https// www. Helicobacter.ru/index.php?i=59; Helicobacter pylori - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии (пособие для врачей) / НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Научно-производственная фирма «Литех», Научный Центр Здоровья Детей, Центральная Клиническая Больница МЦ УД Президента РФ.- М.: 2004. 41 с.). Очевидно, что именно этим обстоятельством можно объяснить данные статистики, согласно которым полное выздоровление наблюдается лишь у 15% больных хеликобактериозом, и, как ни странно, далеко не все пациенты, инфицированные Helicobacter pylori, заболевают раком желудка. Не исключено, что именно сателлитный микроб Streptococcus gallolyticus создаёт необходимые предпосылки для озлокачествления эрозивного хеликобактерного гастрита.

Один из авторов открытия бактерий Helicobacter pylori, установивших роль возбудителя в патогенезе хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, B.J. Marshall (Goodwin C.S., Armstrong J.A., Marshall B.J.. Campylobacter pylori, gastritis, and peptic ulcer // J. Clin. Pathol. 1986; 39: 353-365; H. Mobley. The role of Helicobacter pylori urease in the pathogenesis of gastritis and peptic ulceration // Alim. Pharmacol. Ther. 1996; 10 (Suppl. 1): 57-64) испытал на себе возможность самозаражения и предложил использовать для лечения хеликобактериоза висмутсодержащую тройную терапию, направленную на эрадикацию Helicobacter pylori (Marshall B.J. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in acute chronic gastritis // Lancet. - 1983. - Vol. 1. - P.1273-1275; B.J. Marshall. Helicobacter pylori: etiologic agent for peptic ulcer // JAMA. 1995. 274:1064 -1066). Принципами терапии Helicobacter pylori-инфекции являются:

- использование многокомпонентных схем лечения (тройная терапия, квадротерапия);

- строгое соблюдение выбранной схемы лечения (определённые лекарственные препараты, определённые дозы, определённая продолжительность терапии);

- учёт синергизма лекарственных препаратов;

- вспомогательные методы, в частности лазеротерапия, направленные на повышение общей реактивности организма, т.е. потенцирование действия основной терапии.

Реализация принципов терапии Helicobacter pylori-инфекции сводится к стандартной тройной и квадротерапии с препаратом висмута (первая линия в схеме лечения), квадротерапии с препаратом висмута и тройной терапии с левофлоксацином (вторая линия в схеме лечения), определение антибиотикорезистентности Helicobacter pylori (третья линия в схеме лечения). В научной литературе приведены также и несколько иные схемы современной эрадикационной терапии с оценкой их клинической эффективности: монотерапия, двухкомпонентная терапия, трёхкомпонентная терапия, квадротерапия. Конечным итогом терапии Helicobacter pylori - ассоциированных заболеваний должна быть эрадикация, т.е. удаление возбудителя Helicobacter pylori и санация организма. Очевидно, что дальнейшие перспективы совершенствования антихеликобактерной терапии связаны с апробацией новых схем с высоким показателем стоимость/эффективность и меньшим числом побочных действий, отмечаемых при тройной терапии. Такие схемы (варианты), касающиеся лечения инфекции Helicobacter pylori, прописаны в рекомендациях Американской коллегией гастроэнтерологов, МаастрихтV/Флорентийского (2016) и Торонтского (2016) консенсусов ввиду недостаточной эффективности эрадикации возбудителя хеликобактериоза при использовании других схем лечения (Пиманов С.И., Макаренко Е.В. Оптимизированные эрадикационные протоколы: рекомендации Американской коллегии гастроэнтерологов, МаастрихтV/Флорентийского и Торонтского консенсусов // Медицинский совет. 2017;15:10-17). Предложено 16 вариантов эрадикационных протоколов для практического использования. Последним из 16-ти вариантов лечения, который рекомендовано использовать после безуспешности 3-4 вариантов эрадикации, является протокол с рифабутином. Таким образом, в настоящее время имеется достаточно представительный перечень эрадикационных протоколов, но всё зависит от квалификации лечащего врача, выбора удачных схем лечения и последовательности их применения (Ивашкин В.Т., Маев И.В., Лапина Т.Л., Шептуллин А.А. Рекомендация Российской Гастроэнтерологической Ассоциации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых / Комитет по подготовке проекта рекомендации. Методические рекомендации: РЖГГК- www.gastro-j.ru-2012. 1: 87-89). Неудачи эрадикации бактерий хеликобактера связаны, по нашему мнению, с тем, что все предложенные схемы лечения не были апробированы в ходе доклинических испытаний на биопробных животных, и недостатки самих схем выявлялись уже в клинических условиях на больных. Возможным объяснением трудностей, возникающих в связи с попытками моделирования хеликобактериоза, является следующий факт, о котором 20.06.2015г. сообщил информационно-аналитический портал «Русская Планета»: животные практически никак не реагируют на хеликобактера и не страдают связанными с ним болезнями. И эта констатация фактически переводит хеликобактериоз в разряд антропонозов, что с очевидностью усложняет проблему моделирования данной инфекции, но при этом делает ее более интересной.

То, что эрадикация Helicobacter pylori возможна, свидетельствует успешный опыт одного из авторов открытия бактерий Helicobacter pylori B.J. Marshall по самозаражению возбудителем и излечению приобретенного хеликтобактерного гастрита в результате двухнедельного курсового приема метронидазола и солей висмута. В последующем именно этот метод лег в основу современной эрадикации Helicobacter pylori. Как показывает опыт клиницистов, эрадикационная терапия представляет собой довольно трудную задачу, не всегда решаемую положительно. В то же время считается, что эрадикация возбудителя Helicobacter pylori, достигающая 80-90%, является отличным показателем. Данная терапия Helicobacter pylori-позитивным больным настоятельно рекомендуется при выявлении у них язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки в стадии обострения или ремиссии, включая осложнённую язвенную болезнь, MALT-лимфому, атрофический гастрит, состояния после резекции желудка по поводу рака, а также ближайшим родственникам больных раком желудка, естественно по желанию пациента и после подробной консультации с врачом. Такой довольно внушительный перечень показаний для проведения эрадикационной терапии естественно должен быть подкреплён наличием как эффективного терапевтического средства для её осуществления, так и соответствующей схемы его применения. В проведенных нами исследованиях теоретически и экспериментально обоснована возможность моделирования хеликобактериоза у конвенциональных белых мышей при пероральном введении возбудителя; были апробированы методические подходы к воспроизведению инфекции у экспериментальных животных при введении им бактерий маркированного штамма Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) на фоне внутримышечного введения животным синтетического глюкокортикоидного препарата Дексаметазон; разработана и апробирована селективная плотная питательная среда с рифампицином для выращивания бактериальных культур Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R), в том числе выделенных из организма экспериментальных животных (И.П. Погорельский, И.Ю. Чичерин, И.А. Лундовских, Д.Н. Смирнова, Н.В. Богачёва. Способ моделирования хеликобактериоза. Патент № 2690943. Российская Федерация, опубл. 07.06.2019. Бюл. № 16. Номер охранного документа МПК G09B 2328; Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Горшков А.С., Шабалина М.Р., Смирнова Д.Н., Богачёва Н.В. Экспериментальный хеликобактериоз у конвенциональных белых мышей при инфицировании возбудителем Helicobacter pylori // Инфекционные болезни. 2018; 16 (2): 77-85). Дополнительные данные о биологии возбудителя Helicobacter pylori и подтверждение результатов экспериментов на подопытных животных по моделированию у них хеликобактериоза получены в опытах самозаражения возбудителем Helicobacter pylori людей добровольцев (Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Шабалина М.Р., Колеватых Е.П., Козлов П.А., Корнаухов А.С. Оценка эрадикационной эффективности метапребиотика Стимбифид плюс при остром экспериментальном хеликобактериозе у лабораторных животных и людей-добровольцев // Инфекционные болезни. 2018; 16 (4): 62-74).

Известно антихеликобактерное средство и способ его применения (Чичерин И.Ю. Антихеликобактерное средство и способ его применения. Патент № 2713154 от 04.02.2020. Российская Федерация, опубл. 04.02.2020. Бюл. № 27. Номер охранного документа МПК А61К 31/702, А61К 31/733, А61Р 1/04), состоящее из пребиотического компонента в виде олигофруктозы и инулина и метабиотического компонента в виде лактата кальция в эффективной терапевтической дозе, обеспечивающей колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка и кишечника. Оптимальным соотношением лечебный эффект/доза обладает композиция, содержащая в 100 г смеси 55,1 г олигофруктозы, 23,7 г инулина и 21,2 г лактата кальция, в форме порошка, раствора или в таблетированной форме. Терапевтическая доза композиции при пероральном введении составляет для взрослых 1,5-3,0 г в сутки, для белых мышей при проведении экспериментальных исследований 10-20 мг в сутки. Приведенное антихеликобактерное средство и способ его применения является наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому способу и средству его осуществления.

Относительно колонизационной резистентности желудка и кишечника, которую поддерживает и/или восстанавливает антихеликобактерное средство, состоящее из пребиотического компонента в виде олигофруктозы и инулина и метабиотического компонента в виде лактата кальция, необходимо отметить следующее. Как колонизационная резистентность, так и нормальная микробиота вносят существенный вклад в защиту организма млекопитающих от возбудителей кишечных инфекций и в значительной степени определяют здоровье или болезнь всего организма. Для поддержания колонизационной резистентности желудка и кишечника, а также индивидуального состава микробиоценоза пищеварительного тракта предложено средство - лактат кальция (Чичерин И.Ю. Средство для восстановления кишечного микробиоцноза при дисбиозах. Патент № 2593584 от 10.08.2016. Российская Федерация, опубл. 10.08.2016. Бюл. № 22. МПК А61К 31/19, А61К 9/20, А61Р 1/00; Чичерин И.Ю. Антибактериальное средство и способ лечения кишечного иерсиниоза, или псевдотуберкулёза, или эшерихиоза. Патент № 2614730 от 28.03.2017. Российская Федерация, опубл. 28.03.2017. Бюл. № 10. МПК А61К 31/19, А61К 9/08, А61К 9/14, А61К 9/20, А61Р 31/04). Лактат кальция хорошо зарекомендовал себя как терапевтическое средство при острых кишечных инфекциях и как средство восстановления кишечного микробиоценоза; он входит в состав коммерческого препарата Стимбифид плюс.

Особо следует отметить, что в обоих случаях - и в экспериментах на конвенциональных белых мышах и в эксперименте самозаражения добровольцев при остром хеликобактериозе была успешно испытана терапевтическая эффективность метапребиотика Стимбифид плюс (изготовитель ООО «В-МИН», г. Сергиев Посад, Россия; в одной таблетке метапребиотика массой 500 мг содержится олигофруктозы 270 мг, инулина 116 мг, кальция лактат 19 мг). Показательными являются опыты на добровольцах: приём метапребиотика Стимбифид плюс привёл к полному удалению бактерий Helicobacter pylori из желудочно-кишечного тракта; бактерии хеликобактера не выделялись из фекалий добровольцев при контрольных исследованиях через две недели и через один месяц после окончания приёма метапребиотика Стимбифид плюс.

Достигнутый лечебный эффект при остром хеликобактериозе обусловлен следующим терапевтическими свойствами данного препарата:

- он не является классическим антибиотиком и к нему не вырабатываться устойчивость микроорганизмов;

- препарат обладает избирательным спектром действия - угнетает рост бактерий Helicobacter pylori и других возбудителей кишечных инфекций и в то же время стимулирует рост индигенной микробиоты;

- препарат характеризуется стабильной антагонистической активностью в отношении бактерий Helicobacter pylori в кислой среде желудка как подопытных животных, так и добровольцев;

- препарат способен проникать сквозь слой слизи, достигать мишени на поверхности бактерий-возбудителей кишечных инфекций и желудочного патогена Helicobacter pylori без утраты антимикробной активности, а также повышать колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка и содействовать её деконтаминации (очищения) от бактерий Helicobacter pylori.

Непосредственно в желудке метапребиотик Стимбифид плюс «запускает» два взаимосвязанных механизма рестрикции (т.е. ограничения) возбудителя Helicobacter pylori: прямого действия на бактерии и косвенного, связанного со стимуляцией размножения желудочной микробиоты, продуцирующей экзометаболиты, и восстановлением естественной колонизационной резистентности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Оба механизма действия метапребиотика Стимбифид плюс как на возбудителя Helicobacter pylori, так и на микробиоту и колонизационную резистентность слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, получили полное экспериментальное подтверждение.

Ввиду того, что в начале заболевания больные острым хеликобактериозом, как правило, к врачу не обращаются, то по отношению к ним, т.е при хроническом хеликобактериозе, протекающем в течение многих лет, для излечения может быть применён каждый из 16 эрадикационных протоколов, причём без гарантии на успех. Поэтому очень важными являются результаты оценки клинической эффективности метапребиотика Стимбифид плюс в эрадикации Helicobacter pylori у 30 больных хроническим гастритом, ассоциированным с персистированием хеликобактера, которые подтверждены клинико-лабораторными исследованиями, свидетельствующими о достижении эрадикации возбудителя у 80% пациентов (Минушкин О.В., Зверков И.В., Проценко О.А, Чичерин И.Ю, Погорельский И.П. Первый опыт использования метапребиотической терапии в эрадикации Helicobacter pylori // Кремлёвская медицина. Клинический вестник. 2019; 2: 36-38). Безусловно, это очень хороший результат. Однако мы считаем, что оставшиеся 20% пациентов с хроническим гастритом, ассоциированным с длительным персистированием хеликобактера, могут быть носителями сателлитного микроба Streptococcus gallolyticus - этиологического агента колоректального рака. Поэтому необходима полная эрадикация, которая может быть достигнута усилением воздействие на бактерии Helicobacter pylori путём добавления в схему лечения наиболее изученного в линейке наноструктурных препаратов уникального по своим характеристикам препарата Скай-форс, созданного в «НПФ»НаноТехПром», Россия (Тарасов М.Б.. Нанопрепараты для животноводства и птицеводства // Наноиндустрия. Научно - технический журнал. 2012; 4(34): 54 -56; Тарасов М.Б. Идентификация нанопрепаратов// Наноиндустрия. Научно - технический журнал. 2019; 7-8(93): 420-423; Глухова М.В., Погорельский И.П., Тарасов М.Б.. Оценка антибактериальной активности и токсичности нового наноструктурного препарата Скай-форс //Международный научный журнал «Символ науки». 2015; 4: 215-217; Романов В.Е., Тарасов М.Б., Погорельский И.П. Опыт практического использования наноструктурных препаратов в ветеринарии //Материалы Всероссийской научно-практической конференции 10-11 апреля 2014 г «Современные научно-практические достижения в ветеринарии». Киров: ВятГСХА. 2014; Вып.5: 87-89). Зарегистрировано научное открытие авторов М.Б. Тарасова, И.П. Погорельского, И.В Дармова, И.А Лундовских, И.Ю Чичерина, А.А Лещенко, К.А. Урванова под названием «Явление селективности воздействия наноструктурных химиотерапевтических препаратов с перестраиваемой наноструктурой и изменяемой топологией поверхности на возбудителей кишечных инфекций (Диплом № 502 // Научные открытия: сборник кратких описаний научных открытий, научных идей, научных гипотез - 2017/ Составитель В.В. Потоцкий - М.: РАЕН, 2018. 52 с.). Явление селективности воздействия наноструктурных химиотерапевтических препаратов заключается в том, что при локальном повышении температуры в очаге инфекции происходят изменения кристаллической наноструктуры и топологии поверхности препаратов, сопровождющиеся избирательным бактерицидным действием на микробные клетки возбудителей кишечных инфекций при одновременном стимулирующем воздействии на рост и размножение нормальной микробиоты желудка и кишечника, восстановление колонизационной резистентности и репарацию повреждений эпителия слизистой оболочки пищеварительного тракта.

Разнонаправленность действия наноструктурного препарата Скай-форс способствует:

- купированию развития хеликобактериоза за счёт бактерицидного эффекта в отношении бактерий Helicobacter pylori;

- деконтаминации поверхности слизистой оболочки желудка и кишечника от бактерий Helicobacter pylori;

- репарации локальных участков деструкции слизистой оболочки пищеварительного тракта;

- восстановлению колонизационной резистентности слизистой оболочки пищеварительного тракта;

- стимуляции размножения и полноценного функционирования собственной микробиоты желудка и кишечника, в том числе за счёт совместимости с метапребиотиком Стимбифид плюс;

- повышению эффективности других методов эрадикации бактерий Helicobacter pylori за счёт восстановления чувствительности рецепторного аппарата внутренней поверхности желудочно-кишечного тракта;

- профилактике побочных эффектов фармакотерапии, наблюдаемых, в частности, при использовании антибиотиков.

Особо следует отметить безвредность препарата Скай-форс: даже увеличение вводимой животным суточной дозы препарата в 10-15 раз никак не сказывается на их состоянии (Глухова М.В. Изучение токсичности химиотерапевтического средства для ветеринарии // Международный научный журнал «Символ науки». 2015. №4: 212-214).

Целью изобретения является разработка способа, позволяющего эффективно с помощью предлагаемого средства осуществлять полноценную эрадикацию бактерий Helicobacter pylori при экспериментальном хеликобактериозе у лабораторных животных.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании данного способа, заключается в том, что, во-первых, у лабораторных животных можно проследить, на какой стадии развития инфекционного процесса, вызванной бактериями Helicobacter pylori, происходит малигнизация (озлокачествление) хронической язвы желудка или толстой кишки под влиянием симбионтных микробов Helicobacter pylori и Streptococcus gallolyticus; во вторых, решение проблемы хронического течения хеликобактериоза и сопутствующей персистенции в тканях толстой и прямой кишки бактерий Streptococcus gallolyticus напрямую связывается с установлением длительности пребывания возбудителей в тканях желудочно-кишнчного тракта, а также с инструментальным доказательством терапевтической эффективности и полноты эрадикации Helicobacter pylori и Streptococcus gallolyticus после проведения эрадикационной терапии предлагаемым средством; в-третьих, не требуется составлять анамнез и проводить определение антибиотико-резистентности индивидуальных бактерий Helicobacter pylori, вызвавших инфекционное заболевание; в - четвёртых, нет необходимости в процессе лечения принимать ингибиторы протонной помпы или принимать их в повышенных дозах; в-пятых, исключается «гибридная» терапия на основе рекомендованных так называемых оптимизированных вариантов лечения больных; в-шестых, исключается в ходе лечения больных приём пробиотиков в качестве составной части адъювантной терапии при эрадикации возбудителя Helicobacter pylori; в-седьмых, исключаются побочные эффекты от антибиотиков, в частности, маролидов (неопасная диарея, связанная с прокинетическим эффектом этой группы антибиотиков).

Технический результат достигается тем, что способ эрадикации бактерий Helicobacter pylori при экспериментальном хеликобактериозе включает:

внутримышечное введение в течение пяти суток каждой конвенциональной белой мыши синтетического глюкокортикоидного препарата Дексаметазона в дозе 40 мкг в сутки,

с последующим через 24 часа пероральным введением белым мышам в течение четырех суток суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11Rif^R на изотоническом растворе хлорида натрия один раз в сутки в объёме 0,2 мл, содержащем 1×10⁵ микробных клеток, причем введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 Rif^R продолжают, ежедневно отбирая фекалии для определения количества бактерий хеликобактера, выводимых из организма белых мышей, путём высева фекалий на селективную геминсодержащую плотную питательную среду с рифампицином 150 мкг × мл^-1 в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37 ℃ в течение 24 - 48 часов в микроаэрофильных условиях,

с последующим через 24 часа после окончания перорального введения бактерий Helicobacter pylori КМ-11Rif^R введением на шестые сутки всем конвенциональным белым мышам 0,2 мл суспензии на дистиллированной воде смеси метапребиотика Стимбифид плюс и наноструктурного препарата Скай-форс, не переставая фиксировать в фекалиях белых мышей отсутствие жизнеспособных бактерий, подтверждающее бактериологическим методом полную эрадикацию возбудителя из организма животных.

При этом о колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка и кишечника судят по отсутствию дисбиотических изменений в составе кишечной микробиоты путём подсчёта общего количества микробиоты и отдельных её представителей в КОЕ/мл, выявленных на плотной питательной среде после инкубации посева фекалий конвенциональных белых мышей при температуре 37 ℃.

Средство для эрадикации бактерий Helicobacter pylori при экспериментальном хеликобактериозе содержит метапребиотик Стимбифид плюс и наноструктурный препарат Скай-форс в виде суспензии на дистиллированной воде объёмом 0,2 мл смеси матапребиотика Стимбифид плюс 4 мг и наноструктурного препарата Скай-форс 4 мг.

Таким образом, заявленное техническое решение достигается:

- формированием иммуносупрессивного состояния у лабораторных животных путем внутримышечного введения синтетического глюкокортикоидного препарата Дексаметазона;

- инициированием хеликобактериоза путем перорального введения лабораторным животным суспензии маркированного штамма бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) на фоне иммуносупрессивного эффекта от внутримышечного введения препарата Дексаметазона;

- проведением эрадикационной терапии путём перорального введения лабораторным животным с экспериментальным хеликобактериозом метапребиотика Стимбифид плюс и наноструктурного препарата Скай-форс.

Дексаметазон (производитель КRКА, Словения), согласно инструкции по применению, является мощным синтетическим глюкокортикоидным препаратом, содержащим гормоны коры надпочечников и их синтетические аналоги, который предназначен для регуляции белкового, углеводного и минерального обмена. Иммуносупрессивный эффект дексаметазона обусловлен вызываемой им инволюцией лимфоидной ткани, угнетением пролиферации лимфоцитов (особенно Т - лимфоцитов), подавлением миграции В - клеток и взаимодействия Т - и В - лимфоцитов, торможением миграции цитокинов (интерлейкина 1, интерлейкина 2, интерферона гамма) из лимфоцитов и макрофагов, снижением образования антител. Суточная доза вводимого белым мышам препарат с учетом переводного коэффициента составляет 40 мкг на одно животное.

Метапребиотик Стимбифид плюс (изготовитель ООО «В-МИН», г. Сергиев Посад, Россия; в одной таблетке метапребиотика массой 500 мг содержится олигофруктозы 270 мг, инулина 116 мг, кальция лактат 19 мг). Согласно инструкции по применению, в состав метапребиотика Стимбифид плюс входит узконаправленный пребиотический компонент - природные фруктоолигосахариды и фруктополисахариды с оптимизированным соотношением коротких (GFn, n=2-8) и длинных (GFn, n=2-60) цепочек, и метабиотический компонент - лактат кальция. Суточная доза вводимого белым мышам препарата с учетом переводного коэффициента составила 7,8-8,0 мг на одно животное.

Матричный наноструктурный препарат Скай-форс (создан в «НПФ» НаноТехПром», Россия) предназначен для лечения кишечных и респираторных заболеваний. В линейке наноструктурных препаратов представлены также препараты Эндосупер, Рифомаст и Пентациклин. Последний в качестве контроля использован в опытах in vitro для определения зон задержки роста бактерий Helicobacter pylori; препарат хорошо зарекомендовал себя при лечении респираторных и желудочно-кишечных заболеваний бактериальной и вирусной природы крупного рогатого скота, свиней и молодняка сельскохозяйственных животных.

Существенным показателем, характеризующим размножение бактерий Helicobacter pylori в желудке и его дальнейшее проникновение в кишечник, является выделение бактерий и их количественное определение в фекалиях животных. Важной особенностью заявляемого способа является использование маркированного по признаку устойчивости к антибиотику рифампицину штамма Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R), полученного авторами. Признак имеет хромосомную природу, является стабильным, обеспечивает возможность идентификации бактерий хеликобактера в фекалиях животных при их высеве на селективную плотную питательную среду с рифампицином (ЗАО «Брынцалов-А», Россия) в концентрации 150 мкг × мл^-1, на которой бактерии кишечной микрофлоры и другие бактерии не растут (Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский, И.П., Лундовских И.А., Янов С.Н. Способ оценки выживаемости бифидо- и лактобактерий в желудочно - кишечном тракте экспериментальных животных. Патент № 2528867. Российская Федерация, опубл. 20.09.2014. Бюл. № 26. Номер охранного документа МПК C12Q 1/04, МПК C12Q 1/06).

Для выращивания бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R), содержащихся в фекалиями животных, и их количественной оценки суспензию фекалий белых мышей высевают на селективную геминсодержащую плотную питательную среду со специальными добавками (дрожжевой экстракт, глюкоза, тиамина хлорид, кальция пантотенат, натрия сульфит, гемин, твин-80) и с рифампицином в концентрации 150 мкг х мл^-1. Выращивание бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) и микроорганизмов представителей кишечной микробиоты проводят при температуре 37°С на селективной плотной питательной среде в чашках Петри с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III-LE003 (HiMedia Laboratories Pvt. LTD, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными HiAnaero Gas Pacet.

Пример 1

С целю доказательства непосредственного воздействия наноструктурного препарата Скай-форс и метапребиотика Стимбифид плюс на бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) были поставлены опыты in vitro c использованием диско-диффузионного метода J.H. Jorgensen, J.D. Turnidge (Jorgensen J.H., Turnidge J.D. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. Manual of clinical microbiology. 9th-ed ASM Press Washington, 2007:1152-1172). В качестве контролей использовали матричный наноструктурный препарат Пентациклин и антибиотик Гентамицин. Концентрация препаратов Скай-форс и Пентациклина составляла 5,0 мг в 1 мл, метапребиотика Стимбифид плюс 5,8 мг в 1 мл, антибиотика Гентамицина 10 мкг в 1 мл.

Суть опытов состояла в установлении диаметра сформировавшихся вокруг бязевых тест- объектов, пропитанных растворами препаратов Скай-форс, Пентациклина, Стимбифд плюс, Гентамицина, зон ингибирования роста бактерий H.pylori КМ-11(Rif^R).

Выращивают культуру бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) в чашках Петри в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчёта 1,0×10⁸ микробных клеток в объёме 1,0 мл. Полученную бактериальную суспензию наносят на селективную плотную питательную среду с рифампицином в чашках Петри, дают впитаться бактериальной суспензии в толщу агаровой пластинки, после чего на подсушенную поверхность питательной среды с посевом тест-микробов выкладывают квадратики из бязи, пропитанные растворами препаратов Скай-форс, Пентациклина, Стимбифд плюс и Гентамицина. Чашки Петри с посевами микробов и квадратиками из бязи, пропитанными растворами препаратов, инкубируют при температуре 37° в микроаэрофильных условиях в течение 24 ч. После истечения времени инкубирования посевов бактерий определяют наличие и размер зон ингибирования роста бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R). На фигуре представлена фотография чашки Петри с посевом культуры бактерий хеликобактера и расположенными на газоне выросшей культуры бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) бязевых квадратиков, пропитанных растворами препаратов Скай-форс (1), Пентациклина (2), Гентамицина (3) и Стимбифд плюс (4). Как следует из представленной фигуры, вокруг бязевых квадратиков, пропитанных растворами наноструктурных препаратов Скай-форс (1) и Пентациклина (2), сформировались зоны ингибирования роста бактерий хеликобактера диаметром 16-17 мм и 15-16 мм соответственно; вокруг бязевого квадратика, пропитанного раствором антибиотика Гентамицина, сформировалась зона ингибирования роста бактерий хеликобактера диаметром 9-11 мм

метапребиотик Стимбифид плюс обусловил формирование зоны задержки бактериального роста диаметром 13-14 мм. Таким образом, можно говорить о том, что все четыре испытанных антибактериальных средства обладают антихеликобактерной активностью, которая позволяет считать препараты Скай-форс и Стимбифд плюс в качестве перспективных средств для эрадикации бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) для испытания на животных.

Пример 2

Выращивают культуру бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) на селективной плотной питательной среде с антибиотиком Гентамицином в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия их расчёта 1,0 х 10⁵ микробных клеток в объёме 0,2 мл.

Готовят раствор Дексаметазона из расчета 40 мкг в 0,1 мл дистиллированной воды на одно животное.

Берут необходимое количество прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18 - 20 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Для получения сведений об исходном состоянии кишечной микробиоты ежедневно отбирают от каждого животного фекалии, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг × мл^-1) в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч в микроаэрофильных условиях. С учетом массы фекалий, полученных от каждого животного, делают перерасчет числа бактерий на 1 г фекалий (КОЕ × г^-1).

Вводят 0,1 мл раствора Дексаметазона белым мышам внутримышечно в течение 5 дней.

Через 24 ч после внутримышечного введения раствора Дексаметазона животным вводят перорально один раз в сутки 0,2 мл суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) на изотоническом растворе хлорида натрия. Введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) продолжают в течение 4 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества хеликобактерий, выводимых из организма животных.

Обрабатывают полученные результаты высева фекалий на селективную плотную питательную среду с рифампицином, основываясь на количестве выросших колоний, и выносят суждение о приживаемости бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) в стенке желудка, о начале бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) с фекалиями животных, продолжительности бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R).

На основании полученных результатов сделан вывод о том, что в фекалиях животных хеликобактер появляется уже на 2 день после начала перорального введения белым мышам; на 4 день количество бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) достигает (9500-9800) КОЕ х г^-1, а на 10 сутки эксперимента, т.е. спустя 3 суток после прекращения введения бактерий хеликобактера, их численность достигает (1,3-1,5) х 10⁵ КОЕ х г^-1. В последующем количество бактерий постоянно снижается до значений (13-15) КОЕ х г^-1 на 21 день эксперимента, а с 22 суток эксперимента в фекалиях в ходе наблюдения в течение 2 недель бактериологическим методом удаётся выявить единичные бактерии Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R).

Пример 3

Выращивают культуру бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчёта 1,0×10⁵ микробных клеток в объёме 0,2 мл.

Готовят раствор Дексаметазона из расчета 40 мкг в 0,1 мл дистиллированной воды на одно животное.

Берут необходимое количество прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18 - 20 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Ежедневно отбирают от каждого животного фекалии, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг × мл^-1) в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч в микроаэрофильных условиях. С учетом массы фекалий от каждого животного делают перерасчет числа бактерий на 1 г фекалий (КОЕ × г^-1).

Вводят 0,1 мл раствора Дксаметазона белым мышам внутримышечно в течение 5 суток.

Через 24 ч после внутримышечного введения раствора Дексаметазона животным вводят перорально один раз в сутки 0,2 мл суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) на изотоническом растворе хлорида натрия. Введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) продолжают в течение 4 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества хеликобактерий, выводимых из организма животных.

Обрабатывают полученные результаты высева фекалий на селективную плотную питательную среду с рифампицином, основываясь на количестве выросших колоний, и выносят суждение о приживаемости бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) в стенке желудка, о начале бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) с фекалиями животных, продолжительности бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R).

Результаты определения количества бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) свидетельствуют о том, что в фекалиях животных единичные бактерии хеликобактера появляются на 2 день после начала перорального введения белым мышам; на 4 день количество бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) достигает 88000-89000 КОЕ×г^-1. На 6 день эксперимента, т.е через 24 ч после окончания введения бактерий хеликобактера, каждому из животных перорально вводят в виде суспензии на дистиллированной воде 7,8 мг метапребиотика Стимбифид плюс, не переставая определять в фекалиях животных количество жизнеспособных бактерий. Метапребиотикотерапия проводится в течение 7 суток и оказывает существенное влияние на эрадикацию хеликобактера в эксперименте. Так, уже на 4 день после начала введения животным метапребиотика Стимбифид плюс численность бактерий хеликобактера снизилась до 410-430 КОЕ×г^-1, к 6 дню до 114 КОЕ×г^-1, к 7 дню в фекалиях определялись единичные бактерии хеликобактера. Через 2 суток после прекращения введения животным метапребиотика Стимбифид плюс бактерии хеликобактера не выявлялись бактериологическим методом. И в последующем в течение двух недель наблюдения за животными выделения бактерий хеликобактера из фекалий не отмечалось, что является свидетельством излечения животных.

Пример 4

Выращивают культуру бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, исходя из расчёта 1×10⁵ микробных клеток в объёме 0,2 мл.

Готовят раствор Дексаметазона из расчета 40 мкг в 0,1 мл дистиллированной воды на одно животное.

Берут необходимое количество прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18 - 20 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Ежедневно отбирают от каждого животного фекалии, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг × мл^-1) в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч в микроаэрофильных условиях. С учетом массы фекалий от каждого животного делают перерасчет числа бактерий на 1 г фекалий (КОЕ × г^-1).

Вводят 0,1 мл раствора Дксаметазона белым мышам внутримышечно в течение 5 суток.

Ежедневно отбирают от каждого животного фекалии, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг × мл^-1) в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч в микроаэрофильных условиях. С учетом массы фекалий от каждого животного делают перерасчет числа бактерий на 1 г фекалий (КОЕ × г^-1).

Через 24 ч после внутримышечного введения раствора Дексаметазона животным вводят перорально один раз в сутки 0,2 мл суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) на изотоническом растворе хлорида натрия. Введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 (Rif^R) продолжают в течение 4 суток, ежедневно отбирая фекалии для определения количества бактерий хеликобактера, выводимых из организма животных.

Полученные результаты определения количества бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) свидетельствуют о том, что в фекалиях животных единичные бактерии хеликобактера появляются на 2 день после начала перорального введения белым мышам; на 4 день количество бактерий Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R) достигает 86000-88000 КОЕ×г^-1. На 6 день эксперимента, т.е. после окончания введения бактерий хеликобактера, каждому из животных, с учётом данных о синнергизме их антибактериального действия, перорально вводят в виде суспензии на дистиллированной воде смесь метапребиотика Стимбифид плюс (4 мг) и наноструктурного препарате Скай-форс (4 мг) в течение 7 суток, не переставая определять в фекалиях животных количество жизнеспособных бактерий.

Сочетанная эрадикационная терапия метапребиотиком Стимбифид плюс и наноструктурным препаратом Скай-форс оказалась достаточно эффективной при экспериментальном хеликобактериозе. Так, уже на 4 день после начала сочетанной терапии численность бактерий хеликобактера в фекалиях снизилась до 220-230 КОЕ×г^-1, к 6 дню выявлялись единичные бактери Helicobacter pylori КМ-11(Rif^R), а к 8 дню в фекалиях бактерии хеликобактера не выявлялись бактериологическим методом. В последующем в течение двух недель наблюдения за животными выделения бактерий хеликобактера из фекалий не отмечалось, что является ожидаемым свидетельством излечения животных.

Изобретение относится к микробиологии и касается способа эрадикации бактерий Helicobacter pylori при экспериментальном хеликобактериозе у конвенциональных белых мышей. Сущность способа заключается в том, что проводят внутримышечное введение в течение пяти суток каждой конвенциональной белой мыши синтетического глюкокортикоидного препарата Дексаметазона в дозе 40 мкг в сутки с последующим через 24 часа пероральным введением белым мышам в течение четырех суток суспензии бактерий H. pylori КМ-11Rif^R на изотоническом растворе хлорида натрия один раз в сутки. Введение суспензии бактерий H. pylori КМ-11 Rif^R продолжают, ежедневно отбирая фекалии для определения количества H.pylori, выводимых из организма белых мышей, путём высева фекалий на селективную геминсодержащую плотную питательную среду с рифампицином. Через 24 часа после окончания перорального введения H.pylori КМ-11Rif^R на шестые сутки всем конвенциональным белым мышам вводят средство, состоящее из 0,2 мл суспензии на дистиллированной воде смеси метапребиотика Стимбифид плюс и наноструктурного препарата Скай-форс. Отсутствие жизнеспособных бактерий в чашках Петри подтверждает полную эрадикацию возбудителя из организма животных. Использование способа позволяет осуществлять эрадикацию H. pylori при экспериментальном хеликобактериозе у лабораторных животных. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

1. Способ эрадикации бактерий Helicobacter pylori при экспериментальном хеликобактериозе у конвенциональных белых мышей, включающий внутримышечное введение в течение пяти суток каждой конвенциональной белой мыши синтетического глюкокортикоидного препарата Дексаметазона в дозе 40 мкг в сутки,

с последующим через 24 часа пероральным введением белым мышам в течение четырех суток суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11Rif^R на изотоническом растворе хлорида натрия один раз в сутки в объёме 0,2 мл, содержащем 1⋅10⁵ микробных клеток, причем введение суспензии бактерий Helicobacter pylori КМ-11 Rif^R продолжают, ежедневно отбирая фекалии для определения количества бактерий хеликобактера, выводимых из организма белых мышей, путём высева фекалий на селективную геминсодержащую плотную питательную среду с рифампицином 150 мкг⋅мл^-1 в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°C в течение 24-48 часов в микроаэрофильных условиях,

с последующим через 24 часа после окончания перорального введения бактерий Helicobacter pylori КМ-11Rif^R введением на шестые сутки всем конвенциональным белым мышам 0,2 мл суспензии на дистиллированной воде смеси метапребиотика Стимбифид плюс и наноструктурного препарата Скай-форс, не переставая фиксировать в фекалиях белых мышей отсутствие жизнеспособных бактерий, подтверждающее бактериологическим методом полную эрадикацию возбудителя из организма животных.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что о колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка и кишечника судят по отсутствию дисбиотических изменений в составе кишечной микробиоты путём подсчёта общего количества микробиоты и отдельных её представителей в КОЕ/мл, выявленных на плотной питательной среде после инкубации посева фекалий конвенциональных белых мышей при температуре 37 °C.

3. Средство для эрадикации бактерий Helicobacter pylori при экспериментальном хеликобактериозе по способу п. 1, содержащее метапребиотик Стимбифид плюс и наноструктурный препарат Скай-форс в виде суспензии на дистиллированной воде объёмом 0,2 мл смеси матапребиотика Стимбифид плюс 4 мг и наноструктурного препарата Скай-форс 4 мг.