Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и представляет собой лечебно-профилактический препарат на основе лактобактерий вида Lactobacillus acidophilus. Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая.
Препараты и продукты, содержащие в своем составе лактобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия, антибиотико- и химиотерапию.
За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе штаммов лактобактерий вида Lactobacillus acidophilus (патент США №3639666; патент Франции №2622452; патент Швейцарии №637297; патент ФРГ 2421066; патент Японии №05227946; Международная заявка (WO) №93/09793).
Однако препараты зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание, преимущественно, лечебно-профилактических средств и БАД в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные препараты имеют существенные недостатки, связанные с низкой лечебно-профилактической активностью.
Известен бактериально-ферментный препарат, включающий биомассу бифидобактерий 106-108 КОЕ и ферментный компонент лизоцим в количестве 5-20 мг в одной дозе (патент РФ №2071339, МПК А 61 К 35/74, опубл. 10.01.97 г.).
Известен бактериально-ферментный препарат, включающий бактериальный симбиоз Streptococcus lactis. Streptococcus cremoris и Streptococcus diacetylactis и продукты ферментативного гидролиза протиолитическим ферментом сывороточных белков (патент РФ №2084161, МПК А 23 С 9/12, опубл. 20.07.97 г.).
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является пробиотический препарат “Микростим”, содержащий жизнеспособные клетки штамма L.plantarum 8-РА-3 и их метаболиты (Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования. Международная научно-практическая конференция памяти Г.И.Гончаровой. Сборник материалов. М., 28-29 мая 2002, с.49). Однако вышеуказанные аналоги и прототип имеют недостаточный спектр антагонистической активности, в частности, в отношении патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих различные формы гастритов и язв желудка и двенадцатиперстной кишки.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание препарата, обладающего более широким спектром антагонистической активности, в частности, в отношении патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих различные формы гастритов и язв желудка и двенадцатиперстной кишки и значительно большим содержанием полезных веществ, необходимых для коррекции дисбактериозов и различных желудочно-кишечных заболеваний.
Указанный технический результат достигается тем, что бактериально-ферментный препарат, включающий биомассу живых пробиотических бактерий,согласно изобретению, препарат содержит биомассу бактерий штамма Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ", а в качестве источника клеточного детрита, внеклеточных и внутриклеточных метаболитов содержит биомассу бактерий штамма Lactobacillus N.V. Ер 317/402-Х “Баланс-Наринэ”, подвергнутую многократному замораживанию-оттаиванию или автолизу, при следующем содержании компонентов, мас.%:
биомасса бактерий
штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ер 317/402-Х
"Баланс-Наринэ" 1,0-99,0
биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х
"Баланс-Наринэ", подвергнутая многократному замораживанию-оттаиванию или автолизу остальное до 100%
Кроме того, препарат дополнительно содержит лизоцим в количестве 0,5-30,0 мг на 1 мл препарата и/или низин в количестве 0,001-0,1 мг на 1 мл препарата.
Штамм Lactobacillus acidophilus N.V. Ep 317/402-Х (авторское наименование "Баланс-Наринэ") получен селекцией исходной культуры Lactobacillus acidophilus N.V. Ep 317/402 "Наринэ" и направленного отбора по следующим показателям (заявка на патент РФ №2001125048, МПК С 12 N 1/20, приоритет 12.09.2001 г.):
- антагонистическая активность по отношению к микроорганизмам, вызывающим желудочно-кишечные заболевания, в частности, патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих различные формы гастритов и язв желудка и двеннадцатиперстной кишки;
- способность продуцировать полезные вещества (витамины, аминокислоты, антиоксиданты);
- устойчивость мембранных структур бактериальных клеток к внешним факторам (кислотность, температура и т.п), обеспечивающая сохранение высокого титра лактобактерий в процессе хранения.
Штамм Lactobacillus acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ" депонирован под №МЦКМ В-17 в Коллекции Межрегионального центра коррекции микроценоза человека (г.Новосибирск) и имеет следующие свойства, культурально-морфологические: неподвижные аспорогенные палочки 2-20×0,8-0,9 мкм, клетки расположены одиночно или в виде коротких цепочек, неподвижны, грамположительные спор и капсул не образуют. По Граму окрашиваются положительно. При окрашивании метиленовой синью в клетках наблюдаются четко выраженные метахроматические зерна. Гомоферментативные, микроаэрофилы. Колонии образуют клубки в виде перепутанных нитей. Физиологические: минимальная температура роста 20°С, оптимальная - +37-39°С. Штамм имеет повышенную протеолитическую, ароматообразующую, антагонистическую активность, синтезирует в молоке витамины, аминокислоты. Клетки бактерии не образуют индола и скатола, желатину не разжижают, энергично сбраживают лактозу. Штамм непатогенен и нетоксичен. Температурный диапазон роста штамма 20-48°С. Физиологический диапазон рН жизнедеятельности бактерий штамма - 3,8-6,5. Каталазоотрицательный. Разлагает глюкозу без образования газа. Логарифмическая фаза роста в сыворотке или молочной среде (обезжиренном молоке) заканчивается к 8-14 часам с образованием равномерного сгустка. Сбраживает: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, дульцит, галактозу. Не сбраживает - маннит, глицерин. Индол не образует. Штамм продуцирует значительное количество безвредных антибиотических веществ, подавляющих рост и развитие как грамположительных (St aureus), так и грамотрицательных (Е. соli) патогенных бактерий, в том числе всех без исключения бактерий-возбудителей дезинтерии и дезинтериоподобных заболеваний. Штамм высокочувствителен к антибиотикам:
бензилпенициллину, стрептомицину, эритромицину, карбипицилину, линкомицину, цифобиду, левомицитину, доксициклину, фуразолидону. Штамм слабочувствителен к антибиотикам: гентамицину, тетрациклину, олететрину, кефзолу, рифампицину, ампициллину, канамицину, нитроксалину, фузидину, клофорану, полимиксину, ампиоксу. Не чувствителен к антибиотикам: сульфодиметоксину, сульфадимезину, бисептолу, торавиду, сульфалену. Антагонистическая активность штамма, выраженная в миллиметрах, зон угнетения роста патогенных тест-штаммов Флекснера и штамма Зонне, протея, энтеропатогенной кишечной палочки, золотистого стафилококка составляет не менее 15 мм. Кроме того, штамм Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" устраняет прилипание бактерий Helicobacter pylori к стенкам желудочно-кишечного тракта.
В цельном молоке с содержанием СОМО 8-10% динамика роста и кислотообразования выглядит следующим образом. Среда культивирования: молоко коровье цельное, нормализованное или обезжиренное (обрат). Температура культивирования: 37-39°С. Время инкубации: 5-7 ч, в зависимости от температуры инкубации количество закваски, вносимой в молоко, 1,5-2%. Штамм Lactobacillus acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ" может быть использован в бактериальных заквасках, а также для приготовления лечебно-диетических продуктов. Селекция предлагаемого штамма проведена путем традиционного пассирования первоначального штамма 317/402 на молочно-сывороточной среде без внесения каких-либо искусственных химических веществ-мутагенов, а потому штамм не обладает потенциальной опасностью.
Клеточный детрит, внеклеточные и внутриклеточные метаболиты бактерий штамма Lactobacillus acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ" включают комплекс бактериальных ферментов, которые получают, например, путем многократного замораживания-оттаивания биомассы бактерий и обработки ультразвуком замороженных клеток бактерий. При этом освобождаются ферменты и другие внеклеточные и внутриклеточные метаболиты.
Лизоцим (мурамидаза) является ферментом класса гидролаз мол. массы 14-93 тыс. Дальтон, вызывает лизис многих грамположительных патогенных бактерий, растворяя их клеточные стенки. Лизоцим получают, например, из яичного белка путем его экстракции водой при рН 3,0-4,0 и содержании хлорида щелочного металла в реакционной среде 0,5-4,0 мас.% с одновременным нагреванием реакционной среды до 80-95°С и последующим отделением осадка балластных белков.
Фермент низин синтезируется молочно-кислыми бактериями Streptococcus lactis и представляет не индивидуальное вещество, а семейство близких по структуре и физико-химическим свойствам полипептидов. Низин проявляет активность в отношении многих грамотрицательных бактерий, в том числе Helicobacter pylori.
Ниже приведены примеры составов препарата.
Пример 1:
Биомасса бактерий
штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х
"Баланс-Наринэ" 10,0 мл
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ",
подвергнутая многократному
замораживанию-оттаиванию или автолизу, 990,0 мл
Пример 2:
Биомасса бактерий
штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х 500,0 мл
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ",
подвергнутая многократному
замораживанию-оттаиванию или автолизу, 500,0 мл
Пример 3:
Биомасса бактерий
штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х
"Баланс-Наринэ" 990,0 мл
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ",
подвергнутая многократному
замораживанию-оттаиванию или автолизу, 10,0 мл
Лизоцим 1000 мг
Низин 1 мг
Пример 4:
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-X
"Баланс-Наринэ" 100,0 мл
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ",
подвергнутая многократному
замораживанию-оттаиванию или автолизу,
"Баланс-Наринэ" 900,0 мл
Лизоцим 500,0 мг
Пример 5:
Биомасса бактерий
штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х
"Баланс-Наринэ" 500,0 мл
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ",
подвергнутая многократному
замораживанию-оттаиванию или автолизу, 500,0 мл
Лизоцим 30000 мг
Пример 6:
Биомасса бактерий
штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х
"Баланс-Наринэ" 900,0 мл
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х "Баланс-Наринэ",
подвергнутая многократному
замораживанию-оттаиванию или автолизу, 100,0 мл
Низин 1,0 мг
Пример 7:
Биомасса бактерий
штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ep 317/402-Х
"Баланс-Наринэ" 900,0 мл
Биомасса бактерий штамма Lactobacillus
acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ",
подвергнутая многократному
замораживанию-оттаиванию или автолизу, 100,0 мл
Низин 100,0 мг
Пример 8. Технология получения противогастритного и противоязвенного бактериально-ферментного препарата "Баланс-Наринэ-Ф"
Первый вариант. Закваска лактобактерий, приготовленная на основе штамма L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ", была использована для приготовления кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания. В качестве основы используют молоко, которое нормализуют по массовой доле жира. Затем молоко подвергают "глубокой" пастеризации при температуре (92±2)°С с выдержкой не менее 15 мин и охлаждают до температуры заквашивания +35°С. Сквашивают молоко в резервуарах для кисломолочных напитков с охлаждаемой рубашкой и снабженных специальными мешалками для равномерного перемешивания молочного сгустка. В молоко вносят производственную закваску на основе жидкой закваски лактобактерий (штамм L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ") в количестве (2-5)% от массы нормализованной смеси. Полученную смесь сквашивают при температуре (+38±1)°С в течение (4,0-5,0) ч. Окончание сквашивания определяют по образованию достаточно прочного сгустка и кислотности, которая должна быть не более 100°Т. По окончании сквашивания продукт охлаждают до температуры (+25-30)°С, подавая в межстенное пространство резервуара ледяную воду. Затем сгусток перемешивают (10-15) мин. Перемешанный сгусток сразу же подают на розлив, а затем доохлаждают до температуры (6±2)°С в холодильной камере.
Далее часть полученного продукта (биомассы бактерий) подвергают многократному замораживанию-оттаиванию и обрабатывают ультразвуком замороженных клеток бактерий. Из полученных компонентов приготавливают бактериально-ферментный препарат "Баланс-Наринэ-Ф" в соответствии с примерами 1 и 2.
Кроме того, в препарат дополнительно вводят лизоцим и/или низин в соответствии с примерами 3-7.
Второй вариант. Биомассу живых пробиотических бактерий получают так же, как в первом варианте. Далее часть живых пробиотических бактерий (до охлаждения) продолжают сквашивать при температуре (+38±1)°С в течение (14,0-16,0) ч. Окончание сквашивания определяют по образованию достаточно прочного сгустка и кислотности, которая должна быть не менее 180°Т. По окончании сквашивания продукт охлаждают до температуры (+25-30)°С, подавая в межстенное пространство резервуара ледяную воду. Затем сгусток перемешивают (10-15) мин. Перемешанный сгусток подают на розлив, а затем доохлаждают до температуры (6±2)°С в холодильной камере и выдерживают в течение времени (не менее 1 месяца), достаточного для приобретения кислотности 350°С и более. Из полученных компонентов приготавливают бактериально-ферментный препарат "Баланс-Наринэ-Ф" в соответствии с примерами 1 и 2.
Кроме того, в препарат дополнительно вводят лизоцим и/или низин в соответствии с примерами 3-7.
Пример 9. Исследование бактериально-ферментного препарата "Баланс-Наринэ-Ф" на антагонистическую активность
А. По отношению к патогенным бактериям Helicobacter pylori
Прилипание бактерий Helicobacter pylori к стенкам желудочно-кишечного тракта моделировалось на известной их способности прикрепляться к клеткам раковых клеток (аденокарциномы) кишечника, например, к монослою клеток НТ29. Для этого клетки НТ29 культивируют на обезжиренных стеклах при 37°С в минимальной модифицированной среде Дульбекко (ДМЕМ), содержащей 10% галактозы и диализованную телячью плазму в атмосфере 10% СО2 и 90% воздуха и используют до 2-го деления.
Бактерии Helicobacter pylori культивируют отдельно на пластинах Мюллера-Хиттона на 10%-ной овечьей крови в течение 72 часов при 37°С в атмосфере 5% О2, 10% СО2 и 85% азота. С пластинок соскребают и собирают бактерии и промывают в физрастворе. Клетки Helicobacter pylori наносят на монослой клеток НТ29 в количестве 106 кл/см2 и подвергают инкубации в течение 2 часов при 37°С с последующим отмыванием неприкрепившихся клеток. Количество клеток Helicobacter pylori, прикрепившихся к клеткам НТ29, определяют тестом на уреазу. Интенсивность реакции считывают со спектрофотометра на длине волны 550 нм.
В суспензию исследуемого бактериально-ферментного препарата "Наринэ-Ф" на основе штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" помещают пластинки с монослоями бактерий Helicobacter pylori, прилипших к клеткам НТ29, и инкубируют в течение 1 часа с последующим промыванием пластинок с монослоями и тестированием на уреазу. Заявляемый препарат способен снизить содержание прикрепленных клеток Helicobacter pylori к монослою клеток НТ29 с 106 кл/см2 (до обработки) до 10 кл/см2 (после обработки).
Это подтверждает, что заявляемый бактериально-ферментный препарат Наринэ-Ф" обладает повышенной антагонистической активностью в отношении патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих гастрит или язву желудка, и, таким образом, обладает противогастритным и противоязвенным свойствами.
Б. Антагонистическая активность заявляемого препарата была изучена методом in vitro при совместном выращивании с патогенными тест-штаммами по зоне задержке роста тест-микробов методом штриховых кодов (таблица 1).
Антагонистическая активность бактериально-ферментного препарата "Баланс-Наринэ-Ф" и его колонизационная активность наиболее полно была изучена in vivo на организменно-популяционной модели - лабораторных мышах в хроническом эксперименте.
- Исследования были проведены на племенных мышах обоего пола колонии ICR в течение 3 лет на 18 поколении рандомбринга в количестве 900 самок и 450 самцов.
- Препарат лактобактерий производился на основе штамма L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х "Баланс-Наринэ" на молочной среде с добавлением внутриклеточных и внеклеточных продуктов метаболизма и низина или лизоцима.
- Препарат лактобактерий применялся в дозе 0,1 мл на голову в сутки в течение 1 месяца ежедневно.
- Бактериологические исследования фекалиев мышей проводилось в соответствии с методическими указаниями “Дисбактериоз кишечника и методы его лабораторной диагностики”.
- Проводилось наблюдение за выживаемостью, весом мышей.
- На основании данных о числе желтых тел и мест имплантации живых и мертвых эмбрионов определяли пост- и преимплантационную смертность зародышей.
Результаты бактериологического исследования молодняка первого поколения, полученного от родителей, получавших жидкий препарат лактобактерий, показали, что произошло не только значительное снижение уровня патогенной и условно-патогенной микрофлоры, но и увеличение бифидо- и лактобактерий почти в равной степени с 105 до 108-109 микробных тел в 1 г фекалий (табл.2).
Бактериологические исследования фекалий племенного молодняка следующих поколений показали наличие сформировавшегося барьерного эффекта гастро-инстестинальной микрофлоры по отношению к таким патогенным микроорганизмам, как Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium digficile, грибы Candida, Proteus и др. Это является результатом колонизирующей способности кишечника мышей бактериально-ферментного препарата "Баланс-Наринэ-Ф". Более раннее становление микрофлоры новорожденных мышат через коррекцию микрофлоры родителей обеспечило хорошую защищенность организма и возможность противостоять инфекции извне.
Таким образом, экспериментальные исследования на животных, профилактика и лечение больных людей в условиях стационара и амбулаторно показывают, что заявляемый бактериально-ферментный препарат обладает высокой антагонистической активностью, противогастритными и противоязвенными свойствами и повышенным сроком сохранности при высоком титре, что позволяет использовать его как препарат для лечения гастритов и язв желудочно-кишечного тракта, иммунокоррекции организма; лечить дисбактериозы бактериального и вирусного происхождения, диспепсию и дезинтерию без применения антибиотиков.
Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и представляет собой лечебно-профилактический препарат на основе лактобактерий вида Lactobacillus acidophilus. Бактериальный пробиотический препарат содержит биомассу живых бактерий штамма Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х “Баланс-Наринэ” и в качестве источника клеточного детрита, внеклеточных и внутриклеточных метаболитов - биомассу бактерий штамма Lactobacillus acidophilus N.V. Ер 317/402-Х “Баланс-Наринэ”, подвергнутую многократному замораживанию-оттаиванию или автолизу, при следующем содержании компонентов, мас.%: биомасса живых бактерий штамма L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х “Баланс-Наринэ” 1,0-99,0, биомасса бактерий штамма L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х “Баланс-Наринэ”, подвергнутая многократному замораживанию-оттаиванию или автолизу в качестве источника клеточного детрита, внеклеточных и внутриклеточных метаболитов - остальное. Кроме того, препарат дополнительно содержит лизоцим в количестве 0,5-30,0 мг на 1 мл препарата и/или низин в количестве 0,001-0,1 мг на 1 мл препарата. Полученный препарат обладает широким спектром антагонистической активности, в частности, в отношении патогенных бактерий Helicobacter pylori, вызывающих различные формы гастритов и язв желудка и двенадцатиперстной кишки и высоким содержанием полезных веществ, необходимых для коррекции дисбактериозов и различных желудочно-кишечных заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Биомасса живых бактерий
штамма L. acidophilus
N.V. Ер 317/402-Х “Баланс-Наринэ” 1,0-99,0
Биомасса бактерий штамма
L. acidophilus N.V. Ер 317/402-Х
“Баланс-Наринэ”, подвергнутая
многократному замораживанию-
-оттаиванию или автолизу в качестве
источника клеточного детрита,
внеклеточных и внутриклеточных
метаболитов Остальное
| Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования | |||
| Международная научно-практическая конференция памяти Галины Ивановны Гончаровой | |||
| Сборник материалов | |||
| М., 28-29 мая, 2002, с.49 | |||
| ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS N.V.EP 317/402 "НАРИНЭ" ААА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ПРЕПАРАТОВ, ДИЕТИЧЕСКИХ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИСБАКТЕРИОЗА И ЕГО ПОСЛЕДСТВИЙ | 1999 |
|
RU2146454C1 |
| Устройство для образования шва в свежеуложенном бетонном дорожном или аэродромном покрытии | 1973 |
|
SU482530A1 |
| СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛЕРГИИ | 1996 |
|
RU2174012C2 |
