Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно – к фармакологии и фармации, и может быть использовано для получения лекарственных средств с противовоспалительным, иммуномодулирующим и ранозаживляющим свойствами на основе секретома культур клеток.
Известно использование глюкокортикостероидных гормональных препаратов с противовоспалительной и иммуносупрессивной целью. При этом глюкокортикоиды являются препаратами с очень широким спектром биологической активности. Они влияют на все виды обмена веществ: углеводный, белковый, жировой, водно-солевой; подавляют активность фосфолипаза А2, таким образом нарушая образование арахидоновой кислоты из фосфолипидов; подавляют экспрессию циклоксигеназы 2, нарушая образование простагландинов; подавляют деление и функциональную активность лимфоцитов, в первую очередь, Т-клеток; снижают продукцию множества цитокинов, особенно, активирующих клетки иммунной системы, и антител; стабилизируют мембраны клеток, снижая их секреторную и миграционную активность; повышают чувствительность рецепторов к катехоламинам, что приводит к повышению давления; модифицируют психические и поведенческие реакции, например, усиливают аппетит; подавляют деление клеток кожи при местном применении.
Столь широкий охват регулируемых процессов имеет и обратную сторону – не менее широкий спектр побочных эффектов и осложнений:
1) сахарный диабет;
2) ожирение;
3) атрофия мышц;
4) остеопороз и патологические переломы;
5) катаракта;
6) язвенное поражение слизистых оболочек желудка и 12-перстной кишки с кровотечениями;
7) артериальная гипертензия;
8) иммуносупрессия с развитием инфекционных осложнений;
9) обострение хронических инфекций, в т.ч туберкулеза;
10) атрофия кожи;
11) обострение психических заболеваний и ряд других менее тяжелых.
Таким образом, длительное применение высокоэффективных препаратов, содержащих глюкокортикоидные гормоны, при самооподдерживающемся воспалении (чаще всего – аутоиммунного генеза) невозможно из-за абсолютно неизбежного развития какого-либо осложнения, обусловленного их плейотропным действием (1, 2).
В этой связи ведется поиск альтернативных препаратов, обладающих сходной по выраженности противовоспалительной активностью, но с меньшим числом побочных эффектов. Было обнаружено, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки и их секретом обладают искомым набором свойств (10).
Прототипом является секретом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, которые культивируют на бессывороточной питательной среде в течение 24-96 часов. Жировая ткань является легко доступным источником ММСК, а их количество в ней и противовоспалительный потенциал выше, чем у костномозговых ММСК. Однако секретом нативных, ничем не индуцированных, ММСК жировой ткани обладает меньшей способностью к подавлению продукции провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-9, IL-17, IFN-γ), чем предлагаемая композиция (8, 9). При этом известные варианты стимуляции ММСК физическими факторами или химическими факторами отличаются от предлагаемых нами (3-7).
Технический результат – повышение противовоспалительной и иммуномодулирующей активности.
Технический результат достигается использованием композиции с противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью на основе секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, отличающейся тем, что содержит следующие белки, определяемые масс-спектрометрически в условных единицах “peptide ion abundance” (PIA), принятых за стандарт в этом методе исследования:
(ACTN4_HUMAN)
(MANBA_HUMAN)
(RCN3_HUMAN)
Целью изобретения является получение новой композиции биологического происхождения, содержащего комплекс гуморальных факторов ММСК, для создания на его основе лекарственных средств, а также разработка способа ее получения. Композиция должна обладать высокой противовоспалительныой, иммуномодулирующей активностью, сопоставимой с активностью глюкокортикостероидных гормонов и превышающей активность композиции, полученной из секретома нестимулированных ММСК.
Поставленная задача достигается использованием в качестве указанной композиции кондиционированной среды (супернатанта) от культуры ММСК, предварительно подвергнутых индукции глюкокортикоидными гормонами in vitro.
Изобретение осуществляется следующим образом.
ММСК получали из фрагментов жировой ткани или липоаспирата, полученных у добровольцев, подписавших информированное согласие на безвозмездное донорство жировой ткани во время оперативных вмешательств на животе.
Цельные образцы жировой ткани подвергали микродисссекции ножницами до фрагментов 1-2 мм, после чего инкубировали в течение 2 часов с 0,075% раствором коллагеназы 2 типа при 37°С на шейкере. Затем ферментированный образец центрифугировали при 450g 10 минут, удаляли надосадочную жидкость с остатками неферментированного жира, а клеточный осадок отмывали дважды фосфатно-солевым буфером (рН = 7,2-7,4).
Липоаспират предварительно центрифугировали при 400g 10 мин, жировую ткань переносили в пробирки 50 мл, куда добавляли 0,075% раствор коллагеназы и далее работали, как описано выше.
Полученный осадок клеток после отмывания ресуспендировали в среде α-МЕМ с 10% эмбриональной бычьей сыворотки, с добавлением антибиотиков и антимикотиков, помещали в культуральные флаконы для адгезивных культур. Выращивание вели во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С. Через 48 часов микроскопически контролировали прикрепление клеток к дну флаконов, удаляли среду с неприкрепившимися клетками, детритом, вносили свежую среду прежнего состава и продолжали культивирование в условиях СО2-инкубатора.
После получения культуры ММСК ее идентифицировали методом проточной цитометрии по составу поверхностных маркеров: CD31-CD34-CD45-CD73+CD90+CD105+, и по способности к дифференцировке не менее, чем в 2-х направлениях: остеогенном и адипогенном. Подтверждение типовых характеристик ММСК и получение секретома проводили параллельно или подвергали криоконсервации в 90% сыворотке крупного рогатого скота с добавлением 10% диметилсульфоксида, с хранением в парах жидкого азота при -190°С.
Для получения предлагаемой композиции клетки высаживали на культуральные флаконы в одну из питательных сред: α-MEM, DMEM/F12 или DMEM c добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров, с культивированием во влажной атмосфере 5-8% СО2 при 37°С. В случае посева криоконсервированных клеток, через сутки не прикрепившиеся клетки отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и добавляли свежую среду того же состава. Культивирование вели до достижения клетками 85-95% конфлюэнтности, после чего к среде добавляли дексаметазон или другой водорастворимый глюкокортикоид в конечной концентрации 10-6 – 10-4 моль/л. Клетки инкубировали во влажной атмосфере 5-8% СО2 при 37°С в течение 1-24 часов, достаточных для проникновения глюкокортикоида в ядро клеток и оказания им эффекта. После этого среду удаляли, клетки отмывали 1-2 раза раствором ФСБ, затем к клеткам добавляли ту же бессывороточную среду, на которой проводили предварительное культивирование (α-MEM, DMEM/F12 или DMEM). Культуральную посуду с клетками помещали во влажную атмосферу 5-8% СО2 при 37°С на 16-96 часов. После этого среду, кондиционированную ММСК, собирали, центрифугировали при 400g 10 минут для удаления остатков клеток. Надосадок для удаления солей и низкомолекулярных веществ подвергали ультрадиафильтрации через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа, в 10 кратном объеме бидистиллированной воды. Полученный концентрат подвергали высушиванию на роторном испарителе при температуре 37-40°С. Перед исследованием сухой остаток растворяли в ФСБ с нормализацией по содержанию общего белка 1 мг/мл.
Примеры. Полуколичественные отличия в составе секретома ММСК, индуцированных глюкокортикоидом, и необработанных ММСК представлены в таб. 1. Предлагаемая композиция отличается не менее, чем 4-кратным содержанием 24 белков.
Предлагаемая композиция сильнее подавляет продукцию провоспалительных цитокинов по сравнению с прототипом, представленным секретомом нативных ММСК: TNF-α до 17% от контроля против 45%, IL-1β до 42% от контроля против 53%, IL-9 до 28% от контроля против 50%, IL-17A до 20% от контроля против 62% (фиг.1).
Кроме того, предлагаемая композиция более выраженно подавляет продукцию цитокинов иммунного ответа Th2-типа, а именно IL-4 на 52% от контроля против 74% для прототипа, IL-5 на 45% от контроля против 68% для прототипа (фиг. 2). Указанные цитокины играют большую роль в развитии IgE-опосредованных аллергических реакций и эозинофильного воспаления.
Также предлагаемая композиция в отличие от прототипа тормозит пролиферацию донорских лимфоцитов в культуре при стимуляции их фитогемагглютинином на 38% по сравнению с контролем и на 48% по сравнению с прототипом по данным проточной цитометрии (фиг.3 и фиг. 5). В качестве меры измерения выбрана метрика разрешения, которую вычисляли по формуле, представленной на фиг. 4. В отличии от прямого сравнения медиан интенсивности сигнала, данный показатель не зависит от случайных выбросов.
Таб. 1. Отличия в белковом составе между предлагаемой композицией и прототипом.
(ACTN4_HUMAN)
(MANBA_HUMAN)
(RCN3_HUMAN)
На Фиг. 1 – продукция провоспалительных цитокинов донорскими мононуклеарами под влиянием дексаметазона 10-5 ммоль/мл, секретома нативных и индцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
На Фиг. 2 – продукция цитокинов Th2-ответа донорскими мононуклеарами под влиянием дексаметазона 10-5 ммоль/мл, секретома нативных и индцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
На Фиг. 3 – экспрессия маркера пролиферации Ki-67 донорскими мононуклеарами под влиянием дексаметазона 10-5 ммоль/мл, секретома нативных и индцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
На Фиг. 4 – формула расчета метрики разрешения Rd.
На Фиг. 5 – гистограммы экспрессии маркера Ki-67 донорскими мононукларами под влиянием дексаметазона 10-5 ммоль/мл, секретома нативных и индуцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
На всех фигурах знаком * обозначено достоверное отличие (p<0,05) влияния секретома индуцированных дексаметазоном ММСК от секретома нативных ММСК. Количество исследуемых пар образцов секретома 6, количество доноров мононуклеаров 6. Для статистической обработки использован дисперсионный анализ и критерий Ньюмена-Кейлса.
Поставленная задача достигается использованием в качестве указанной композиции секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека, полученного в результате их индукции глюкокортикоидными гормонами в концентрации 10-6 – 10-4 моль/л в течение 1-24 часов, с последующей отмывкой от индуктора и инкубацией в бессывороточной среде в течение 16-96 часов. Для очистки от низкомолекулярных соединений секретом подвергают ультрадиафильтрации в 10-кратном объеме бидистиллированной воды через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа.
Список литературы
1. Wiffen, P. Litt's Drug Eruptions & Reactions Manual. s.l. : CRC Press, 2016. p. 546.
2. Brunton L., Knollmann B., Hilal-Dandan R. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw-Hill Education, 13 ed. 2017. p. 1440.
3. Cui X., Wang H., Guo H., et al. Transplantation of mesenchymal stem cells preconditioned with diazoxide, a mitochondrial ATP-sensitive potassium channel opener, promotes repair of myocardial infarction in rats. Tohoku J Exp Med. 2010, Vol. 220, pp. 139–147.
4. Yao Y., Zhang F.,Wang L., et al. Lipopolysaccharide preconditioning enhances the efficacy of mesenchymal stem cells transplantation in a rat model of acute myocardial infarction. J Biomed Sci. 2009, Vol. 16, p. 74.
5. Li N., Yang Y.J., Qian H.Y., et al. Intravenous administration of atorvastatin-pretreated mesenchymal stem cells improves cardiac performance after acute myocardial infarction: role of CXCR(2013). Am J Trans Res. 2015, Vol. 7, pp. 1058–1070.
6. Kim Y.S., Ahn Y., Kwon J.S., et al. Priming of mesenchymal stem cells with oxytocin enhances the cardiac repair in ischemia/reperfusion injury. Cells Tissues Organs. 2012, Vol. 195, pp. 428–442.
7. Liu J., Zhu P., Song P., et al. Pretreatment of adipose derived stem cells with curcumin facilitates myocardial recovery via antiapoptosis and angiogenesis. Stem Cells Int. 2015, Vol. 2015, p. 638153.
8. Ferreira J.R., Teixeira G.Q., Santos S.G., et al. Mesenchymal Stromal Cell Secretome: Influencing Therapeutic Potential by Cellular Pre-conditioning. Front. Immunol. 2018, Vol. 9, p. 2837.
9. Kalinina, N., Kharlampieva, D., Loguinova, M. et al. Characterization of secretomes provides evidence for adipose-derived mesenchymal stromal cells subtypes. Stem Cell Res Ther. 2015, Vol. 6, 221.
10. Bassi E.J., Aita C.A.M., Camara N.O.S. Immune regulatory properties of multipotent mesenchymal stromal cells: Where do we stand? World J Stem Cells 2011 January 26; 3(1): 1-8.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Крем с секретомом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для коррекции псориазиформного воспаления в эксперименте | 2019 |
|
RU2704322C1 |
| Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи | 2022 |
|
RU2812015C1 |
| Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения | 2017 |
|
RU2659204C1 |
| Способ лечения фиброза печени аллогенной трансплантацией мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) лабораторных животных | 2022 |
|
RU2802673C1 |
| КУЛЬТУРА МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (Medulla ossium Bos taurus), ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ | 2011 |
|
RU2482183C1 |
| Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения | 2018 |
|
RU2710368C2 |
| Способ лечения хронического пародонтита с использованием мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани | 2022 |
|
RU2791194C1 |
| СПОСОБ УСКОРЕННОГО ФОРМИРОВАНИЯ КОСТНОЙ МОЗОЛИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ | 2009 |
|
RU2404242C1 |
| БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ТРАВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОСТНОЙ ТКАНИ ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ОБЛАСТИ | 2008 |
|
RU2380105C1 |
| СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ФОРМИРОВАНИЯ ФИБРОЗНО-ХРЯЩЕВОГО РЕГЕНЕРАТА КОСТНОЙ МОЗОЛИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ | 2011 |
|
RU2461621C1 |
Группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии, а именно к фармакологии и фармации, и может быть использована для получения лекарственных средств с противовоспалительным, иммуномодулирующим и ранозаживляющим свойствами на основе секретома культур клеток. Композиция с противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью на основе секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани состоит из заявленных белков. Для получения указанной композиции проводят индукцию секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток глюкокортикоидными гормонами в концентрации 10-6–10-4 моль/л в течение 1-24 часов, с последующей отмывкой от индуктора и инкубацией в бессывороточной среде в течение 16-96 часов. Для очистки от низкомолекулярных соединений секретом подвергают ультрадиафильтрации в 10-кратном объеме бидистиллированной воды через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа. Использование группы изобретений позволяет повысить противовоспалительную и иммуномодулирующую активность. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 1 пр.
1. Композиция с противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью на основе секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, состоящая из следующих белков:
(BGH3_HUMAN)
(ACTN4_HUMAN)
(MANBA_HUMAN)
(RCN3_HUMAN)
2. Способ получения композиции с противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью на основе секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, состоящей из следующих белков:
(ACTN4_HUMAN)
(MANBA_HUMAN)
(RCN3_HUMAN)
в ходе которого проводят индукцию секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток глюкокортикоидными гормонами в концентрации 10-6–10-4 моль/л в течение 1-24 часов, с последующей отмывкой от индуктора и инкубацией в бессывороточной среде в течение 16-96 часов; для очистки от низкомолекулярных соединений секретом подвергают ультрадиафильтрации в 10-кратном объеме бидистиллированной воды через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа.
| NORONHA NC et al | |||
| Primingng approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies | |||
| Stem Cell Research & Therapy, 2019, 10: 131 | |||
| US 2019046576 A1, 14.02.2019 | |||
| MELIEF SM et al | |||
| Adipose Tissue-Derived Multipotent Stromal Cells Have a Higher Immunomodulatory Capacity Than Their Bone Marrow-Derived Counterparts | |||
| Stem Cells |
