Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи Российский патент 2024 года по МПК C12N5/77 A61K35/28 A61P17/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и применяется как способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи.

Заживление глубоких повреждений кожи, возникающих при серьезных ранениях, зачастую происходит с нарушениями. В результате образуются рубцы или рана переходит из острой в хроническую, возможен летальный исход. Традиционные методы лечения преимущественно основываются на борьбе с инфекцией и поддержании благоприятной среды для заживления [1]. Клеточная терапия предоставляет дополнительные терапевтические возможности: стимулирует восстановление нормальной структуры кожи. Технология создана с целью разработки способа лечения, предотвращающего возникновение рубцов, хронической раны, а также для ускорения процессов заживления и сокращения сроков лечения пациента.

Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) являются самообновляющимися и доступными клеточными популяциями. Они могут быть выделены из широкого спектра источников, таких как красный костный мозг, жировая ткань и др. Ключевой терапевтический эффект ММСК обеспечивается их способностью секретировать широкий спектр цитокинов, факторов роста и хемокинов, которые модулируют функции клеток и способствуют восстановлению тканей [2]. Например, клетки секретируют фактор роста эндотелия сосудов (VEGFA), участвующий в процессе ангиогенеза и неоваскуляризации, трансформирующий фактор роста бета, регулирующий пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток, и др. ММСК также секретируют медиаторы иммуносупрессии, в частности, простагландин E2, который подавляет действие различных иммунных клеток [3].

Культивирование ММСК в виде сфероидов обеспечивает повышение секреторной активности клеток, а также увеличивает их жизнеспособность после инъекции [4]. Сохранение жизнеспособности и высокое содержание секретируемых белков в тканях после трансплантации способствует повышению лечебного эффекта клеточной терапии.

Согласно базе данных alliancerm.org на мировом рынке доступно 20 коммерческих продуктов для клеточной терапии, 8 из которых содержат ММСК: Stemirac (Nipro Corp, Япония), предназначен для лечения травмы спинного мозга; Neuronata-R (Corestem, Ю. Корея) для терапии бокового амиотрофического склероза; Cellgram-AMI (FCB Pharmicell, Ю. Корея) для лечения острого инфаркта миокарда; TEMCELL (JCR Pharmaceuticals SO LTD, Япония) для лечения диабета I типа, острого лучевого поражения и других заболеваний; Queencell и Cupistem (Anterogen, Ю. Корея) для лечения заболеваний соединительной ткани и восстановления поврежденных тканей суставов соответственно; Stempeucel (Stempeutics Research PVT, Индия) для лечения ишемии конечностей; Cartistem (Medipost, Южная Корея) для терапии дефектов коленного хряща.

Для лечения травм и дефектов кожи разработаны несколько способов применения мезенхимальных стволовых клеток в составе суспензий для внутрикожного введения [пат. 2271818, 2004; пат. 2526814, 2013; пат 2671642, 2018]. Все они подразумевают введение единичных клеток вокруг и внутрь ишемизированных тканей. Ключевой недостаток такого способа – гибель более 90 % клеток после трансплантации, что значительно снижает терапевтическую эффективность [5]. Существуют различные подходы для повышения эффективности лечения на основе ММСК. Одним из методов оптимизации является получение клеточных сфероидов. Культура сфероидов является многообещающим подходом, способствующим созданию динамических трехмерных сред, которые сохраняют межклеточное взаимодействие и межклеточных матрикс. Сфероиды мезенхимальных стволовых клеток демонстрируют повышенную противовоспалительную и ангиогенную активность, улучшенную выживаемость и замедленное репликативное старение [6-7].

На сегодняшний день применение сфероидов в первую очередь рассматривается для восстановления дефектов костной ткани [пат. 2721532, 2017; пат. 2747087, 2020; пат. 2744756, 2020; пат. 2744664, 2020].

Ключевое отличие заявляемого способа от аналогов: использование клеточных сфероидов ММСК для терапии травм и дефектов кожи. Кроме того, в данном изобретении предложено прекондиционирование (добавление в питательную среду во время культивирования сфероидов) клеток аскорбиновой кислотой, выполняющей роль антиоксиданта, что увеличивает секреторную активность клеток и повышает выживаемость клеток после трансплантации в ткани.

Ключевым сырьем является первичная клеточная культура ММСК. Получение первичной культуры осуществляется путем аспирации красного костного мозга или жировой ткани. ММСК должны быть отделены от других клеток путем культивирования на пластике с адгезивным покрытием на «нулевом» пассаже до достижения конфлюэнтности. Клетки должны отвечать требованиям, установленным Комитетом по мезенхимальным и стромальным стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии:

- клетки должны обладать адгезией к культуральному пластику in vitro;

- клеточная популяция экспрессирует специфические поверхностные маркеры CD105, CD90, CD73 (более 95 %) и не экспрессирует CD45, CD34 (допустима положительная экспрессия менее 2 %);

- клетки должны обладать способностью к дифференцировке в остеоциты, хондроциты и адипоциты.

Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи наглядным образом демонстрируются с помощью следующих иллюстраций:

Фиг. 1. Внешний вид ММСК мыши при культивировании в 2D, (А, монослой) и 3D (Б, сфероид), масштабная черточка – 200 мкм.

Фиг. 2. Содержание VEGFA (А) и PDGF AB+BB (Б) в лизатах клеток, культивируемых в монослое и в сфероидах без и с добавлением аскорбиновой кислоты, * p < 0,05.

Фиг. 3. Динамика стягивания раны после снятия повязки, * p < 0,05.

Фиг. 4. Содержание PDGF АВ+ВВ (А) и провоспалительного IL-1β (Б)

в лизатах тканей. * p < 0,05.

Для получения сфероидов ММСК для лечения повреждений кожи могут быть использованы клетки самого пациента (аутологичные), так и клетки донора (аллогенные).

1. Клетки культивируют в стандартной питательной среде, поддерживающей активную пролиферацию ММСК. Может быть использована культуральная среда αMEM, DMEM или DMEM/F12 (в соотношении 3 к 1 по объему). В качестве дополнительных компонентов могут быть использованы: фетальная бычья сыворотка, L-глутамин, заменимые аминокислоты, антибиотик (стрептомицин и пенициллин, гентамицин). Культивирование клеток может проводиться в нормоксических (5 % СО₂, 21 % О₂) или гипоксических (5 % СО₂, 2-7 % О₂) условиях. Все описанные варианты питательных сред и условия культивирования широко используются для культивирования ММСК из различных источников, поддерживают жизнеспособность и пролиферативную активность клеток [8, 9].

2. Для получения клеточных сфероидов культивируемые ММСК снимают с помощью раствора протеолитических ферментов с флакона согласно стандартной процедуре и переносят в агарозные подложки, помещенные в культуральную среду аналогичного состава (п.1). Как вариант осуществления изобретения, для получения сфероидов могут быть использованы 96-луночные планшеты с неадгезивной поверхностью. Также как и агарозные подложки, 96-луночные планшеты позволяют получить строго определенное количество сфероидов приблизительно одинаковых размеров.

Как вариант осуществления изобретения, в питательную среду может быть добавлена аскорбиновая кислота. Витамин С (аскорбиновая кислота) участвует в синтезе коллагена, а также обладает антиоксидантными свойствами [10]. При культивировании ММСК в монослое добавление аскорбиновой кислоты способствует увеличению пролиферации клеток, а также задерживает старение клеток [11, 12]. Ключевые свойства витамина С обуславливают его применения для заживления ран [13]. Добавление аскорбиновой кислоты способствует увеличению секреторной активности клеточных сфероидов (пример 1), а также значительно снижает воспалительные процессы, происходящие в ране (пример 2).

3. Культивирование клеток в агарозных подложках может быть осуществлено в течение от 12 часов до 4 суток. Для формирования клеточных сфероидов необходимо не менее 12 часов. Жизнеспособность 3D-структур (сохранение формы) сохраняется в течение 4 суток, при замене питательной среды 1 раз в 2 дня.

4. После формирования сфероидов их собирают вместе с питательной средой и центрифугируют на низких оборотах (не более 2000 об/мин). К осадку сфероидов добавляют фосфатно-буферный раствор из расчета от 20 до 500 сфероидов на 1 мл и ресуспендируют. Суспензию фосфатно-буферного раствора используют для инъекционного введения клеточных агрегатов по периметру раны. Для нанесения сфероидов непосредственно на рану к осадку сфероидов добавляют коллагеновый гель из расчета от 20 до 500 сфероидов на 1 мл.

Пример 1

С целью оценки секреторной активности были получены сфероиды ММСК жировой ткани (фиг. 1), культивируемые в стандартных условиях и с добавлением аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл). Полученные сфероиды были собраны и перенесены в лунки 12-луночного планшета из расчета 60-70 сфероидов на лунку. Параллельно в отдельные лунки высеяны клетки в максимальной плотности (контрольная группа). Через 8 часов, после адгезии клеток и сфероидов на дне лунки, проводилась замена питательной среды (для сфероидов, полученный при добавлении аскорбиновой кислоты, питательная среда также содержала аскорбиновую кислоту в той же концентрации). Время культивирования после замены среды составило 48 часов. После этого кондиционированная питательная среда была собрана, а клетки лизировали с помощью лизирующего буферного раствора в течение 20 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Количество белка в лизатах определяли с помощью набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Определение VEGFA (фиг. 2А) в кондиционированной питательной среде проводили с использованием метода интерферометрии слоя биомолекул по разработанной ранее методике [14]. Определение PDGF (фиг. 2Б) проводили методом иммунноблоттинга. Таким образом, секреция PDGF AB+BB и VEGFA при 3D-культивировании клеток увеличивается в 2 и 3 раза соответственно.

Пример 2

В качестве тест-системы использованы мыши линии Balb/c, самки в возрасте 5-6 месяцев. Животные были поделены на 5 групп (4 экспериментальные и 1 контрольная). Все процедуры проводили под общим наркозом в соответствии с требованиями по гуманному обращению с лабораторными животными.

Предварительно со спины животного удаляли шерсть. Травму наносили путем вырезания полнослойного лоскута кожи диаметром 1,5 см. Затем проводили инъекцию фосфатно-буферного раствора (контроль) или суспензии сфероидов ММСК (90-100 сфероидов) в объеме 200 мкл по периметру раны. Поверх травмы накладывали непроницаемую клеящуюся повязку. Через 2 суток повязку снимали, после удаления пленки место травмы фотографировали каждые 2-3 дня. Измерение площади раны по мере заживления проводили с помощью программы ImageJ v1.43. Установлено значительное уменьшение площади раны на раннем этапе в 3 из 4 экспериментальных групп по сравнению с контрольной (фиг. 3).

Гистологический анализ проводили по стандартной методике [15], срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Процесс заживления во всех препаратах охарактеризован как заживление под струпом. Плотной рубцовой ткани не сформировано ни в одном из образцов, воспалительный инфильтрат присутствует в слабой или умеренной степени.

Для оценки уровня факторов роста и цитокинов в тканях после инъекции сфероидов ММСК образцы тканей были механически гомогенизированы в лизирующем буферном растворе с последующим центрифугированием. Количество белка в лизатах определяли с помощью набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Определение IL-1β проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора Mouse IL-1 beta ELISA Kit (ab100705, Abcam, Великобритания), содержание PDGF AB+BB проводили методом иммуноблоттинга.

Установлено значительное увеличение PDGF AB+BB (фиг. 4А) в экспериментальной группе, получившей инъекцию сфероидов ММСК красного костного мозга, по сравнению с контрольной группой, а также отмечено достоверное снижение воспалительного цитокина IL-1β (фиг. 4Б) в тканях животных, получивших инъекцию выращенных в присутствии аскорбиновой кислоты сфероидов ММСК красного костного мозга, по сравнению с контрольными животными.

Для способа получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи необходимы мезенхимальные стволовые (стромальные) клетки красного костного мозга, которые культивируют в питательной среде. При достижении конфлюэнтности 80 % и более клетки снимают по стандартной процедуре, центрифугируют и переносят в агарозные подложки, препятствующие адгезии клеток. Клетки в агарозных подложках культивируют до получения сфероидов. Сфероиды собирают вместе с питательной средой и центрифугируют. Супернатант удаляют, осадок сфероидов аккуратно ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе из расчета от 20 до 150 сфероидов на 1 мл. Введение суспензии клеток осуществляют подкожно по периметру раны из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см². При этом возможно использование мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани. При этом возможно использование гипоксических условий культивирования – 37 ^оС, 5 % СО₂, от 2 до 7 % О₂ и относительная влажность 90-98 %. При этом вместо фосфатно-буферного раствора может быть использован коллагеновый гель, который наносят на поверхность раневого ложа из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см². При этом в питательную среду во время культивирования сфероидов может быть добавлена аскорбиновая кислота в концентрации от 10 до 100 мкг/мл.

Список использованной литературы

[1] Dash B. C. et al. Stem cells and engineered scaffolds for regenerative wound healing //Bioengineering. – 2018. – Т. 5. – №. 1. – С. 23.

[2] Song N., Scholtemeijer M., Shah K. Mesenchymal stem cell immunomodulation: mechanisms and therapeutic potential //Trends in Pharmacological Sciences. – 2020. – Т. 41. – №. 9. – С. 653-664.

[3] Han Y. et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine //Cells. – 2019. – Т. 8. – №. 8. – С. 886.

[4] Han H. W., Asano S., Hsu S. Cellular spheroids of mesenchymal stem cells and their perspectives in future healthcare //Applied Sciences. – 2019. – Т. 9. – №. 4. – С. 627.

[5] Bhang S. H. et al. Angiogenesis in ischemic tissue produced by spheroid grafting of human adipose-derived stromal cells //Biomaterials. – 2011. – Т. 32. – №. 11. – С. 2734-2747.

[6] Cesarz Z., Tamama K. Spheroid culture of mesenchymal stem cells // Stem cells international. – 2016. – Т. 2016.

[7] Bauman E. et al. Xeno-free pre-vascularized spheroids for therapeutic applications // Scientific reports. – 2018. – Т. 8. – №. 1. – С. 1-13.

[8] Both S. K. et al. A rapid and efficient method for expansion of human mesenchymal stem cells //Tissue engineering. – 2007. – Т. 13. – №. 1. – С. 3-9.

[9] Dhanasekaran M. et al. A comprehensive study on optimization of proliferation and differentiation potency of bone marrow derived mesenchymal stem cells under prolonged culture condition //Cytotechnology. – 2013. – Т. 65. – №. 2. – С. 187-197.

[10] DePhillipo N. N. et al. Efficacy of vitamin C supplementation on collagen synthesis and oxidative stress after musculoskeletal injuries: a systematic review //Orthopaedic journal of sports medicine. – 2018. – Т. 6. – №. 10. – С. 2325967118804544.

[11] Fujisawa K. et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells //Stem cell research & therapy. – 2018. – Т. 9. – №. 1. – С. 1-12.

[12] Yang M. et al. Ascorbic acid inhibits senescence in mesenchymal stem cells through ROS and AKT/mTOR signaling //Cytotechnology. – 2018. – Т. 70. – №. 5. – С. 1301-1313.

[13] Chokesuwattanaskul S. et al. High dose oral vitamin C and mesenchymal stem cells aid wound healing in a diabetic mouse model //Journal of Wound Care. – 2018. – Т. 27. – №. 5. – С. 334-339.

[14] Волкова М. В. и др. Адаптация метода интерферометрии слоя биомолекул для количественной оценки содержания фактора роста эндотелия сосудов в кондиционированной клеточной среде //Биофизика. – 2020. – Т. 65. – №. 6. – С. 1099-1106.

[15] Ham A. W. Histology. – JB Lippincott, 1953.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи. Способ предусматривает культивирование мезенхимальных стволовых клеток красного костного мозга в питательной среде до получения сфероидов. Изобретение эффективно для приготовления суспензии и ее введения подкожно по периметру раны из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см². 3 з.п. ф-лы, 2 пр.

1. Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи, который включает в себя культивирование мезенхимальных стволовых клеток красного костного мозга до конфлюэнтности 80% и более, затем клетки снимают по стандартной процедуре, центрифугируют и переносят в агарозные подложки, препятствующие адгезии клеток, далее клетки в агарозных подложках культивируют в питательной среде, содержащей аскорбиновую кислоту в концентрации от 10 до 100 мкг/мл, до получения сфероидов, сфероиды собирают вместе с питательной средой из агарозных подложек и центрифугируют, супернатант удаляют, а сфероиды ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе из расчета от 20 до 150 сфероидов на 1 мл и осуществляют введение суспензии подкожно по периметру раны из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см².

2. Способ получения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи по п.1, отличающийся тем, что используются мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани.

3. Способ получения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи по п.1, отличающийся тем, что возможно использование гипоксических условий культивирования – 37°С, 5% СО₂, от 2 до 7% О₂ и относительная влажность 90-98%.

4. Способ применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи по п.1, отличающийся тем, что вместо фосфатно-буферного раствора используют коллагеновый гель, который наносят на поверхность раневого ложа из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см².