СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано в пищевой промышленности для видовой идентификации рыб семейства тресковых (Gadidae) в пищевых продуктах и продовольственном сырье.

Cуществуют стандарты, регламентирующие видовую идентификацию рыб, в том числе семейства тресковых способами электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [ГОСТ Р 54414-2011 Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2013.], изоэлектрофокусировки [ГОСТ Р 52840-2007 Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2008.] и секвенирования [ГОСТ 34106-2017 Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции. Москва, Стандартинформ, 2017.].

Однако, эти способы по сравнению с ПЦР в режиме реального времени более трудоемки и времязатратны, требуют наличия у персонала специальных навыков, более сложного оборудования и наличия стандартных образцов для каждого вида рыб.

Известен подход к видовой идентификации тресковых рыб [Namikoshi, A., Takashima, Y., Iguchi, J., Yanagimoto, T., &Yamashita, M. (2011). Species identification of Alaska pollock, Gadus spp., and Micromesistius spp. in cod roe products using a PCR-based method.FisheriesScience, 77(4), 671-678.], основанный на детекции видоспецифической ДНК методом ПЦР. Тест-системы, описанные в этой научной работе, в качестве метода регистрации результата используют гель-электрофорез, что существенно усложняет анализ и увеличивает время, необходимое для его проведения.

Технической задачей настоящего изобретения является идентификация рыб семейства тресковых с помощью обнаружения специфических ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени».

Способ основан на выявлении специфических участков генапантофизина, NADH-дегидрогеназы, АТФазы 6 и родопсина с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов. Разработанные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности:

Последовательность (5'-3') Размер ампликона, п.н. Ген-мишень №№ в базе данных
GenBank Треска тихоокеанская (Gadus macrocephalus)
F: ATGTGTCAGATTATACCAGTTAATTC
R: GTTGGTTAAATTGTATAACAAGGA
Pr: FAM-TCTGGGCGTGACCTCAACACTA-BHQ1 169 NADH-дегидрогеназа EU729423.1 Треска атлантическая (Gadus morhua)
F: CAATGTTAATGTTTCTCCTACTTT
R: TGACGAAGTGTAGTTGCCAA
Pr: ROX-CAGCATCCTTACCAAGTCCCTACC-BHQ2 108 пантофизин AF288943.1 Минтай (Gadus chalcogrammus)
F: GCAATGTTAATGTTTCTCCTACT
R: AGTTAGTTGCCAATAAGGAAAG
Pr: FAM-CAGCATTCTTACACAGTCCCTACCT-BHQ1 101 пантофизин AY292495.1 Пикша (Melanogrammus aeglefinus)
F: AATTTAGGCTTAGCTGTTCC
R: GAATTAGAGCTGTAGGGGTG
Pr: ROX-TAGCAACTGTTCTTATTGGAATACGAA-BHQ2 115 АТФаза 6 DQ010963.1 Путассу (Micromesisteus poutassou)
F: ACTCTCCTGGTTGATTGATATT
R: CTATACAGGTGTTGGAAGCC
Pr: FAM-CTTGTTTCTTAGATTGATGCAGCATT-BHQ1 240 пантофизин AY292496.1 Сайда (Pollachius virens)
F: GTTTGTGCTATCATACCCATC
R: GGACTTTGTAAGAATGCTGC
Pr: ROX-CTCCTAAATCGTGGCTGGTTGA-BHQ2 138 пантофизин AY292491.1 Мерланг (Merlangius merlangus)
F: TACACCCGCGCTGAGG
R: GTAGATGGACGAGGACTTGG
Pr: FAM-AGATGGGACCGAAGACGCTG-BHQ1 330 родопсин EU492056.1

Для проведения ПЦР используют геномную ДНК рыб. Для выделения ДНК используют готовые наборы реактивов, предназначенные для работы с пищевыми продуктами и продовольственным сырьем. Выделение ДНК осуществляют из кусочков филе рыб или образца продукта питания, не имевших контакта с внешней средой (с целью избежать возможной исходной контаминации чужеродной ДНК) в соответствии с протоколом (инструкцией по применению), рекомендованным производителем.

Оценку чистоты полученных препаратов ДНК производят спектрофотометрическим методом с помощью спектрофотометра, позволяющего измерять оптическую плотность при длинах волн 260 и 280 нм. Для анализа используют препараты ДНК с соотношением оптической плотности при длинах волн 260 нм и 280 нм (A260/A280) в пределах 1,8-2,0. Полученные препараты ДНК хранят в морозильной камере при −20°С до использования.

Для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени» используют амплификатор нуклеиновых кислот, позволяющий осуществлять термоциклирование и одновременную регистрацию флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» в формате микропробирок, микрочипов или микропланшетов.

Разработанный состав смеси для ПЦР и концентрации отдельных компонентов представлены в таблице.

Компонент Концентрация Объем, мкл Конечная концентрация в реакции (25 мкл) Смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) 2,5 ммоль/ дм³ каждого дНТФ 2,5 250 мкмоль/дм³ Прямой праймер 5 пмоль/см³ 2 0,4 пмоль/ см³ Обратный праймер 5 пмоль/ см³ 2 0,4 пмоль/ см³ ДНК-зонд 2,5 пмоль/ см³ 2 0,2 пмоль/ см³ ПЦР-буфер c MgCl₂ 10x 2,5 1x Термостабильная ДНК-полимераза (Taq) с горячим стартом 5 Е/мкл 0,5 2,5 Е/реакция Вода деионизованная - 4,5 - ДНК исследуемого образца - 9 - (36% конечного объема реакции)

Объем реакции может быть масштабирован в соответствии с типом используемого оборудования (амплификатора нуклеиновых кислот).

Для корректной работы тест-систем используется следующая программа термоциклирования:

Первичная денатурация - 120с при 94°С с последующим циклированием: денатурация - 5с при 94°С, отжиг праймеров и элонгация - 30с при 60°С (45 циклов). Регистрация сигнала осуществляется после прохождения этапа отжига праймеров и элонгации.

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривойфлуоресценции с установленной пороговой линией (Threshold) и значения порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора, следующим образом:

1. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30.

2. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно выполняются следующие условия:

- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышают 30;

- в пробирках/реакторах с тест-системами для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30.

3. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышает 30.

4. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если выполняется хотя бы одно из следующих условий:

- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышают 30;

- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и сайды (Pollachius virens);

- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и путассу (Micromesisteus poutassou).

Разработанный способ видовой идентификации тресковых рыб по сравнению с существующими методами обладает следующими преимуществами:

- возможность идентификации основных промысловых видов тресковых рыб;

- идентификация всех заявленных видов тресковых рыб в рамках одного анализа за счет оптимизированных последовательностей специфических олигонуклеотидов и унифицированной программы термоциклирования;

- ускоренное по сравнению с существующими способами получение результата анализа.

--->

Перечень последовательностей

<110> Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит"

<120> СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР

В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

<140> 2020133599

<141> 13.10.2020

<160> 21

<210> 1

<211> 26

<212>ДНК

<213>Gadus macrocephalus

<400> 1

atgtgtcagattataccagttaattc

<210>2

<211> 24

<212>ДНК

<213>Gadus macrocephalus

<400> 2

gttggttaaattgtataacaagga

<210>3

<211> 22

<212>ДНК

<213>Gadus macrocephalus

<400>3

tctgggcgtgacctcaacacta

<210> 4

<211> 24

<212>ДНК

<213>Gadus morhua

<400> 4

caatgttaatgtttctcctacttt

<210>5

<211> 20

<212>ДНК

<213>Gadus morhua

<400> 5

tgacgaagtgtagttgccaa

<210>6

<211> 24

<212>ДНК

<213>Gadus morhua

<400> 6

cagcatccttaccaagtccctacc

<210> 7

<211> 23

<212>ДНК

<213>Gadus chalcogrammus

<400> 7

gcaatgttaatgtttctcctact

<210>8

<211> 22

<212>ДНК

<213>Gadus chalcogrammus

<400> 8

agttagttgccaataaggaaag

<210> 9

<211> 25

<212>ДНК

<213>Gadus chalcogrammus

<400> 9

cagcattcttacacagtccctacct

<210> 10

<211> 20

<212>ДНК

<213>Melanogrammus aeglefinus

<400>10

aatttaggcttagctgttcc

<210>11

<211> 20

<212>ДНК

<213>Melanogrammus aeglefinus

<400>11

gaattagagctgtaggggtg

<210>12

<211> 27

<212>ДНК

<213>Melanogrammus aeglefinus

<400>12

tagcaactgttcttattggaatacgaa

<210>13

<211> 22

<212>ДНК

<213>Micromesisteus poutassou

<400>13

actctcctggttgattgatatt

<210>14

<211> 20

<212>ДНК

<213>Micromesisteus poutassou

<400>14

ctatacaggtgttggaagcc

<210>15

<211> 26

<212>ДНК

<213>Micromesisteus poutassou

<400> 15

cttgtttcttagattgatgcagcatt

<210>16

<211> 21

<212>ДНК

<213>Pollachius virens

<400> 16

gtttgtgctatcatacccatc

<210>17

<211> 20

<212>ДНК

<213>Pollachius virens

<400> 17

ggactttgtaagaatgctgc

<210>18

<211> 22

<212>ДНК

<213>Pollachius virens

<400> 18

ctcctaaatcgtggctggttga

<210>19

<211> 16

<212>ДНК

<213>Merlangius merlangus

<400>19

tacacccgcgctgagg

<210>20

<211> 20

<212>ДНК

<213>Merlangius merlangus

<400>20

gtagatggacgaggacttgg

<210>21

<211> 20

<212>ДНК

<213>Merlangius merlangus

<400>21

agatgggaccgaagacgctg

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано в пищевой промышленности для видовой идентификации рыб семейства тресковых (Gadidae) в пищевых продуктах и продовольственном сырье. Выделяют ДНК из проб тканей рыб или из образца пищевого продукта (продовольственного сырья). Проводят анализ методом полимерной цепной реакции в режиме реального времени для выявления специфических последовательностей ДНК рыб с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов, установленных для каждого вида рыб. Готовят смесь для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР. Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией Threshold и значением порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышает 30. Для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30 в пробирках/реакторах с тест-системами. Предлагаемый способ позволяет провести идентификацию всех видов тресковых рыб в рамках одного анализа и получить результат анализа быстрее по сравнению с существующими методами. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ видовой идентификации рыб семейства тресковых, заключающийся в выделении ДНК из проб тканей рыб, образца продукта питания или продовольственного сырья, последующем анализе методом полимерной цепной реакции в режиме реального времени для выявления специфических последовательностей ДНК рыб, с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов, установленных для каждого вида рыб, так для трески атлантической прямой праймер CAATGTTAATGTTTCTCCTACTTT, обратный праймер TGACGAAGTGTAGTTGCCAA, зонд ROX-CAGCATCCTTACCAAGTCCCTACC-BHQ2, для трески тихоокеанской прямой праймер ATGTGTCAGATTATACCAGTTAATTC, обратный праймер GTTGGTTAAATTGTATAACAAGGA, зонд FAM-TCTGGGCGTGACCTCAACACTA-BHQ1, для пикши прямой праймер AATTTAGGCTTAGCTGTTC, обратный праймер GAATTAGAGCTGTAGGGGTG, зонд ROX-TAGCAACTGTTCTTATTGGAATACGAA-BHQ2, для минтая прямой праймер GCAATGTTAATGTTTCTCCTACT, обратный праймер AGTTAGTTGCCAATAAGGAAAG, зонд FAM-CAGCATTCTTACACAGTCCCTACCT-BHQ1, для сайды прямой праймер GTTTGTGCTATCATACCCATC, обратный праймер GGACTTTGTAAGAATGCTGC, зонд ROX-CTCCTAAATCGTGGCTGGTTGA-BHQ2, для путассу прямой праймер ACTCTCCTGGTTGATTGATATT, обратный праймер CTATACAGGTGTTGGAAGCC, зонд FAM-CTTGTTTCTTAGATTGATGCAGCATT-BHQ1, для мерланга прямой праймер TACACCCGCGCTGAGG, обратный праймер GTAGATGGACGAGGACTTGG, зонд FAM-AGATGGGACCGAAGACGCTG-BHQ1, готовят смесь для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР и осуществляют термоциклирование с первичной денатурацией – 120 с при 94°С с последующим циклированием: денатурация – 5 с при 94°С, отжиг праймеров и элонгация – 30 с при 60°С (45 циклов), регистрацию сигнала осуществляют после прохождения этапа отжига праймеров и элонгации, результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией Threshold и значением порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь для проведения ПЦР содержит следующие компоненты в конечных концентрациях: смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) – 250 мкмоль/дм³ каждого дНТФ; прямой праймер – 0,4 пмоль/см³; обратный праймер – 0,4 пмоль/см³; ДНК-зонд – 0,2 пмоль/см³; ПЦР-буфер c MgCl₂ – 1x; термостабильная ДНК-полимераза (Taq) с «горячим стартом» - 0,1 E/мкл и образец ДНК 36% от общего объема смеси.