Тест-система идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к идентификации видовой принадлежности тканей рыб.

Известен набор реагентов для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР, который содержит следующие компоненты в конечных концентрациях: смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) - 250 мкмоль/дм³ каждого дНТФ; прямой праймер - 0,4 пмоль/см³; обратный праймер - 0,4 пмоль/см³; ДНК-зонд - 0,2 пмоль/см³; ПЦР-буфер с MgCl₂ - 1х; термостабильная ДНК-полимераза (Taq) с «горячим стартом» - 0,1 Е/мкл и образец ДНК 36% от общего объема смеси. Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией Threshold и значением порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышает 30. Для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30 в пробирках/реакторах с тест-системами. Предлагаемый набор реагентов позволяет провести идентификацию всех видов тресковых рыб в рамках одного анализа и получить результат анализа быстрее по сравнению с существующими методами (патент РФ №2748058, кл. C12Q 1/68, 2021 г.).

Наиболее близким по технической сущности является техническое решение (патент РФ №2680094, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019 г.) включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер

Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности идентифицировать ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей, повышение точности идентификации видовой принадлежности тканей рыб.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер

Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1, согласно изобретению для положительного контрольного образца используют фрагмент генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) со следующей нуклеотидной последовательностью:

Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер

Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер

Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд.

Новизна заявляемой тест-системы заключается в идентификации видовой принадлежности ткани рыб, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, с использованием набора реагентов, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в сырых рыбных продуктах (частях туши, икре, полуфабрикатах и т.д.), в рыбных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке, а также в мясокостной рыбной муке и кормах.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемая тест-система рекомендована для использования в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических и сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Тест-система для идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке в кормах, реализуется следующим образом.

Для исследования наличия ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в сырых рыбных продуктах (частях туши, икре, полуфабрикатах и т.д.), в рыбных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке, а также в мясокостной рыбной муке и кормах проводят полимеразную цепную реакцию с помощью набора реагентов, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus)n фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидными последовательностями:

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер

Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд,

Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер

Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер

Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд.

ПЦР проводят с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Для повышения точности идентификации ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) для внутреннего контрольного образца используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1.

Использование бактериофага Т4 со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование бактериофага Т4 повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани рыб в продуктах, а также улучшает качество процесса идентификации.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.

Праймеры, специфичные японской скумбрии (Scomber japonicus) были отобраны на основе митохондриальной последовательности ДНК генома японской скумбрии (Scomber japonicus) ген цитохромоксидаза III (Scomber japonicus mitochondrial ATPase6, COIII genes for ATPase subunit 6, cytochrome oxidase subunit III, partial cds, haplotype: SjaATCOH9, GenBank: AB361466.1 участок между 25 и 179). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации были подобраны олигонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды Sj-Z (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Sj-F и Sj-R). Зонд был помечен красителем HEX (JOE/Yellow). Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей:

Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT праймер

Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG праймер

Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 зонд, не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG

Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного применения тест-системы для идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах.

Для подтверждения эффективности тест-системы были использованы сырые рыбные продукты (части туши, икра, полуфабрикаты и т.д.), рыбные продукты, подвергшихся кулинарной обработке, а также мясокостная рыбная мука и корма.

От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.

Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.

Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-СКУМБРИЯ-1-ФАКТОР». Рабочее название набора реагентов - «СКУМБРИЯ-1», который используют для выявления ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus). Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-СКУМБРИЯ-1-ФАКТОР» для определения ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-252-51062356-2021, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.

Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

Исследования состоит из трех этапов:

• экстракция нуклеиновая кислота (НК);

• проведение реакции ПЦР РВ;

• учет результатов анализа.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани японской скумбрии, в качестве которого, используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл.

Следующий этап, это подготовка образцов к проведению ПЦР.

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) СКУМБРИЯ - 1, ВКО СКУМБРИЯ - 1 и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани японской скумбрии и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1.

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ СКУМБРИЯ-1;

10 мкл ПЦР БУФЕР СКУМБРИЯ-1;

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.

Интерпретация результатов анализа

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.

В образце обнаружена ДНК ткани японской скумбрии, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).

Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным.

Образец считается отрицательным (ДНК ткани японской скумбрии не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red - менее 35.

Для исследуемых образцов (сухой корм и рыбные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани японской скумбрии представлен в таблице 5.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Описана тест-система для идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах. Тест-система включает буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер; T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер; Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятые в соотношении 1:1. При этом согласно изобретению для положительного контрольного образца используют фрагмент генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) со следующей нуклеотидной последовательностью: Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT - праймер; Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG - праймер; Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 - зонд. Изобретение расширяет функциональные возможности, повышающие точность идентификации видовой принадлежности тканей рыб. 5 табл., 1 пр.

Тест-система для идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер,

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер,

Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд,

взятые в соотношении 1:1,

отличающаяся тем, что для положительного контрольного образца используют фрагмент генома ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) со следующей нуклеотидной последовательностью:

Sj-F ATAGCCCTCGCCCTAACTCT - праймер,

Sj-R AGGGCTCATTTGTGTCCAGG - праймер,

Sj-Z R6G ATCAGCGGAGGGTAGGTGTA BHQ1 - зонд.