СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСИЛООЛИГОСАХАРИДА Российский патент 2021 года по МПК C12N9/42 C12P19/14 C13K13/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001]

Настоящее изобретение относится к способу получения ксилоолигосахаридов из биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002]

Ксилоолигосахарид представляет собой общий термин для олигосахаридов, образованных с помощью β-гликозидных связей из множества звеньев ксилозы. Ксилоолигосахариды также используют в качестве материала для функциональной пищи, по причине, например, их превосходной функции регулирования кишечника (непатентный документ 1).

[0003]

Ксилоолигосахариды можно получать через гидролиз ксилана, содержащегося в биомассе, содержащей ксилан и целлюлозу. Известные способы гидролиза включают гидротермальный способ обработки (непатентный документ 2), способ кислотного гидролиза (непатентный документ 3) и ферментативный способ обработки с использованием ксиланазы (патентный документ 1).

[0004]

Среди них, гидролиз ксилана с использованием ксиланазы допускает избирательное получение ксилоолигосахаридов, что делает возможным эффективное получение ксилоолигосахаридов. Однако ксилан, субстрат ксиланазы, является основным компонентом гемицеллюлозы, и гемицеллюлоза в клетках растения образует структуру более высокого порядка с целлюлозой и лигнином. Таким образом, чтобы эффективно разрушать ксилан с помощью ксиланазы, необходимы другие процессы гидролиза структуры более высокого порядка.

[0005]

Поскольку ксиланаза является одним из ферментативных компонентов в целлюлазной композиции, продуцируемой микроорганизмом, способ получения ферментов с ксиланазой имеет проблему в виде стоимости производства ферментов, содержащих ксиланазу в качестве основного компонента.

[0006]

В непатентном документе 4 раскрыт способ получения ксилоолигосахаридов посредством гидролиза биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, без отделения и очистки ксиланазы от целлюлазной композиции. Поскольку целлюлазная композиция содержит различные разрушающие ферменты, реакцию гидролиза ксилана до ксилоолигосахаридов можно осуществлять одновременно с разрушением структур более высокого порядка, содержащихся в биомассе, содержащей ксилан и целлюлозу, или гидролизом гемицеллюлозы до ксилана.

ИСТОЧНИКИ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

[0007]

Патентный документ 1: JP 2006-296224 A

НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

[0008]

Непатентный документ 1: Ayyappan AA et al., Compre. Rev. Food. Sci. Food Saf. 10, 2-16 (2011)

Непатентный документ 2: Patricia M et al., Ind. Crops. Prod. 62, 460-465 (2014)

Непатентный документ 3: Ozlem A et al., Carbohydr. Res. 344, 660-666 (2009)

Непатентный документ 4: Kumar R et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35, 377-391 (2008)

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009]

Как описано выше, способ ферментативного получения ксилоолигосахаридов с использованием ксиланазы имеет проблемы в виде сложности процесса и стоимости ксиланазы. Также, способ, описанный в непатентном документе 4, несмотря на простоту процесса и возможное снижение стоимости очистки фермента, имеет проблему в отношении того, что получаемые ксилоолигосахариды разрушаются до ксилозы посредством гидролазы, содержащейся в целлюлазной композиции, что ведет к низкому выходу ксилоолигосахаридов.

СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

[0010]

Авторы настоящего изобретения проводили интенсивные исследования для того, чтобы решить вышеуказанные проблемы и, следовательно, обнаружили, что гидролиз предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, с использованием целлюлазной композиции, имеющей по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы, и по существу не имеющей активность β-ксилозидазы во время гидролиза, направленного на биомассу, содержащую ксилан и целлюлозу, делает возможными одновременные реакции гидролиза от гемицеллюлозы до ксилана и от ксилана до ксилоолигосахаридов, а также ингибирование реакции гидролиза от ксилоолигосахаридов до ксилозы, что делает возможным эффективное получение ксилоолигосахаридов, тем самым выполнив настоящее изобретение.

[0011]

Соответственно, настоящее изобретение предусматривает следующие пункты с 1 до 11.

(1) Способ получения ксилоолигосахаридов, способ включает гидролиз биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, с использованием целлюлазной композиции,

в котором целлюлазная композиция имеет по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы и по существу не имеет активности β-ксилозидазы, направленной на биомассу, во время гидролиза.

(2) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с (1), в котором целлюлазная композиция содержит ферментативные активные компоненты, получаемые посредством существенной инактивации активностей β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, направленных на биомассу, посредством инкубации целлюлазной смеси, происходящей из гриба, относящегося к роду Trichoderma, которая имеет по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, направленные на биомассу.

(3) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с (2), в котором инкубация представляет собой процесс инкубации целлюлазной смеси, происходящей из гриба, относящегося к роду Trichoderma, pH которой корректируют до 5,5-8,0 при 35-60°C.

(4) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с любым одним из (1)-(3), в котором компонент, имеющий активность β-глюкозидазы в целлюлазной композиции, содержит компонент, имеющий активность β-глюкозидазы, происходящую из гриба, относящегося к роду Aspergillus.

(5) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с любым одним из (1)-(4), в котором активность β-ксилозидазы в целлюлазной композиции в отношении ферментативной активности для разрушения 4-нитрофенил-β-D-ксилопиранозида составляет 50-500 Ед/г белков в целлюлазной композиции.

(6) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с любым одним из (1)-(5), в котором активность β-глюкозидазы в целлюлазной композиции в отношении активности для разрушения 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида составляет по меньшей мере 14000 Ед/г белков в целлюлазной композиции.

(7) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с любым одним из (1)-(6), в котором значение pH во время гидролиза составляет 6,0-8,0.

(8) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с любым одним из (1)-(7), который включает гидролиз продукта, получаемого посредством предварительной обработки биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, с использованием щелочи.

(9) Способ получения ксилоолигосахаридов в соответствии с любым одним из (1)-(8), дополнительно включающий стадии: разделения гидролизата, получаемого посредством реакции гидролиза, на твердые и жидкие продукты; фильтрования получаемого жидкого продукта через ультрафильтр; извлечения целлюлазной композиции со стороны не проникшего и получения ксилоолигосахаридов со стороны проникшего.

(10) Целлюлазная композиция, имеющая следующие ферментативные активности (a)-(d):

(a) активность ксиланазы в отношении ферментативной активности для разрушения ксилана по меньшей мере 14000 Ед/г белков в целлюлазной композиции;

(b) активность целлобиогидролазы в отношении ферментативной активности для разрушения 4-нитрофенил-β-D-лактопиранозида по меньшей мере 50 Ед/г белков в целлюлазной композиции;

(c) активность β-глюкозидазы в отношении ферментативной активности для разрушения 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида по меньшей мере 14000 Ед/г белков в целлюлазной композиции; и

(d) активность β-ксилозидазы в отношении ферментативной активности для разрушения 4-нитрофенил-β-D-ксилопиранозида 50-500 Ед/г белков в целлюлазной композиции.

(11) Целлюлазная композиция в соответствии с (10), в которой компонент, имеющий активность β-глюкозидазы в вышеуказанном (c), содержит компонент, имеющий активность β-глюкозидазы, происходящую из гриба, относящегося к роду Aspergillus.

ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012]

Настоящее изобретение делает возможным удобное и эффективное получение ксилоолигосахаридов из предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0013]

Биомасса, содержащая ксилан и целлюлозу, которую используют в настоящем изобретении, происходит из растительной биомассы, содержащей по меньшей мере ксилан и целлюлозу, которые являются сырьем для ксилоолигосахаридов.

[0014]

Ксилан является элементом гемицеллюлоз, которые встречаются в клеточных стенках растений, и представляет собой гетеросахарид, в котором различные сахара связаны с основной цепью, состоящей из звеньев ксилозы, связанных β-гликозидными связями. Целлюлозы и гемицеллюлозы образуют клеточные стенки растений через формирование структур более высокого порядка через водородные связи или химические связи. Целлюлозы, которые являются основным компонентом клеточных стенок, имеют структуру, в которой звенья глюкозы соединены линейно с помощью β-гликозидных связей.

[0015]

Биомасса, содержащая ксилан и целлюлозу, не ограничена до тех пор, пока она является ресурсом, содержащим ксилан и целлюлозу, и можно использовать растения, такие как семенные растения, папортникообразные, моховидные, водоросли и водные растения, а также материалы строительных отходов. Семенные растения делятся на голосемянных и покрытосемянных, предпочтительно можно использовать и те и другие. Покрытосемянные дополнительно делятся на однодольные и двудольные. Конкретные примеры однодольных включают багассу, просо прутьевидное, слоновую траву, Erianthus, кукурузную солому, сердцевину кукурузного початка, стебли риса и стебли пшеницы. Конкретные примеры используемых двудольных предпочтительно включают свекловичный жом, эвкалипт, дуб и березу белую. Предпочтительной биомассой в настоящем изобретении являются багасса, сердцевина кукурузного початка, кукурузная солома, стебли риса и солома, и наиболее предпочтительной является багасса, с точки зрения превосходного свойства разрушения ксилана и целлюлозы. Эти биомассы можно использовать индивидуально или две или больше из них можно использовать в комбинации.

[0016]

Содержание ксилана в биомассе, содержащей ксилан и целлюлозу, предпочтительно составляет по меньшей мере 5% по массе, более предпочтительно по меньшей мере 10% по массе, еще более предпочтительно по меньшей мере 20% по массе, на основании твердой массы биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу. Обычно, содержание ксилана в биомассе, содержащей ксилан и целлюлозу, составляет 50% по массе или меньше.

[0017]

Способ предварительной обработки, используемый в настоящем изобретении, не ограничен, и можно использовать, в частности, известные способы, такие как кислотная обработка, обработка серной кислотой, обработка разведенной серной кислотой, щелочная обработка, гидротермическая обработка, докритическая обработка, обработка мелким помолом и паровая обработка. Способ предварительной обработки предпочтительно представляет собой щелочную обработку или гидротермическую обработку с небольшим разрушением ксилана при предварительной обработке и наиболее предпочтительно щелочную обработку.

[0018]

При щелочной обработке можно использовать гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция или аммиак. Гидроксид натрия предпочтителен с точки зрения того, что он является недорогостоящим и простым в обращении. Что касается условий щелочной обработки, концентрацию твердых веществ биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, в состоянии смеси с раствором щелочи задают в диапазоне от 0,1 до 50% по массе, предпочтительно от 1 до 20% по массе, более предпочтительно от 5 до 10% по массе. Когда концентрация твердых веществ биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, составляет меньше чем 1% по массе, количество используемой воды чрезвычайно велико, что ведет к экономическому недостатку. С другой стороны, когда концентрация твердых веществ биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, превышает 20% по массе, щелочной раствор не пропитывается через биомассу, содержащую ксилан и целлюлозу, что ведет к недостаточному эффекту предварительной обработки. Что касается количества добавляемой щелочи, например, когда используют водный раствор гидроксида натрия, количество добавляемого гидроксида натрия находится в диапазоне от 0,1 до 100% по массе, предпочтительно от 1 до 50% по массе, более предпочтительно от 5 до 10% по массе, на основании содержания твердых веществ биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу.

[0019]

Концентрацию твердых веществ биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, можно корректировать на основании массы твердых веществ. Массу твердых веществ можно вычислять в соответствии со следующим способом.

[0020]

Массу твердых веществ биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, можно вычислять в соответствии со следующим способом. Взвешивают A граммов биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, и осуществляют нагрев при 105°C до тех пор, пока не достигают постоянной массы в B граммов. Здесь B/A представляет фракцию твердых веществ биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, и массу твердых веществ определяют как значение, вычисляемое посредством умножения массы влажной биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, на B/A. Массу твердых веществ предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, также можно определять аналогичным образом.

[0021]

Когда количество добавляемой щелочи составляет меньше чем 1% по массе, гидролиз с помощью целлюлазной композиции протекает с трудом и достаточного выхода ксилоолигосахаридов не достигают. С другой стороны, когда добавляемое количество превышает 50% по массе, в дополнение к тому факту, что количество щелочи велико, это ведет к увеличению количества кислоты, используемой для корректировки pH во время реакции гидролиза с использованием целлюлазной композиции, что экономически неблагоприятно. Температура во время щелочной обработки предпочтительно составляет от 10 до 200°C, более предпочтительно от 25 до 120°C, особенно предпочтительно от 75 до 100°C, с точки зрения выхода сахаров при гидролизе. Длительность периода времени щелочной обработки можно надлежащим образом задавать, например, в соответствии с количеством щелочи, и обычно оно составляет приблизительно от 0,5 до 24 часов.

[0022]

Предварительно обработанную биомассу, содержащую ксилан и целлюлозу, можно использовать непосредственно для реакции гидролиза с использованием целлюлазной композиции по данному изобретению или можно подвергать разделению твердого вещества и жидкости перед реакцией гидролиза. Твердый продукт, получаемый посредством разделения твердого вещества и жидкости, можно использовать в качестве предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу. В качестве способов разделения твердого вещества и жидкости можно использовать известные способы, в том числе центрифугирование, такое как шнековый декантатор, фильтрование, такое как фильтрование под давлением или с подсосом, и мембранное фильтрование, такое как микрофильтрование. Кроме того, твердый продукт в предварительно обработанном продукте биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, можно промывать чистой водой до и после разделения твердого вещества и жидкости. Это промывание предпочтительно, поскольку оно позволяет дополнительно снижать ингибиторы ферментативных реакций, такие как продукты разложения лигнина, и также позволяет снижать количество кислоты, необходимой для корректировки pH во время реакции гидролиза.

[0023]

В настоящем изобретении, термин «ксилоолигосахариды» относится к олигосахаридам, имеющим структуру, в которой от 2 до 6 звеньев ксилозы связаны ковалентно, где звенья ксилозы связаны через β-гликозидную связь. Ксилоолигосахариды обозначают как ксилобиозу (дисахарид), ксилотриозу (трисахарид), ксилотетраозу (тетрасахарид), ксилопентаозу (пентасахарид) или ксилогексаозу (гексасахарид), в зависимости от числа звеньев ксилозы.

[0024]

Целлюлазная композиция представляет собой смесь различных гидролаз, которые гидролизуют гликозидные связи в β-1,4-глюканах. Примеры гидролаз, входящих в целлюлазную композицию, включают целлобиогидролазу, ксиланазу, эндоглюканазу, β-глюкозидазу, β-ксилозидазу, арабинофуранозидазу, ксиланэстеразу, эстеразу феруловой кислоты, α-глюкуронидазу, хитозаназу, хитиназу, маннаназу, маннозидазу, α-галактозидазу и β-галактозидазу.

[0025]

Целлюлазная композиция, используемая в настоящем изобретении (далее в настоящем описании обозначаемая как «целлюлазная композиция по настоящему изобретению»), может представлять собой любую из тех, которые имеют по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы, и по существу не имеют активность β-ксилозидазы во время гидролиза, направленного на биомассу, содержащую ксилан и целлюлозу, и источники активностей не ограничены. Целлюлазную композицию по настоящему изобретению можно получать посредством смешивания очищенных ферментов, коммерчески доступных целлюлазных продуктов или коммерчески доступных продуктов. Также можно использовать культуру, получаемую посредством культивирования микроорганизмов, как она есть в качестве целлюлазной композиции. Альтернативно в настоящем изобретении можно использовать смесь ферментов, очищенных от культуры, и другие коммерчески доступные ферментативные продукты.

[0026]

Когда целлюлазную композицию, происходящую из микроорганизма, используют в качестве целлюлазной композиции по настоящему изобретению, в качестве микроорганизма предпочтительно можно использовать гриб. Примеры гриба включают микроорганизмы, относящиеся к родам Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Chlostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor или Talaromyces. Среди этих грибов предпочтительны те, которые относятся к родам Trichoderma и Aspergillus.

[0027]

Конкретные примеры грибов, относящихся к роду Trichoderma, включают Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei RutC-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80, и Trichoderma viride QM9123. Среди этих грибов, относящихся к роду Trichoderma, предпочтителен Trichoderma reesei. Кроме того, предпочтительно можно использовать мутантные штаммы с усовершенствованной производительностью целлюлазной композиции или со сниженной активностью β-ксилозидазы, получаемые посредством введения мутаций в описанные выше грибы, продуцирующие целлюлазную композицию, с использованием мутагена, облучения ультрафиолетом или тому подобного.

[0028]

Конкретные примеры грибов, относящихся к роду Aspergillus, включают Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus aculeatus и Aspergillus terreus.

[0029]

Целлюлазная композиция, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой целлюлазную композицию, происходящую от одного из грибов, описанных выше, или смесь целлюлазных композиций, происходящих от двух или больше грибов. При использовании целлюлазной композиции, происходящей от двух или больше грибов, комбинация не ограничена и, например, можно использовать смесь целлюлазной композиции, происходящей от гриба, относящегося к роду Trichoderma, и целлюлазной композиции, происходящей от гриба, относящегося к роду Aspergillus. Конкретные примеры β-глюкозидазы, происходящей от гриба, относящегося к роду Aspergillus, включают Novozyme 188 (Novozymes), β-глюкозидазу из Aspergillus niger (Megazyme) и Sumizyme BGA (Shinnihon Chemicals). Предпочтительно, компонент, имеющий активность β-глюкозидазы, содержит компонент, имеющий активность β-глюкозидазы, происходящей от гриба, относящегося к роду Aspergillus, который описан выше.

[0030]

В отличие от ферментов, целлюлазная композиция по настоящему изобретению может содержать контаминанты, такие как соли и сахара, и средства для усиления сохраняемости фермента, корректировки pH или усиления активности. Также можно использовать клеточный гомогенат или культуру гриба, который продуцирует целлюлазную композицию, а также ферментативно сырье, получаемое посредством удаления солей, сахаров и т. п. из клеточного гомогената или культуры.

[0031]

Гидролиз биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, с использованием целлюлазной композиции по настоящему изобретению может предоставлять гидролизат, содержащий ксилоолигосахариды и глюкозу в качестве основных компонентов. Термин «содержащий в качестве основного компонента», как используют в настоящем описании, обозначает, что, когда гидролизат содержит ксилоолигосахариды, глюкозу и ксилозу, % концентрация (масс./об.) ксилоолигосахаридов выше % концентрации (масс./об.) ксилозы. С другой стороны, гидролиз биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, с использованием целлюлазной композиции, имеющей активности ксиланазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, предоставляет гидролизат, содержащий ксилозу и глюкозу в качестве основных компонентов.

[0032]

Активность β-ксилозидазы измеряют в виде ферментативной активности разрушения 4-нитрофенил-β-D-ксилопиранозида. Количество фермента, которое создает 1 мкмоль 4-нитрофенола в минуту определяют как 1 Ед. Ферментативную активность определяют в соответствии с процедурами, описанными далее в эталонном примере 5.

[0033]

Предпочтительно целлюлазная композиция по настоящему изобретению по существу не проявляет активность β-ксилозидазы во время гидролиза биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу. Активность β-ксилозидазы на 1 г белков в целлюлазной композиции предпочтительно составляет 500 Ед/г или меньше, более предпочтительно 400 Ед/г или меньше, наиболее предпочтительно 300 Ед/г или меньше. Здесь содержание белков в целлюлазной композиции по настоящему изобретению измеряют с использованием способа Брэдфорда. Способ определения содержания белков способом Брэдфорда, можно осуществлять следующим образом: смешать разведенный раствор целлюлазной композиции и раствор бриллиантового голубого G; инкубировать смесь в течение определенного периода времени; и измерять поглощение при 595 нм. Содержание белка в разведенном растворе целлюлазной композиции вычисляют на основании калибровочной кривой, получаемой отдельно с использованием стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина, по которой можно определять содержание белка в целлюлазной композиции.

[0034]

Ферментативную активность ксиланазы измеряют в качестве разрушающей ксилан активности для ксилана, используемого в качестве реактива. Количество фермента, которое образует 1 мкмоль восстанавливающего сахара в минуту, определяют как 1 Ед. Ферментативную активность измеряют в соответствии с процедурами, описанными далее в эталонном примере 5.

[0035]

В частности, разрушающая ксилан активность на 1 г белков в целлюлазной композиции предпочтительно составляет 14000 Ед/г или больше, более предпочтительно 16000 Ед/г или больше, еще более предпочтительно 18000 Ед/г или больше. Разрушающая ксилан активность в целлюлазной композиции на 1 г белков в целлюлазной композиции составляет обычно 50000 Ед/г или меньше.

[0036]

Активность целлобиогидролазы измеряют как ферментативную активность разрушения 4-нитрофенил-β-D-лактопиранозида. Количество фермента, которое образует 1 мкмоль 4-нитрофенола в минуту, определяют как 1 Ед. Ферментативную активность измеряют в соответствии с процедурами, описанными далее в эталонном примере 5.

[0037]

В частности, активность целлобиогидролазы на 1 г белков в целлюлазной композиции предпочтительно составляет 50 Ед/г или больше, более предпочтительно 65 Ед/г или больше, еще более предпочтительно 80 Ед/г или больше. Активность целлобиогидролазы в целлюлазной композиции на 1 г белков в целлюлазной композиции составляет обычно 300 Ед/г или меньше.

[0038]

Активность β-глюкозидазы измеряют как ферментативную активность разрушения 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида. Количество фермента, которое образует 1 мкмоль 4-нитрофенола в минуту, определяют как 1 Ед. Ферментативную активность измеряют в соответствии с процедурами, описанными далее в эталонном примере 5.

[0039]

В частности, активность β-глюкозидазы на 1 г белков в целлюлазной композиции может представлять собой любое значение не меньше 1000 Ед/г и предпочтительно составляет 10000 Ед/г или больше, более предпочтительно 14000 Ед/г или больше, еще более предпочтительно 16000 Ед/г или больше, наиболее предпочтительно 18000 Ед/г или больше. Активность β-глюкозидазы в целлюлазной композиции на 1 г белков в целлюлазной композиции составляет обычно 50000 Ед/г или меньше.

[0040]

Ферментативные компоненты в целлюлазной композиции можно идентифицировать, в дополнение к указанному выше способу измерения ферментативных активностей, посредством: разделения ферментативных компонентов с использованием известного способа, такого как гель-фильтрация, ионный обмен или двухмерный электрофорез; анализа аминокислотной последовательности выделенного компонента (анализ N-конца, анализ C-конца и масс-спектрометрия); и сравнения результатов с базой данных.

[0041]

В настоящем изобретении, предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, можно гидролизовать с использованием целлюлазной композиции, имеющей по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы и по существу не имеющей активности β-ксилозидазы во время гидролиза, направленной на биомассу, содержащую ксилан и целлюлозу, чтобы получать гидролизат, содержащий ксилоолигосахариды.

[0042]

Условия гидролиза в настоящем изобретении не ограничены до тех пор, пока целлюлазная композиция по настоящему изобретению может гидролизовать предварительно обработанный продукт биомассы для получения ксилоолигосахаридов. Температуру реакции во время гидролиза поддерживают предпочтительно на 50°C или ниже, более предпочтительно в диапазоне от 30 до 45°C. Когда температуру реакции поддерживают в диапазоне от 30°C до 45°C, активности различных гидролаз, входящих в целлюлазную композицию, не снижаются, что допускает повторное использование целлюлазной композиции после реакции гидролиза.

[0043]

Предпочтительный pH в реакции гидролиза не ограничен, и pH предпочтительно составляет 4,5-8,0, более предпочтительно 6,0-8,0, еще более предпочтительно 6,5-7,5. Диапазон pH от 6,5 до 7,5 оказывает эффект увеличения выхода ксилоолигосахаридов, и позволяет поддерживать активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы в целлюлазной композиции на высоких уровнях даже после гидролиза.

[0044]

Корректировку pH во время гидролиза можно осуществлять посредством индивидуальной корректировки значений pH предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, и целлюлазной композиции перед добавлением целлюлазной композиции в предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу. Альтернативно, значение pH можно корректировать после добавления целлюлазной композиции в предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу. Предпочтительно, значения pH корректируют индивидуально перед добавлением целлюлазной композиции в предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу.

[0045]

Для корректировки значения pH можно использовать кислоту, щелочь или pH буферный раствор. Типы кислоты, щелочи или pH буферного раствора не ограничены до тех пор, пока они способны корректировать pH до предварительно определяемого значения. Примеры кислоты включают соляную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту, муравьиную кислоту и уксусную кислоту. Среди них, соляная кислота и серная кислота предпочтительны с точки зрения того, что они являются недорогостоящими и обладают способность корректировать pH до желаемого значения в небольшом количестве. Примеры щелочи включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, аммиак, карбонат натрия, карбонат кальция и фосфат тринатрия. Среди них гидроксид натрия и гидроксид калия предпочтительны с точки зрения того, что они являются недорогостоящими и обладают способностью корректировать pH до желаемого значения в небольшом количестве. Когда используют pH буферный раствор, примеры используемого pH буферного раствора включают ацетатный буфер, цитратный буфер, фосфатный буфер и Tris-HCl буфер. Среди них, фосфатный буфер и Tris-HCl буфер предпочтительны с точки зрения того, что pH, подлежащий корректировке, составляет pH 6,0-8,0.

[0046]

Во время реакции гидролиза, реакцию предпочтительно осуществляют при перемешивании для того, чтобы содействовать контакту между предварительно обработанным продуктом биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, и целлюлазной композицией по настоящему изобретению и делать концентрацию сахаров в гидролизате однородной. Концентрация твердых веществ в предварительно обработанном продукте биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, во время гидролиза предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 30% по массе, более предпочтительно от 3 до 20% по массе, еще более предпочтительно от 5 до 10% по массе.

[0047]

Время реакции гидролиза предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 144 часов, более предпочтительно от 3 до 72 часов, еще более предпочтительно от 6 до 24 часов, наиболее предпочтительно от 6 до 10 часов.

[0048]

В реакции гидролиза в настоящем изобретении с использованием гидролаз, входящих в целлюлазную композицию, целлюлозу, входящую в предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, разрушают посредством целлобиогидролазы до целлоолигосахаридов, которые в свою очередь гидролизуют с помощью β-глюкозидазы до глюкозы. С другой стороны, ксилан, входящий в предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, гидролизуют с помощью ксиланазы до ксилоолигосахаридов.

[0049]

Ксилан является членом гемицеллюлоз, которые встречаются в клеточных стенках растений. Гемицеллюлозы образуют клеточные стенки растений через формирование структур более высокого порядка через водородные связи или химические связи с целлюлозой. В настоящем изобретении обнаружено, что использование целлюлазной композиции, имеющей не только активность ксиланазы, но также активности целлобиогидролазы и β-глюкозидазы, в реакции гидролиза делает возможным эффективное получение ксилоолигосахаридов.

[0050]

В гидролизате, в дополнение к ксилоолигосахаридам, могут содержаться, например, моносахариды, такие как глюкоза, ксилоза, манноза, арабиноза и галактоза, и олигосахариды, такие как целлобиоза, целлотетраоза, маннобиоза и галактобиоза, продуцируемые гидролазами, входящими в целлюлазную композицию.

[0051]

Когда целлюлазная композиция имеет активности ксиланазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, целлюлазную композицию по настоящему изобретению можно получать с помощью следующих процессов.

[0052]

Целлюлазную композицию суспендируют или растворяют в водной среде. pH получаемой суспензии или водного раствора целлюлазной композиции корректируют до 5,5-8,0 и инкубируют при 35-60°C. Когда целлюлазную композицию суспендируют, условие, при котором не добавляют субстрат, является предпочтительным. pH корректируют более предпочтительно в диапазоне 6,0-8,0, еще более предпочтительно 6,5-8,0. Время инкубации конкретно не ограничено и предпочтительно составляет в пределах 24 часов, более предпочтительно в пределах 12 часов, еще более предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 8 часов, наиболее предпочтительно в диапазоне от 2 до 6 часов. Когда целлюлазную композицию суспендируют, концентрация целлюлазной композиции конкретно не ограничена, и предпочтительно ее корректируют от 0,1 до 100 г/л, более предпочтительно от 1 до 50 г/л, еще более предпочтительно от 2 до 10 г/л в отношении концентрации белка. Концентрацию белка измеряют способом Брэдфорда. Для того чтобы корректировать pH суспензии или водного раствора целлюлазной композиции можно использовать указанные выше кислоты, щелочи или pH буферные растворы, используемые при корректировке pH предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу.

[0053]

Как подробно описано далее в примерах, описанная выше обработка удивительно снижает активность β-ксилозидазы, тогда как снижение активностей ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы относительно мало. Таким образом, активность β-ксилозидазы в целлюлазной композиции можно значительно избирательно снижать. Таким образом, например, даже когда активность β-ксилозидазы в целлюлазной композиции перед инкубацией составляет более 500 Ед/г белков в целлюлазной композиции, инкубация позволяет снижать активность β-ксилозидазы до 500 Ед/г или ниже, предпочтительно 400 Ед/г или ниже, еще более предпочтительно 300 Ед/г или ниже, на грамм белков в целлюлазной композиции, при этом сохраняя активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы в пределах каждого из предпочтительных диапазонов, описанных выше. Целлюлазные композиции, происходящие от грибов, часто имеют активность β-ксилозидазы, превышающую 500 Ед/г белков в целлюлазной композиции. Даже эти целлюлазные композиции можно превращать в такие, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению и по существу не имеют активности β-ксилозидазы, за счет вышеуказанной простой инкубации. Термин «целлюлазные композиции, происходящие от грибов» включают те, в которых одну или две или больше из ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы отдельно и совокупно добавляют до тех пор, пока целлюлазные композиции, продуцируемые грибами, содержатся. Поскольку активность β-ксилозидазы на грамм белков в целлюлазных композициях обычно составляет 50 Ед/г или больше, активность β-ксилозидазы предпочтительно составляет 50-500 Ед/г.

[0054]

Способы извлечения целлюлазной композиции из гидролизата, получаемого в реакции гидролиза, включают, но не ограничиваясь этим, способ, включающий фильтрование гидролизата через ультрафильтр и последующее извлечение целлюлазной композиции со стороны не проникшего; и способ, включающий разделение гидролизата на твердые и жидкие продукты и последующие элюирование целлюлазной композиции из твердого продукта.

[0055]

Среди них способ извлечения целлюлазной композиции с использованием ультрафильтра является предпочтительным. Способ извлечения с использованием ультрафильтра является предпочтительным, поскольку он может давать раствор сахаров, содержащий целлюлазную композицию, на стороне не проникшего и раствор сахаров, содержащий ксилоолигосахариды, на стороне проникшего. Чистоту целлюлазной композиции дополнительно можно увеличивать посредством добавления воды в непермеат и повторения фильтрования через ультрафильтр снова.

[0056]

При извлечении целлюлазной композиции с использованием ультрафильтра, молекулярный порог предпочтительно находится в диапазоне от 1000 до 50000, более предпочтительно от 5000 до 50000, еще более предпочтительно от 10000 до 30000.

[0057]

Примеры материала ультрафильтра, который можно использовать, включают полиэфирсульфон (PES), полисульфон (PS), полиакрилонитрил (PAN), дифторид поливинилидена (PVDF), регенерированную целлюлозу, целлюлозу, сложный эфир целлюлозы, сульфонированный полисульфон, сульфонированный полиэфирсульфон, полиолефин, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат и политетрафторэтилен. Поскольку целлюлазная композиция разрушает регенерированную целлюлозу, целлюлозу и сложный эфир целлюлозы, предпочтительно используют ультрафильтры, выполненные из синтетических полимеров, таких как PES и PVDF.

[0058]

Фильтрование с использованием ультрафильтров включает тупиковое фильтрование и фильтрование в перекрестном потоке, и фильтрование в перекрестном потоке является предпочтительным с точки зрения сдерживания засорения мембраны. Формы ультрафильтра, которые можно использовать, включают подходящие формы, например, плоского, спирального, трубчатого и половолоконного типов. В частности, можно использовать тип G-5, тип G-10, тип G-20, тип G-50, тип PW и тип HWSUF из DESAL; HFM-180, HFM-183, HFM-251, HFM-300, HFK-131, HFK-328, MPT-U20, MPS-U20P, MPS-U20S; Synder SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5, SPV50, SOW30 из KOCH; серию Microza (зарегистрированный товарный знак) UF производства Asahi Kasei, молекулярный порог которых составляет от 3000 до 10000; и NTR7410 и NTR7450 производства Nitto Denko.

[0059]

Кроме того, раствор сахаров, содержащий ксилоолигосахариды, который получают в настоящем изобретении, можно концентрировать для того, чтобы дополнительно увеличивать концентрацию сахаров. Примеры процесса концентрирования включают концентрирование посредством испарения, концентрирование при пониженном давлении и концентрирование через мембрану. Среди них, способ фильтрации через нанофильтрующую мембрану и/или мембрану обратного осмоса, как раскрыто в WO2010/067785, предпочтительно можно использовать для достижения концентрирования сахаров, в которой концентрируют сахарные компоненты, где в способе используют меньше энергии и он позволяет удалять ингибиторы ферментации, содержащиеся в растворе сахаров.

[0060]

Ксилоолигосахариды, получаемые в настоящем изобретении, можно использовать непосредственно в качестве сырья, например, для пищи и кормов. Альтернативно, ксилоолигосахариды с повышенной чистотой, достигаемой известными способами, можно использовать в качестве сырья, например, для пищи и кормов.

[0061]

Кроме того, различные химические соединения можно получать с использованием растворов сахаров, содержащих глюкозу и ксилозу, которые отделяют с помощью вышеуказанного способа, в качестве сырья ферментации, и выращивания микроорганизмов, способных продуцировать химические соединения. Фраза «с использованием растворов сахаров в качестве сырья ферментации и для выращивания микроорганизмов» обозначает использование сахарных компонентов или амино-источников, содержащихся в растворе сахаров, в качестве питательных веществ для микроорганизмов и выращивания или поддержания роста микроорганизмов. Конкретные примеры химических соединений включают вещества, массово получаемые в ферментационной промышленности, такие как спирты, органические кислоты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты. Такие химические соединения продуцируются и накапливаются внутри и снаружи микроорганизмов через процессы метаболизма сахарных компонентов в растворе сахаров, используемом в качестве источников углерода. Конкретные примеры химических продуктов, которые можно получать с помощью микроорганизмов, включают спирты, такие как этанол, 1,3-пропандиол, 1,4-бутандиол и глицерин; органические кислоты, такие как уксусная кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, итаконовая кислота и лимонная кислота; нуклеозиды, такие как инозин и гуанозин; нуклеотиды, такие как инозиновая кислота и гуаниловая кислота; и соединения аминов, такие как кадаверин. Кроме того, раствор сахаров, получаемый в настоящем изобретении, можно применять для получения, например, ферментов, антибиотиков и рекомбинантных белков. Любые микроорганизмы, которые могут эффективно продуцировать химические соединения, представляющие интерес, можно использовать при получении таких химических соединений, в том числе микроорганизмы, такие как Escherichia coli, дрожжи и грибы (нитчатые грибы и базидиомицеты).

ПРИМЕРЫ

[0062]

Настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на примеры и сравнительные примеры.

[0063]

Эталонный пример 1. Предварительная обработка биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу

Предварительно обрабатывали багассу в качестве биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу. 5 г багассы взвешивали и нагревали до 105°C. Долю содержания твердых веществ в багассе вычисляли на основании изменения массы при нагревании. Влажную багассу умножали на уровень содержания воды для получения массы содержащихся твердых веществ. Багассу в количестве 100 г погружали в водный раствор гидроксида натрия так, что концентрация твердых веществ в смеси с раствором гидроксида натрия составляла 5% по массе, и так, что количество добавляемого гидроксида натрия относительно содержания твердых веществ в багассе составляло 10% по массе, и затем смесь подвергали предварительной обработке при 80°C в течение 3 часов. Смесь разделяли на твердые и жидкие продукты посредством центрифугирования (3000 g, 10 минут). Твердый продукт промывали чистой водой и затем использовали в дальнейшем эксперименте в качестве предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу.

[0064]

Эталонный пример 2. Получение целлюлазной композиции

Предварительная культура

В 500 мл колбу Эрленмейера с перегородками загружали 100 мл раствора 5% (масс./об.) жидкого кукурузного экстракта, 2% (масс./об.) глюкозы, 0,37% (масс./об.) тартрата аммония, 0,14% (масс./об.) сульфата аммония, 0,2% (масс./об.) дигидрофосфата калия, 0,03% (масс./об.) дигидрата хлорида кальция, 0,03% (масс./об.) гептагидрата сульфата магния, 0,02% (масс./об.) хлорида цинка, 0,01% (масс./об.) гексагидрата хлорида железа (III), 0,004% (масс./об.) пентагидрата сульфата меди (II), 0,0008% (масс./об.) тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006% (масс./об.) борной кислоты и 0,0026% (масс./об.) тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде, и затем смесь стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут. После того, как колбу оставляли остывать, каждое из 0,01% (масс./об.) PE-M и Tween 80, независимо стерилизованных в автоклаве при 121°C в течение 15 минут, отдельно добавляли в раствор для того, чтобы получать среду для предварительного культивирования. В 100 мл этой среды для предварительного культивирования инокулировали 1×10⁵ клеток/мл Trichoderma reesei ATCC66589 (приобретали в ATCC) и культивировали при встряхивании на 180 об./мин при 28°C в течение 72 часов для получения предварительной культуры (встряхиватель: TAITEC BIO-SHAKER BR-40LF).

[0065]

Основная культура

В 5 л перемешиваемый сосуд (DPC-2A производства ABLE) загружали 2,5 л раствора 5% (масс./об.) жидкого кукурузного экстракта, 2% (масс./об.) глюкозы, 10% (масс./об.) целлюлозы (Avicel), 0,37% (масс./об.) тартрата аммония, 0,14% (масс./об.) сульфата аммония, 0,2% (масс./об.) дигидрофосфата калия, 0,03% (масс./об.) дигидрата хлорида кальция, 0,03% (масс./об.) гептагидрата сульфата магния, 0,02% (масс./об.) хлорида цинка, 0,01% (масс./об.) гексагидрата хлорида железа (III), 0,004% (масс./об.) пентагидрата сульфата меди (II), 0,0008% (масс./об.) тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006% (масс./об.) борной кислоты и 0,0026% (масс./об.) тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде и затем смесь стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут. После того, как колбу оставляли остывать, каждое из 0,1% PE-M и Tween 80, независимо стерилизованных в автоклаве 121°C в течение 15 минут, отдельно добавляли в раствор для того, чтобы получать среду основной культуры. В 2,5 л этой среды основной культуры инокулировали 250 мл Trichoderma reesei PC3-7, предварительно культивированного в описанной выше среде для предварительного культивирования. Затем клетки культивировали при 28°C в течение 87 часов при 300 об./мин уровне аэрации 1 об./об./мин и центрифугировали. Затем супернатант фильтровали через мембранный фильтр (Stericup-GV, выполненный из PVDF, производства Millipore). В полученную культуру добавляли β-глюкозидазу (Novozyme 188) в количестве 1/100 в единицах соотношения масс белка для получения целлюлазной композиции.

Поскольку LA Grange DC et al. (Appl. Environ. Microbiol. 62, 1036-1044, 1996), Boer H et al. (Biotechnol. Bioeng. 69, 486-494, 2000), и William JC et al. (Eur. J. Biochem. 165, 333-341, 1987) раскрывают, что оптимальные значения pH ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы в целлюлазной композиции, происходящей от нитчатых грибов, составляют pH 5,0-6,0, pH 5,0 и pH 5,0, соответственно, оптимальный pH целлюлазной композиции, получаемой в эталонном примере, для ферментативной реакции оценивали как pH 5.

[0066]

Эталонный пример 3. Измерение концентрации белка

Коммерчески доступный реактив для измерения концентрации белка (белковый анализ Quick Start Bradford, производства Bio-Rad) использовали для измерения концентрации белка целлюлазных композиций. 5 мкл разведенного раствора целлюлазной композиции по настоящему изобретению добавляли к 250 мкл реактива для измерения концентрации белка, который предварительно возвращали к комнатной температуре. После того, как смесь оставляли стоять при комнатной температуре в течение 5 минут, поглощение при 595 нм измеряли с использованием считывателя микропланшетов (POWERSCAN HT, производства Sumitomo Dainippon Pharma). Используя водный раствор бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта, концентрацию белка в растворе целлюлазной композиции вычисляли на основании калибровочной кривой.

[0067]

Эталонный пример 4. Измерение концентрации сахаров

Количественные анализы ксилоолигосахаридов, глюкозы и ксилозы осуществляли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии LaChrom Eite (HITACHI) при следующих условиях.

[0068]

Количественные анализы были основаны на калибровочных кривых, полученных с использованием стандартов ксилобиозы, ксилотриозы, ксилотетраозы, ксилопентаозы и ксилогексаозы, которые являются ксилоолигосахаридами, глюкозы и ксилозы. Ксилоолигосахариды, описанные в этом примере, относятся к ксилоолигосахаридам, в которых от 2 до 6 звеньев ксилозы связаны β-гликозидными связями.

[0069]

Колонка: KS802, KS803 (Shodex)

Подвижная фаза: вода

Способ обнаружения: RI

Скорость потока: 0,5 мл/мин

Температура: 75°C

[0070]

Эталонный пример 5. Способ измерения ферментативной активности

Четыре ферментативные активности: 1) активность β-ксилозидазы; 2) разрушающая ксилан активность; 3) активность целлобиогидролазы; и 4) активность β-глюкозидазы оценивали через измерение при pH 5, который является оптимальным pH для ферментативных реакций целлюлазной композиции, получаемой в эталонном примере 2, в соответствии со следующей процедурой.

[0071]

1) Активность β-ксилозидазы

4-нитрофенил-β-D-ксилопиранозид (производства Sigma-Aldrich) растворяли в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (pH 5,0) до концентрации 1 мМ для получения раствора субстрата. Раствор фермента в количестве 10 мкл добавляли к 90 мкл раствора субстрата и смесь оставляли стоять для реакции при 30°C. После 10 минут реакцию останавливали посредством добавления 10 мкл раствора карбоната натрия. Затем количественно определяли 4-нитрофенол посредством измерения поглощения при 405 нм. В приведенной выше реакционной системе, количество фермента, которое образует 1 мкмоль 4-нитрофенола в минуту, определяют как 1 Ед. Значение активности (Ед/мл) вычисляли в соответствии со следующей формулой:

Активность β-ксилозидазы (Ед/мл)=4-нитрофенол (мкмоль/мл) × объем реакционного раствора (мкл)/((время реакции (мин) × объем раствора фермента (мкл)) × степень разведения (кратно).

[0072]

2) Разрушающая ксилан активность

Ксилан (ксилан из березняка производства Fluka) суспендировали в 50 мМ натрий-ацетатного буфера (pH 5,0) до концентрации 1% по массе для получения раствора субстрата. Раствор фермента в количестве 5 мкл добавляли к 500 мкл дозированного раствора субстрата и смесь оставляли реагировать при перемешивании вращением на 50°C. Время реакции, которое в основном составляло 30 минут, варьировало надлежащим образом от 10 до 60 минут, в зависимости от ферментативной активности. После реакции, пробирку центрифугировали и измеряли концентрацию восстанавливающего сахара в супернатанте с помощью способа DNS. В вышеуказанной реакционной системе, количество фермента, которое образует 1 мкмоль восстанавливающего сахара в минуту, определяют как 1 Ед. Значение активности (Ед/мл) вычисляли в соответствии со следующей формулой:

Разрушающая ксилан активность (Ед/мл)=концентрация восстанавливающего сахара (г/л) × 1000 × 505 (мкл)/(150,13 × время реакции (мин) × 5 (мкл)).

[0073]

3) Активность целлобиогидролазы

4-нитрофенил-β-D-лактопиранозид (производства Sigma-Aldrich) растворяли в 50 мМ натрий-ацетатного буфера (pH 5,0) до концентрации 1 мМ, чтобы получать раствор субстрата. Раствор фермента в количестве 10 мкл добавляли к 90 мкл раствора субстрата, и смесь оставляли стоять для реакции при 30°C. После 10 минут, реакцию останавливали посредством добавления 10 мкл раствора карбоната натрия. Затем количественно определяли 4-нитрофенол посредством измерения поглощения при 405 нм. В вышеуказанной реакционной системе количество фермента, которое образует 1 мкмоль 4-нитрофенола в минуту, определяют как 1 Ед. Значение активности (Ед/мл) вычисляли в соответствии со следующей формулой:

Активность целлобиогидролазы (Ед/мл)=4-нитрофенол (мкмоль/мл) × объем реакционного раствора (мкл)/(время реакции (мин) × объем раствора фермента (мкл)) × степень разведения (кратно).

Поскольку чувствительность обнаружения падает, когда значение активности составляет меньше чем 5 Ед/г, предел обнаружения в способе измерения составляет меньше 5 Ед/г.

[0074]

4) Активность β-глюкозидазы (BGL активность)

4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид (производства Sigma-Aldrich) растворяли в 50 мМ натрий-ацетатного буфера (pH 5,0) до концентрации 1 мМ, чтобы получать раствор субстрата. Раствор фермента в количестве 10 мкл добавляли к 90 мкл раствора субстрата и оставляли стоять для реакции при 30°C. После 10 минут, реакцию останавливали посредством добавления 10 мкл раствора карбоната натрия. Затем количественно определяли 4-нитрофенол посредством измерения поглощения при 405 нм. В вышеуказанной реакционной системе, количество фермента, которое образует 1 мкмоль 4-нитрофенола в минуту, определяют как 1 Ед. Значение активности (Ед/мл) вычисляли в соответствии со следующей формулой:

Активность β-глюкозидазы (Ед/мл)=4-нитрофенол (мкмоль/мл) × объем реакционного раствора (мкл)/((время реакции (мин) × объем раствора фермента (мкл)) × степень разведения (кратно).

Поскольку чувствительность обнаружения падает, когда значение активности составляет меньше чем 50 Ед/г, предел обнаружения в способе измерения составляет 50 Ед/г.

[0075]

Сравнительный пример 1. Реакция гидролиза с использованием ксиланазы

Доля содержания твердых веществ в предварительно обработанном продукте биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, полученном в соответствии с эталонным примером 1, определяли аналогичным образом, как в эталонном примере 1 для доли содержания твердых веществ в багассе, и 1 г твердых веществ взвешивали в 50 мл пробирки. Чистую воду добавляли так, что концентрация твердых веществ в предварительно обработанном продукте биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, в начале реакции составляла 10% по массе, при этом pH корректировали до 5,0 с использованием разведенной соляной кислоты. Cellulosin TP25 (производства HBI) в качестве ксиланазы для промышленного использования добавляли в предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, со скорректированным pH так, что разрушающая ксилан активность составляла 250 Ед/г твердых веществ предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, как измеряют способом, описанным в эталонном примере 5. Затем смесь смешивали вращением с использованием гибридизационного вращателя (SN-06BN производства Nissin Rika) при условиях реакции, которые представляют собой рекомендованные условия pH и температуры для Cellulosin TP25, то есть при pH 5,0 и 40°C в течение 8 часов. Сахарные компоненты, содержащиеся в супернатанте получаемого гидролизата, анализировали способом, описанным в эталонном примере 4.

[0076]

Пример 1. Реакция гидролиза с использованием целлюлазной композиции по настоящему изобретению, эту целлюлазную композицию инкубировали при конкретных условиях pH и температуры

Значение pH целлюлазной композиции, получаемой в эталонном примере 2, корректировали до 5,5-8,0 с использованием 1 Н водного раствора гидроксида натрия. После разведения целлюлазной композиции водой так, что концентрация белка составляла 4 г/л, получаемое разведение инкубировали в температурном диапазоне 35-60°C. Подробные условия инкубации приведены в таблице 1. В таблице 1 приведено сравнение результатов определения активностей целлобиогидролазы, β-глюкозидазы, разрушения ксилана и β-ксилозидазы в целлюлазных композициях, которые инкубировали при каждом условии с использованием способа, описанного в эталонном примере 5, и результатов активностей до инкубации. Как показано в результатах, при любых условиях инкубации, активности β-ксилозидазы при оптимальном pH для ферментативной активности снижали до значений, которые по существу неактивны для гидролиза, направленного на биомассу, тогда как активности целлобиогидролазы, β-глюкозидазы и разрушения ксилана оставались 60% или больше, что демонстрирует, что β-ксилозидазу избирательно дезактивировали при любых условиях инкубации.

[0077]

Затем реакцию гидролиза биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, осуществляли с использованием, в качестве целлюлазной композиции по настоящему изобретению, целлюлазных композиций, у которых активность β-ксилозидазы избирательно дезактивировали через инкубацию при соответствующих условиях. Исходя из разрушающей ксилан активности, которую определяли перед инкубацией в соответствии с эталонным примером 5, целлюлазную композицию по настоящему изобретению так добавляли в предварительно обработанный продукт биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, pH которого корректировали до 7,0, что разрушающая ксилан активность составляла 250 Ед/г твердых веществ предварительно обработанного продукта биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу. Смесь смешивали при вращении с использованием гибридизационного вращателя при pH 7,0 и 40°C в течение 8 часов. Сахарные компоненты, содержащиеся в супернатанте получаемого гидролизата, анализировали способом, описанным в эталонном примере 4, и результаты приведены в таблице 2. Обнаружено, что получали больше ксилоолигосахаридов по сравнению с реакцией гидролиза с использованием ксиланазы в сравнительном примере 1 или не инкубированной целлюлазной композиции в сравнительном примере 2.

[0078]

[Таблица 1]

Фермент Условия инкубации pH во время измерения активности, pH Температура во время измерения активности, °C Активность β-ксилозидазы (Ед/г) Разрушающая ксилан активность (Ед/г) Активность целлобиогидролазы (Ед/г) Активность β-глюкозидазы (Ед/г) Ксиланаза (сравнительный пример 1) - 5,0 30 20 40000×102 ниже предела обнаружения ниже предела обнаружения Целлюлаза, происходящая от нитчатых грибов (эталонный пример 2) - 5,0 30 650 33,200 128 26,100 Целлюлаза, происходящая от нитчатых грибов (пример 1) pH 5,5, 60°C, 1 ч 5,0 30 244 29000 117 25,800 pH 7,5, 40°C, 2 ч 5,0 30 147 31,300 120 25,400 pH 7,5, 40°C, 6 ч 5,0 30 135 27,400 93 25,200 pH 7,6, 44°C, 4 ч 5,0 30 98 20,800 88 20,800 pH 8,0, 35°C, 10 мин 5,0 30 103 26,200 103 25000

[0079]

[Таблица 2]

Фермент Условия инкубации pH во время гидролиза Температура во время гидролиза (°C) Ксилоолигосахариды (г/л) Глюкоза (г/л) Ксилоза (г/л) Ксиланаза (Сравнительный пример 1) - 5,0 40 7 2 1 - 7,0 40 5 2 1 Целлюлаза, получаемая из нитчатых грибов (эталонный пример 2) - 7,0 40 5 37 15 Целлюлаза, получаемая из нитчатых грибов (пример 1) pH 5,5, 60°C, 1 ч 7,0 40 15 35 6 pH 7,5, 40°C, 2 ч 7,0 40 16 36 5 pH 7,5, 40°C, 6 ч 7,0 40 14 34 6 pH 7,6, 44°C, 4 ч 7,0 40 13 32 5 pH 8,0, 35°C, 10 мин 7,0 40 14 34 6

[0080]

Пример 2

Реакцию гидролиза осуществляли аналогичным образом, как в реакции гидролиза в примере 1, за исключением того, что реакцию осуществляли при pH 6,0-8,0 и 40°C с использованием целлюлазной композиции, которую инкубировали при pH 7,5 и 40°C в течение 2 часов. Анализировали сахарные компоненты, содержащиеся в супернатанте получаемого гидролизата, и результаты приведены в таблице 3. В результатах обнаружено, что реакция гидролиза при любых значениях pH может давать больше ксилоолигосахаридов по сравнению с реакцией гидролиза с использованием ксиланазы в сравнительном примере 1.

[0081]

[Таблица 3]

pH реакции Температура реакции (°C) Ксилоолигосахарид (г/л) Глюкоза (г/л) Ксилоза (г/л) 6,0 40 8 41 15 6,5 40 16 36 9 7,0 40 16 36 5 7,5 40 14 31 6 8,0 40 9 27 5

[0082]

Пример 3

Целлюлазную композицию в эталонном примере 2 предварительно инкубировали при pH 7,5 и 40°C в течение 2 часов перед добавлением β-глюкозидазы (Novozyme 188). Активность β-глюкозидазы после инкубации составляла 124 Ед/г. Затем β-глюкозидазу (Novozyme 188) добавляли в инкубированную целлюлазную композицию так, что каждая активность β-глюкозидазы составляла 1000 Ед/г, 5000 Ед/г, 10000 Ед/г, 14000 Ед/г, 18000 Ед/г и 25000 Ед/г, соответственно, чтобы получать целлюлазные композиции, используемые в данном примере. Реакцию гидролиза осуществляли аналогичным образом, как в реакции гидролиза в примере 2, за исключением использования этих целлюлазных композиций при pH 7,0 и 40°C. Сахарные компоненты, содержащиеся в супернатанте получаемого гидролизата, анализировали способом, описанным в эталонном примере 4, и результаты приведены в таблице 4. В результатах обнаружено, что целлюлазная композиция, содержащая более высокое добавляемое количество β-глюкозидазы, обеспечивает усовершенствованный выход ксилоолигосахаридов.

[0083]

[Таблица 4]

Активность β-глюкозидазы (Ед/г) Ксилоолигосахарид (г/л) Глюкоза (г/л) Ксилоза (г/л) 1000 9 17 6 5000 9 22 5 10000 10 27 5 14000 13 30 5 18000 14 33 6 25000 16 36 5

[0084]

Пример 3

Реакцию гидролиза осуществляли аналогичным образом, как в реакции гидролиза в примере 1, за исключением того, что реакцию осуществляли при pH 7,0 и 35-45°C с использованием целлюлазной композиции, которую инкубировали при pH 7,5 и 40°C в течение 2 часов. После смешивания реакции вращением в течение 8 часов, получаемый гидролизат центрифугировали на 8000 g в течение 5 минут и разделяли на жидкие и твердые продукты. Жидкий продукт фильтровали через микрофильтрующую мембрану (Millex-GV, производства Millipore), имеющую размер пор 0,22 мкм, чтобы получать фильтрат. Кроме того, получаемый фильтрат фильтровали через ультрафильтр (Vivaspin 20-10K, производства Sartopore), имеющий молекулярный порог 10000, чтобы получать пермеат и непермеат. Результаты, получаемые посредством измерения содержания сахаров, содержащихся в пермеате, приведены в таблице 4. Результаты, получаемые посредством определения активностей ферментов, содержащихся в непермеате, аналогичным образом, как в эталонном примере 5, приведены в таблице 5. В таблице 6 представлены относительные активности ферментов в непермеате, когда каждую ферментативную активность перед инкубацией целлюлазной композиции принимали за 100. В этих результатах обнаружено, что целлюлазную композицию, которая сохраняет высокие активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы, даже после гидролиза можно извлекать из гидролизата, в котором получали ксилоолигосахариды.

[0085]

[Таблица 5]

Реакция pH Температура реакции (°C) Ксилоолигосахарид (г/л) Глюкоза (г/л) Ксилоза (г/л) 7,0 35 12 34 9 7,0 40 16 36 5 7,0 45 17 34 5

[0086]

[Таблица 6]

pH реакции Температура реакции (°C) Активность β-ксилозидазы (%) Разрушающая ксилан активность (%) Активность целлобиогидролазы (%) Активность β-глюкозидазы (%) 7,0 35 15 66 58 78 7,0 40 10 58 41 76 7,0 45 7 40 32 67

Промышленная применимость

[0087]

Ксилоолигосахариды, получаемые в настоящем изобретении, можно использовать в качестве сырье, например, для пищи и кормов, содержащих ксилоолигосахариды.

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности. Предварительно обрабатывают биомассу. Проводят гидролиз биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, при рН от 4,5 до 8,0 и температуре от 35 до 45°С с использованием целлюлазной композиции. Целлюлазная композиция имеет по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы, и по существу не имеет активности β-ксилозидазы, направленной на указанную биомассу, во время гидролиза. Композиция содержит активные ферментативные компоненты, получаемые посредством существенной инактивации активностей β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, направленных на указанную биомассу, посредством инкубации смеси, происходящей из гриба, относящегося к роду Trichoderma, имеющей по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, направленные на указанную биомассу. Активности ксиланазы и целлобиогидролазы в композиции включают указанные активности ксиланазы и целлобиогидролазы, остающиеся после указанной инкубации целлюлазной смеси. Целлюлазная смесь происходит из Trichoderma reesei. Активность ксиланазы составляет по меньшей мере 14000 Ед на один грамм белка, целлобиогидролазы по меньшей мере 50 Ед на один грамм белка и β-глюкозидазы по меньшей мере 1000 Ед на один грамм белка. Изобретение обеспечивает удобный и эффективный способ получения ксилоолигосахаридов. 5 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.

1. Способ получения композиции, содержащей ксилоолигосахарид, включающий гидролиз биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, с использованием целлюлазной композиции,

где указанная целлюлазная композиция имеет по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы и по существу не имеет активности β-ксилозидазы, направленной на указанную биомассу, во время гидролиза, где указанная целлюлазная композиция содержит активные ферментативные компоненты, получаемые посредством существенной инактивации активностей β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, направленных на указанную биомассу, посредством инкубации целлюлазной смеси, происходящей из гриба, относящегося к роду Trichoderma, имеющей по меньшей мере активности ксиланазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы и β-ксилозидазы, направленные на указанную биомассу,

где указанные активности ксиланазы и целлобиогидролазы в указанной целлюлазной композиции включают указанные активности ксиланазы и целлобиогидролазы, остающиеся после указанной инкубации указанной целлюлазной смеси,

причем биомасса проходит предварительную обработку; гидролиз проводят при рН от 4,5 до 8,0 при температуре от 35 до 45ºС; целлюлазная смесь происходит из Trichoderma reesei; ативность ксиланазы составляет по меньшей мере 14000 Ед на один грамм белка; активность целлобиогидролазы составляет по меньшей мере 50 Ед на один грамм белка и активность β-глюкозидазы составляет по меньшей мере 1000 Ед на один грамм белка.

2. Способ получения ксилоолигосахаридов по п. 1, в котором компонент, имеющий активность β-глюкозидазы в указанной целлюлазной композиции, содержит компонент, имеющий активность β-глюкозидазы, происходящий из гриба, относящегося к роду Aspergillus.

3. Способ получения ксилоолигосахаридов по любому одному из пп. 1 или 2, в котором активность β-ксилозидазы в указанной целлюлазной композиции в отношении ферментативной активности для разрушения 4-нитрофенил-β-D-ксилопиранозида составляет 50-500 Ед/г белков в указанной целлюлазной композиции.

4. Способ получения ксилоолигосахаридов по любому одному из пп. 1-3, в котором значение pH во время гидролиза составляет 6,0-8,0.

5. Способ получения ксилоолигосахаридов по любому одному из пп. 1-4, который включает гидролиз продукта, получаемого посредством предварительной обработки указанной биомассы, содержащей ксилан и целлюлозу, с использованием щелочи.

6. Способ получения ксилоолигосахаридов по любому одному из пп. 1-5, дополнительно включающий стадии: разделения гидролизата, получаемого посредством реакции гидролиза, на твердые и жидкие продукты; фильтрования получаемого жидкого продукта через ультрафильтр; извлечения целлюлазной композиции со стороны непроникшего и получения ксилоолигосахаридов со стороны проникшего.