ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛАЗ, КСИЛАНАЗЫ И КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛАЗ, КСИЛАНАЗЫ И КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ ДЛЯ ГИДРОЛИЗА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N9/42 C12P19/00 C12R1/80 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, для переработки растительного сырья.

Ферментные комплексы, содержащие целлюлозо- и гемицеллюлозолитические ферменты, гидролизующие основные компоненты клеточной стенки (как и отдельные составляющие их ферменты), могут применяться для биодеградации целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, для конверсии растительной биомассы и получения сахаров, биоэтанола и других продуктов микробного синтеза, для деструкции клеточных стенок растений, для гидролиза некрахмальных полисахаридов, а также в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок в кормах, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутантный штамм Penicillium funiculosum S2006 ВКМ F-3887D, продуцирующий комплекс карбогидраз (целлюлаз, β-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ), полученный с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P.funiculosum ВКМ F-3661D с применением ультрафиолетового облучения (заявка на патент РФ №2006110721/13 (011668), C12N 9/00, С12Р 19/00 от 4 апреля 2006 г.).

Техническая задача, на решение которой направлено разработанное изобретение, - расширение арсенала высокопродуктивных штаммов-продуцентов ферментов целлюлазного и гемицеллюлазного комплексов, обладающих высокой специфической активностью и предназначенных для высокоэффективной деструкции природного растительного сырья, отходов его промышленной и сельскохозяйственной переработки, для гидролиза растительных полисахаридов.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в получении нового высокопродуктивного штамма мицелиального гриба рода Penicillium, осуществляющего биосинтез комплекса целлюлаз, обладающих высокой специфической активностью (целлобиогидролаз, эндоглюканаз, целлобиаз и β-глюкозидаз), целлобиаз (β-глюкозидаз) и сопутствующих ферментов (ксиланаз и ксилоглюканаз).

Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм мицелиального гриба P.verruculosum PV2007 - продуцент комплекса целлюлаз, обладающих уникально высокой специфической активностью (целлобиогидролаз, эндоглюканаз, целлобиаз и β-глюкозидаз), целлобиаз (β-глюкозидаз) и сопутствующих ферментов (ксиланаз и ксилоглюканаз).

Штамм мицелиального гриба P.verruculosum PV2007 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под номером ВКМ F-3972D.

Штамм P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D получают с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P.verruculosum 28К ВКМ F-3764D. Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), культивируют при 28°С в течениие 2 суток и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, целлобиаз (β-глюкозидаз), ксиланаз и ксилоглюканаз при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше. Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Кулътурально-морфологические признаки штамма. При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 36 мм на 7 сутки при росте при 25°С. Колонии плотные, ровные с выпуклым центром. Мицелий светлый, пушистый. Обратная сторона палево-красновато-оранжевая. Конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом на 7-ые сутки имеют 27-30 мм в диаметре, складчатые, с ровным краем, поверхность шерстистая. Мицелий светлый, желтоватый. Обратная сторона - палево-оранжевая. Конидиогенез слабый.

Гриб не растет на среде с глицерином и на агаре Чапека при 5°С. При культивировании на агаре Чапека при 37°С колонии имеют 18 мм в диаметре, складчатые, средней плотности, обратная сторона буровато-красноватая.

Конидиогенез: кисточки бивертициллятные, метулы прижатые, гладкие (8-10×2,5-3,0). Фиалиды ацерозные (8-9×2,5-3,0), с короткой шейкой. Конидии эллиптические, мелкие (2,2×1,5-2,0), гладкие.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,35 ч^-1, в конце культивирования - 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма. Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз. Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, маннозу, маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - арабинозу, рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, дезоксиглюкозу и тиоглюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, β-глюкане, лихенине, пектине, и галактоманнане. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза карбогидраз заключается в следующем. Конидии пересевают в пробирки с минимальной средой, содержащей минеральные соли, следовое количество (0,5 г/л) дрожжевого экстракта, аморфную целлюлозу, а также исследуемый репрессор или антиметаболит (глюкоза, дезоксиглюкоза, лактоза, глицерин и др.). Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирку инкубируют 4 суток при 30°С и затем 20 ч при 45°С. Об устойчивости биосинтеза карбогидраз к катаболитной репрессии судят по глубине зоны деструкции аморфной целлюлозы (по размеру зоны просветления столбика агара в пробирке) в присутствии репрессора или антиметаболита).

Полученный мутантный штамм P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D по своим морфологическим признакам при росте на глюкозокартофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма P.verruculosum 28K ВКМ F-3764D существенно сниженной интенсивностью спороношения, изменением цвета конидий (с серо-зеленого на темно-серый) и окраской колонии с обратной стороны при выращивании на твердых средах, более медленным ростом на агаризованных средах и повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз, целлобиаз (β-глюкозидаз), ксиланаз и ксилоглюканаз.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВKМ F-3972D проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на водной питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся непосредственно индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования нерастворимых, например, микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) и растворимых, например глюкоза, субстратов секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - целлюлаз (целлобиогидролаз, эндоглюканаз), целлобиаз (β-глюкозидаз), ксиланаз и ксилоглюканаз. Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.

Ферментные препараты, полученные с использованием полученного штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде концентрированных препаратов, получаемых с использованием ультрафильтрации, в виде сухих препаратов или гранулированных препаратов.

Возможность использования изобретения иллюстрировано примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в качалочных колбах.

Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D выращивают на сусло - или СМ-агаре при 29°С в течение 7 суток и далее - при комнатной температуре на свету в течение 7 суток. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина 80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл водной ферментационной среды предпочтительно следующего состава, в г/л: МКЦ - 50, пшеничные отруби - 12 дрожжевой экстракт - 12, (NH₄)₂SО₄ - 5, KН₂РО₄ - 5, MgSO₄×7H₂О - 0,3, СаСl₂×2Н₂О - 0,3, рН 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 32°С и 200 об/мин. в течение 120-144 ч. Целлобиогидролазная активность после окончания ферментации в колбах составляет 19-20 ед/мл, эндоглюканазная активность - 320-350 ед/мл, β-глюкозидазная активность - 20-25 ед/мл, целлобиазная активность - 10-12 ед/мл, ксиланазная активность - 530-540 ед/мл, ксилоглюканазная активность - 200-220 ед/мл.

Пример 2. Культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в ферментере.

Проводят культивирование штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в 10-литровом ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6,0 л., используя предпочтительно питательную среду того же состава, что в качалочных колбах при рН 4,5 и 32°С в течение 120-144 час. Через 36 часов после начала ферментации (и до конца ферментации) осуществляют подпитку глюкозой путем непрерывной подачи ее водного раствора в ферментер со скоростью 1 г/л/час. Целлобиогидролазная активность после окончания ферментации составляет 60-65 ед/мл, эндоглюканазная активность - 820-850 ед/мл, β-глюкозидазная активность - 60-70 ед/мл, целлобиазная активность - 25-30 ед/мл, ксиланазная активность - 1550-1600 ед/мл, ксилоглюканазная активность - 610-640 ед/мл.

После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую комплекс целлюлаз и сопутствующих ферментов, подвергают ее ультрафильтрации на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДa) и лиофильно высушивают ультраконцентрат с получением сухого ферментного препарата. Целлобиогидролазная активность сухого ферментного препарата составляет 900-920 ед/г, эндоглюканазная активность - 14500-14900 ед/г, β-глюкозидазная активность - 1200-1250 ед/г, целлобиазная активность - 600-670 ед/г, ксиланазная активность - 23000-24000 ед/г, ксилоглюканазная активность - 7500-8200 ед/г.

Пример 3. Сравнительный анализ активности ферментного комплекса P.verruculosum.

Анализ активности проводят сравнивая полученный, как указано выше, ферментативный препарат с аналогичными препаратами целлюлаз и сопутствующих ферментов, полученных с помощью штаммов-продуцентов мицелиальных грибов родов Penicillium и Trichoderma. При этом используют ферментативные препараты и методики, приведенные ниже.

Используют следующие коммерческие (промышленные) и лабораторные ферментные препараты: ферментные препараты на основе грибов рода Penicillium - препарат PV2007 (получен с помощью штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D, как указано в примере 2), препарат S-2006 (получен с помощью штамма P.funiculosum S2006 ВКМ F-3887D как указано в заявке на патент РФ №2006110721/13 (011668), C12N 9/00, С12Р 19/00 от 4 апреля 2006 г.), ферментные препараты на основе грибов рода Trichoderma: препарат Целловиридин Г20Х (T.longibrachiatum), компании ООО «Промфермент» (Россия), препарат BioACE компании Dyadic International Ltd., США (T.longibrachiatum), препараты Spezyme CP и Accellerase 1000 компании Genencor/Danisco, препарат Celluclast 1.5L (T.reesei) компании Novozymes, Дания, препарат Fibrilase HDL 160 (Т.reesei), компании Iogen, Канада. Удельные активности ферментных препаратов (в ед/мг белка) приведены в таблице 1.

Таблица 1. Препарат Источник Авицелазa КМЦ-аза β-глюкозидаза Ксиланаза PV2007 P.verruculosum 2,8 32,1 1,80 37,2 S-2006 P.funiculosum 0,82 28,2 1,70 32,3 Целловиридин Г20Х   0,35 18,4 0,24 11,9 BioACE   0,47 7,4 0,14 0,9 Spezyme CP Trichoderma 1,8 21,9 0,40 6,4 Accellerase 1000   2,3 23,8 3,80 2,9 Celluclast 1.5 L   0,36 14,0 0,19 2,1 Fibrilase HDL   0,26 20,4 0,65 1,5

Из данных таблицы 1 очевидно, что наибольшую активность проявляет ферментный препарат PV2007, полученный с помощью заявляемого штамма P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D.

Методы определения активности. Целлобиогидролазную (авицелазную) активность измеряют проводя гидролиз МКЦ (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 60 минут. После этого определяют в реакционной смеси концентрацию восстанавливающих сахаров (ВС) методом Нельсона-Сомоджи. За единицу целлобиогидролазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минут при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе суспензии МКЦ концентрацией 5 мг/мл освобождает количество ВС, эквивалентных 1 микромолю глюкозы, и определяемых методом Сомоджи-Нельсона.

Эндоглюканазную (КМЦ-азную) активность измеряют, проводя гидролиз водорастворимой Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу эндоглюканазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора КМЦ концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентного 1 микромолю глюкозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

β-Глюкозидазную активность измеряют, проводя гидролиз 0,5 мг/мл п-нитрофенил-β-D-глюкозида (пНФГ) при рН 5,0 (0,05 М ацетатный буфер) и 40°С в течение 10 минут. Реакцию останавливают 1 М Nа₂СО₃, после чего измеряют оптическую плотность при 400 нм. За единицу β-глюкозидазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при рН 5,0 и 40°С приводит к образованию 1 микромоля п-нитрофенола.

Целлобиазную активность измеряют проводя гидролиз целлобиозы (2,5 мМ) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 40°С в течение 10 минут. За единицу целлобиазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 40°С и рН 5,0 при гидролизе раствора целлобиозы концентрацией 2,5 мМ приводит к образованию 1 микромоль глюкозы (глюкозу определяют глюкозооксидазно-пероксидазным методом. Итоги науки и техники, серия Биотехнология, т.25, ВИНИТИ, Москва, 1993, с.34).

Ксиланазную активность измеряют проводя гидролиз березового ксилана (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу ксиланазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора ксилана концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентных 1 микромолю ксилозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учебное пособие, М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).

Ксилоглюканазную активность измеряют проводя гидролиз ксилоглюкана тамариска (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу ксилоглюканазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора ксилоглюкана концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентных 1 микромолю глюкозы, определяемых методом Сомоджи-Нельсона.

Таким образом, предлагаемый штамм P.verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных целлюлаз, включающий целлобиогидролазы, эндоглюканазы, целлобиазы (β-глюкозидазы) и сопутствующих ферментов (ксиланаз и ксилоглюканаз), что создает возможность получения активного и полного комплекса ферментов, а также, при необходимости - отдельных индивидуальных ферментов, гидролизующих основные компоненты клеточной стенки растений, осуществляющих биодеградацию целлюлозо- и гемицеллюлозосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, а также осуществляющих конверсию растительной биомассы и получение сахаров, биоэтанола и других продуктов микробного синтеза, для получения ферментов для применения в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок в кормах, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Для достижения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Технический результат, получаемый при реализации предложенного технического решения, состоит в существенном увеличении эффективности действия ферментных препаратов и расширении спектра использования ферментных препаратов в различных областях биотехнологии.

Ферментный препарат комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы получают культивированием штамма Penicillium verruculosum BKM F-3972D на водной среде, содержащей в г/л: целлюлозу - 50-60, глюкозу - 10-30, минеральные соли - KН₂РО₄ 8-12, (NH₂)₂SO₄ 3-7, MgSO₄·7H₂O 0,2-0,4, CaCl₂·2H₂O 0,2-0,4, при непрерывной подпитке глюкозой. Процесс культивирования ведут при температуре 26-30°С и поддержании рН в диапазоне 4,5-5,0. Культуральную жидкость, содержащую ферментный препарат, отделяют через 120-144 ч после начала культивирования, подвергают ультрафильтрации и высушивают. Это обеспечивает высокую специфическую активность комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способствует повышению эффективности использования ферментного препарата в различных областях биотехнологии. 2 н.п. ф-лы., 1 табл.

1. Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum BKM F-3972D - продуцент комплекса целлюлаз, содержащего целлобиогидролазу, эндоглюканазу, β-глюкозидазу, целлобиазу, ксиланазу и ксилоглюканазу.

2. Способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы, характеризующийся тем, что штамм Penicillium verruculosum BKM F-3972D культивируют на водной питательной среде, содержащей, г/л: целлюлозу 50-60, глюкозу 10-30, KН₂РO₄ 8-12,
(NH₂)₂SO₄ 3-7, MgSO₄·7H₂O 0,2-0,4, CaCl₂·2H₂O 0,2-0,4, при подпитке глюкозой, при температуре 26-30°С и рН в диапазоне 4,5-5,0, через 120-144 ч после начала культивирования культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации и высушивают.