СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ САХАРНОГО РАСТВОРА Российский патент 2015 года по МПК C13K1/02 C12P19/14 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу изготовления сахарного раствора из целлюлозы и к устройству для этого способа.

Уровень техники

Способы ферментативного производства химических продуктов с использованием сахаров в качестве исходных материалов применяют для изготовления разнообразных промышленных материалов. В настоящее время в качестве сахаров, используемых как исходные материалы для ферментации, в промышленности применяют сахара, полученные из пищевых материалов, таких как сахарный тростник, крахмал и сахарная свекла. Однако, учитывая, что ожидается увеличение цен на продукты питания вследствие грядущего роста мирового населения, или что с этической точки зрения сахара как промышленные материалы могут конкурировать с сахарами как продуктами питания, в будущем должен быть разработан способ эффективного производства сахарного раствора из возобновляемых непищевых ресурсов, то есть содержащей целлюлозу биомассы, или способ использования полученного сахарного раствора как исходный материал для ферментации в целях эффективной переработки сахарного раствора в промышленные материалы.

Примеры описанных способов изготовления сахарного раствора из содержащей целлюлозу биомассы включают способы изготовления сахарных растворов путем кислотного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы с использованием концентрированной серной кислоты (патентные документы 1 и 2) и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролитической обработке, используя разбавленную серную кислоту, и затем подвергают ферментативной обработке целлюлазой или аналогичным ферментом для получения сахарного раствора (непатентный документ 1). Кроме того, примеры описанных способов без использования кислоты включают способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу гидролизуют, используя докритическую воду при температуре, составляющей приблизительно от 250°C до 500°C, для изготовления сахарного раствора (патентный документ 3), способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают обработке докритической водой и затем ферментативной обработке для получения сахарного раствора (патентный документ 4), и способ, в котором содержащую целлюлозу биомассу подвергают гидролитической обработке сжатой горячей водой при температуре от 240°C до 280°C и затем ферментативной обработке для получения сахарного раствора (патентный документ 5).

В последние годы всесторонне исследуют способы гидролиза биомассы, которые используют меньше энергии и оказывают меньшее воздействие на окружающую среду, но обеспечивают высокие выходы сахара. Однако указанные способы с использованием ферментов имеют недостаток, который заключается в высокой стоимости ферментов.

Для решения этих технических проблем предложены способы извлечения и повторного использования ферментов, применяемых в гидролизе. Примеры таких описанных способов включают способ, в котором непрерывное разделение твердых и жидких фаз осуществляют, используя центробежный фильтр, и полученный сахарный раствор фильтруют через ультрафильтрационную мембрану для извлечения ферментов (патентный документ 6), способ, в котором поверхностно-активное вещество поступает на стадии ферментативного осахаривания для подавления адсорбции фермента, и в результате этого повышается эффективность извлечения (патентный документ 7), способ, в котором остаток, полученный ферментативным осахариванием, подвергают электрической обработке для извлечения ферментативного компонента (патентный документ 8), и способ, в котором остаток, полученный ферментативным осахариванием, снова поступает в следующую партию биомассы, и в результате чего повторно используются ферменты (патентный документ 9).

Документы уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: японская переведенная выложенная патентная заявка согласно PCT № 11- 506934

Патентный документ 2: японский патент № 2005-229821 A

Патентный документ 3: японский патент № 2003-212888 A

Патентный документ 4: японский патент № 2001-95597 A

Патентный документ 5: японский патент № 3041380 B

Патентный документ 6: японский патент № 2006-87319

Патентный документ 7: японский патент № 63-87994 A

Патентный документ 8: японский патент № 2008-206484 A

Патентный документ 9: японский патент № 55-144885 A

Непатентные документы

Непатентный документ 1: A. Aden и др. «Проект переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол и экономика с использованием прямоточного предварительного гидролиза разбавленной кислотой и ферментативного гидролиза для кукурузной соломы», технический отчет NREL, 2002 г.

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Разработаны описанные выше способы производства сахарных растворов путем извлечения/повторного использования фермента, но эффекты этих способов оказались недостаточными с точки зрения уменьшения количества используемого фермента. Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы разработать способ, в котором эффект уменьшения количества фермента превышает уровни, достигнутые в традиционных способах.

Средства решения проблем

Авторы настоящего изобретения проводили интенсивные исследования для решения вышеуказанных проблем и в результате изобрели способ гидролиза целлюлозы с использованием мицелиальной полученной из грибов целлюлазы в качестве карбогидразы, и этот способ включает: стадию добавления карбогидразы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза и последующего подвергания первичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения первичного сахарного раствора и твердых веществ; стадию добавления воды к твердым веществам и осуществления вторичного гидролиза с последующим подверганием вторичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения вторичного сахарного раствора и остатка; и стадию фильтрования первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора через ультрафильтрационную мембрану и извлечения карбогидразы на стороне подачи и извлечения сахарного раствора на стороне фильтрата.

Таким образом, настоящее изобретение содержит перечисленные ниже компоненты (1)-(13).

(1) Способ изготовления сахарного раствора с использованием в качестве карбогидразы полученной из мицелиальных грибов целлюлазы для гидролиза целлюлозы, причем способ включает:

стадию добавления указанной карбогидразы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза и последующего подвергания первичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения первичного сахарного раствора и твердых веществ;

стадию добавления воды к твердым веществам и осуществления вторичного гидролиза с последующим подверганием вторичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения вторичного сахарного раствора и остатка; и

стадию фильтрования первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора через ультрафильтрационную мембрану, извлечения карбогидразы на стороне подачи и извлечения сахарного раствора на стороне фильтрата.

(2) Способ изготовления сахарного раствора по п. (1), в котором полученная из мицелиальных грибов целлюлаза представляет собой полученную из грибов Trichoderma целлюлазу.

(3) Способ изготовления сахарного раствора по п. (1) или (2), в котором целлюлозу получают из обработанного продукта, полученного из биомассы аммиачной обработкой, гидротермальной обработкой или обработкой разбавленной серной кислотой.

(4) Способ изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(3), в котором вторичный гидролиз представляет собой гидролиз в присутствии одного или более веществ, выбранных из группы, которую составляют неорганические соли (за исключением солей кальция), гидрофильные органические растворители, аминокислоты и неионные поверхностно-активные вещества, и сахарные растворы, включающие эти вещества.

(5) Способ изготовления сахарного раствора по п. (4), в котором неорганическая соль (неорганические соли) (за исключением солей кальция) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют соли натрия, соли калия, соли магния, соли серной кислоты, соли аммония, соли хлористоводородной кислоты, соли фосфорной кислоты, соли уксусной кислоты и соли азотной кислоты.

(6) Способ изготовления сахарного раствора по п. (5), в котором неорганическая соль (неорганические соли) (за исключением солей кальция) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют хлорид натрия, ацетат натрия, сульфат натрия, гидросульфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия, хлорид аммония, гидрофосфат калия, сульфат аммония, хлорид магния и сульфат магния.

(7) Способ изготовления сахарного раствора по п. (4), в котором гидрофильный органический растворитель (гидрофильные органические растворители) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют метанол, этанол, 1-пропанол, изопропанол, N,N-диметилформамид, бутанол, ацетон, ацетонитрил, этиленгликоль и глицерин.

(8) Способ изготовления сахарного раствора по п. (4), в котором аминокислота (аминокислоты) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют аргинин, цистеин, глютаминовая кислота, гистидин и лизин.

(9) Способ изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(8), в котором разделение твердых и жидких фаз первичного гидролизата и/или вторичного гидролизата представляет собой пресс-фильтрацию.

(10) Способ изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(9), причем способ включает стадию фильтрования сахарного раствора через обратноосмотическую мембрану и/или нанофильтрационную мембрану для концентрирования сахарного раствора.

(11) Устройство для способа изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(10), причем устройство включает в качестве компонентов реакционный бак с мешалкой для первичного гидролиза; устройство для разделения твердых и жидких фаз; бак вторичного гидролиза или пресс-фильтр для вторичного гидролиза; устройство (устройства) разделения твердых и жидких фаз для первичного гидролизата и/или вторичного гидролизата; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для отделения карбогидразы и сахарного раствора от первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора.

(12) Устройство для способа изготовления сахарного раствора по любому из пп. (1)-(10), причем устройство включает в качестве компонентов реакционный бак для первичного гидролиза; пресс-фильтр, содержащий питающий бак с теплой водой; циркуляционную линию для циркуляции фильтрата из пресс-фильтра в питающий бак с теплой водой; и устройство с ультрафильтрационной мембраной для отделения карбогидразы и сахарного раствора от первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора.

(13) Устройство по п. (11) или (12), включающее в качестве компонента устройство концентрирования сахарного раствора, снабженное обратноосмотической мембраной и/или нанофильтрационной мембраной для концентрирования сахарного раствора, полученного с помощью устройства с ультрафильтрационной мембраной.

Эффект изобретения

В настоящем изобретении после первичного гидролиза следует разделение твердых и жидких фаз, и остаточные ферментативные компоненты, содержащиеся в полученных твердых веществах, используют для осуществления вторичного гидролиза. Так создается 1) эффект увеличения выхода сахара и 2) эффект увеличения извлеченного количества фермента. Таким образом, настоящее изобретение имеет экономическое преимущество по сравнению с традиционными технологиями.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 2 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 3 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 4 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в камере пресс-фильтра.

Фиг. 5 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 6 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 7 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в камере пресс-фильтра.

Фиг. 8 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 9 представляет чертеж, изображающий результаты анализа фермента, содержащегося во вторичном сахарном растворе, полученном способом изготовления сахарного раствора по изобретению.

Фиг. 10 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в баке вторичного гидролиза, который отделен от бака первичного гидролиза.

Фиг. 11 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в баке вторичного гидролиза, который отделен от бака первичного гидролиза.

Фиг. 12 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в баке вторичного гидролиза, который отделен от бака первичного гидролиза.

Фиг. 13 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором первичный гидролиз и вторичный гидролиз в способе изготовления сахарного раствора по изобретению осуществляют в одном баке.

Фиг. 14 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором устройство с микрофильтрационной мембраной установлено выше по потоку относительно устройства с ультрафильтрационной мембраной.

Фиг. 15 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором фильтрование в поперечном потоке осуществляют, используя микрофильтрационный мембранный модуль.

Фиг. 16 представляет схематический чертеж, изображающий вариант осуществления, в котором тупиковое фильтрование осуществляют, используя микрофильтрационный мембранный модуль.

Наилучший способ осуществления изобретения

Большие количества целлюлозных материалов содержат травяные биомассы, такие как багасса (выжимки от получения сахара из тростника), просо прутьевидное, слоновая трава, эриантус сахаристый, кукурузная солома, рисовая солома и пшеничная солома; и древесные биомассы, такие как деревья и отходы от строительных материалов. Эти содержащие целлюлозу биомассы можно предпочтительно использовать в качестве исходных материалов в настоящем изобретении.

Содержащая целлюлозу биомасса содержит, помимо целлюлозы и гемицеллюлозы (далее в настоящем документе используется общий термин «целлюлоза» для обозначения целлюлозы и гемицеллюлозы), лигнин и другие вещества, которые представляют собой ароматические макромолекулы. Таким образом, в тех случаях, когда полученную из биомассы целлюлозу используют в качестве исходного материала для сахарного раствора в способе изготовления сахарного раствора по изобретению, эффективность ферментативного гидролиза можно повышать посредством предварительной обработки. Примеры способов предварительной обработки содержащей целлюлозу биомассы включают кислотную обработку, обработку серной кислотой, обработку разбавленной серной кислотой, щелочную обработку, обработку гидроксидом натрия, аммиачную обработку, гидротермальную обработку, обработку докритической водой, пульверизационную обработку и паровую обработку. В настоящем изобретении, способ предварительной обработки предпочтительно представляет собой аммиачную обработку, гидротермальную обработку или обработку разбавленной серной кислотой.

Аммиачную обработку осуществляют согласно японским патентам № 2008-161125 и № 2008-535664 A. Например, к биомассе добавляют аммиак в концентрации, составляющей от 0,1 до 15 масс. %, и обработку осуществляют при температуре от 4 до 200°C, предпочтительно от 90 до 150°C. Добавляемый аммиак может находиться в состоянии жидкости или газа. Кроме того, форма добавляемого аммиака может представлять собой чистый аммиак или водный раствор аммиака. Кратность обработки не ограничена, и обработку можно осуществлять однократно или многократно. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или большее число раз, условия первой обработки могут отличаться от условий второй и последующей обработок. Обработанный продукт, полученный посредством аммиачной обработки, необходимо направлять на нейтрализацию аммиака или удаление аммиака в целях дальнейшего осуществления реакции ферментативного гидролиза. Нейтрализацию аммиака можно осуществлять как после отделения твердых веществ от гидролизата путем разделения твердых и жидких фаз или в состоянии, в котором содержатся твердые вещества. Кислотный реагент, используемый для нейтрализации, не является ограниченным. Аммиак можно удалять, выдерживая обработанный аммиаком продукт при пониженном давлении, обеспечивая испарение аммиака и его переход в газообразное состояние. Отделенный аммиак можно извлекать и повторно использовать.

В случае обработки разбавленной серной кислотой концентрация серной кислоты составляет предпочтительно от 0,1 до 15 масс. %, предпочтительнее от 0,5 до 5 масс. %. Температуру реакции можно устанавливать в интервале от 100 до 300°C, и ее предпочтительно устанавливают в интервале от 120 до 250°C. Время реакции можно устанавливать в интервале от 1 секунды до 60 минут. Кратность обработки не является ограниченной, и можно осуществлять однократную или многократную обработку. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующей обработок. Поскольку гидролизат, полученный посредством обработки разбавленной серной кислотой, содержит кислоту, необходима нейтрализация для последующего осуществления реакции гидролиза с целлюлазой или в целях использования гидролизата в качестве исходного материала для ферментации.

В случае гидротермальной обработки воду добавляют таким образом, что содержащая целлюлозу биомасса составляет от 0,1 до 50 масс. %, и обработку затем осуществляют при температуре от 100 до 400°C в течение от 1 секунды до 60 минут. При осуществлении обработки в условиях такой температуры происходит гидролиз целлюлозы. Кратность обработки не является ограниченной, и можно осуществлять однократную или многократную обработку. В частности, в тех случаях, когда обработку осуществляют два или более раз, условия для первой обработки могут отличаться от условий для второй и последующей обработок.

Целлюлаза, используемая в настоящем изобретении, представляет собой полученную из мицелиальных грибов целлюлазу. Примеры мицелиальных грибов включают микроорганизмы, такие как Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor и Talaromyces. Поскольку эти микроорганизмы выделяют целлюлазу в культуральную среду, можно использовать культуральную среду, поскольку она представляет собой неочищенную полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, или можно очищать культуральную среду и готовить составы для использования в виде смеси, содержащей полученную из мицелиальных грибов целлюлазу. В тех случаях, когда полученную из мицелиальных грибов целлюлазу используют в качестве очищенного и составленного продукта, можно добавлять помимо фермента другое вещество (другие вещества), такие как ингибитор протеазы, диспергатор, солюбилизатор и/или стабилизатор, для приготовления состава, содержащего целлюлазу.

Полученная из мицелиальных грибов целлюлаза, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой целлюлазу, которую выделяют грибы Trichoderma (далее в настоящем документе называется полученная из грибов Trichoderma целлюлаза). В настоящем изобретении полученная из грибов Trichoderma целлюлаза предпочтительно представляет собой целлюлазу, полученную из грибов Trichoderma reesei, и конкретные примеры предпочтительных микроорганизмов Trichoderma, из которых получают целлюлазу, включают Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei RutC-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 и Trichoderma viride QM9123. Целлюлазу можно также получать из мутантного штамма, происходящего из описанных выше микроорганизмов Trichoderma, причем данный мутантный штамм получают путем мутагенеза, используя мутаген, ультрафиолетовое облучение или подобное средство, чтобы повысить способность производить целлюлазу.

Полученная из мицелиальных грибов целлюлаза представляет собой ферментативную композицию, включающую множество ферментативных компонентов, таких как целлобиогидролаза, эндоглюканаза, экзоглюканаза, β-глюкозидаза, ксиланаза и ксилозидаза, причем данная ферментативная композиция обладает активностью, чтобы гидролизовать и осахаривать целлюлозу. Поскольку полученная из мицелиальных грибов целлюлаза включает такое множество ферментативных компонентов и обеспечивает при разложении целлюлозы эффективный гидролиз целлюлозы вследствие их комбинированного эффекта или комплементарного эффекта, полученную из мицелиальных грибов целлюлазу предпочтительно используют в настоящем изобретении.

Целлобиогидролаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют целлюлозу с концевых участков. Группа ферментов, принадлежащих к целлобиогидролазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.91.

Эндоглюканаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы с их центральных участков. Группа ферментов, принадлежащих к эндоглюканазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.4.

Экзоглюканаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы с их концевых участков. Группа ферментов, принадлежащих к экзоглюканазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.74.

β-глюкозидаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые воздействуют на целлоолигосахариды или целлобиозу. Группа ферментов, принадлежащих к β-глюкозидазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.21.

Ксиланаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые воздействуют на гемицеллюлозу или, в частности, ксилан. Группа ферментов, принадлежащих к ксиланазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.8.

Ксилозидаза представляет собой общий термин для целлюлаз, которые воздействуют на ксилоолигосахариды. Группа ферментов, принадлежащих к ксилозидазе, описывается номером EC: EC 3.2.1.37.

Такие компоненты полученной из мицелиальных грибов целлюлазы можно разделять, используя известный способ, такой как гель-фильтрация, ионный обмен или двухмерный электрофорез, и разделенные компоненты можно направлять на анализ последовательности аминокислот (анализ концевых атомов N, анализ концевых атомов C или масс-спектрометрический анализ), за которым следует сравнение последовательностей с базой данных.

Ферментативную активность полученной из мицелиальных грибов целлюлазы можно оценивать на основании ее гидролитической активности по отношению к полисахаридам, такой как активность разложения Avicel, активность разложения карбоксиметилцеллюлозы (CMC), активность разложения целлобиозы, активность разложения ксилана и активность разложения маннана. Основные компоненты целлюлазы, определяющие активность разложения Avicel, представляют собой целлобиогидролазу и экзоглюканазу, которые разлагают целлюлозу с ее концевых участков. Основные компоненты целлюлазы, определяющие активность разложения ксилана, представляют собой ксиланазу и ксилозидазу. Основной компонент целлюлазы, определяющий активность разложения целлобиозы, представляет собой β-глюкозидазу. Основные компоненты целлюлазы, определяющие активность разложения CMC, представляют собой целлобиогидролазу, экзоглюканазу и эндоглюканазу. Термин «основной» в настоящем документе используют для обозначения того, что компонент (компоненты) принимает/принимают участие в разложении в наиболее высокой степени, хотя и другие ферментативные компоненты также принимают участие в разложении.

В качестве полученной из мицелиальных грибов целлюлазы предпочтительно используют неочищенный ферментативный продукт. Неочищенный ферментативный продукт выделяют из культуральной надосадочной жидкости, полученной после культивирования микроорганизмов, принадлежащих к роду мицелиальных грибов, в течение заданного периода в среде, приготовленной таким образом, что микроорганизмы производят целлюлазу. Используемые компоненты среды не являются ограниченными, и можно обычно использовать среду с добавкой целлюлозы, чтобы способствовать производству целлюлазы. В качестве неочищенного ферментативного продукта культуральную жидкость можно использовать в неизменном виде, или культуральную надосадочную жидкость обрабатывают, удаляя только мицелиальные грибы, которые можно предпочтительно использовать.

Массовые соотношения ферментативных компонентов в неочищенном ферментативном продукте не являются ограниченными, и, например, культуральная жидкость, полученная из грибов Trichoderma reesei, содержит от 50 до 95 масс. % целлобиогидролазы, а также содержит в качестве других компонентов эндоглюканазу, β-глюкозидазу и подобные ферменты. Микроорганизмы, принадлежащие к роду Trichoderma, выделяют сильные компоненты целлюлазы в культуральную жидкость, в то время как активность β-глюкозидазы в культуральной жидкости является низкой, поскольку β-глюкозидаза удерживается в клетках или на поверхностях клеток. Таким образом, β-глюкозидазу из различных видов или из одного вида можно добавлять в неочищенный ферментативный продукт. В качестве β-глюкозидазы из различных видов можно предпочтительно использовать β-глюкозидазу, полученную из Aspergillus. примеры β-глюкозидазы, полученной из Aspergillus, включают Novozyme 188, который поставляет на продажу фирма Novozyme. Способ добавления β-глюкозидазы из различных видов или из одного вида в неочищенный ферментативный продукт может представлять собой способ, в котором ген вводят в микроорганизм, принадлежащий к Trichoderma, чтобы осуществлять генетическую рекомбинацию микроорганизма таким образом, что β-глюкозидаза выделяется в культуральную жидкость, и микроорганизм, принадлежащий к Trichoderma, затем культивируют с последующим отделением культуральной жидкости.

В настоящем изобретении гидролиз целлюлозы, используя полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, осуществляют в две стадии, то есть осуществляют первичный гидролиз и вторичный гидролиз. Эти стадии далее описаны по порядку.

Первичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что карбогидразу добавляют к целлюлозе, которая не вступала в контакт с карбогидразой, чтобы осуществлять гидролиз. Фермент, используемый для первичного гидролиза, может представлять собой вышеупомянутый свежий фермент или извлеченный фермент, и, учитывая уменьшение количества используемого фермента, в частности количества используемого свежего фермента, предпочтительно использовать смесь извлеченного фермента и свежего фермента.

Температура реакции во время первичного гидролиза составляет предпочтительно от 40 до 60°C, и, особенно в тех случаях, когда используют полученную из грибов Trichoderma целлюлазу, температура реакции предпочтительнее составляет от 45 до 55°C.

Время реакции первичного гидролиза составляет предпочтительно от 2 часов до 200 часов. В тех случаях, когда время реакции составляет менее чем 2 часов, выход сахара оказывается недостаточным, что не является предпочтительным. С другой стороны, в тех случаях, когда время реакции составляет более чем 200 часов, ферментативная активность уменьшается, что не является предпочтительным, поскольку в вышеупомянутом вторичном гидролизе выход сахара оказывается недостаточным, и фермент невозможно извлекать.

Значение pH во время первичного гидролиза составляет предпочтительно от 4,0 до 5,5. В тех случаях, когда полученную из грибов Trichoderma целлюлазу используют в качестве полученной из мицелиальных грибов целлюлазы, оптимальное значение pH реакции составляет 5,0, но, особенно в случае первичного гидролиза, pH изменяется во время гидролиза. Таким образом, предпочтительно осуществлять гидролиз, поддерживая при этом постоянное значение pH, используя кислоту или щелочь.

Первичный гидролизат содержит первичный сахарный раствор и твердые вещества, и твердые вещества содержат полисахаридные компоненты, такие как неразложившаяся целлюлоза и гемицеллюлоза, и компоненты, которые невозможно первоначально разлагать с помощью карбогидразы, такие как лигнин. Кроме того, относительно большое количество полученной из мицелиальных грибов целлюлазы адсорбируется на твердых веществах. Таким образом, в настоящем изобретении, чтобы осуществлять вышеупомянутый вторичный гидролиз, используя полисахаридные компоненты и полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, которая содержится в твердых веществах, полученных первичным гидролизом, полученные твердые вещества извлекают путем разделения твердых и жидких фаз. Примеры способов разделения твердых и жидких фаз включают центрифугирование и пресс-фильтрацию, и в настоящем изобретении является предпочтительным извлечение твердых веществ путем пресс-фильтрации.

Причина, по которой пресс-фильтрация является предпочтительной для разделения твердых и жидких фаз, заключается в том, что 1) может быть достигнут высокий выход сахарного раствора. Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить повышенное извлечение сахара и извлечение фермента по сравнению с показателями традиционных технологий. Таким образом, способ разделения твердых и жидких фаз представляет собой предпочтительный способ, который позволяет единовременно извлекать большее количество компонентов сахарного раствора. Извлечение компонентов сахарного раствора путем разделения твердых и жидких фаз можно усовершенствовать, в частности, увеличивая количество воды, добавляемой после вторичного гидролиза. Однако увеличение количества добавляемой воды вызывает уменьшение концентрации сахара во вторичном сахарном растворе, что не является предпочтительным. Таким образом, в целях уменьшения количества используемой воды при одновременном достижении высокого извлечения сахара разделение твердых и жидких фаз предпочтительно осуществляют посредством пресс-фильтра. Еще одна причина, по которой пресс-фильтрация является предпочтительной, заключается в том, что 2) можно получать прозрачный фильтрат. В настоящем изобретении первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор, полученный посредством разделения твердых и жидких фаз, фильтруют через ультрафильтрационную мембрану для извлечения ферментативных компонентов. Сахарный раствор, пропускаемый через ультрафильтрационную мембрану, предпочтительно содержит лишь небольшие количества твердых веществ и мелкодисперсных компонентов в целях предотвращения засорения мембраны, и в случае фильтрования в пресс-фильтре фильтрат содержит лишь небольшие количества твердых веществ и мелкодисперсных компонентов, и его можно, таким образом, предпочтительно использовать в настоящем изобретении.

Вторичный гидролиз в настоящем изобретении означает, что второй гидролиз осуществляют для твердых веществ, полученных путем разделения твердых и жидких фаз первичного гидролизата, используя только полученную из мицелиальных грибов целлюлазу, адсорбированную на твердых веществах. Таким образом, при вторичном гидролизе гидролиз твердых веществ осуществляют только с адсорбированным ферментом без дополнительного введения карбогидразы.

По сравнению с традиционными технологиями (в которых осуществляют только первичный гидролиз) настоящее изобретение отличается тем, что вторичный гидролиз осуществляют без дополнительного введения фермента, чтобы повысить выход сахара и/или коэффициент извлечения фермента. Производство сахара и/или извлечение фермента можно, разумеется, осуществлять также и в традиционных технологиях, но посредством осуществления вторичного гидролиза по изобретению можно извлекать больше сахара и фермента. Основная причина этого заключается в предотвращении ингибирования фермента путем отделения полученного сахара. Гидролизат после первичного гидролиза содержит большое количество компонентов сахара. Осуществляя разделение твердых и жидких фаз для удаления сахаров (глюкоза, ксилоза и олигосахариды), полученных путем гидролиза, и вводя дополнительное количество воды, можно уменьшать концентрацию полученных сахаров, содержащихся в качестве компоненты раствора. Таким путем можно предотвращать ингибирование фермента продуктами, и вторичный гидролиз можно в достаточной степени осуществлять, используя только фермент, адсорбированный на твердых веществах. Таким образом, даже при таком же количестве использованного фермента, как в традиционной технологии, можно извлекать больше сахара и/или фермента путем осуществления вторичного гидролиза по изобретению.

Количество воды, добавляемой по изобретению, не является ограниченным, и добавление предпочтительно осуществляют таким образом, что концентрация твердых веществ перед вторичным гидролизом составляет от 1 масс. % до 20 масс. %. В тех случаях, когда концентрация твердых веществ составляет более чем 20 масс. %, и в тех случаях, когда концентрация твердых веществ составляет менее чем 1 масс. %, выход сахара и/или извлеченное количество фермента может быть низким, что является неэффективным и нежелательным.

Температура реакции во время вторичного гидролиза составляет предпочтительно от 40 до 60°C, и, в частности, в тех случаях, когда используют полученную из грибов Trichoderma целлюлазу, температура реакции составляет предпочтительнее от 40 до 55°C, наиболее предпочтительно около 50°C.

Время реакции вторичного гидролиза составляет предпочтительно от 5 до 180 минут. В тех случаях, когда время реакции составляет менее чем 5 минут, эффективность извлечения адсорбированного фермента является низкой, при этом даже в тех случаях, когда реакцию осуществляют в течение не менее чем 180 минут, эффективность извлечения адсорбированного фермента не увеличивается, что является неэффективным.

Значение pH во время вторичного гидролиза составляет предпочтительно от 6,0 до 8,0. В тех случаях, когда полученную из грибов Trichoderma целлюлазу используют в качестве полученной из мицелиальных грибов целлюлазы, оптимальное значение pH реакции составляет 5,0 и, в частности, в случае первичного гидролиза, реакцию предпочтительно осуществляют при pH 5,0. С другой стороны, при вторичном гидролизе, поскольку основная цель представляет собой извлечение адсорбированного фермента, реакцию предпочтительно осуществляют при значении pH в интервале от 6,0 до 8,0, в котором эффективность извлечения адсорбированного фермента является высокой. При pH, составляющем менее чем 6,0, количество извлекаемого фермента уменьшается, в то время как при pH, составляющем более чем 8,0, карбогидраза дезактивируется, что не является предпочтительным. Таким образом, при pH в интервале от 6,0 до 8,0 степень дезактивации карбогидразы является предельно низкой, и эффективность извлечения карбогидразы может быть высокой.

Вторичный гидролизат содержит вторичный сахарный раствор и твердые вещества, и, аналогично случаю первичного гидролиза, их можно отделять друг от друга, используя разделение твердых и жидких фаз, предпочтительно пресс-фильтрацию.

При вторичном гидролизе можно добавлять одно или более соединений, в качестве которых выбирают неионные поверхностно-активные вещества, аминокислоты, неорганические соли (за исключением солей кальция) и гидрофильные органические растворители. Путем добавления такого соединения (соединений) можно увеличивать любой один или более из следующих параметров: выход сахара, количество извлеченного фермента и активность извлеченного фермента. В частности, в тех случаях, когда активность извлеченного фермента является высокой, можно уменьшать количество свежего фермента, добавляемого при повторном использовании извлеченного фермента, что является экономически предпочтительным.

Вторичный гидролиз можно осуществлять в присутствии поверхностно-активного вещества, и поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой неионное поверхностно-активное вещество. Это объясняется тем, что в тех случаях, когда используют катионное поверхностно-активное вещество, анионное поверхностно-активное вещество или амфотерное поверхностно-активное вещество, это поверхностно-активное вещество способствует дезактивации карбогидразы и производит ингибирующее действие на реакцию вторичного гидролиза. Кроме того, активность извлеченного фермента также уменьшается, что не является предпочтительным. С другой стороны, в случае неионного поверхностно-активного вещества можно получать высокую эффективность получения сахара и высокую эффективность извлечения фермента, таким образом, предпочтительно используют неионное поверхностно-активное вещество.

Неионное поверхностно-активное вещество называется также термином «неионогенное поверхностно-активное вещество» и представляет собой поверхностно-активное вещество, гидрофильные фрагменты которого составляет неэлектролит. Конкретные примеры неионных поверхностно-активных веществ включают простые полиоксиэтиленалкилэфиры, блок-сополимеры полиоксипропилена, простые полиоксиэтиленалкилаллилэфиры, сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот, сложные эфиры сорбита и жирных кислот, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирных кислот, полиоксиэтиленнонилфениловые простые эфиры, полиоксиэтиленнафтиловые простые эфиры, полиоксиэтиленоктилфениловые простые эфиры, полиоксиэтиленалкиламины, сложные эфиры глицерина и жирных кислот и полиоксиэтиленоксиды ацетиленового ряда, причем их можно использовать индивидуально или в виде смеси двух или более соединений. Неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой блок-сополимер полиоксипропилена. Молекулярная масса блок-сополимера полиоксипропилена составляет предпочтительно от 500 до 15000.

Неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно добавляют в концентрации, составляющей от 0,05 масс. % до 5 масс. %. В тех случаях, когда концентрация составляет менее чем 0,05 масс. %, эффективность извлечения карбогидразы является низкой, при этом в тех случаях, когда концентрация составляет более чем 5 масс. %, это способствует дезактивации карбогидразы, что оказывается экономически невыгодным и, следовательно, не является предпочтительным.

Вторичный гидролиз можно осуществлять в присутствии неорганической соли (неорганических солей), и примеры неорганической соли (неорганических солей), которые можно использовать, включают соли натрия, соли калия, соли магния, соли серной кислоты, соли аммония, соли хлористоводородной кислоты, соли фосфорной кислоты, соли уксусной кислоты и соли азотной кислоты. Примеры более предпочтительных неорганических солей включают хлорид натрия, ацетат натрия, сульфат натрия, гидросульфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия, гидрофосфат калия, сульфат аммония, хлорид магния и сульфат магния. Среди них хлорид натрия, сульфат натрия и гидросульфат натрия, которые представляют собой соли натрия, а также хлорид магния и сульфат магния, которые представляют собой соли магния, являются наиболее предпочтительными. Путем добавления такой неорганической соли (неорганических солей) можно увеличивать активность разложения Avicel и активность разложения ксилана в извлеченном ферменте.

Кроме того, в качестве альтернативы таким неорганическим солям, можно использовать морскую воду. Морская вода представляет собой водный раствор неорганических солей, который содержит от 2,6 до 2,7% хлорида натрия, от 0,3 до 0,4% хлорида магния, от 0,1 до 0,2% сульфата магния и приблизительно 0,07% хлорида калия и который существует в природе в наибольшем количестве. Таким образом, морскую воду можно использовать в качестве водного раствора неорганических солей во вторичном гидролизе. Значение pH морской воды зависит, главным образом, от ее солевого состава и, как правило, находится в интервале от 8,2 до 8,5. Морскую воду можно использовать во вторичном гидролизе без изменения pH или после установления заданного значения pH. Считается предпочтительным устанавливать значение pH в пределах интервала от 5 до 8,3 в целях повышения ферментативной активности извлеченной целлюлазы. Для регулирования pH можно использовать обычную кислоту, такую как серная кислота или хлористоводородная кислота, причем кислота не ограничивается этими примерами.

Кроме того, в качестве альтернативы такой неорганической соли (неорганических солей), можно использовать золу, полученную путем направления на сжигание в котле содержащей целлюлозу биомассы, предварительно обработанного продукта содержащей целлюлозу биомассы, остатка осахаривания, полученного после гидролиза содержащей целлюлозу биомассы или аналогичного материала. Такая зола содержит большое количество солей калия, и водный раствор неорганических солей можно приготовить растворением солей в воде.

Неорганическую соль (неорганические соли) предпочтительно добавляют в концентрации, составляющей от 0,05 до 5 масс. %. В тех случаях, когда концентрация составляет менее чем 0,05 масс. %, эффективность извлечения карбогидразы является низкой, при этом в тех случаях, когда концентрация составляет более чем 5 масс. %, дезактивация карбогидразы усиливается, что является экономически невыгодным, и, следовательно, не является предпочтительным. В тех случаях, когда морскую воду используют в качестве водного раствора неорганических солей, степень разбавления морской воды предпочтительно устанавливают в интервале от 1/10 до 1.

Вторичный гидролиз можно осуществлять в присутствии гидрофильных органических растворителей. Гидрофильный органический растворитель в настоящем изобретении означает растворитель, имеющий растворимость в воде, составляющую не менее чем 100 г/л при 20°C. С другой стороны, органический растворитель, имеющий растворимость, составляющую менее чем 100 г/л в приведенных выше условиях, называют термином «гидрофобный органический растворитель». Примеры гидрофобных органических растворителей включают, но не ограничиваются этим, 1-бутанол (74 г/л), 1-пентанол (27 г/л), 1-гексанол (5,8 г/л), этилацетат (83 г/л), гексан (следовое количество) и хлороформ (следовое количество). Представительные примеры гидрофильных органических растворителей в настоящем изобретении включают метанол, этанол, 1-пропанол, изопропанол, диметилсульфоксид, N,N-диметилформамид, ацетон, ацетонитрил, этиленгликоль и глицерин. Добавляя такой гидрофильный органический растворитель, можно повысить активность извлеченного фермента в отношении разложения Avicel, что является предпочтительным.

Перечисленные выше гидрофильные органические растворители предпочтительно добавляют в концентрации, составляющей от 0,05 до 5 масс. %. В тех случаях, когда концентрация составляет менее чем 0,05 масс. %, эффективность извлечения карбогидразы является низкой, при этом в тех случаях, когда концентрация составляет более чем 5 масс. %, усиливается дезактивация карбогидразы, что является экономически невыгодным и, следовательно, не является предпочтительным.

Вторичный гидролиз можно осуществлять в присутствии аминокислоты (аминокислот), и примеры аминокислоты (аминокислот), которые можно использовать, включают аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глютамин, глютаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин и их производные. Среди этих аминокислот предпочтительными являются аланин, аргинин, аспарагин, цистеин, глютамин, глютаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан и валин, которые имеют высокую растворимость. Наиболее предпочтительными являются аргинин, цистеин, глютаминовая кислота, гистидин и лизин, которые можно получить с извлеченным ферментом, имеющим высокую активность разложения Avicel.

Перечисленные выше аминокислоты предпочтительно добавляют в концентрации, составляющей от 0,05 до 5 масс. %. В тех случаях, когда концентрация составляет менее чем 0,05 масс. %, эффективность извлечения карбогидразы является низкой, при этом в тех случаях, когда концентрация составляет более чем 5 масс. %, усиливается дезактивация карбогидразы, что является экономически невыгодным и, следовательно, не является предпочтительным.

В настоящем изобретении первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор фильтруют через ультрафильтрационную мембрану, и карбогидразу отделяют/извлекают на стороне подачи, и сахарный раствор извлекают на стороне фильтрата. Предельная молекулярная масса, отсекаемая ультрафильтрационной мембраной, используемой в настоящем изобретении, не является ограниченной, при том условии, что мембрана допускает проникновение глюкозы (молекулярная масса, 180), которая представляет собой моносахарид, и позволяет блокировать фермент. Более конкретно, предельная молекулярная масса может находиться в пределах от 500 до 50000, и ультрафильтрационная мембрана отсекает предельную молекулярную массу, составляющую предпочтительно от 5000 до 50000, предпочтительнее от10000 до 30000. Примеры материала, который можно использовать для функциональной мембраны ультрафильтрационной мембраны, включают полиэфирсульфон (PES), полисульфон (PS), полиакрилонитрил (PAN), поливинилиденфторид (PVDF), регенерированную целлюлозу, целлюлозу, сложный эфир целлюлозы, сульфированный полисульфон, сульфированный полиэфирсульфон, полиолефин, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат и политетрафторэтилен. Поскольку регенерированная целлюлоза, целлюлоза и сложный эфир целлюлозы претерпевают разложение под действием целлюлазы, предпочтительно используют ультрафильтрационную мембрану, содержащую синтетический полимерный материал, такой как PES или PVDF. Примеры способов фильтрования через ультрафильтрационную мембрану включают тупиковое фильтрование и фильтрование в поперечном потоке, и предпочтительный способ представляет собой фильтрование в поперечном потоке в целях подавления засорения мембраны. Примеры формы ультрафильтрационной мембраны, которую можно использовать в качестве соответствующей, включают плоскую мембрану, спирально навитую мембрану, трубчатую мембрану и полую волоконную мембрану. Конкретные примеры ультрафильтрационной мембраны включают тип G-5, тип G-10, тип G-20, тип G-50, тип PW и тип HWS UF, которые производит DESAL; HFM-180, HFM-183, HFM-251, HFM-300, HFM-116, HFM-183, HFM-300, HFK-131, HFK-328, MPT-U20, MPS-U20P и MPS-U20S, которые производит KOCH; SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5; SPV50 и SOW30, которые производит Synder; изделия Microza (зарегистрированный товарный знак) серии UF, которые производит Asahi Kasei Corporation, отсекающие молекулярные массы от 3000 до 100000; и NTR7410 и NTR7450, которые производит Nitto Denko Corporation.

В тех случаях, когда соединение (соединения), например неионное поверхностно-активное вещество (вещества), неорганическая соль (соли), гидрофильный органический растворитель (растворители), аминокислота (аминокислоты) и/или подобные соединения добавляют для вторичного гидролиза, вторичный сахарный раствор, разумеется, содержит добавки этих соединений. Такие соединения могут производить ингибирующее действие на более поздней стадии ферментации в зависимости от своих типов и добавленных количеств. В таком случае только извлеченный фермент можно выделять/извлекать из вторичного сахарного раствора, используя ультрафильтрационную мембрану, и сахарный раствор, содержащий неорганические соли, полученный на стороне фильтрата, можно обрабатывать как жидкие отходы.

В настоящем изобретении предпочтительно фильтровать первичный сахарный раствор и вторичный сахарный раствор через ультрафильтрационную мембрану и далее фильтровать сахарный раствор, полученный на стороне фильтрата, через обратноосмотическую мембрану и/или нанофильтрационную мембрану. В настоящем изобретении, вторичный сахарный раствор может иметь меньшую концентрацию сахара по сравнению с первичным сахарным раствором, так как, например, 1) поскольку вторичный сахарный раствор получают реакцией гидролиза, используя только карбогидразу, адсорбированную на твердых веществах, уменьшается абсолютное количество карбогидразы; и 2) эффективность гидролиза лигноцеллюлозы, которая остается в твердом состоянии, является низкой. Таким образом, в тех случаях, когда только вторичный сахарный раствор или смесь вторичного сахарного раствора и первичного сахарного раствора используют на более поздней стадии ферментации, концентрация продукта ферментации может становиться низкой вследствие низкой концентрации сахара. Однако посредством фильтрования сахарного раствора через обратноосмотическую мембрану и/или нанофильтрационную мембрану можно предотвращать уменьшение концентрации сахара в сахарном растворе. Концентрация сахара в настоящем документе означает суммарное количество моносахаридных компонентов, в частности глюкозы и ксилозы. Степень концентрирования при таком концентрировании сахара не является ограниченной при том условии, что концентрирование осуществляют для достижения концентрации, подходящей для более поздней стадии ферментации. Концентрация сахара в сахарном растворе перед концентрированием не является ограниченной и составляет предпочтительно от 10 г/л до 100 г/л. Концентрация сахара после концентрирования не является ограниченной, и сахарный раствор, как правило, можно предпочтительно использовать на более поздней стадии ферментации тех случаях, когда концентрация сахара составляет от 50 г/л до 200 г/л.

Примеры материалов нанофильтрационной мембраны или обратноосмотической мембраны, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают полимерные материалы, такие как полимеры на основе ацетата целлюлозы, полиамиды, сложные полиэфиры, полиимиды, виниловые полимеры и полисульфоны. Мембрана не ограничена мембраной, состоящей только из одного материала, и может представлять собой мембрану, включающую множество мембранных материалов.

В качестве нанофильтрационной мембраны для использования в настоящем изобретении предпочтительным является спирально навитый мембранный элемент. Конкретные примеры предпочтительного элемента нанофильтрационной мембраны включают элемент нанофильтрационной мембраны на основе ацетата целлюлозы GE Sepa, который производит GE Osmonics; нанофильтрационные мембранные элементы NF99 и NF99HF, которые производит Alfa-Laval и которые содержат полиамидные функциональные слои; нанофильтрационные мембранные элементы NF-45, NF-90, NF-200, NF-270 и NF-400, которые производит FilmTec Corporation и которые содержат сшитые пиперазинполиамидные функциональные слои; и нанофильтрационные мембранные элементы SU-210, SU-220, SU-600 и SU-610, которые производит Toray Industries, Inc. и которые включают нанофильтрационную мембрану UTC60 от того же производителя, содержащую сшитый пиперазинполиамид в качестве основного компонента. Нанофильтрационный мембранный элемент предпочтительнее представляет собой NF99 или NF99HF; NF-45, NF-90, NF-200 или NF-400; или SU-210, SU-220, SU-600 или SU-610. Нанофильтрационный мембранный элемент наиболее предпочтительно представляет собой SU-210, SU-220, SU-600 или SU-610.

В качестве обратноосмотической мембраны для использования в настоящем изобретении спирально навитый мембранный элемент является предпочтительным, как и в случае нанофильтрационной мембраны. Конкретные примеры предпочтительного элемента обратноосмотической мембраны включают полиамидные обратноосмотические мембранные модули, которые производит Toray Industries, Inc., а именно SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-720L, SU-720LF, SU-720R, SU-710P и SU-720P, представляющие собой тип модулей низкого давления, а также SU-810, SU-820, SU-820L и SU-820FA, содержащие UTC70 в качестве обратноосмотической мембраны и представляющие собой тип модулей высокого давления; содержащие ацетат целлюлозы обратноосмотические мембраны от того же производителя SC-L100R, SC-L200R, SC-1100, SC-1200, SC-2100, SC-2200, SC-3100, SC-3200, SC-8100 и SC-8200; NTR-759HR, NTR-729HF, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U и LF10-D, которые производит Nitto Denko Corporation; RO98pHt, RO99, HR98PP и CE4040C-30D, которые производит Alfa-Laval; GE Sepa, которые производит GE; и BW30-4040, TW30-4040, XLE-4040, LP-4040, LE-4040, SW30-4040 и SW30HRLE-4040, которые производит FilmTec Corporation.

Устройство для осуществления описанного выше способа изготовления сахарного раствора по изобретению представлено ниже. Устройство для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению должно включать в качестве компонентов, по меньшей мере, следующие: бак 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза; бак 28 вторичного гидролиза или пресс-фильтр 8 для осуществления вторичного гидролиза; устройство (устройства) (25, 30) разделения твердых и жидких фаз для первичного гидролизата и вторичного гидролизата; и устройство (12, 33) с ультрафильтрационной мембраной для отделения карбогидразы и сахарного раствора от первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора. Для описания вариантов осуществления такого устройства конкретные примеры представлены на Фиг. 2-8 и 10-16. Устройства на Фиг. 2-8 и 10-16 классифицировали как формы 1-4 на основании их характеристик. Форма 1 представляет собой форму устройства, в котором вторичный гидролиз осуществляют в камере пресс-фильтра 8, и соответствует Фиг. 2-8.

Форма 1 представляет собой вариант осуществления, в котором вода циркулирует в камеру пресс-фильтра, и в устройстве этой формы вторичный гидролиз по изобретению можно осуществлять при том условии, что это устройство содержит пресс-фильтр 8 для разделения твердых и жидких фаз. Преимущество этого заключается в том, что состав устройства является простым, и, следовательно, можно сократить расходы на устройство. Однако его недостаток заключается в том, что первичный сахарный раствор и вторичный сахарный раствор загрязняются друг другом в данном устройстве.

Форма 2 представляет собой форму устройства, включающего бак 28 вторичного гидролиза для осуществления вторичного гидролиза. Форма 2 включает отдельный бак 2 с мешалкой и бак 28 вторичного гидролиза. Форма 2 имеет преимущество в том, что твердые вещества можно повторно суспендировать в баке 28 вторичного гидролиза, и эффективность вторичного гидролиза является высокой. В зависимости, в частности, от типов и концентраций соединений, добавляемых для вторичного гидролиза, соединения могут производить ингибирующее действие на позднюю стадию ферментации сахарного раствора. Таким образом, чтобы предотвратить взаимное загрязнение первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора, целесообразно иметь, как в форме 2, бак 28 вторичного гидролиза, предназначенный для осуществления вторичного гидролиза отдельно от бака 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза, и также иметь устройство 30 для разделения твердых и жидких фаз, предназначенное для вторичного сахарного раствора, и устройство 33 с ультрафильтрационной мембраной, предназначенное для вторичного сахарного раствора. Однако Форма 2 имеет недостаток в том, что при увеличении суммарного числа устройств, включая бак 28 вторичного гидролиза, увеличивается стоимость оборудования.

Форма 3, представляющая собой форму устройства, в котором вторичный гидролиз осуществляют в баке 2 с мешалкой, в котором также осуществляют первичный гидролиз, представлена на чертеже. Форма 3 представляет собой форму устройства, в котором гидролизат, полученный в баке 2 с мешалкой, направляют на разделение твердых и жидких фаз и затем снова возвращают в бак 2 с мешалкой, после чего к нему добавляют воду для осуществления вторичного гидролиза. Форма 3 имеет преимущество в том, что число устройств может быть минимальным, и можно уменьшить стоимость оборудования. Однако Форма 3 имеет недостаток в том, что первичный сахарный раствор и вторичный сахарный раствор загрязняют друг друга в данном устройстве.

Примеры формы 4, представляющей собой вариант осуществления, в котором устройство 36 с микрофильтрационной мембраной расположено между устройством 25 для разделения твердых и жидких фаз и устройством 12 с ультрафильтрационной мембраной, которые частично представлены на чертежах. Установка устройства с микрофильтрационной мембраной имеет преимущество в том, что можно отделять нерастворимые микрочастицы, которые невозможно в достаточной степени отделять путем разделения твердых и жидких фаз, и закупоривание мембраны в устройстве 12 с ультрафильтрационной мембраной можно уменьшать на последней стадии.

Таблица 1 Форма Характеристики устройства Соответствующие чертежи 1 Форма устройства, в котором вторичный гидролиз осуществляют в камере пресс-фильтра Фиг. 2-8 2 Форма устройства, в котором вторичный гидролиз осуществляют в баке вторичного гидролиза Фиг. 10-12 3 Форма устройства, в котором вторичный гидролиз осуществляют в баке с мешалкой, который также используют для первичного гидролиза Фиг. 13 4 Форма устройства, в котором устройство с микрофильтрационной мембраной расположено выше по потоку относительно устройства с ультрафильтрационной мембраной (частичная схема) Фиг. 14-16

Форма 1, которая представляет собой вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз осуществляют в пресс-фильтре, описана ниже с помощью схематических иллюстраций, показанных на Фиг. 2-8.

Примеры устройства для осуществления способа изготовления сахарного раствора по изобретению включают устройство, содержащее в качестве компонентов бак 2 с мешалкой для первичного гидролиза, пресс-фильтр 8, имеющее питающий бак с теплой водой 6, циркуляционную линию 10 для циркуляции фильтрата из пресс-фильтра 8 в питающий бак 6 с теплой водой и устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной для отделения карбогидразы и сахарного раствора от первичного сахарного раствора и/или вторичного сахарного раствора. Устройство для способа изготовления сахарного раствора по изобретению описано ниже со ссылкой на примеры устройства, представленного на чертежах.

Фиг. 2 и 3 представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие устройства, в каждом из которых использован пресс-фильтр 8, имеющий впуск 15 теплой воды и впуск 14 гидролизата, представленные отдельно на Фиг. 4. Фиг. 5 и 6 представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие устройства, в каждом из которых использован пресс-фильтр 8, имеющий совместный впуск 21 гидролизата и теплой воды, представленный на Фиг. 7. Фиг. 2 и 5 представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие устройства, каждое из которых содержит отдельно бак 2 с мешалкой и питающий бак 6 с теплой водой. С другой стороны, Фиг. 3 и 6 представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие устройства, в каждом из которых использован бак 2 с мешалкой, который служит также как питающий бак с теплой водой.

Далее подробно описано устройство, представленное на Фиг. 2. Бак 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза имеет впуск 3 для ввода целлюлозы, перемешивающее устройство 4 для смешивания/перемешивания лигноцеллюлозы и термостат 1 для поддержания температуры бака с мешалкой. Первичный гидролизат, полученный в баке 2 с мешалкой, поступает в пресс-фильтр 8 из впуска 14 гидролизата. В пресс-фильтре 8 разделение твердых и жидких фаз осуществляют путем сжатия с помощью компрессора 9, и теплая вода поступает из питающего бака 6 с теплой водой к твердым веществам, находящимся в камере пресс-фильтра, через впуск 15 теплой воды. Питающий бак с теплой водой 6 имеет линию 5 водоснабжения, термостат 7 питающего бака 6 с теплой водой для поддержания температуры теплой воды на заданном уровне и циркуляционную линию 10 для циркуляции фильтрата, полученного путем пресс-фильтрации. Первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор, полученный путем пресс-фильтрации, содержат в баке для сбора фильтрата 11 и фильтруют через устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной. Полученную карбогидразу извлекают и/или повторно используют через линию извлечения карбогидразы.

Далее подробно описано устройство, представленное на Фиг. 3. Бак 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза содержит впуск 3 для ввода целлюлозы, перемешивающее устройство 4 для смешивания/перемешивания целлюлозы и термостат 1 для поддержания температуры бака с мешалкой. Первичный гидролизат, полученный в баке 2 с мешалкой, поступает в пресс-фильтр 8 из впуска 14 гидролизата. В пресс-фильтре 8 разделение твердых и жидких фаз осуществляют путем сжатия компрессором 9. В этом варианте в качестве питающего бака с теплой водой используют бак 2, из которого теплую воду подают к твердым веществам, находящимся в камере пресс-фильтра, через впуск 15 теплой воды. Впуск 14 гидролизата и впуск 15 теплой воды присоединены к пресс-фильтру 8, и поток можно переключать с помощью клапана. Первичный сахарный раствор или вторичный сахарный раствор, полученный путем пресс-фильтрации, содержат в баке 11 для сбора фильтрата и фильтруют через устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной. Полученную карбогидразу извлекают и/или повторно используют через линию извлечения карбогидразы.

Далее подробно описано устройство, представленное на Фиг. 5. Бак 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза содержит впуск 3 для ввода целлюлозы, перемешивающее устройство 4 для смешивания/перемешивания целлюлозы и термостат 1 для поддержания температуры бака с мешалкой. Первичный гидролизат, полученный в баке 2 с мешалкой, поступает в пресс-фильтр 8 из совместного впуска 21 гидролизата и теплой воды. В пресс-фильтре 8 разделение твердых и жидких фаз осуществляют путем сжатия с помощью компрессора 9, и теплая вода поступает из питающего бака 6 с теплой водой 6 к твердым веществам, находящимся в камере пресс-фильтра, через совместный впуск 21 гидролизата и теплой воды. Питающий бак с теплой водой 6 содержит линию 5 водоснабжения, термостат 7 питающего бака 6 с теплой водой для поддержания температуры теплой воды на заданном уровне и циркуляционную линию 10 для циркуляции фильтрата, полученный путем пресс-фильтрации. Первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор, полученный путем пресс-фильтрации, содержат в баке 11 для сбора фильтрата и фильтруют через устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной. Полученную карбогидразу извлекают и/или повторно используют через линию извлечения карбогидразы.

Далее подробно описано устройство, представленное на Фиг. 6. Бак 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза содержит впуск 3 для ввода целлюлозы, перемешивающее устройство 4 для смешивания/перемешивания целлюлозы и термостат 1 для поддержания температуры бака с мешалкой. Первичный гидролизат, полученный в баке 2 с мешалкой, поступает в пресс-фильтр 8 из совместного впуска 21 гидролизата и теплой воды. В пресс-фильтре 8 разделение твердых и жидких фаз осуществляют путем сжатия с помощью компрессора 9, и теплая вода поступает из бака 2 с мешалкой к твердым веществам, находящимся в камере пресс-фильтра, через совместный впуск 21 гидролизата и теплой воды. Первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор, полученный путем пресс-фильтрации, содержат в баке 11 для сбора фильтрата и фильтруют через устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной. Полученную карбогидразу извлекают и/или повторно используют через линию извлечения карбогидразы.

В описанных выше устройствах вторичный гидролиз можно осуществлять, направляя первичный гидролизат на пресс-фильтрацию и подавая и/или циркулируя теплую воду при температуре от 40 до 60°C в бак фильтровальной камеры, содержащий полученные твердые вещества. Поскольку твердые вещества после пресс-фильтрации имеют низкое влагосодержание и низкую текучесть, для осуществления вторичного гидролиза в отдельном баке с мешалкой или аналогичном устройстве требуется энергия, которая расходуется на повторное диспергирование твердых веществ. При поступлении теплой воды, подогретой до температуры в интервале от 40 до 60°C в питающем баке 6 с теплой водой, в камеру пресс-фильтра можно увеличивать активность ферментативных компонентов, адсорбированных на твердых веществах, таким образом, что можно увеличивать вторичный гидролиз по изобретению. В тех случаях, когда количество поступающей теплой воды является чрезмерно большим, концентрация сахара во вторичном сахарном растворе оказывается чрезмерно низкой, что не является предпочтительным. С другой стороны, в тех случаях, когда количество поступающей теплой воды является чрезмерно малым, температуру реакции в фильтровальной камере невозможно поддерживать на достаточном уровне, что не является предпочтительным. Следует отметить, что при нагревании поступившей воды до температуры от 40 до 60°C и повторной циркуляции воды можно поддерживать температуру реакции и можно увеличивать концентрацию сахара во вторичном сахарном растворе. Продолжительность времени поступления и/или циркуляции теплой воды составляет предпочтительно от 5 минут до 180 минут. В тех случаях, когда продолжительность времени составляет менее чем 5 минут, вторичный гидролиз невозможно осуществлять в достаточной степени, при этом в тех случаях, когда продолжительность времени составляет более чем 180 минут, эффективность сахарного производства достигает насыщения, что не является предпочтительным с точки зрения энергии.

Пресс-фильтр представлен на Фиг. 4 и в виде схематических иллюстраций. В устройстве, представленном на Фиг. 4, первичный гидролизат поступает из впуска 14 гидролизата в камеру 20 пресс-фильтра, и разделение твердых и жидких фаз осуществляют путем сжатия с помощью прижимной плиты 19. После этого теплая вода поступает через впуск 15 теплой воды, и теплую воду приводят в контакт с твердыми веществами (первичный гидролизат) 18 и затем фильтруют через фильтровальную ткань 17. Фильтрат далее циркулирует через термостат и поступает обратно в камеру пресс-фильтра через впуск 15 теплой воды. Обеспечивая такую циркуляцию, вторичный гидролиз можно осуществлять в камере пресс-фильтра. Фиг. 7 представляет схематический чертеж, изображающий способ поступления теплой воды через совместный впуск 21 гидролизата и теплой воды. Таким образом, первичный гидролизат поступает через совместный впуск 21 гидролизата и теплой воды в камеру 20 пресс-фильтра и подвергают сжатию с помощью прижимной плиты 19, в результате чего осуществляют разделение твердых и жидких фаз. После этого теплая вода поступает через совместный впуск 21 гидролизата и теплой воды, и теплую воду приводят в контакт с твердыми веществами (первичный гидролизат) 18 и затем фильтруют через фильтровальную ткань 17. Фильтрат далее циркулирует через термостат и поступает обратно в камеру пресс-фильтра через совместный впуск 21 гидролизата и теплой воды. Обеспечивая такую циркуляцию, можно осуществлять вторичный гидролиз в камере пресс-фильтра. Продолжительность времени поступления и/или циркуляции теплой воды в камеру пресс-фильтра составляет предпочтительно от 5 минут до 180 минут. В тех случаях, когда продолжительность времени составляет менее чем 5 минут, вторичный гидролиз невозможно осуществлять в достаточной степени, при этом в тех случаях, когда продолжительность времени составляет более чем 180 минут, эффективность сахарного производства достигает насыщения, что не является предпочтительным с точки зрения энергии. В тех случаях, когда количество поступающей теплой воды является чрезмерно большим, концентрация сахара во вторичном сахарном растворе оказывается чрезмерно низкой, что не является предпочтительным. С другой стороны, в тех случаях, когда количество поступающей теплой воды является чрезмерно малым, температуру реакции в фильтровальной камере невозможно поддерживать на достаточном уровне, что не является предпочтительным. В таких случаях путем нагревания поступающей воды до температуры от 40 до 60°C и повторной циркуляции воды можно поддерживать температуру реакции, и можно увеличивать концентрацию сахара во вторичном сахарном растворе.

Фиг. 8 представляет схематический чертеж, изображающий устройство, в котором устройство для концентрирования сахара, содержащее обратноосмотическую мембрану и/или нанофильтрационную мембрану для концентрирования сахарного раствора, дополнительно присоединено к устройству, представленному на Фиг. 2. Более конкретно, это устройство включает со стороны фильтрата устройства с ультрафильтрационной мембраной 12, бак для сахарного раствора 22; нанофильтрационное мембранное устройство и/или обратноосмотическое мембранное устройство 23, присоединенное к нему через насос; и линию фильтрата 24. В тех случаях, когда нанофильтрационное мембранное устройство и/или обратноосмотическое мембранное устройство присоединяют к устройству, представленному на Фиг. 3, 5 или 6, нанофильтрационное мембранное устройство и/или обратноосмотическое мембранное 5 устройство можно соединять таким же образом, как на Фиг. 8, ниже по потоку относительно устройства с ультрафильтрационной мембраной 12, которое включено в устройство, представленное на Фиг. 3, 5 или 6, аналогично устройству, представленному на Фиг. 2.

Форма 2, представляющая вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз осуществляют в баке вторичного гидролиза, описана далее со ссылкой на Фиг. 10-12.

Фиг. 10 представляет чертеж, изображающий пример системы устройства, содержащего отдельно бак 2 с мешалкой для первичного гидролиза и бак 28 вторичного гидролиза. Устройство 25 для разделения твердых и жидких фаз не является ограниченным при том условии, что оно обеспечивает разделение твердых и жидких фаз первичного гидролизата, используя центрифугу, фильтр-пресс, ленточный фильтр или подобное приспособление. Твердые вещества, полученные с помощью устройства 25 для разделения твердых и жидких фаз, поступают в бак 28 вторичного гидролиза посредством устройства 26 для передачи твердых веществ. Устройство 26 для передачи твердых веществ не является ограниченным при том условии, что оно является подходящим для свойств твердых веществ, и примеры такого устройства включают ленточный конвейер и винтовой насос. Бак 28 вторичного гидролиза, по меньшей мере, включает термостат (бак вторичного гидролиза) 27 для осуществления вторичного гидролиза. Устройство, показанное на Фиг. 10, дополнительно содержит второе перемешивающее устройство 29 (бак вторичного гидролиза) для смешивания твердых веществ путем перемешивания. Бак 28 вторичного гидролиза дополнительно включает второе устройство 30 для разделения твердой и жидкой фаз вторичного гидролизата для осуществления разделения твердых и жидких фаз вторичного гидролизата. Вторичный сахарный раствор, отделенный с помощью второго устройства 30 для разделения твердых и жидких фаз, поступает в бак 32 для сбора вторичного сахарного раствора. Вторичный сахарный раствор в баке 32 для сбора вторичного сахарного раствора фильтруют с помощью устройства 33 с ультрафильтрационной мембраной для вторичного сахарного раствора для извлечения фермента. Фиг. 11 представляет вариант осуществления системы устройства, содержащего отдельно бак 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза и бак 28 вторичного гидролиза, а также отдельно устройство 25 для разделения твердых и жидких фаз и устройство для разделения твердых и жидких фаз 2 (вторичный гидролизат) 30, при этом устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной используют как для первичного сахарного раствора, так и для вторичного сахарного раствора. Как и на Фиг. 10, вторичный гидролизат, полученный в баке 28 вторичного гидролиза, подвергают разделению твердых и жидких фаз в устройстве для разделения твердых и жидких фаз 2 (вторичный гидролизат) 30 и направляют в бак 11 для фильтрата через линию для передачи вторичного сахарного раствора 34. Первичный сахарный раствор и вторичный сахарный раствор, находящиеся в баке 11 для фильтрата, фильтруют через ультрафильтрационную мембрану 12 сразу или впоследствии, и в результате этого разделяют фермент и сахар.

Фиг. 12 представляет вариант осуществления системы устройства, содержащего отдельно бак 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза и бак 28 вторичного гидролиза, при этом устройство 25 для разделения твердых и жидких фаз и устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной используют как для первичного сахарного раствора, так и для вторичного сахарного раствора. Вторичный гидролизат, полученный в баке 28 вторичного гидролиза, направляют в устройство 25 для разделения твердых и жидких фаз через линию для передачи вторичного гидролизата 35 и разделяют на вторичный сахарный раствор и твердые вещества. Первичный сахарный раствор и вторичный сахарный раствор, отделенные в устройстве 25 для разделения твердых и жидких фаз, направляют бак 11 для сбора фильтрата и фильтруют через ультрафильтрационную мембрану 12 сразу или впоследствии, и в результате этого разделяют фермент и сахар.

Форма 3, представляющая собой вариант осуществления, в котором вторичный гидролиз осуществляют в баке, который также используют для первичного гидролиза, описана ниже со ссылкой на Фиг. 13.

Устройство, изображенное на Фиг. 13, представляет собой вариант осуществления, в котором первичный гидролизат, полученный в баке 2 с мешалкой для осуществления первичного гидролиза, разделяют с помощью устройства 25 для разделения твердых и жидких фаз, и полученные твердые вещества циркулируют в бак первичного гидролиза через линию для передачи вторичного гидролизата 35, после чего вторичный гидролиз осуществляется в баке первичного гидролиза. Первичный сахарный раствор и вторичный сахарный раствор, отделенные в устройстве 25 для разделения твердых и жидких фаз, собирают в бак 11 для сбора фильтрата и фильтруют через устройство 12 с ультрафильтрационной мембраной для разделения фермента и сахара.

Формы устройств, в которых устройство с микрофильтрационной мембраной расположено выше по потоку относительно устройства с ультрафильтрационной мембраной, описаны ниже со ссылкой на Фиг. 14-16. Фиг. 14 представляет вариант осуществления (частичная схема), в котором устройство 36 с микрофильтрационной мембраной расположено выше по потоку относительно устройства с ультрафильтрационной мембраной 12. Устройство 36 с микрофильтрационной мембраной не является ограниченным при том условии, что оно способно отделять нерастворимые микрочастицы компонентов, которые содержатся в первичном сахарном растворе и/или вторичном сахарном растворе, полученном в устройстве 33 для разделения твердых и жидких фаз или пресс-фильтре 8, и примеры устройства 36 с микрофильтрационной мембраной включают микрофильтрационные мембраны, имеющие средний размер пор, составляющий от 0,01 мкм до 1 мкм. Способ фильтрования в устройстве 36 с микрофильтрационной мембраной может представлять собой фильтрование в поперечном потоке (Фиг. 15) или тупиковое фильтрование (Фиг. 16).

Фиг. 15 представляет вариант осуществления устройства 36 с микрофильтрационной мембраной для осуществления микрофильтрования посредством фильтрования в поперечном потоке. Первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор можно хранить в баке 37 для неочищенной жидкости с микрофильтрационной мембраной и фильтровать через микрофильтрационную мембрану 38 в процессе циркуляции с помощью насоса.

Фиг. 16 представляет вариант осуществления, в котором микрофильтрование осуществляют посредством тупикового фильтрования. Первичный сахарный раствор и/или вторичный сахарный раствор хранят в баке 37 для неочищенной жидкости с микрофильтрационной мембраной и фильтруют через микрофильтрационную мембрану 38. В случае тупикового фильтрования можно установить соответствующее устройство 39 для подачи сжатого воздуха, которое осуществляет очистку поверхности мембраны с помощью воздушных пузырьков, и можно установить насос 40 для обратного промывания, который осуществляет обратное промывание. Обратное промывание можно осуществлять, используя фильтрат, собранный в бак 41 для сбора микрофильтрата, или в некоторых случаях обычную жидкость для промывания мембран, или жидкое средство. Микрофильтрационная мембрана 38 может иметь форму плоской мембраны или полой волоконной мембраны. Полая волоконная мембрана может представлять собой тип мембраны внутреннего давления или тип мембраны внешнего давления.

Примеры

Далее настоящее изобретение описано более подробно посредством примеров. Однако настоящее изобретение не является ограниченным данными примерами.

(Справочный пример 1) Приготовление предварительно обработанной целлюлозы

1. Приготовление предварительно обработанной целлюлозы 1 (обработка разбавленной серной кислотой)

В качестве целлюлозы использовали рисовую солому. Целлюлозу вымачивали в 1% водном растворе серной кислоты и подвергали обработке, используя автоклав (производитель Nitto Koatsu Co., Ltd.) при 150°C в течение 30 минут. После обработки осуществляли разделение твердых и жидких фаз, чтобы отделить обработанную серной кислотой целлюлозу от водного раствора серной кислоты (далее в настоящем документе называется «жидкость после обработки разбавленной серной кислотой»). После этого обработанную серной кислотой целлюлозу смешивали с жидкостью после обработки разбавленной серной кислотой при перемешивании таким образом, что концентрация твердого содержимого составляла 10 масс. %, и pH устанавливали приблизительно на уровне 5, используя гидроксид натрия. Полученную смесь использовали в представленных ниже примерах в качестве предварительно обработанной целлюлозы 1.

2. Приготовление предварительно обработанной целлюлозы 2 (аммиачная обработка)

В качестве целлюлозы использовали рисовую солому. Целлюлозу помещали в компактный реактор (производитель Taiatsu Techno Corporation, TVS-N2 30 мл) и охлаждали жидким азотом. В этот реактор пропускали газообразный аммиак, и образец полностью пропитывался жидким аммиаком. Крышку реактора закрывали, и реактор выдерживали при комнатной температуре в течение приблизительно 15 минут. После этого реактор нагревали на масляной бане при 150°C в течение 1 часа. Затем реактор снимали с масляной бани и выпускали газообразный аммиак в вытяжной шкаф; после этого реактор вакуумировали до 10 Па, используя вакуумный насос, в результате чего целлюлоза высыхала. Полученный продукт использовали в описанных ниже примерах в качестве предварительно обработанной целлюлозы 2.

3. Приготовление предварительно обработанной целлюлозы 3 (гидротермальная обработка)

В качестве целлюлозы использовали рисовую солому. Целлюлозу вымачивали в воде и подвергали обработке в автоклаве (производитель Nitto Koatsu Co., Ltd.) при 180°C в течение 20 минут при перемешивании. Обработку осуществляли при давлении 10 МПа. После обработки разделение твердых и жидких фаз осуществляли путем центрифугирования (3000 G) для отделения компонента переработанной биомассы от компонента раствора (далее в настоящем документе называется «гидротермально обработанная жидкость»). Компонент переработанной биомассы использовали в описанных ниже примерах в качестве предварительно обработанной целлюлозы 3.

(Справочный пример 2) Измерение концентрации сахара

Концентрации глюкозы и ксилозы, содержащихся в сахарном растворе, измеряли в описанных ниже условиях HPLC на основании сравнения со стандартными образцами.

Колонка: Luna NH₂ (производитель Phenomenex, Inc.)

Подвижная фаза: Milli-Q:ацетонитрил=25:75 (скорость потока 0,6 мл/мин)

Реакционный раствор: отсутствует

Способ обнаружения: RI (дифференциальный показатель преломления)

Температура: 30°C

(Справочный пример 3) Приготовление полученной из грибов Trichoderma целлюлазы

Полученную из грибов Trichoderma целлюлазу готовили следующим способом.

[Прекультура]

Готовили смесь 5 масс./об.% раствора кукурузного экстракта, 2 масс./об.% глюкозы, 0,37 масс./об.% тартрата аммония, 0,14 масс./об. % сульфата аммония, 0,2 масс./об.% дигидрофосфата калия, 0,03 масс./об.% дигидрата хлорида кальция, 0,03 масс./об.% гептагидрата сульфата магния, 0,02 масс./об.% хлорида цинка, 0,01 масс./об.% гексагидрата хлорида железа (III), 0,004 масс./об.% пентагидрата сульфата меди (II), 0,0008 масс./об.% тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006 масс./об.% борной кислоты и 0,0026 масс./об.% тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде, и 100 мл этой смеси помещали в колбу Эрленмейера (Erlenmeyer) объемом 500 мл с перегородками, после чего осуществляли стерилизацию в автоклаве при 121°C в течение 15 минут. После охлаждения смеси PE-M и Tween 80, каждый из которых отдельно от смеси стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут, добавляли к смеси в количестве по 0,01 масс./об.% каждого. В эту прекультуральную среду инокулировали Trichoderma reesei PC3-7 в количестве 1×10⁵ клеток/мл, и клетки культивировали при 28°C в течение 72 часов при встряхивании со скоростью 180 об/мин, чтобы получить прекультуру, используя встряхиватель Bio-Shaker BR-40LF (производитель Taitec Corporation).

[Основная культура]

Готовили смесь 5 масс./об.% раствора кукурузного экстракта, 2 масс./об.% глюкозы, 10 масс./об.% целлюлозы (Avicel), 0,37 масс./об.% тартрата аммония, 0,14 масс./об.% сульфата аммония, 0,2 масс./об.% дигидрофосфата калия, 0,03 масс./об.% дигидрата хлорида кальция, 0,03 масс./об.% гептагидрата сульфата магния, 0,02 масс./об.% хлорида цинка, 0,01 масс./об.% гексагидрата хлорида железа (III), 0,004 масс./об.% пентагидрата сульфата меди (II), 0,0008 масс./об.% тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006 масс./об.% борной кислоты и 0,0026 масс./об.% тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде, и 2,5 л этой смеси помещали в колбу объемом 5 л с мешалкой (производитель ABLE, DPC-2A), после чего осуществляли стерилизацию в автоклаве при 121°C в течение 15 минут. После охлаждения смеси PE-M и Tween 80, каждый из которых отдельно от смеси стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут, добавляли к смеси в количестве по 0,1 масс./об.% каждого. В полученную смесь инокулировали 250 мл прекультуры Trichoderma reesei PC3-7, предварительно приготовленной в жидкой среде описанным выше способом. Клетки культивировали при 28°C в течение 87 часов при 300 об/мин и скорости аэрации 1 об./(об.·мин). После центрифугирования надосадочную жидкость подвергали мембранному фильтрованию, используя Stericup-GV (производитель Millipore, материал: PVDF). К культуральной жидкости, приготовленной в описанных выше условиях, добавляли β-глюкозидазу (Novozyme 188) при массовом соотношении белка 1/100, и полученную смесь использовали в качестве полученной из грибов Trichoderma целлюлазы в приведенных ниже примерах.

(Справочный пример 4) Способ измерения активности целлюлазы

Активность целлюлазы измеряли и оценивали, используя следующие процедуры, чтобы определить четыре типа активности разложения: 1) активность разложения Avicel, 2) активность разложения карбоксиметилцеллюлозы (CMC), 3) активность разложения целлобиозы и 4) активность разложения ксилана.

1) Активность разложения Avicel

К раствору фермента (изготовленному в заданных условиях) добавляли Avicel (микрокристаллическая целлюлоза, которую производит Merck) в количестве 1 г/л и буферный раствор ацетата натрия (pH 5,0) в количестве 100 мМ, после чего оставляли полученную смесь реагировать при 50°C в течение 24 часов. Этот реакционный раствор готовили в пробирке объемом 1 мл, и реакцию проводили при перемешивании раствора путем вращении в описанных выше условиях. После этого пробирку подвергали центрифугированию и измеряли концентрацию глюкозы в компоненте надосадочной жидкости. Измерение концентрации глюкозы осуществляли согласно способу, описанному в справочном примере 2. Концентрацию полученной глюкозы (г/л) использовали в качестве значения активности как активность разложения Avicel.

2) Активность разложения CMC

К раствору фермента добавляли карбоксиметилцеллюлозу в количестве 10 г/л и буферный раствор ацетата натрия (pH 5,0) в количестве 100 мМ, после чего оставляли полученную смесь реагировать при 50°C в течение 0,5 часа. Этот реакционный раствор готовили в пробирке объемом 1 мл, и реакцию проводили при перемешивании раствора путем вращения в описанных выше условиях. После этого пробирку подвергали центрифугированию и измеряли концентрацию глюкозы в компоненте надосадочной жидкости. Измерение концентрации глюкозы осуществляли согласно способу, описанному в справочном примере 2. Концентрацию полученной глюкозы (г/л) использовали в качестве значения активности как активность разложения CMC.

3) Активность разложения целлобиозы

К раствору фермента добавляли целлобиозу (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в количестве 500 мг/л и буферный раствор ацетата натрия (pH 5,0) в количестве 100 мМ, после чего оставляли полученную смесь реагировать при 50°C в течение 0,5 часа. Этот реакционный раствор готовили в пробирке объемом 1 мл, и реакцию проводили при перемешивании раствора путем вращения в описанных выше условиях. После этого пробирку подвергали центрифугированию и измеряли концентрацию глюкозы в компоненте надосадочной жидкости. Измерение концентрации глюкозы осуществляли согласно способу, описанному в справочном примере 2. Концентрацию полученной глюкозы (г/л) использовали в качестве значения активности как активность разложения целлобиозы.

4) Активность разложения ксилана

К раствору фермента добавляли ксилан (ксилан из березовой древесины от Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в количестве 10 г/л и буферный раствор ацетата натрия (pH 5,0) в количестве 100 мМ, после чего оставляли полученную смесь реагировать при 50°C в течение 4 часов. Этот реакционный раствор готовили в пробирке объемом 1 мл, и реакцию проводили при перемешивании раствора путем вращении в описанных выше условиях. После этого пробирку подвергали центрифугированию и измеряли концентрацию ксилозы в компоненте надосадочной жидкости. Измерение концентрации ксилозы осуществляли согласно способу, описанному в справочном примере 2. Концентрацию полученной ксилозы (г/л) использовали в качестве значения активности как активность разложения ксилана.

(Пример 1) Гидролиз целлюлозы полученной из грибов Trichoderma целлюлазой

Результаты первичного гидролиза и вторичного гидролиза при гидролизе целлюлозы с использованием полученной из грибов Trichoderma целлюлазы описаны в приведенных ниже примерах. Эксперимент выполняли следующим способом.

(Стадия 1. Первичный гидролиз)

К каждому из предварительно обработанных целлюлозных материалов 1-3 (по 1 г каждого) добавляли дистиллированную воду и по 10 мг полученной из грибов Trichoderma целлюлазы добавляли, после чего добавляли дистиллированную воду в таком количестве, что общая масса составляла 10 г. Кроме того, в раствор добавляли разбавленную серную кислоту или разбавленный гидроксид натрия, чтобы довести значение pH раствора до уровня в интервале от 4,5 до 5,3. После установления pH раствор переносили в пробирку с боковым отводом φ30 NS14/23 (производитель Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), и раствор переносили в реактор с боковым отводом φ30 NS14/23 (производитель Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), после чего осуществляли гидролиз при 50°C в течение 24 часов с инкубированием и перемешиванием, используя компактный механический смеситель CPS-1000 (производитель Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), переходник-преобразователь, впуск исходного материала с трехходовым краном, инкубатор MG-2200. Гидролизат подвергали разделению твердых и жидких фаз путем центрифугирования (3000 G, 10 минут) и, таким образом, гидролизат разделяли на первичный сахарный раствор (6 мл) и твердые вещества. Концентрации глюкозы и ксилозы в полученном первичном сахарном растворе измеряли способами, описанными в справочном примере 2. Выход сахара (мг) в первичном сахарном растворе вычисляли согласно следующему уравнению.

Таблица 2 представляет краткое изложение результатов.

Выход сахара (мг) в первичном сахарном растворе={концентрация сахара (г/л) после 24 часов инкубирования - концентрация сахара (г/л) после 0 часов инкубирования}×6 (мл)

(Стадия 2. Вторичный гидролиз)

К твердым веществам, полученным на стадии 1, добавляли дистиллированную воду таким образом, что суммарная масса составляла 10 г. Кроме того, в раствор добавляли разбавленную серную кислоту или разбавленный гидроксид натрия, чтобы установить значение pH раствора на уровне в интервале от 4,5 до 5,3. Раствор переносили в пробирку с боковым отводом φ30 NS14/23 (производитель Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), и раствор помещали в реактор с боковым отводом φ30 NS14/23 (производитель Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), после чего осуществляли вторичный гидролиз при 50°C в течение 1 часа с инкубированием и перемешиванием, используя компактный механический смеситель CPS-1000 (производитель Tokyo Rikakikai Co., Ltd.), переходник-преобразователь, впуск исходного материала с трехходовым краном, инкубатор MG-2200. Гидролизат подвергали разделению твердых и жидких фаз путем центрифугирования (3000 G, 10 минут) и, таким образом, гидролизат разделяли на первичный сахарный раствор (6 мл) и твердые вещества. Концентрации глюкозы и ксилозы в полученном первичном сахарном растворе измеряли способами, описанными в справочном примере 2. Выход сахара (мг) в первичном сахарном растворе вычисляли согласно следующему уравнению.

Выход сахара (мг) во вторичном сахарном растворе={концентрация сахара (г/л) после 1 часа инкубирования - концентрация сахара (г/л) после 0 часов инкубирования}×6 (мл)

Таблица 3 представляет краткое изложение результатов. Было обнаружено, что, хотя дополнительный фермент не добавляли при вторичном гидролизе, одночасовое инкубирование не смогло вызвать увеличение концентрации сахара. Таким образом, наблюдали, что вторичный гидролиз происходил только с первичным сахарным раствором, оставшимся в твердых веществах, и/или ферментом, адсорбированным на твердых веществах.

(Стадия 3. Извлечение карбогидразы)

Первичный сахарный раствор (6 мл), полученный путем первичного гидролиза на стадии 1, и вторичный сахарный раствор (6 мл), полученный путем вторичного гидролиза на стадии 2, смешивали друг с другом, и карбогидразу извлекали из полученного раствора.

Вышеупомянутый раствор фильтровали через ультрафильтрационную мембрану, отсекающую молекулярную массу 10000 (VIVASPIN 20, производитель Sartorius Stedim Biotech, материал PES) путем центрифугирования при 4500 G, пока мембранная фракция не уменьшилась до 1 мл. К мембранной фракции добавляли 10 мл дистиллированной воды, и полученную смесь снова центрифугировали при 4500 G, пока мембранная фракция не уменьшилась до 1 мл. После этого фермент извлекали из мембранной фракции. Концентрацию белка в извлеченном ферменте анализировали, используя измерительный комплект BCA (комплект реагентов для определения белков с помощью BCA, производитель Pierce), используя бычий альбумин (2 мг/мл) в качестве стандартного образца, путем измерения поглощения при 562 нм методом колориметрии. Концентрацию фермента (мг/мл), который можно было извлекать, умножали на 1 мл, то есть на количество раствора в мембранной фракции, чтобы вычислить количество карбогидразы, которую можно было извлечь. В результате, как представлено в таблице 4, было обнаружено, что фермент можно было извлечь в количестве от 1,6 до 2,6 мг.

Таблица 4 Предварительно обработанная целлюлоза 1 Количество извлеченного фермента (мг) 50°C Предварительно обработанная целлюлоза 2 1,6 Предварительно обработанная целлюлоза 3 2,6 Предварительно обработанная целлюлоза 4 2,0

(Пример 2) Влияние температуры реакции на выход сахара/количество извлеченного фермента при вторичном гидролизе

Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как на стадии 2 примера 1, за исключением того, что температуру реакции устанавливали в интервале от 25°C до 90°C. Выход сахара (глюкоза, г) во вторичном сахарном растворе (6 мл) был таким, как представлено в таблице 5. Было обнаружено, что при вторичном гидролизе по изобретению выход сахара является наиболее высоким в интервале от 40°C до 60°C, то есть при оптимальной температуре реакции полученной из грибов Trichoderma целлюлазы.

Кроме того, вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как на стадии 2 примера 1, за исключением того, что температуру реакции устанавливали в интервале от 25°C до 90°C и осуществляли извлечение карбогидразы на стадии 3, после чего вычисляли количество карбогидразы, которую можно было извлечь. В результате, как представлено в таблице 6, было обнаружено, что извлекаемое количество карбогидразы увеличивалось при температуре реакции в интервале от 40 до 60°C во время вторичного гидролиза. Кроме того, можно было подтвердить, что более предпочтительная температура во время вторичного гидролиза составляет 50°C.

(Пример 3) Анализ извлеченного фермента

Извлеченный фермент, полученный на стадии 3 примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 2) подвергали электрофорезу, используя SDS-PAGE, чтобы проанализировать извлеченные ферментативные компоненты. Сначала равное количество буферного раствора для обработки образца Ez Apply (производитель ATTO Corporation) смешивали с извлеченным ферментом, и полученный смесь нагревали при 100°C в течение 10 минут. На 15% гель для электрофореза e-PAGEL (производитель ATTO Corporation) наносили 5 мкл обработанного образца и осуществляли электрофорез (40 мА, 30 минут). Гель удаляли и окрашивали, используя кумасси бриллиантовый голубой Bio-safe CBB (производитель Bio-Rad Laboratories), после чего обесцвечивали дистиллированной водой. Результаты, полученные окрашиванием геля после электрофореза, представлены на Фиг. 9. Удалось подтвердить, что в интервале от 40°C до 60°C, в частности, целлобиогидролаза среди полученных из грибов Trichoderma компонентов целлюлазы содержится в качестве извлеченного ферментативного компонента.

(Пример 4) Соотношение между временем реакции и выходом сахара/количеством извлеченного фермента при вторичном гидролизе

Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как на стадии 2 примера 1, за исключением того, что время реакции устанавливали в интервале от 0 до 720 минут.

Выход сахара (глюкоза, г) во вторичном сахарном растворе (6 мл) был таким, как представлено в таблице 7. Было обнаружено, что достаточное количество сахара можно производить путем осуществления вторичного гидролиза по изобретению в течение не менее чем 5 минут. С другой стороны, количество извлеченного фермента не изменялось в пределах интервала, превышавшего 180 минут.

После этого вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как на стадии 2 примера 1, за исключением того, что время реакции устанавливали в интервале от 0 до 720 минут, и извлечение карбогидразы на стадии 3 осуществляли, после чего вычисляли количество карбогидразы, которое можно было извлечь. В результате, как представлено в таблице 8, было обнаружено, что достаточное количество фермента можно извлекать путем осуществления вторичного гидролиза по изобретению в течение не менее чем 5 минут. С другой стороны, количество извлеченного фермента не изменялось в пределах интервала, превышавшего 180 минут.

(Пример 5) Соотношение между pH и количеством извлеченного фермента при вторичном гидролизе

Стадию 2 примера 1 осуществляли при 50°C после установления значения pH в интервале от 4,5 до 5,3 с помощью разбавленной серной кислоты или разбавленного гидроксида натрия. Однако в настоящем примере значение pH регулировали, используя разбавленные буферные растворы, в интервале от 3 до 10, и вторичный гидролиз осуществляли при 50°C. В качестве буферного раствора буферный раствор 2 мМ ацетата натрия использовали для регулирования значений pH в интервале от 3 до 8, в то время как буферный раствор 2 мМ глицина и гидроксида натрия использовали для регулирования значений pH в интервале от 9 до 10. Эксперимент осуществляли таким же образом, как в примере 1, за исключением регулирования pH. В результате, как представлено в таблице 9, было обнаружено, что количество извлеченного фермента можно увеличивать путем осуществления вторичного гидролиза при значениях pH в интервале от 6,0 до 8,0.

(Пример 6) Соотношение между количеством добавляемого неионного поверхностно-активного вещества и количеством извлекаемого фермента при вторичном гидролизе

В качестве неионного поверхностно-активного вещества использовали Pluronic F-68 (производитель BASF). Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как на стадии 2 примера 1, за исключением того, что Pluronic F-68 добавляли так, что его конечная концентрация находилась в интервале от 0,01 до 5%. Использовали такой же способ, как в примере 1, за исключением добавления неионного поверхностно-активного вещества. В результате, как представлено в таблице 10, количество извлеченного фермента можно было увеличивать путем добавление неионного поверхностно-активного вещества в концентрациях, составляющих 0,05% до 2%.

Таблица 10   0,01% 0,05% 0,1% 0,25% 0,5% 1% 2% 5% Предварительно обработанная целлюлоза 1 1,6 1,8 2,1 2,3 2,5 2,9 3,3 3,3 Предварительно обработанная целлюлоза 2 2,7 3,0 3,2 3,6 3,8 4,1 4,2 4,2 Предварительно обработанная целлюлоза 3 2,0 2,1 2,4 2,6 2,9 3,4 3,7 3,8

(Справочный пример 4) Массовое производство первичного гидролизата

Для массового производства первичного гидролизата 20 г полученной из грибов Trichoderma целлюлазы добавляли к предварительно обработанной целлюлозе 3 (2 кг), и затем добавляли дистиллированную воду в таком количестве, что суммарная масса составляла 20 кг. Кроме того, значение pH раствора регулировали в интервале от 4,5 до 5,3, используя разбавленную серную кислоту или разбавленный гидроксид натрия. Пока раствор инкубировали таким образом, что температура раствора поддерживалась в интервале от 45 до 50°C, и разбавленную серную кислоту и/или разбавленный гидроксид натрия добавляли к раствору, чтобы значение pH сохранялось в интервале от 4,5 до 5,3, фермент оставляли реагировать с предварительно обработанной целлюлозой 3 в течение 24 часов (жидкость, полученная посредством реакции далее в настоящем документе называется термином «жидкая суспензия после ферментативного осахаривания).

(Сравнительный пример 1) Разделение твердых и жидких фаз путем пресс-фильтрации (разделение твердых и жидких фаз после первичного гидролиза)

Используя 10 л жидкой суспензии после ферментативного осахаривания, полученной в справочном примере 4, пресс-фильтрацию осуществляли согласно следующей процедуре. Для пресс-фильтрации использовали компактное устройство - фильтр-пресс MO-4 фирмы Yabuta Industries Co., Ltd. В качестве фильтровальной ткани использовали сложнополиэфирный тканый материал T2731C (производитель Yabuta Industries Co., Ltd.). После добавления 10 л жидкой суспензии после ферментативного осахаривания в компактный бак впуск жидкости открывали, чтобы медленно впускать жидкую суспензию после ферментативного осахаривания в фильтровальную камеру с помощью воздушного насоса 66053-3EB (производитель Taiyo International Corporation) при аэрации сжатым воздухом со дна. Поскольку фильтрат, полученный после одноминутной работы, оставался мутным, фильтрат возвращали в компактный бак. Вытесняющее давление воздушного насоса постепенно повышали для увеличения давления в фильтровальной камере, и стадию нагнетания продолжали до тех пор, пока не был получен фильтрат. Максимальное давление нагнетания в этот момент составляло 0,15 МПа. Продолжительность времени, требуемого для вышеупомянутой стадии нагнетания, составляло 30 минут.

После этого стадию сжатия осуществляли путем раздутия диафрагмы, прикрепленной к фильтровальной камере. Давление сжатия постепенно повышали до 0,5 МПа, и устройство затем оставляли приблизительно на 30 минут для извлечения фильтрата. Продолжительность времени, требуемого на вышеупомянутую стадию сжатия, составляло 40 минут.

После завершения стадии сжатия снижали давление в диафрагме и баке и собирали полученные твердые вещества. Суммарное количество полученного фильтрата составляло 9,0 л. Оставшийся жидкий компонент оказывался потерянным вследствие застойного объема устройства. На основании результатов измерения концентрации сахара в полученном фильтрате, то есть первичном сахарном растворе сравнительного примера 1, концентрация глюкозы составляла 35 г/л, и концентрация ксилозы составляла 7 г/л. Таким образом, в сравнительном примере 1 выход глюкозы составлял 315 г, и выход ксилозы составлял 63 г (таблица 11).

(Сравнительный пример 2) Разделение твердых и жидких фаз путем пресс-фильтрации (разделение твердых и жидких фаз и промывание твердых веществ после первичного гидролиза)

Используя 10 л жидкой суспензии после ферментативного осахаривания, полученной в справочном примере 4, пресс-фильтрацию осуществляли согласно следующей процедуре. Пресс-фильтрацию осуществляли, используя такое же устройство, как в сравнительном примере 1, и технологические условия были такими же, как в справочном примере 1, до стадии нагнетания. На стадии сжатия давление сжатия увеличивали до 0,2 МПа, и фильтрат собирали в течение приблизительно 5 минут. Количество собранного фильтрата в этот момент составляло 8 л. На основании результатов измерения концентрации сахара в полученном фильтрате, то есть в первичном сахарном растворе сравнительного примера 2, концентрация глюкозы составляла 35 г/л, и концентрация ксилозы составляла 7 г/л. Таким образом, при первичном гидролизе, выход глюкозы (выход сахара в первичном сахарном растворе) составлял 280 г, и выход ксилозы составлял 56 г (таблица 11).

После этого твердые вещества, оставшиеся в камере пресс-фильтра, промывали водой согласно следующей процедуре. Следует отметить, что эта операция не представляет собой вторичный гидролиз.

В бак добавляли 2,5 л дистиллированной воды при 18°C, и стадию нагнетания осуществляли при давлении нагнетания 0,2 МПа до тех пор, пока не прекращалось получение фильтрата. После этого стадию сжатия осуществляли путем раздувания диафрагмы, прикрепленной к фильтровальной камере. Давление сжатия постепенно увеличивали до 0,5 МПа, и устройство затем оставляли приблизительно на 30 минут для извлечения фильтрата. Продолжительность времени, требуемого для вышеупомянутой стадии сжатия, составляла 35 минут. После завершения стадии сжатия уменьшали давление в диафрагме и баке и собирали полученные твердые вещества. Суммарное количество полученного фильтрата составляло 3,5 л. Оставшийся жидкий компонент терялся вследствие застойного объема устройства. На основании результатов измерения концентрации сахара в полученном фильтрате, то есть во вторичном сахарном растворе сравнительного примера 2, концентрация глюкозы составляла 14 г/л, и концентрация ксилозы составляла 3,1 г/л. Таким образом, в этом случае выход глюкозы составлял 49 г, и выход ксилозы составлял 11 г (таблица 11).

(Пример 6) Вторичный гидролиз в камере пресс-фильтра

Используя 10 л жидкой суспензии после ферментативного осахаривания, полученной в справочном примере 4, разделение твердых и жидких фаз и вторичный гидролиз осуществляли согласно следующей процедуре.

Пресс-фильтрацию осуществляли, используя такое же устройство, как в сравнительном примере 2, при таких же технологических условиях. Таким образом, количество фильтрата, который можно было собрать, составляло 8 л. На основании результатов измерения концентрации сахара в полученном фильтрате, то есть в первичном сахарном растворе примера 2, концентрация глюкозы составляла 35 г/л, и концентрация ксилозы составляла 7 г/л. Таким образом, в этом случае выход глюкозы составлял 280 г, и выход ксилозы составлял 56 г. Таблица 12 представляет краткое изложение результатов в отношении выхода сахара в первичном сахарном растворе примера 6.

После этого вторичный гидролиз в камере пресс-фильтра осуществляли согласно следующей процедуре.

Во время стадии сжатия начинали введение 2,5 л дистиллированной воды в бак. После этого бак нагревали, используя резиновый нагреватель, до тех пор, пока температура дистиллированной воды не составляла 50°C. После нагревания теплая вода при 50°C поступала в фильтровальную камеру таким же образом, как жидкая суспензия. Весь полученный фильтрат возвращали в бак, чтобы обеспечить циркуляцию. Эту циркуляция продолжали в течение 1 часа после начала получения фильтрата. Согласно результатам измерения температуры фильтрата, фильтрат находился при 40°C через 10 минут и сохранял постоянную температуру 45°C через 15 минут и далее. Давление нагнетания поддерживали на постоянном уровне 0,15 МПа. Через 120 минут работу на стороне фильтрата переключали на удаление вместо циркуляции в бак. Стадию нагнетания продолжали при давлении нагнетания 0,2 МПа до тех пор, пока не прекращалось получение фильтрата. После этого стадию сжатия осуществляли путем раздувания диафрагмы, прикрепленной к фильтровальной камере. Давление сжатия постепенно увеличивали до 0,5 МПа, и устройство затем оставляли приблизительно на 30 минут для извлечения фильтрата. Продолжительность времени, требуемого для вышеупомянутой стадии сжатия, составляла 35 минут. После завершения стадии сжатия уменьшали давление в диафрагме и баке и собирали полученные твердые вещества. Суммарное количество полученного фильтрата составляло 3,5 л. Оставшийся жидкий компонент оказывался потерянным вследствие застойного объема устройства. На основании результатов измерения концентрации сахара в полученном фильтрате концентрация глюкозы составляла 28 г/л, и концентрация ксилозы составляла 5 г/л. Таким образом, в этом случае выход глюкозы составлял 98 г, и выход ксилозы составлял 17,5 г. Таблица 12 представляет краткое изложение результатов в отношении выхода сахара во вторичном сахарном растворе, полученном путем вторичного гидролиза и разделения твердых и жидких фаз в примере 6.

Пример 6

При сравнении результатов сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2, где вторичный гидролиз не осуществляли, с результатами примера 6, представленными в таблице 12, обнаружено, что выход сахара можно значительно увеличивать путем осуществления вторичного гидролиза по изобретению.

(Пример 7) Количество извлеченной карбогидразы, полученной вторичным гидролизом в камере пресс-фильтра

Первичный сахарный раствор (6 мл) и вторичный сахарный раствор (6 мл), полученные в примере 6, смешивали друг с другом, и карбогидразу извлекали из полученного сахарного раствора. Для сравнения первичный сахарный раствор (6 мл) и жидкость для промывания твердого вещества (6 мл), полученную в сравнительном примере 2, смешивали друг с другом, и карбогидразу также извлекали из полученного сахарного раствора. Сахарный раствор фильтровали через ультрафильтрационную мембрану, отсекающую молекулярную массу 10000 (VIVASPIN 20, производитель Sartorius Stedim Biotech, материал PES) путем центрифугирования при 4500 G, пока мембранная фракция не уменьшилась до 1 мл. К мембранной фракции добавляли 10 мл дистиллированной воды, и полученную смесь снова центрифугировали при 4500 G, пока мембранная фракция не уменьшилась до 1 мл. После этого фермент извлекали из мембранной фракции. Концентрацию белка в извлеченном ферменте анализировали, используя измерительный комплект BCA (комплект реагентов для определения белков с помощью BCA, производитель Pierce), используя бычий альбумин (2 мг/мл) в качестве стандартного образца, путем измерения поглощения при 562 нм методом колориметрии. Концентрацию фермента (мг/мл), который можно было извлекать, умножали на 1 мл, то есть на количество раствора в мембранной фракции, чтобы вычислить количество карбогидразы, которую можно было извлечь. В результате, как представлено в таблице 13, удалось подтвердить, что количество извлеченной карбогидразы увеличивалось за счет эффекта, производимого пропусканием теплой воды в примере 6, по сравнению с количеством фермента, извлеченного из сахарного раствора в сравнительном примере 2.

(Пример 8) Извлечение и повторное использование карбогидразы

Первичный сахарный раствор (8 л) и вторичный сахарный раствор (3,5 л), полученные в каждом из сравнительного примера 2 и примера 6, смешивали друг с другом, и карбогидразу извлекали из 11,5 л каждой из этих полученных смесей. Извлечение карбогидразы осуществляли, используя компактное фильтрование устройство с плоской мембраной Sepa (зарегистрированный товарный знак) CF II Med/High Foulant System (производитель GE), снабженное плоской ультрафильтрационной мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 (SEPA серии PW, производитель GE, материал функциональной поверхности: полиэфирсульфон). При этом рабочее давление регулировали таким образом, что скорость потока на исходной стороне оставалась на постоянном уровне 2,5 л/мин, и постоянный поток через мембрану составлял 0,1 м/D, и фильтровали 11 л из 11,5 л. Таким образом, 0,5 л карбогидразы извлекали на стороне подачи. После этого полученный извлеченный фермент в количестве 0,5 л добавляли к предварительно обработанной целлюлозе 3 (1 кг), и дистиллированную воду добавляли в таком количестве, чтобы суммарная масса составляла 10 кг. Кроме того, в раствор добавляли разбавленную серную кислоту или разбавленный гидроксид натрия, чтобы установить значение pH раствора в интервале от 4,5 до 5,3. Пока раствор инкубировали таким образом, что температура раствора сохранялась в интервале от 45 до 50°C, и разбавленную серную кислоту и/или разбавленный гидроксид натрия добавляли в раствор, чтобы поддерживать значение pH в интервале от 4,5 до 5,3, фермент оставляли реагировать с предварительно обработанной целлюлозой 3 в течение 24 часов. В результате, как представлено в таблице 14, удалось подтвердить, что выход сахара в том случае, когда использовали фермент, извлеченный из сахарных растворов (первичного и вторичного) согласно примеру 6, превышал выход сахара в том случае, когда использовали фермент, извлеченный из сахарных растворов (первичного и вторичного) согласно сравнительному примеру 2.

(Пример 9) Концентрирование первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора с помощью обратноосмотической мембраны (мембраны RO)

Каждый из первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора в примере 6 в количестве 1 л концентрировали, используя обратноосмотическую мембрану (мембрану RO). Сначала каждый из первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора предварительно фильтровали через микрофильтрационную мембрану, у которой размер пор составлял 0,45 мкм. Каждый из полученных после фильтрования через мембрану растворов в количестве 1 л использовали для осуществления концентрирования с помощью обратноосмотической мембраны. В качестве обратноосмотической мембраны использовали сшитую полностью ароматическую обратноосмотическую мембрану UTC80 (производитель Toray Industries, Inc.). Обратноосмотическую мембрану устанавливали на компактное плоское устройство для мембранного фильтрования Sepa (зарегистрированный товарный знак) CFII Med/High Foulant System (производитель GE), и обработку путем фильтрования осуществляли, используя исходную жидкость при температуре 25°C и при давлении 3 МПа, с помощью насоса высокого давления. Посредством этой обработки получали 0,7 л фильтрата. Концентрации глюкозы и ксилозы в этом случае были такими, как представлено в таблице 15, и удалось подтвердить, что концентрацию сахаров в первичном сахарном растворе и вторичном сахарном растворе можно увеличивать путем концентрирования с помощью обратноосмотической мембраны.

(Пример 10) Концентрирование первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора с помощью нанофильтрационной мембраны (мембраны NF)

Каждый из первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора согласно примеру 8 в количестве 1 л концентрировали с помощью нанофильтрационной мембраны (мембраны NF).

Сначала каждый из первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора предварительно фильтровали через микрофильтрационную мембрану, у которой размер пор составлял 0,45 мкм. Каждый из полученных после фильтрования через мембрану растворов в количестве 1 л использовали для осуществления концентрирования с помощью мембраны NF. В качестве мембраны NF использовали содержащую сшитый пиперазинполиамид нанофильтрационную мембрану UTC60 (производитель Toray Industries, Inc.). Мембрану NF устанавливали на компактное плоское устройство для мембранного фильтрования Sepa (зарегистрированный товарный знак) CFII Med/High Foulant System (производитель GE), и обработку путем фильтрования осуществляли, используя исходную жидкость при температуре 25°C и при давлении 3 МПа, с помощью насоса высокого давления. Посредством этой обработки получали 0,7 л фильтрата. Концентрации глюкозы и ксилозы в этом случае были такими, как представлено в таблице 16, и удалось подтвердить, что концентрацию сахаров в первичном сахарном растворе и вторичном сахарном растворе можно увеличивать путем концентрирования с помощью нанофильтрационной мембраны.

(Сравнительный пример 3) Разделение твердых и жидких фаз путем центрифугирования (разделение твердых и жидких фаз после первичного гидролиза)

Используя 10 л жидкой суспензии после ферментативного осахаривания, полученной в примере 7, центрифугирование осуществляли согласно следующей процедуре.

В каждую из 25 центрифужных пробирок объемом 500 мл помещали по 400 мл суспензии после ферментативного осахаривания, и суспензию подвергали центрифугированию при 3000 G в течение 10 минут. Из каждой центрифужной пробирки можно было получить по 240 мл надосадочной жидкости, и общий объем 6 л надосадочной жидкости можно было, таким образом, собрать из 25 центрифужных пробирок. Оставшиеся 160 мл (в сумме 4 л) содержимого в каждой центрифужной пробирке рассматривали в качестве твердого вещества в центрифужной пробирке и собирали. На основании результатов измерения концентрации сахаров в полученном фильтрате, то есть в первичном сахарном растворе примера 8, концентрация глюкозы составляла 35 г/л, и концентрация ксилозы составляла 7 г/л. Таким образом, в том случае, когда сахар получали путем центрифугирования для разделения твердых и жидких фаз, выход глюкозы (выход сахара в первичном сахарном растворе) составлял 210 г, и выход ксилозы составлял 42 г (таблица 17).

(Сравнительный пример 4) Разделение твердых и жидких фаз путем центрифугирования (разделение твердых и жидких фаз и промывание твердых веществ после первичного гидролиза)

Используя 10 л жидкой суспензии после ферментативного осахаривания, полученной в примере 7, центрифугирование осуществляли согласно следующей процедуре.

В каждую из 25 центрифужных пробирок объемом 500 мл помещали по 400 мл суспензии после ферментативного осахаривания, и суспензию подвергали центрифугированию таким же образом, как в сравнительном примере 3. В сумме можно было собрать 6 л надосадочной жидкости.

Оставшиеся 160 мл (в сумме 4 л) содержимого в каждой центрифужной пробирке рассматривали в качестве твердого вещества в центрифужной пробирке и собирали. На основании результатов измерения концентрации сахаров в полученном фильтрате, то есть в первичном сахарном растворе примера 8, концентрация глюкозы составляла 35 г/л, и концентрация ксилозы составляла 7 г/л. Таким образом, в том случае, когда сахар получали путем центрифугирования для разделения твердых и жидких фаз, выход глюкозы (выход сахара в первичном сахарном растворе) составлял 210 г, и выход ксилозы составлял 42 г (таблица 17).

После этого оставшиеся твердые вещества промывали водой согласно следующей процедуре. Следует отметить, что эта операция не представляет собой вторичный гидролиз.

К твердым веществам, собранным после центрифугирования, добавляли воду, и центрифугирование осуществляли снова, чтобы осуществить разделение твердых и жидких фаз, в результате чего получали сахарный раствор. К осажденному компоненту в количестве 160 мл, оставшемуся в каждой из 25 центрифужных пробирок, добавляли по 100 мл дистиллированной воды. Температура дистиллированной воды в этом случае составляла 18°C. После добавления воды 25 центрифужных пробирок медленно вращали для перемешивания их содержимого и снова центрифугировали при 3000 G в течение 10 минут. После этого по 150 мл надосадочной жидкости можно было собрать из каждой центрифужной пробирки. Таким образом, в сумме 3,75 л надосадочной жидкости можно было собрать из 25 центрифужных пробирок. На основании результатов измерения концентрации сахаров в полученной надосадочной жидкости, то есть во вторичном сахарном растворе сравнительного примера 4, концентрация глюкозы составляла 21 г/л, и концентрация ксилозы составляла 4 г/л. Таким образом, в этом случае выход глюкозы составлял 79 г, и выход ксилозы составлял 15 г (таблица 17).

(Пример 11) Разделение твердых и жидких фаз путем центрифугирования (первичный гидролиз и вторичный гидролиз)

Используя 10 л жидкой суспензии после ферментативного осахаривания, полученной в справочном примере 4, центрифугирование осуществляли согласно следующей процедуре.

В каждую из 25 центрифужных пробирок объемом 500 мл помещали по 400 мл суспензии после ферментативного осахаривания, и суспензию подвергали центрифугированию таким же образом, как в сравнительном примере 3. В сумме можно было собрать 6 л надосадочной жидкости.

После этого вторичный гидролиз оставшихся твердых веществ осуществляли согласно следующей процедуре. В каждую из 25 центрифужных пробирок объемом 500 мл помещали по 400 мл суспензии после ферментативного осахаривания, и суспензию подвергали центрифугированию при 3000 G в течение 10 минут. После центрифугирования по 240 мл надосадочной жидкости можно было собрать из каждой центрифужной пробирки. Таким образом, в сумме 6 л надосадочной жидкости можно было собрать из 25 центрифужных пробирок. Оставшиеся 160 мл (в сумме 4 л) содержимого в каждой центрифужной пробирке рассматривали в качестве осажденного компонента в центрифужной пробирке и собирали. На основании результатов измерения концентрации сахаров в полученном фильтрате, то есть в первичном сахарном растворе согласно примеру 11, концентрация глюкозы составляла 35 г/л, и концентрация ксилозы составляла 7 г/л. Таким образом, в том случае, когда сахар получали путем центрифугирования для разделения твердых и жидких фаз, выход глюкозы (выход сахара в первичном сахарном растворе) составлял 210 г, и выход ксилозы составлял 42 г. Эти результаты кратко представлены в таблице 17 как выход сахара в случае первичного гидролиза (выход сахара в первичном сахарном растворе).

К осажденному компоненту, собранному после центрифугирования, добавляли воду, и центрифугирование осуществляли снова, чтобы осуществить разделение твердых и жидких фаз, в результате чего получали сахарный раствор. К осажденному компоненту в количестве 160 мл, оставшемуся в каждой из 25 центрифужных пробирок, добавляли по 100 мл дистиллированной воды, подогретой до 50°C. После этого центрифужные пробирки медленно вращали для перемешивания их содержимого, оставляли для выдерживания в инкубаторе при температуре 50°C в течение 1 часа. Затем центрифужные пробирки медленно вращали для перемешивания их содержимого и снова центрифугировали при 3000 G в течение 10 минут. Тем самым по 150 мл надосадочной жидкости можно было собрать из каждой центрифужной пробирки. Таким образом, в сумме 3,75 л надосадочной жидкости можно было собрать из 25 центрифужных пробирок. На основании результатов измерения концентрации сахаров в полученной надосадочной жидкости, то есть во вторичном сахарном растворе согласно примеру 11, концентрация глюкозы составляла 29 г/л, и концентрация ксилозы составляла 5 г/л. Таким образом, в этом случае выход глюкозы составлял 109 г, и выход ксилозы составлял 19 г (таблица 18).

На основании сравнения результатов сравнительного примера 3 и сравнительного примера 4, представленных в таблице 17, где вторичный гидролиз не осуществляли, с результатами примера 11, представленными в таблице 18, было обнаружено, что выход сахара можно значительно увеличивать путем осуществления вторичного гидролиза по изобретению. Однако на основании сравнения результатов примера 11 с результатами примера 6, где осуществляли разделение твердых и жидких фаз путем пресс-фильтрации, было обнаружено, что выход сахара снижается в тех случаях, когда отделение жидкости осуществляют путем центрифугирования, как можно видеть при сравнении таблицы 12 и таблицы 18. Это обусловлено, главным образом, тем, что более высокую эффективность извлечения сахара посредством разделения твердых и жидких фаз можно обеспечить путем пресс-фильтрации, чем путем центрифугирования.

(Пример 12) Активность разложения целлюлозы извлеченного фермента при вторичном гидролизе

Вторичный гидролиз осуществляли при условиях примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C), примера 2 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 25°C) и примера 5 (предварительно обработанная целлюлоза 3, Pluronic F68: 0,1%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%), и активность целлюлазы для каждого извлеченного фермента измеряли способом согласно справочному примеру 4. Таблица 19 кратко представляет значения активности, выраженные в относительных величинах, которые вычисляли, используя в качестве стандарта активность фермента, извлеченного после вторичного гидролиза, при условиях примера 1 (50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях. Поскольку активность разложения ксилана не была обнаружена также в примере 1, который был предназначен для использования в качестве стандарта, активность разложения ксилана, наблюдаемая в случае Pluronic F68: 0,5% в примере 5, определяли равной 1 для описания относительных активностей.

Никакой активности целлюлазы не наблюдали для извлеченного фермента при условиях 25°C (пример 2). С другой стороны, все величины активности целлюлазы были выше для извлеченных ферментов при условиях 50°C, особенно при 50°C в присутствии неионного поверхностно-активного вещества (Pluronic F-68) (пример 5).

(Сравнительный пример 5) Действие добавок на извлечение фермента с использованием катионных и анионных поверхностно-активных веществ

В качестве соединения, добавляемого при вторичном гидролизе, использовали лаурилсульфат натрия (SDS), который представляет собой анионное поверхностно-активное вещество, или 1% хлорид бензалкония, который представляет собой катионное поверхностно-активное вещество. Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как в примере 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3), за исключением того, что поверхностно-активное вещество добавляли так, что его конечная концентрация составляла 1%. Извлеченный фермент получали согласно такой же процедуре, как в примере 1, и измеряли активность целлюлазы извлеченного фермента, но активность невозможно было обнаружить при любых условиях. Таким образом, удалось подтвердить, что для извлечения фермента при сохранении его активности нельзя использовать ни катионное поверхностно-активное вещество, ни анионное поверхностно-активное вещество.

(Пример 13) Соотношение между типом неорганической соли при вторичном гидролизе и активностью извлеченного фермента

В качестве соединений, добавляемых для вторичного гидролиза, использовали разнообразные неорганические соли (хлорид натрия, ацетат натрия, сульфат натрия, гидросульфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия, гидрофосфат калия, хлорид аммония, хлорид магния, сульфат магния и хлорид кальция). Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как в примере 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3), за исключением того, что каждую из неорганических солей добавляли в таком количестве, что ее конечная концентрация составляла 1%. Значение pH после добавления устанавливали, используя гидроксид натрия или хлористоводородную кислоту, в интервале от 5,5 до 6,0. Эксперимент осуществляли при таких же условиях, как в примере 1 (при 50°C в течение 1 часа), за исключением добавления неорганической соли. Таблица 20 кратко представляет значения активности, вычисленные в виде относительных значений с использованием в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях. Поскольку активность разложения ксилана не была обнаружена также в примере 1, который был предназначен для использования в качестве стандарта, активность разложения ксилана, наблюдаемую в случае гидрофосфата калия, определяли равной 1 для описания относительных активностей.

В результате, как представлено в таблице 20, было обнаружено, что количество извлекаемого фермента склонно к увеличению в тех случаях, когда добавляли неорганическую соль, по сравнению с теми случаями, когда неорганическую соль не добавляли. Однако было обнаружено, что извлеченный фермент проявляет низкую активность в случае хлорида кальция, который представляет собой неорганическую соль кальция. Сульфат кальция и гидрокарбонат кальция, которые также представляют собой соли кальция, также исследовали, но эксперимент невозможно было осуществлять, поскольку эти соли оказались нерастворимыми для заданной концентрации (конечная концентрация 1%) вследствие своей низкой растворимости в воде. Таким образом, было обнаружено, что среди неорганических солей неорганические соли кальция не являются подходящими в качестве соединений, добавляемых для вторичного гидролиза по изобретению.

(Пример 14) Влияние концентрации неорганической соли, добавляемой при вторичном гидролизе

Влияние концентрации добавляемой неорганической соли подтверждали, используя хлорид натрия, который представляет собой соль натрия. Используя такую же процедуру, как в примере 13, вторичный гидролиз осуществляли при концентрациях хлорида натрия, составлявших 0%, 0,1%, 0,5%, 1% и 5%, и активность разложения целлюлазой извлеченного фермента измеряли аналогично справочному примеру 4. Таблица 21 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях. Поскольку активность разложения ксилана не была обнаружена также в примере 1, который был предназначен для использования в качестве стандарта, активность разложения ксилана, наблюдаемую при добавлении 0,5% хлорида натрия, определяли равной 1 для описания относительных активностей.

Как представлено в таблице 21, было обнаружено, что добавление хлорида натрия в качестве неорганической соли в низкой концентрации, составляющей всего лишь 0,1%, увеличивает активность разложения Avicel извлеченного фермента, и добавление хлорида натрия в концентрации, составляющей не менее чем 0,5%, в значительной степени увеличивает активность разложения всех материалов по сравнению со случаем, в котором хлорид натрия не добавляли.

(Пример 15) Соотношение между добавлением неорганической соли и температурой вторичного гидролиза

Вторичный гидролиз осуществляли в присутствии 1% хлорида натрия при температурах, составляющих 30°C, 40°C, 50°C и 60°C, и измеряли активность извлеченного фермента. Таблица 22 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях. Поскольку активность разложения ксилана не была обнаружена также в примере 1, который был предназначен для использования в качестве стандарта, активность разложения ксилана, наблюдаемую при добавлении 1% хлорида натрия при 60°C, определяли равной 1 для описания относительных активностей,

Как представлено в таблице 22, было обнаружено, что в присутствии хлорида натрия, в частности, активность разложения Avicel склонна увеличиваться по мере приближения температуры к 50°C, но активность заметно уменьшается при 60°C. В отношении активности разложения CMC и активности разложения целлобиозы, невозможно было наблюдать никакое зависящее от температуры увеличение степени извлечения, и значения активности разложения не уменьшались даже при увеличении температуры выше 60°C. В отношении активности разложения ксилана, было обнаружено, что активность разложения извлеченного фермента усиливается при температурах в интервале от 30°C до 50°C, но активность резко уменьшается при 60°C.

(Пример 16) Использование морской воды в качестве неорганической соли при вторичном гидролизе

В примерах 13-15 удалось подтвердить, что добавление неорганической соли может увеличивать количество и активность извлеченного фермента. В связи с этим проведено исследование для определения того, можно ли в качестве альтернативы использовать морскую воду, которая представляет собой водный раствор, содержащий неорганические соли. В качестве морской воды использовали морскую воду, собранную около рыбного порта Мисаки в префектуре Канагава (pH 8,3; количество растворенных твердых веществ 3,2%). Значение pH морской воды доводили с помощью серной кислоты до 6,5 (добавляли 24 мг серной кислоты на 1 л морской воды), 5,0 (добавляли 50 мг серной кислоты на 1 л морской воды) или 3,8 (добавляли 100 мг серной кислоты на 1 л морской воды). Что касается количества морской воды для вторичного гидролиза, морскую воду добавляли к твердым веществам таким образом, что ее конечная концентрация составляла 50% (степень разбавления 1/2). Вторичный гидролиз осуществляли при 50°C в течение 1 часа. Таблица 23 представляет значения активности фермента, который можно было извлечь. Таблица кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (целлюлоза, предварительно обработанный продукт 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях. Поскольку активность разложения ксилана не была обнаружена также в примере 1 (целлюлоза, предварительно обработанный продукт 3, 50°C), который был предназначен для использования в качестве стандарта, активность разложения ксилана, наблюдаемую в случае морской воды при pH 3,8, определяли равной 1 для описания относительных активностей.

Как представлено в таблице 23, удалось подтвердить, что также в тех случаях, когда морскую воду использовали в качестве неорганической соли, увеличивалась активность целлюлазы извлеченного фермента. Кроме того, было обнаружено, что значения активности разложения проявляют тенденции, аналогичные тем, которые наблюдаются в тех случаях, когда использовали такой реагент, как неорганическая соль, например хлорид натрия. Однако было показано, что активность разложения Avicel является ниже при pH 3,8, чем при других значениях pH.

(Пример 17) Соотношение между добавлением морской воды и температурой вторичного гидролиза

Вторичный гидролиз осуществляли при температурах, составляющих 30°C, 40°C, 50°C и 60°C, в присутствии морской воды при pH 5,0, когда проявлялся наибольший эффект из всех случаев добавления морской воды, и измеряли активность извлеченного фермента. Таблица 24 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях. Поскольку активность разложения ксилана не была обнаружена также в примере 1 (целлюлоза, предварительно обработанный продукт 3, 50°C), который был предназначен для использования в качестве стандарта, активность разложения ксилана, наблюдаемую в случае морской воды при 60°C, определяли равной 1 для описания относительных активностей.

Как представлено в таблице 24, было обнаружено, что в присутствии морской воды, в частности, активность разложения Avicel склонна к увеличению, по мере того, как температура приближается к 50°C, но активность заметно уменьшается при 60°C. В отношении активности разложения CMC и активности разложения целлобиозы, не удалось наблюдать никакого зависимого от температуры увеличения степени извлечения, и значения активности разложения не уменьшались даже при температуре, превышающей 60°C. В отношении активности разложения ксилана, было обнаружено, что активность разложения извлеченного фермента повышается при температурах в интервале от 30°C до 50°C, но активность резко уменьшается при 60°C. Такие тенденции были аналогичны тем, которые наблюдали в примере 15, в котором использовали хлорид натрия.

(Пример 18) Соотношение между количеством добавляемой аминокислоты при вторичном гидролизе и количеством извлеченного фермента

В качестве соединений, добавляемых для вторичного гидролиза, использовали разнообразные аминокислоты (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глютамин, глютаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин). Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как в примере 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C), за исключением того, что каждую из аминокислот добавляли при конечной концентрации 1%.

Аспарагиновая кислота и тирозин оказались нерастворимыми в заданной концентрации, и, следовательно, невозможно было создать конечную концентрацию 1%. Значение pH после добавления устанавливали, используя хлористоводородную кислоту и/или гидроксид натрия, в интервале от 5,5 до 6,5. Эксперимент осуществляли таким же образом, как в примере 1, за исключением добавления аминокислоты. Таблица 25 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (целлюлоза, предварительно обработанный продукт 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях. Поскольку активность разложения ксилана не была обнаружена также в примере 1 (целлюлоза, предварительно обработанный продукт 3, 50°C), который был предназначен для использования в качестве стандарта, обнаруживаемую активность разложения ксилана, наблюдаемую при использовании лизина, определяли равной 1 при описании относительной активности для гистидина.

В результате, как представлено в таблице 25, было обнаружено, что добавление аминокислот стремится к увеличению количества извлеченного фермента по сравнению со случаем, в котором аминокислоту не добавляли. Кроме того, было обнаружено, что при добавлении, в частности, глютаминовой кислоты, лизина, гистидина, аргинина или цистеина из числа аминокислот активность извлеченного фермента можно увеличивать. Удалось подтвердить, что эффект добавления цистеина является особенно высоким в отношении активности разложения Avicel. Кроме того, удалось подтвердить, что активность разложения ксилана можно увеличивать, в частности, путем добавления лизина или гистидина.

(Пример 19) Соотношение между добавлением аминокислоты и температурой вторичного гидролиза

Вторичный гидролиз осуществляли при температурах, составляющих 30°C, 40°C, 50°C и 60°C, в присутствии 1% цистеина, добавление которого обеспечивало наибольший эффект по сравнению с другими аминокислотами, и измеряли активность извлеченного фермента. Таблица 26 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при любых условиях, и она представлена как ND (не обнаружено).

Как представлено в таблице 26, было обнаружено, что в присутствии цистеина, в частности, активность разложения Avicel склонна к увеличению по мере того, как температура приближается к 50°C, но активность заметно уменьшается при 60°C. В отношении активности разложения CMC и активности разложения целлобиозы, не удалось наблюдать никакого зависимого от температуры увеличения степени извлечения, и значения активности разложения не уменьшались даже при температуре, превышающей 60°C. В отношении активности разложения ксилана, активность невозможно было обнаружить при любых температурах.

(Пример 20) Соотношение между количеством добавленного гидрофильного органического растворителя при вторичном гидролизе и активностью извлеченного фермента

В качестве соединений, добавляемых для вторичного гидролиза, использовали гидрофильные органические растворители (метанол, этанол, 1-пропанол, изопропанол, диметилсульфоксид, N,N-диметилформамид, ацетон, ацетонитрил, этиленгликоль и глицерин). Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как в примере 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C), за исключением того, что каждый из гидрофильных органических растворителей добавляли в конечной концентрации 1%. Эксперимент осуществляли таким же образом, как в примере 1, за исключением добавления гидрофильного органического растворителя. Таблица 27 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при любых условиях, и она представлена как ND (не обнаружено).

В результате, как представлено в таблице 27, было обнаружено, что активность извлеченного фермента, в частности активность разложения Avicel, можно увеличивать путем добавления гидрофильного органического растворителя.

(Сравнительный пример 6) Эффект добавления гидрофобного органического растворителя при вторичном гидролизе

В качестве соединений, добавляемых для вторичного гидролиза, использовали н-гексан, 1-бутанол и 1-пентанол, и вторичный гидролиз осуществляли согласно такой же процедуре, как в примере 19. Однако гидрофобные органические растворители отделялись от водной фазы, и извлечение с помощью ультрафильтрационной мембраны было затруднительным. Независимо от того, можно было извлекать фермент или нет, обнаружено, что гидрофобные органические растворители не являются подходящими в качестве соединений, добавляемых для вторичного гидролиза, поскольку с ними трудно работать.

(Пример 21) Соотношение между добавлением гидрофильного органического растворителя и температурой вторичного гидролиза

Вторичный гидролиз осуществляли при температурах 30°C, 40°C, 50°C (таких же, как в примере 20) и 60°C в присутствии 1% этанола, который представляет собой один из гидрофильных органических растворителей, используемых в примере 20, и измеряли активность извлеченного фермента. Таблица 28 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (предварительно обработанная целлюлоза 3, 50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при любых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено).

Было обнаружено, что в присутствии этанола, в частности, активность разложения Avicel склонна к увеличению по мере того, как температура приближается к 50°C, но активность заметно уменьшается при 60°C. В отношении активности разложения CMC и активности разложения целлобиозы, невозможно было наблюдать никакого зависимого от температуры увеличения степени извлечения, и значения активности разложение не уменьшались даже при температуре, превышающей 60°C. В отношении активности разложения ксилана, активность невозможно было обнаружить при любых температурах.

(Сравнительный пример 7) Эффект добавления водорастворимого полимера при вторичном гидролизе

В качестве соединений, добавляемых для вторичного гидролиза, использовали разнообразные водорастворимые полимеры. В качестве водорастворимых полимеров использовали полиаллиламин-HCl-3S (PAA-3S, Nitto Boseki Co., Ltd.), полиаллиламин-HCl-10S (PAA-10S, Nitto Boseki Co., Ltd.), полиэтиленгликоль #4000 (PEG #4000, Nakalai Tesque), полиэтиленгликоль #6000 (PEG #6000, Nakalai Tesque), полиэтиленгликоль #20000 (PEG #20000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), поливиниловый спирт 500 (PVA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и поливинилпирролидон (PVP, Sigma-Aldrich). Вторичный гидролиз осуществляли таким же образом, как в примере 1 (целлюлоза, предварительно обработанный продукт 3, 50°C), за исключением того, что каждый из водорастворимых полимеров добавляли в конечной концентрации 1%. Значение pH после добавления устанавливали, используя хлористоводородную кислоту и/или гидроксид натрия, в интервале от 5,5 до 6,5. Эксперимент осуществляли таким же образом, как в примере 1, за исключением добавления водорастворимого полимера. Таблица 29 кратко представляет значения активности, вычисленные как относительные значения при использовании в качестве стандарта активности фермента, извлеченного после вторичного гидролиза при условиях примера 1 (целлюлоза, предварительно обработанный продукт 3, 50°C) (50°C) (активность=1). Активность разложения ксилана невозможно было обнаружить при некоторых условиях, и ее обозначали как ND (не обнаружено) в таких случаях.

В присутствии водорастворимых полимеров невозможно наблюдать никакого увеличения активности извлеченного фермента в отношении какой-либо активности разложения вследствие их добавления.

Промышленная применимость

Сахарный раствор, полученный по изобретению, можно использовать в качестве сахарного материала для получения разнообразных продуктов ферментации.

Список позиций

1 - Термостат

2 - Бак с мешалкой

3 - Впуск целлюлозы

4 - Перемешивающее устройство

5 - Линия водоснабжения

6 - Питающий бак с теплой водой

7 - Термостат питающего бака 6 с теплой водой

8 - Пресс-фильтр

9 - Компрессор

10 - Циркуляционная линия

11 - Бак для сбора фильтрата

12 - Устройство с ультрафильтрационной мембраной

13 - Линия извлечения карбогидразы

14 - Впуск гидролизата

15 - Впуск теплой воды

16 - Внешняя рама

17 - Фильтровальная ткань

18 -Твердые вещества (первичный гидролизат)

19 - Прижимная плита

20 - Внутренняя часть камеры пресс-фильтра

21 - Совместный впуск гидролизата и теплой воды

22 - Бак для сахарного раствора

23 - Устройство с нанофильтрационной мембраной или устройство с обратноосмотической мембраной

24 - Линия фильтрата

25 - Устройство для разделения твердых и жидких фаз

26 - Устройство для передачи твердых веществ

27 - Второй термостат (бак вторичного гидролиза)

28 - Бак вторичного гидролиза

29 - Второе перемешивающее устройство (бак вторичного гидролиза)

30 - Второе устройство для разделения твердой и жидкой фаз вторичного гидролизата

32 - Бак для сбора вторичного сахарного раствора

33 - Устройство с ультрафильтрационной мембраной для вторичного сахарного раствора

34 - Линия для передачи вторичного сахарного раствора

35 - Линия для передачи вторичного гидролизата

36 - Устройство с микрофильтрационной мембраной

37 - Бак для неочищенной жидкости с микрофильтрационной мембраной

38 - Микрофильтрационная мембрана

39 - Устройство для подачи сжатого воздуха

40 - Насос для обратного промывания

41 - Бак для сбора микрофильтрата

Изобретение относится к способу изготовления сахарного раствора и устройству для осуществления способа. Способ предусматривает добавление карбогидразы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза, разделение твердых и жидких фаз первичного гидролизата для получения первичного сахарного раствора, стадию добавления воды к твёрдым веществам, осуществление вторичного гидролиза, разделение твердых и жидких фаз вторичного гидролизата для получения сахарного раствора и остатка, фильтрование первичного и вторичного сахарного раствора через ультрафильтрационную мембрану, причем время реакции первичного гидролиза составляет от 2 до 200 часов, концентрация твердых веществ перед вторичным гидролизом составляет от 1 мас.% до 20 мас.%, а время реакции вторичного гидролиза составляет от 5 до 180 минут. Устройство для осуществления способа изготовления сахарного раствора содержит бак с мешалкой для первичного гидролиза, первое устройство разделения твёрдой и жидкой фаз первичного гидролизата, бак вторичного гидролизата или пресс-фильтр для вторичного гидролиза, второе устройство разделения твердой и жидкой фаз вторичного гидролизата и устройство с ультрафильтрационной мембраной. Изобретение позволяет увеличить выход сахара и количество извлеченного фермента. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 16 ил., 29 табл., 21 пр.

1. Способ изготовления сахарного раствора с использованием карбогидразы для гидролиза целлюлозы, в котором в качестве карбогидразы используют целлюлазу, полученную из мицелиальных грибов Trichoderma, при этом способ включает:
стадию добавления указанной карбогидразы к целлюлозе для осуществления первичного гидролиза и последующего подвергания первичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения первичного сахарного раствора и твердых веществ, причем время реакции первичного гидролиза составляет от 2 до 200 часов;
стадию добавления воды к указанным твердым веществам так, чтобы концентрация твердых веществ перед вторичным гидролизом составляла от 1 мас.% до 20 мас.%, и осуществления вторичного гидролиза с последующим подверганием вторичного гидролизата разделению твердых и жидких фаз для получения вторичного сахарного раствора и остатка, при этом время реакции вторичного гидролиза составляет от 5 до 180 минут; и
стадию фильтрования указанного первичного сахарного раствора и вторичного сахарного раствора через ультрафильтрационную мембрану, извлечения указанной карбогидразы на стороне подачи и извлечения сахарного раствора на стороне фильтрата.

2. Способ по п. 1, в котором указанную целлюлозу получают из обработанного продукта, полученного из биомассы аммиачной обработкой, гидротермальной обработкой или обработкой разбавленной серной кислотой.

3. Способ по п. 1, в котором указанный вторичный гидролиз представляет собой гидролиз в присутствии одного или более веществ, выбранных из группы, которую составляют неорганические соли (за исключением солей кальция), гидрофильные органические растворители, аминокислоты и неионные поверхностно-активные вещества и сахарные растворы, включающие эти вещества.

4. Способ по п. 3, в котором указанная неорганическая соль (соли) (за исключением солей кальция) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют соли натрия, соли калия, соли магния, соли серной кислоты, соли аммония, соли хлористоводородной кислоты, соли фосфорной кислоты, соли уксусной кислоты и соли азотной кислоты.

5. Способ по п. 4, в котором указанная неорганическая соль (соли) (за исключением солей кальция) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют хлорид натрия, ацетат натрия, сульфат натрия, гидросульфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия, хлорид аммония, гидрофосфат калия, сульфат аммония, хлорид магния и сульфат магния.

6. Способ по п. 3, в котором указанный гидрофильный органический растворитель (растворители) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют метанол, этанол, 1-пропанол, изопропанол, Ν,Ν-диметилформамид, бутанол, ацетон, ацетонитрил, этиленгликоль и глицерин.

7. Способ по п. 3, в котором указанная аминокислота (аминокислоты) представляет(-ют) собой одно или более веществ, выбранных из группы, которую составляют аргинин, цистеин, глютаминовая кислота, гистидин и лизин.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором указанное разделение твердых и жидких фаз первичного гидролизата и/или вторичного гидролизата представляет собой пресс-фильтрацию.

9. Способ по любому из пп. 1-7, включающий стадию фильтрования указанного сахарного раствора через обратноосмотическую мембрану или нанофильтрационную мембрану для концентрирования указанного сахарного раствора.

10. Устройство для осуществления способа изготовления сахарного раствора по любому из пп. 1-9, содержащее в качестве компонентов: бак с мешалкой для первичного гидролиза; первое устройство разделения твердой и жидкой фаз первичного гидролизата; бак вторичного гидролиза или пресс-фильтр для вторичного гидролиза; второе устройство разделения твердой и жидкой фаз вторичного гидролизата и устройство с ультрафильтрационной мембраной для отделения указанной карбогидразы и указанного сахарного раствора от указанного первичного сахарного раствора и указанного вторичного сахарного раствора.

11. Устройство по п. 10, содержащее в качестве компонента устройство концентрирования сахарного раствора, снабженное обратноосмотической мембраной или нанофильтрационной мембраной для концентрирования указанного сахарного раствора, полученного с помощью указанного устройства с ультрафильтрационной мембраной.

12. Устройство для осуществления способа изготовления сахарного раствора по любому из пп. 1-9, содержащее в качестве компонентов: бак для проведения первичного гидролиза, снабженный перемешивающим устройством; пресс-фильтр; питающий бак с теплой водой; циркуляционную линию для циркуляции фильтрата из указанного пресс-фильтра в указанный питающий бак с теплой водой и устройство с ультрафильтрационной мембраной для отделения указанной карбогидразы и указанного сахарного раствора от указанного первичного сахарного раствора и указанного вторичного сахарного раствора.

13. Устройство по п. 12, содержащее в качестве компонента устройство концентрирования сахарного раствора, снабженное обратноосмотической мембраной или нанофильтрационной мембраной для концентрирования указанного сахарного раствора, полученного с помощью указанного устройства с ультрафильтрационной мембраной.