СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНО-МАНИПУЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ИЗ КОЖИ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/71 A61K35/36 

Изобретение относится к методикам получения клеточных фракций для биологических исследований, в частности к способам выделения аутологичных/аллогенных эпителиальных кератиноцитов и дермальных фибробластов, и может быть использовано для проведения исследований в области клеточной биологии и инженерии, регенеративной медицины и их применению для регенерации кожи животных и человека.

Подготовка отдельных клеточных фракций является важной частью экспериментального исследования в области регенеративной медицины и биоинженерии, заключающаяся в быстрой изоляции клеток от тканей путем введения набора ферментов для расщепления в измельченные гомогенизированные ткани и инкубации при определенных температурах в зависимости от используемого коктейля ферментов. Однако, сила и концентрация ферментов являются двумя наиболее важными факторами, которые следует учитывать при выборе набора ферментов для получения суспензии отдельных клеток. Ферменты с высокой активностью или высокой концентрацией могут нарушить маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках. что может повлиять на доступность этих маркеров и жизнеспособность клеток в дальнейших экспериментах.

В настоящее время существуют различные протоколы для выделения первичных клеток кожи, в частности эпителиальных кератиноцитов и дермальных фибробластов.

Из существующих аналогов известен способ выделения фибробластов, способ создания биотрансплантата на их основе (варианты) и способ регенерации тканей человека (варианты) (RU 2567004 С2). Фибробласты выделяются из биоптата кожи объемом 2 мм/1 мм/1 мм путем миграции фибробластов из измельченных фрагментов дермы. Несмотря на использование ферментов в данном способе, они не используются непосредственно для выделения фибробластов, а лишь для отделения эпидермиса от дермы либо отмывки прикрепленных клеток.

Известен схожий способ миграции фибробластов из экспланта кожи, исключающий ферментативную обработку (RU 2382077 С2). Срезы ткани размещают на чашке Петри, покрытой поли-D-лизином в среде DMEM c 2% FBS под покровным стеклом.

В известных способах не описан механизм миграции клеток из измельченных тканей, а также количество полученных клеток при таком способе выделения, что является недостатком данных способов. Также, данные способы исключают возможность получения эпителиальных кератиноцитов, являющихся основным типом клеток эпидермиса и участвующих в процессе регенерации.

Известна статья «Выделение дермальных фибробластов мышей методом FACS - PMC (nih.gov) (Walmsley G.G et al., 2016, “Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS”). В данной статье говорится о разработанном протоколе выделения фибробластов из дорсальной кожи взрослых мышей на основе FACS. Предлагаемый протокол позволяет сохранить транскрипционный и протеомный профиль клеток ввиду отсутствия необходимости их культивирования. Для получения культур фибробластов измельченную кожу инкубируют в растворе коллагеназы IV в концентрации 1 мг/мл в DMEM в течение 1,5 часа, с последующим анализом FACS.

Недостатком данного протокола является риск содержания контаминирующих клеток. Воздействие FBS, которое применяется во время проведения выделения клеток, может повлиять на экспрессию генов в клеточной культуре. Более того, данный способ требует наличия специального дорогостоящего оборудования, в отличие от способа, разработанного в нашем протоколе.

Известен способ получения и культивирование первичных кератиноцитов человека из кожи взрослого человека статья (Johansen C., 2017 “Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5755678/). Выделяют и получают первичные кератиноциты человека из кожи взрослого человека на основе использования раствора 0,25% трипсина и 0,1% глюкозы в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) и инкубации в течение 30 минут.

Недостатком данного способа является использование биопсии размером 10×15 см из которого можно выделить 50-100 млн клеток. Однако в клинической практике в случае массивных повреждений кожи, такие размеры жизнеспособного биоптата кожи иногда невозможно получить. Кроме того, при использовании данного способа не имитируются различные слои эпидермиса, а также различные типы клеток кожи, что демонстрируется при применении нашего метода выделения первичных кератиноцитов и фибробластов из кожи.

Известен способ выделения первичных эпидермальных кератиноцитов из кожи новорожденных и взрослых мышей (Li F. et al., 2017 “Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5612483/). Для получения культур кератиноцитов используют метод инкубации в растворе диспазы в концентрации 4 мг/мл в течение 12-18 ч при 4°C для отделения эпидермиса от дермы с последующим расщеплением эпидермиса в трипсине в течение 20 минут.

Однако данный способ выделения подразумевает длительную инкубацию в растворе диспазы при низкой температуре, что значительно усложняет работу, так как затрачивается не только большое количество времени, но и есть вероятность гибели клеток в ходе инкубации при низких температурах. Также авторы не указывают точное количество жизнеспособных клеток, которые можно получить при использовании данного метода. Кроме того, в данном способе не используется гомогенизация тканей, что вероятнее связано с тем, что авторы хотели получить исключительно базальные кератиноциты. Однако недостаточная гомогенизация может повлиять на эффективность ферментативного расщепления и привести к низкому выходу диссоциированных клеток. В предлагаемом нами способе нет необходимости в проведении ферментативного расщепления ткани кожи в течение более 5 часов, а также проводится гомогенизация тканей для получения физиологически релевантного количества жизнеспособных клеток.

Известен способ выделения клеток из кожных биоптатов взрослых мышей ("Optimized protocol for the preparation of single cells from cutaneous wounds for flow cytometric cell sorting and analysis of macrophages", Shakya S., Asosingh K., Mack J.A., Maytin E.V. Optimized protocol for the preparation of single cells from cutaneous wounds for flow cytometric cell sorting and analysis of macrophages. MethodsX. 2020 Aug 8; 7: 101027. doi: 10.1016/j.mex.2020.101027). Биоптат кожи измельчают на фрагменты размером 2-3 мм и инкубируют в растворе диспазы II концентрацией 1 мг/мл в течение ночи при 4°С. По истечении времени фрагменты кожи переносят в раствор коллагеназы I в концентрации 1 мг/мл и инкубируют в течение 2 часов при 37°C на шейкере-инкубаторе. После инкубации клеточную суспензию фильтруют, центрифугируют и проводят оценку жизнеспособности по окрашиванию трипановым синим и сортируют клетки методом проточной цитометрии.

Однако в известном способе необходимо проводить ферментативное расщепление тканей при низкой температуре, что существенно увеличивает время инкубации и приводит к гибели клеток. Также данный протокол предполагает получение 6,7 млн клеток, что ниже количества, получаемого при использовании нашего способа. Более того, осуществление данного протокола требует наличия специального дорогостоящего оборудования, такого как шейкер-инкубатор, в отличие от предлагаемого нами способа.

Известен способ получения клеточных популяций кожи из крайней плоти человека основана на использовании коммерческих смесей ферментов (Heymer et al. “Isolation of keratinocytes and fibroblasts from human foreskin by one-step enzyme incubation using liberase research grade products”, Isolation of keratinocytes and fibroblasts from human foreskin by one-step enzyme incubation using liberase research grade products (fraunhofer.de). Данный способ является оптимизацией способа Liberase blendzyme 1 и Liberase DL Research Grade, представляющих смесь диспазы II и коллагеназ I и II типов. Эпиермальный и дермальный слой механически разделяли после инкубации при 37°C в течение 2,5 часов. Дальнейшую диссоциацию клеток проводили с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 18 минут при 37°C и оценивали число и жизнеспособность клеток окраской трипановым синим. Данный способ позволяет сократить время необходимое для получения одиночных клеток.

Однако авторы отмечают затруднение в различении эпидермального и дермального слоев при их разделении, а также наличие загрязнения популяции кератиноцитов клетками фибробластов в ходе ферментативной диссоциации, чего не наблюдалось при выделении клеток по двухэтапному стандартному протоколу.

Известен способ выделения кератиноцитов из кожи новорожденных и взрослых мышей, который предполагает удаление кальция из FBS путем воздействия хелатирующей смолы (Lichti et al. “Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice” https://www.nature.com/articles/nprot.2008.50). Кусочки кожи инкубируют в 0,25% трипсине при температуре 4°C в течение ночи для разделения дермального и эпидермального слоев. После инкубации ткани переносят в S-MEM, содержащей 8% хелексированную сыворотку, антибиотики и 0,25 М кальций для дальнейшего механического разделения клеток.

Недостатками такого способа выделения является потеря выхода и снижение жизнеспособности клеток, связанных с этапами инкубирования кожи в трипсине при низких температурах и центрифугирования, а также риск контаминации за счет выдерживания биоматериала в течение ночи в трипсине. Кроме того, потеря биологического материала при выделении кератиноцитов связана с низкой степенью лизирования за счет использования только одного фермента - трипсина, в отличие от нашего способа.

Известен способ получения смеси для распыления клеток-фибробластов кератиноцитов человека в растворе и ее применение в качестве регенеративного агента при повреждениях кожи (RU 2016131784 A). Биоптат кожи инкубируют в 0,025% трипсине не менее 16 часов при 4°C для разделения дермы и эпидермиса. Слой дермы дезинтегрируют с помощью инструмента постоянного импульса на фрагменты 1 мм × 1 мм и инкубируют в питательной среде при 37°С, 95% RH, и 5% CO₂ и 20% O₂ до образования монослоя фибробластов. Эпидерму трипсинизируют, а затем нейтрализуют питательной средой с 10% FBS и интенсивно перемешивают. Полученный раствор клеток фильтруют, получая суспензию кератиноцитов.

Однако в известном способе не описан конечный выход клеток и их жизнеспособность, которые будут снижаться в связи с длительным инкубированием в трипсине при низких температурах. Нет данных о размерах пор использованного мембранного фильтра для получения кератиноцитов, и времени воздействия инструмента постоянного импульса на дерму. Использование трипсина, лизирующего в основном неколлагеновые белки матрикса, может стать причиной низкого количества выделенных фибробластов. Для преодоления этого недостатка, в предложенном нами способе используются коллагеназы I и IV типов.

Известен способ выделения и культивирования четырех основных типов клеток кожи, в том числе кератиноциты и фибробласты (Henrot et al. “A Method for Isolating and Culturing Skin Cells: Application to Endothelial Cells, Fibroblasts, Keratinocytes, and Melanocytes From Punch Biopsies in Systemic Sclerosis Skin”, Frontiers | A Method for Isolating and Culturing Skin Cells: Application to Endothelial Cells, Fibroblasts, Keratinocytes, and Melanocytes From Punch Biopsies in Systemic Sclerosis Skin (frontiersin.org). Дерму и эпидермис разделяют посредством инкубирования биоптата в 1 мл диспазы (25 МЕ/мл) в течение ночи при 4°С. Эпидермальный слой инкубируют в 1 мл раствора трипсин-ЭДТА при 37°C в течение 10 мин. После инкубации пробирку встряхивают и переносят эпидерму в солевой раствор Хэнка и добавляют 10% FCS для инактивации действия фермента. Клетки механически диссоциируют, с помощью микроинструментов и центрифугируют. Дермальный слой переносят в пробирку с IMEM, содержащей 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицин, центрифугируют и разрезают на части размером 1 мм³. Нарезанные части инкубируют в 5 мл раствора коллагеназы 90 мин при 37°С в механическом шейкере, затем инактивируют действие коллагеназы 10% FCS. Полученные клетки дермы и эпидермиса культивируют в в 6-луночных планшетах и разделяют основные клеточные компоненты дермы и эпидермиса методом дифференциально трипсинизации.

Недостатком известного способа является необходимость длительного инкубирования клеток с диспазой, что может привести к снижению уровня экспрессии факторов роста клетками и повлиять на их жизнеспособность.

Самым близким (прототипом) является способ выделения первичных кератиноцитов человека из тканей взрослого организма (Liu Z. et al., 2018, “A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue” (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231857/)). В данной работе для инкубации 1,5 см² тканей кожи животных в течение часа использовалась смесь ферментов диспазы и коллагеназы I типа в концентрациях 2,5 мг/мл, растворенных в питательной среде DMEM, с последующим добавлением 0,25% трипсина и повторной инкубацией в течение 20 минут.

Однако, не смотря на схожесть известного способа с предложенным нами способом, авторы не демонстрируют количество клеток, выделенных непосредственно после ферментативного расщепления, а лишь на 7 день культивирования, что не позволяет судить об эффективности данной методики. Кроме того, для клинических применений, таких как лечение кожных повреждений необходимо использование фибробластов, так как фибробласты играют центральную роль в заживлении ран посредством отложения и ремоделирования коллагеновых волокон.

Техническим результатом является получение ферментативным путем из кожи взрослого организма минимально-манипулированных клеточных фракций фибробластов и кератиноцитов с высоким процентом жизнеспособности, сохранении их физиологических свойств и уменьшении их побочного повреждения, которые отражаются на жизнеспособности и морфологии клеточных фракций, для применения в клеточной терапии и увеличения регенеративного потенциала кожи.

Технический результат решается тем, что при выделении минимально-манипулированных клеточных фракций фибробластов и кератиноцитов биоптаты кожи, промытые сначала в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) с добавлением 10% пенициллин-стрептомицина в течение одной минуты, а затем в растворе 70% этанола в течение 30 секунд, находящиеся в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) с добавлением 10% пенициллин-стрептомицина в течение 1 минуты, измельчают до гомогенного состояния с размером фрагментов 100-150 мкм² и инкубируют в соотношении один миллиграмм ткани кожи к 10 мкл раствора комбинации ферментов - коллагеназа I, диспаза II, коллагеназа IV, при концентрации 2,5 мг/мл, 2,5 мг/мл и 2 мг/мл соответственно, трипсин при концентрации 0,25%, отфильтрованных через одноразовой шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, в СО₂ при температуре 37°С в течение 3,5 часов с периодическим перемешиванием на вортексе, затем полученную суспензию клеток в растворе комбинации ферментов пипетируют вверх и вниз 20 раз, используя 10 мл серологическую пипетку, чтобы диссоциировать клетки, и однократно фильтруют через стерильный клеточный фильтр с размером пор 100 в новые конические пробирки объемом 50 мл, чтобы удалить остатки ткани, при этом после фильтрации к клеточной суспензии через использованный клеточный фильтр с размером пор 100 мкм с остатками фрагментов кожи добавляют нейтрализующую среду на основе питательной среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина в количестве 5 мл, центрифугируют при 500g в течение 8 мин при температуре 20°C, удаляют надосадочную жидкость и добавляют объем нейтрализующий среды, равный убранному объему надосадочной жидкости, после этого клетки ресуспендируют в объеме жидкости, проводят однократную фильтрацию через стерильный клеточный фильтр, имеющий размер пор 70 мкм, промывают фильтр 5 мл нейтрализующей среды и центрифугируют при 500g в течение 8 мин при 20°C, полученную суспензию клеток подвергают лизированию с помощью лизирующего раствора BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate, затем проводят подсчет общего числа клеток с использованием камеры Горяева, при подсчете количества жизнеспособных клеток используют раствор трипанового синего в пропорции 1:1, количество получаемых жизнеспособных клеток при размере кожного биоптата в 1 см² достигает 8,9-9,1 млн клеток. При этом полученные минимально-манипулированные клеточные фракции фибробластов и кератиноцитов имеют процент жизнеспособности - 92,15±2,98%.

Способ осуществляют следующим образом.

При выделении минимально-манипулированных клеточных фракций фибробластов и кератиноцитов биоптаты кожи предобрабатывают, промывая сначала один раз в 15 мл стерильного фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), а потом в 10 мл 70% этанола в течение 30 секунд. После предобработки образцы ткани помещают в стерильные чашки Петри содержащие 15 мл PBS с добавлением 1,5 мл раствора пенициллин-стрептомицина, и, используя стерильный скальпель или лезвие, измельчают до гомогенного состояния с размером фрагментов 100-150 мкм² (количество биоптатов кожи выбирают исходя из необходимых потребностей и целей: чем выше необходимое конечное количество клеток, тем больше должен являться размер кожного биоптата). После чего гомогенизированные фрагменты кожи размером 100-150 мкм² переносят с помощью 5 мл серологической пипетки в 15 мл конические пробирки с подготовленными пропущенными через одноразовый шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм растворами коллагеназы I, коллагеназы VI и диспазы II в питательной среде DMEM, имеющими концентрации 2,5 мг/мл, 2 мг/мл и 2,5 мг/мл соответственно. При этом на каждый миллиграмм ткани кожи используют 10 мкл смеси ферментов. Далее гомогенизированные фрагменты подвергают ферментативному расщеплению при температуре 37°С в течение 3 часов с периодическим перемешиванием на вортексе. По прошествии трех часов к полученной суспензии клеток в раствор ферментов добавляют 1/5 объема 0,25% трипсина и продолжают инкубацию ещё в течение 30 минут при температуре 37°С. Так как в ходе выделения клеток используют комбинацию ферментов, то в ходе ферментативного расщепления одновременно разрушается внеклеточный матрикс, разрушаются связи между клетками и внеклеточным матриксом, разрушаются пептидные связи, присутствующие в коллагене и происходит диссоциацию клеток, что позволяет существенно повысить итоговое количество минимально-манипулированных клеточных фракций фибробластов и кератиноцитов.

Далее по прошествии 3,5 часов проводят инактивацию ферментативной активности ферментов в соотношении 1:1 с помощью нейтрализующей среды на основе питательной среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина. Затем суспензию клеток пипетируют вверх и вниз 20 раз, используя 10-мл серологическую пипетку, чтобы диссоциировать клетки и пропускают через клеточный фильтр с размером пор 100 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы удалить остатки ткани. Через этот же фильтр пропускают 5 мл нейтрализующей среды для максимального выхода клеток. Полученную суспензию клеток в растворе центрифугируют при 500g в течение 8 мин при 20 °C, удаляют надосадочную жидкость, уделяя большое внимание тому, чтобы сначала удалить верхний жировой слой, а затем оставшуюся надосадочную жидкость. После чего к клеточному осадку добавляют объем нейтрализующий среды равный убранному объему надосадочной жидкости, ресуспендируют клетки в объеме жидкости и только после этого проводят следующую фильтрацию через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм, промывая фильтр 5 мл нейтрализующей среды, и снова центрифугируют при 500g в течение 8 мин при 20 °C. Полученную суспензию клеток подвергают лизированию с помощью лизирующего раствора с целью исключения эритроцитов кожных сосудов из клеточной суспензии. Затем проводят подсчет общего числа клеток с использованием камеры Горяева. Для подсчета количества жизнеспособных клеток используют раствор трипанового синего в пропорции 1:1. Причем количество получаемых жизнеспособных клеток при размере кожного биоптата в 1 см² достигают (в среднем) - 8,9-9,1 млн клеток.

Пример осуществления предлагаемого способа, где в качестве биоптата использовалась кожа крысы

Для выделения минимально-манипулированных клеточных фракций фибробластов и кератиноцитов использовались 4 биоптата кожи крыс линии Wistar диаметром 7 мм. Осуществление предлагаемого способа проводилось в 10 повторностях.

Полученные биоптата кожи крыс линии Wistar диаметром 7 мм, промывали сначала один раз в 15 мл стерильного фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), а потом в 10 мл 70% этанола в течение 30 секунд с целью исключения контаминации образцов. После предобработки биоптаты кожи помещали в стерильные чашки Петри содержащие 15 мл PBS с добавлением 1,5 мл раствора пенициллин-стрептомицина, и, используя стерильный скальпель или лезвие, измельчали до гомогенного состояния с размером фрагментов 100-150 мкм². После предобработки проводили пробоподготовку реагентов.

Пробоподготовка состояла из приготовления раствора смеси ферментов и приготовления нейтрализующей среды. Для приготовления раствора ферментов брали по 12,5 мг порошков коллагеназы I типа (Gibco, США) и диспазы II (Sigma-Aldrich, США), 10 мг порошка коллагеназы IV (Servicebio, Китай) и растворяли в 5 мл DMEM (ПанЭко, Россия). Полученный раствор пропускали через одноразовой шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Для нейтрализующей среды, состоящей из питательной среды DMEM, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина, использовали 45 мл DMEM, 4,5 мл FBS и 450 мкл пенициллина-стрептомицина. После подготовки раствора ферментов и раствора нейтрализующей среды полученные ткани подвергались ферментативному расщеплению. Для этого на каждый миллиграмм ткани кожи использовали 10 мкл смеси ферментов. Полученную смесь ферментов тщательно перемешивали с гомогенизированными измельченными тканями и инкубировали смесь в CO₂ инкубаторе (Sheldon Manufacturing, США) при 37°С в течение 3 часов периодически перемешивая на вортексе. Через 3 часа к смеси ферментов добавляли 1/5 объема 0,25% трипсина (ПанЭко, Россия) и инкубировали ещё в течение 30 минут в CO₂ инкубаторе. По прошествии 3,5 часов процесс ферментативного расщепления прекращали, используя нейтрализующую среду в соотношении 1:1. После этого раствор пипетировали вверх и вниз примерно 20 раз, используя 10 мл серологическую пипетку, чтобы диссоциировать клетки, и полученный раствор с суспензией клеток пропускали через 100 мкм клеточный фильтр в новую коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы удалить остатки ткани. Через этот же фильтр пропускали 5 мл нейтрализующей среды для максимального выхода клеток. Полученную суспензию клеток в нейтрализующей среде центрифугировали при 500g в течение 8 мин при температуре 20°C, отбирали надосадочную жидкость. При этом сначала удаляли верхний жировой слой, а затем оставшуюся надосадочную жидкость. Затем повторно добавляли 5 мл нейтрализующей среды, ресуспендировали клетки в объеме жидкости, пропускали суспензию клеток с нейтрализующей средой через 70 мкм клеточный фильтр, промывали фильтр 5 мл нейтрализующей среды и снова центрифугировали при 500g в течение 8 мин при 20°C. Полученную суспензию клеток лизировали с помощью лизирующего раствора BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate (BD Biosciences, США) с целью исключения эритроцитов кожных сосудов из клеточной суспензии. После чего клеточную суспензию ресуспендировали и проводили подсчет общего числа клеток в 1 мл клеточной суспензии в камере Горяева. Для определения жизнеспособности выделенных ферментативным путём клеточных фракций использовали окраску трипановым синим. После центрифугирования клеточной суспензии в нейтрализующей среде её ресуспендировали, отбирали 100 мкл клеточной суспензии и добавляли в стерильный эппендорф. Туда же добавляли 100 мкл трипанового синего и инкубировали в течение 2-3 минут. По прошествии 2-3 минут клетки ресуспендировали и подсчитывали число жизнеспособных клеток в 1 мл.

Предложенный способ позволяет повысить однородность полученных клеточных фракций, выход до 8,9-9,1 млн клеток из 1 см² биоптата кожи, увеличить жизнеспособность кератиноцитов и фибробластов до 92,15±2,98% и в дальнейшем использовать в клеточной терапии для увеличения регенеративного потенциала кожи.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу ферментативного выделения минимально-манипулированных клеточных фракций из кожи лабораторных животных, включающему инкубацию тканей кожи животных с использованием смеси ферментов диспазы и коллагеназы I типа в концентрациях 2,5 мг/мл, растворенных в питательной среде DMEM, с последующим добавлением 0,25% трипсина и коллагеназы IV в концентрации 2 мг/мл. Способ обеспечивает получение ферментативным путем из кожи взрослого организма минимально-манипулированных клеточных фракций фибробластов и кератиноцитов с высоким процентом жизнеспособности, сохранение их физиологических свойств и уменьшение их побочного повреждения, которые отражаются на жизнеспособности и морфологии клеточных фракций, для применения в клеточной терапии и увеличения регенеративного потенциала кожи. 1 пр.

Способ ферментативного выделения минимально-манипулированных клеток из кожи, включающий инкубацию тканей кожи животных с использованием смеси ферментов диспазы и коллагеназы I типа в концентрациях 2,5 мг/мл, растворенных в питательной среде DMEM, с последующим добавлением 0,25% трипсина и коллагеназы IV в концентрации 2 мг/мл, отличающийся тем, что при выделении минимально-манипулированных клеточных фракций фибробластов и кератиноцитов биоптаты кожи, промытые сначала в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) с добавлением 10% пенициллин-стрептомицина в течение одной минуты, а затем в растворе 70% этанола в течение 30 секунд, находящиеся в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) с добавлением 10% пенициллин-стрептомицина в течение 1 минуты, измельчают до гомогенного состояния с размером фрагментов 100-150 мкм² и инкубируют в соотношении один миллиграмм ткани кожи к 10 мкл раствора комбинации ферментов - коллагеназа I, диспаза II, коллагеназа IV, при концентрации 2,5 мг/мл, 2,5 мг/мл и 2 мг/мл соответственно, трипсин при концентрации 0,25%, отфильтрованных через одноразовой шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, в СО₂ при температуре 37°С в течение 3,5 часов с периодическим перемешиванием на вортексе, затем полученную суспензию клеток в растворе комбинации ферментов пипетируют вверх и вниз 20 раз, используя 10 мл серологическую пипетку, чтобы диссоциировать клетки, и однократно фильтруют через стерильный клеточный фильтр с размером пор 100 мкм в новые конические пробирки объемом 50 мл, при этом после фильтрации к клеточной суспензии через использованный клеточный фильтр с размером пор 100 мкм с остатками фрагментов кожи добавляют нейтрализующую среду на основе питательной среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина в количестве 5 мл, центрифугируют при 500g в течение 8 мин при температуре 20°C, удаляют надосадочную жидкость и добавляют объем нейтрализующий среды, равный убранному объему надосадочной жидкости, после этого клетки ресуспендируют в объеме жидкости, проводят однократную фильтрацию через стерильный клеточный фильтр, имеющий размер пор 70 мкм, промывают фильтр 5 мл нейтрализующей среды и центрифугируют при 500g в течение 8 мин при 20°C, полученную суспензию клеток подвергают лизированию с помощью лизирующего раствора BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate, затем проводят подсчет общего числа клеток с использованием камеры Горяева, при подсчете количества жизнеспособных клеток используют раствор трипанового синего в пропорции 1:1, количество получаемых жизнеспособных клеток при размере кожного биоптата в 1 см² достигает 8,9-9,1 млн клеток.