СПОСОБ СНЯТИЯ КЛЕТОК С КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПАССАЖА МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2010 года по МПК C12N5/735 C12N9/48 

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к выделению мезенхимальных стволовых клеток из тканей человека, и может найти применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний.

В настоящее время в современной биомедицине формируется новый раздел - клеточная терапия, которая позволяет с помощью трансплантации клеток восполнить недостаточную функциональную активность тканей и регенерировать поврежденные органы. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют стволовые клетки, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. В связи с этим применение стволовых клеток является наиболее перспективным направлением клеточной терапии, и наибольшую актуальность приобретают работы по выделению стволовых клеток из тканей человека. Выделены различные типы стволовых клеток взрослого организма - гематопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной ткани), мезенхимальные (клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения, а также других зародышевых листков) и др. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью пролиферировать в течение долгого времени in vitro и широким спектром дифференцировки. В связи с этим особое внимание уделяется способам изоляции МСК из тканей взрослого организма, однако универсального метода их получения до сих пор нет.

Впервые мезенхимальные стволовые клетки были получены из костного мозга по способности прикрепляться к поверхности культуральной посуды (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974. Vol.2. P.83-92). Недостатком данного метода является неоднородность получаемой популяции клеток, тем не менее адгезия ММСК на пластике стала основой для последующих модифицированных способов выделения ММСК.

Известен способ получения ММСК, основанный на способности клеток прикрепляться к поверхности культуральной посуды и использовании определенных лотов бычьей эмбриональной сыворотки, в результате были изолированы клетки с большей адгезивной способностью, скоростью пролиферации и временем сохранения мультипотентности (Heynesworth S.E., Goshima J., Goldberg V.M., Calplan A.I. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow // Bone. 1995. Vol.13. P.81-95). Недостатком этого метода является длительность и трудоемкость анализа сыворотки в процессе поиска лота, подходящего для культивирования клеток, а также отсутствие воспроизводимости результатов.

Известен способ выделения ММСК с помощью селекции на антитела к Stro-1, антигену с неизвестной функцией, временно экспрессирующемуся на поверхности МСК (Grontos S., Simmons P.J. The growth factors requirements of Stro-1 positive human stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro // Blood. 1995. Vol.85. P.929-940). Способ является очень трудоемким и требует длительного времени для предварительного выделения антител.

Известен способ выделения ММСК, состоящий в получении мононуклеарных клеток центрифугированием в градиенте фиколла, селекции на антитела к поверхностному антигену CD105, экспрессирующемуся на поверхности МСК, и культивировании клеток, прикрепляющихся к пластику. Доля отобранных CD105⁺ клеток составила 2-3% от фракции моноядерных клеток. В результате была получена популяция клеток, обладающих морфологией и профилем экспрессии поверхностных антигенов, характерным для МСК, а также хондрогенным потенциалом (Majumdar M.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. Isolation, characterization, and chondregenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells // J. Cell. Physiol. 2000. Vol.185. P.98-106). Способ приводит к выделению фракции клеток CD105⁺, обогащенной МСК, но это требует дополнительной стадии селекции с помощью антител, иммобилизованных на магнитных шариках, что ведет к потере части клеток и требует дополнительных затрат.

Известно, что количество ММСК в организме, а также их способность к пролиферации и дифференцировке существенно снижается с возрастом (Rao M.S., Mattson M.P. Stem cell and aging: expanding the possibilities // Mech. Ageing Dev. 2001. Vol.122. P.713-734). В связи с этим разрабатываются методы выделения ММСК с высокой пролиферативной активностью и дифференцировочным потенциалом.

Известен способ снятия мезенхимальных стволовых клеток с подложки при проведении пассажа с использованием фермента аккутаза (DUEWELHENKEN, et al. Influence on mitochondria and Cytotoxciti of different antibiotics administered in high concentrations on primary human osteoblast and cell lines. Antimicrob Agent Chemother / 2007 January; 51 (1): 54-63); также известна кратновременная обработка (от 30 секунд до одной минуты) выделенных прогениторных клеток ферментом аккутаза (CEDRIC G GEOFROY and OLIVER RAIETEAU/ A Cre-lox approach for transient transgene expression in neural precursor cells and long-term tracking of their progeny in vitro and in vivo. BMC Del Biol. 2007;7:45). Отличие данной заявки на изобретение от уже известных заключается не в том, что мы предложили использовать аккутазу для снятия ММСК с культивируемой поверхности, как в статье, приведенной выше, а также не в достижении максимальной скорости обработки клеток. Суть в том, что мы снятие клеток осуществляем в парах аккутазы, что позволяет получить большее количество жизнеспосбных клеток при проведении пассажа.

В соответствии с программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», в разделе (19-01) «базовые методы работы с культурами эукариотических клеток» содержатся рекомендации по работе с культурой клеток. В подразделе «Снятие клеток с культуральных сосудов» приведен рекомендуемый протокол действий, согласно которому необходимо: залить монослой раствором для снятия клеток (чтобы полностью покрывал: ~1 мл на 25 см²). После этого инкубировать при 37°С, периодически аккуратно покачивая. Обычно клетки отделяются от субстрата через 1-10' (время зависит от клеточной линии). Жизнеспособность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при выполнении протокола, поддержанного программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», составляет 50-60%. Этот способ мы рассматриваем в качестве ближайшего аналога. Недостатком способа, на наш взгляд, является низкий процент выхода жизнеспособных клеток. На данный момент широко используется методика снятия клеток с подложки путем заливки культуры клеток - 0,25% раствором трипсин-ЭДТА и последующей инкубации в течение 10 минут при 37°С.

Технический результат заявляемого способа заключается в повышении выхода жизнеспособных клеток, что достигается за счет изменения условий ферментативной обработки культуры клеток при проведении пассажа (отделение клеток друг от друга и от поверхности). Выход жизнеспособных клеток по сравнению с известными на сегодняшний день способами-аналогами увеличивается в несколько раз.

Предлагается способ снятия клеток при проведении пассажа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, заключающийся в том, что снятие клеток осуществляют в парах фермента аккутазы. Для этого после удаления питательной среды в культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток добавляется первая порция 0,075% раствора аккутазы (5 мл на 25 см² подложки). Добавление этой порции необходимо для инактивации оставшейся в культуре сыворотки. Через пару секунд необходимо аспирировать фермент. Добавление второй порции 0,075% раствора аккутазы производится сразу после удаления первой порции ферментов. Инкубирование осуществляется в течение 2-3 секунд, после чего 0,075% раствор аккутазы вновь аспирируется. Последующее инкубирование производится уже в парах аккутазы в течение 2 минут при 37°С.

По нашим данным, содержание жизнеспособных клеток при данном способе составляет 95%, в то время как в ближайшем аналоге клетки сохраняли жизнеспособность лишь на 50-60%. Выход ММСК по заявляемому способу составляет 700 тыс. клеток с 25 см,² в то время как в известных аналогах он несколько выше - 700-750 тыс. с 25 см² подложки. Таким образом, следует подчеркнуть, что выход клеток по заявляемому способу существенно не снижается, зато удается значительно повысить жизнеспособность клеток при осуществлении пассажа.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Хориальную строму отделяют от плаценты с помощью маленьких ножниц. Образец ткани массой 5 г промывают трижды PBS (Gibco) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, содержащим однократный раствор антибиотиков (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 50 ед/мл, стрептомицина 50 мкг/мл. Ткань измельчают ножницами в чашках Петри диаметром 10 см, затем добавляют среду DMEM (Gibco) объемом 25 мл, содержащую антибиотики, суспендируют и переносят в пробирку на 50 мл (Costar). В полученную суспензию для ферментативной обработки вводят 1 мл 2% раствора коллагеназы типа IV (Gibco) до конечной концентрации 0.075%, инкубируют 30 минут при 37°С на шейкере при медленном покачивании. Полученную смесь тщательно перемешивают до получения однородной суспензии, затем для нейтрализации коллагеназы добавляют 25 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS (HyClone, PerBio). Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют. Для лизирования эритроцитов осадок ресуспендируют в 20 мл холодного буфера, содержащего 155 мМ NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃, 0.1 мМ Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре. Суспензию разбавляют средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик (Gibco), объемом 25 мл, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют, клеточный осадок суспендируют в среде DMEM для промывки. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Полученный клеточный осадок суспендируют в 25 мл среды DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 мг/мл (Gibco), дополненной 20% FBS (HyClone, PerBio), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco) и однократным раствором антибиотиков (50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, Gibco).

Суспензию клеток пропускают последовательно через фильтры с размером пор 100 мкм и 10 мкм (Millipore) для удаления клеточных остатков и дебриса. Количество очищенных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева. Суммарный выход клеток составляет 10⁹/1 г ткани.

Клетки высевают в чашки Петри площадью 25 см² из расчета 1 млн/1 см². Через 24 часа клеткам меняют среду на свежую. По достижении монослоя клетки субкультивируют, оценивают визуально по морфологии с помощью фазово-контрастного микроскопа, подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации. По результатам морфологического анализа выявлено две основных популяции клеток по фенотипу. Первый тип клеток представлен веретеновидными клетками диаметром 20-40 мкм с гомогенной цитоплазмой, низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 4-7 ядрышек. Второй тип включает крупные фибробластоподобные распластанные клетки диаметром 100 мкм с цитоплазмой различной гомогенности, более низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 2-4 ядрышка. Таким образом, исследуемые клетки имеют морфологию, характерную для ММСК человека. Иммунофенотипирование полученных клеток осуществлялось с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit Rat) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated). Экспрессия маркеров соответствует иммунофенотипу МСК: клетки положительны по интегрину β1, CD54, коллагену I типа, фибронектину и отрицательны по CD14, CD45. Культура клеток способна к дифференцировке в адипоцитарном и остеогенном направлении. При осуществлении первого пассажа через 3 недель культивирования по достижении 80% монослоя в соответствии с заявляемым способом снято 720 тыс. клеток, из них количество жизнеспособных составила 97%.

Методика проведения пассажа

Снятие клеток с культивируемой поверхности при проведении пассажа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток заключается в том, что снятие клеток осуществляют в парах фермента аккутазы. Для этого после удаления питательной среды в культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток добавляется первая порция 0,075% раствора аккутазы (5 мл на 25 см² подложки). Добавление этой порции необходимо для инактивации оставшейся в культуре сыворотки. Через пару секунд необходимо аспирировать фермент. Добавление второй порции 0,075% (5 мл на 25 см² подложки) раствора аккутазы производится сразу после удаления первой порции ферментов. Инкубирование осуществляется в течение 2-3 секунд, после чего 0,075% раствор аккутазы вновь аспирируется. Последующее инкубирование производится уже в парах аккутазы в течение 2 минут при 37°С.

Пример 2. Хориальную строму отделяют от плаценты с помощью маленьких ножниц. Образец ткани массой 5 г промывают трижды PBS (Gibco) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, содержащим однократный раствор антибиотиков (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 50 ед/мл, стрептомицина 50 мкг/мл. Ткань измельчают ножницами в чашках Петри диаметром 10 см, затем добавляют среду DMEM (Gibco) объемом 25 мл, содержащую антибиотики, суспендируют и переносят в пробирку на 50 мл (Costar). В полученную суспензию для ферментативной обработки вводят 1 мл 2% раствора коллагеназы типа IV (Gibco) до конечной концентрации 0.075%, инкубируют 30 минут при 37°С на шейкере при медленном покачивании. Полученную смесь тщательно перемешивают до получения однородной суспензии, затем для нейтрализации коллагеназы добавляют 25 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS (HyClone, PerBio). Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют. Для лизирования эритроцитов осадок ресуспендируют в 20 мл холодного буфера, содержащего 155 мМ NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃, 0.1 мМ Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре. Суспензию разбавляют средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик (Gibco), объемом 25 мл, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют, клеточный осадок суспендируют в среде DMEM для промывки. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Полученный клеточный осадок суспендируют в 25 мл среды DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 мг/мл (Gibco), дополненной 20% FBS (HyClone, PerBio), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco) и однократным раствором антибиотиков (50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, Gibco). Суспензию клеток пропускают последовательно через фильтры с размером пор 100 мкм и 10 мкм (Millipore) для удаления клеточных остатков и дебриса. Количество очищенных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева. Суммарный выход клеток составляет 10⁹/1 г ткани. Клетки высевают в чашки Петри площадью 25 см² из расчета 1 млн/1 см². Через 24 часа клеткам меняют среду на свежую. По достижении монослоя клетки субкультивируют, оценивают визуально по морфологии с помощью фазово-контрастного микроскопа, подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации. По результатам морфологического анализа выявлено две основных популяции клеток по фенотипу. Первый тип клеток представлен веретеновидными клетками диаметром 20-40 мкм с гомогенной цитоплазмой, низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 4-7 ядрышек. Второй тип включает крупные фибробластоподобные распластанные клетки диаметром 100 мкм с цитоплазмой различной гомогенности, более низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 2-4 ядрышка. Таким образом, исследуемые клетки имеют морфологию, характерную для ММСК человека. Полученные клетки иммунофенотипируют окраской антителами к антигенам с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit Rat) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated). Экспрессия маркеров соответствует иммунофенотипу ММСК: клетки положительны по интегрину β1, CD54, коллагену I типа, фибронектину и отрицательны по CD14, CD45. Культура способна к дифференцировке в адипоцитарном и остеогенном направлении. При осуществлении второго пассажа через 6 недель культивирования по достижении 80% монослоя в соответствии с заявляемым способом снято 700 тыс. клеток, из них количество жизнеспособных составило 95%.

Методика проведения пассажа

Снятие клеток с культивируемой поверхности при проведении пассажа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток заключается в том, что снятие клеток осуществляют в парах фермента аккутазы. Для этого после удаления питательной среды в культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток добавляется первая порция 0,075% раствора аккутазы (5 мл на 25 см² подложки). Добавление этой порции необходимо для инактивации оставшейся в культуре сыворотки. Через пару секунд необходимо аспирировать фермент. Добавление второй порции 0,075% (5 мл на 25 см² подложки) раствора аккутазы производится сразу после удаления первой порции ферментов. Инкубирование осуществляется в течение 2-3 секунд, после чего 0,075 % раствор аккутазы вновь аспирируется. Последующее инкубирование производится уже в парах аккутазы в течение 2 минут при 37°С.

Пример 3. Хориальную строму отделяют от плаценты с помощью маленьких ножниц. Образец ткани массой 5 г промывают трижды PBS (Gibco) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, содержащим однократный раствор антибиотиков (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 50 ед/мл, стрептомицина 50 мкг/мл. Ткань измельчают ножницами в чашках Петри диаметром 10 см, затем добавляют среду DMEM (Gibco) объемом 25 мл, содержащую антибиотики, суспендируют и переносят в пробирку на 50 мл (Costar). В полученную суспензию для ферментативной обработки вводят 1 мл 2% раствора коллагеназы типа IV (Gibco) до конечной концентрации 0.075%, инкубируют 30 минут при 37°С на шейкере при медленном покачивании. Полученную смесь тщательно перемешивают до получения однородной суспензии, затем для нейтрализации коллагеназы добавляют 25 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS (HyClone, PerBio). Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют. Для лизирования эритроцитов осадок ресуспендируют в 20 мл холодного буфера, содержащего 155 мМ NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃, 0.1 мМ Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре. Суспензию разбавляют средой DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик (Gibco), объемом 25 мл, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют, клеточный осадок суспендируют в среде DMEM для промывки. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Полученный клеточный осадок суспендируют в 25 мл среды DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 мг/мл (Gibco), дополненной 20% FBS (HyClone, PerBio), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco) и однократным раствором антибиотиков (50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, Gibco). Суспензию клеток пропускают последовательно через фильтры с размером пор 100 мкм и 10 мкм (Millipore) для удаления клеточных остатков и дебриса. Количество очищенных клеток оценивают подсчетом в камере Горяева. Суммарный выход клеток составляет 10⁹/1 г ткани.

Клетки высевают в чашки Петри площадью 25 см² из расчета 1 млн/1 см². Через 24 часа клеткам меняют среду на свежую. По достижении монослоя клетки субкультивируют, оценивают визуально по морфологии с помощью фазово-контрастного микроскопа, подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации. По результатам морфологического анализа выявлено две основных популяции клеток по фенотипу. Первый тип клеток представлен веретеновидными клетками диаметром 20-40 мкм с гомогенной цитоплазмой, низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 4-7 ядрышек. Второй тип включает крупные фибробластоподобные распластанные клетки диаметром 100 мкм с цитоплазмой различной гомогенности, более низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, центрально расположенным ядром, содержащим 2-4 ядрышка. Таким образом, исследуемые клетки имеют морфологию, характерную для ММСК человека. Полученные клетки иммунофенотипируют окраской антителами к антигенам с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit Rat) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated). Экспрессия маркеров соответствует иммунофенотипу ММСК: клетки положительны по интегрину β1, CD54, коллагену I типа, фибронектину и отрицательны по CD14, CD45. Культура потентна в адипоцитарном и остеогенном направлении. При осуществлении третьего пассажа через 9 недель культивирования по достижении 80% монослоя в соответствии с заявляемым способом снято 700 тыс. клеток, из них количество жизнеспособных составило 98%.

Методика проведения пассажа.

Снятие клеток с культивируемой поверхности при проведении пассажа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток заключается в том, что снятие клеток осуществляют в парах фермента аккутазы. Для этого после удаления питательной среды в культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток добавляется первая порция 0,075% раствора аккутазы (5 мл на 25 см² подложки). Добавление этой порции необходимо для инактивации оставшейся в культуре сыворотки. Через пару секунд необходимо аспирировать фермент. Добавление второй порции 0,075% (5 мл на 25 см² подложки) раствора аккутазы производится сразу после удаления первой порции ферментов. Инкубирование осуществляется в течение 2-3 секунд, после чего 0,075% раствор аккутазы вновь аспирируется. Последующее инкубирование производится уже в парах аккутазы в течение 2 минут при 37°С.

Вывод: полученные данные свидетельствуют, что заявляемый способ позволяет получать более 95% жизнеспособных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при проведении пассажей.

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способу снятия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с культуральной поверхности при проведении пассажа, и может быть использовано при культивировании стволовых клеток с последующим их использованием в клеточной терапии. После удаления питательной среды в культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток добавляют первую порцию 0,075% раствора аккутазы 5 мл на 25 см² культуральной поверхности. Через пару секунд фермент аспирируют. Добавление второй порции 0,075% раствора аккутазы производят сразу после удаления первой порции ферментов. Инкубирование осуществляют в течение 2-3 секунд, после чего 0,075% раствор аккутазы вновь аспирируют. Последующее инкубирование производят в парах фермента аккутазы в течение 2 минут при 37°С. Изменения условий ферментативной обработки культуры клеток при проведении пассажа, заключающиеся в том, что снятие клеток осуществляют в парах фермента аккутазы, способствует повышению выхода жизнеспособных клеток.

Способ снятия клеток с культуральной поверхности при проведении пассажа мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с использованием фермента, отличающийся тем, что снятие клеток осуществляют в парах аккутазы, для чего после удаления питательной среды в культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток добавляют первую порцию 0,075% раствора аккутазы 5 мл на 25 см² культуральной поверхности, через 2-3 с фермент аспирируют, добавление второй порции 0,075% раствора аккутазы производят сразу после удаления первой порции ферментов, инкубирование осуществляют в течение 2-3 с, после чего 0,075% раствор аккутазы вновь аспирируют, последующее инкубирование производят в парах фермента аккутазы в течение 2 мин при 37°С.