Биоразлагаемый композиционный материал с антибактериальным эффектом Российский патент 2021 года по МПК A61K31/409 A61L27/40 A61P31/04 C07D487/22 C09B47/00 C08L67/04 C08K5/3415 

Изобретение относится к области полимерных материалов, конкретно к биоразлагаемым полимерным композиционным материалам с антибактериальными свойствами и может быть использовано для придания поверхностям бактерицидных свойств, для изготовления бактерицидных упаковочных материалов и предметов медицинского назначения с антибактериальными свойствами.

Несмотря на развитие медицины, патогенные микроорганизмы представляют собой угрозу для здоровья человека. Источником распространения инфекции могут стать поверхности, к которым прикасается большое количество людей - поручни в общественном транспорте, оборудование в торговых и медицинских учреждениях, внутренние поверхности в лифтах, платежные терминалы и т.д., а также упаковочные материалы и материалы, используемые для изготовления предметов медицинского назначения. По имеющимся оценкам, 65-80% всех инфекций связаны с биопленками [L. Hall-Stoodley, J.W. Costerton, P. Stoodley, Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases, Nat. Rev. Microbiol. 2 (2004), 95-108]. Поэтому в настоящее время актуальны исследования, связанные с разработкой и изготовлением антибактериальных материалов и поверхностей, а также с улучшением их характеристик для устранения или уменьшения адгезии к ним оппортунистических бактерий и бактериальных биопленок.

На рынке присутствуют антибактериальные пленки, выпускаемые французской компанией HEXIS, в частности, пленка, изготовленная из специальных медных сплавов, бактерицидные свойства которой основаны на известной антибактериальной активности меди [https://drcu.ru/?yclid=6689630798415694700#why]. Этой же компании принадлежит запатентованный способ антимикробной защиты различных объектов с помощью самоклеящейся пластиковой пленки на основе пластифицированного поливинилхлорида, покрытой полиэфирным или полиакриламидным лаком, содержащим в качестве бактерицидного агента триклозан, или соль серебра, или смесь пиритиона цинка и тербутрина [ЕР 2115085 В1, опубл. 04.06.2014]. Известно антибактериальное пленочное покрытие, представляющее собой пленку из тефлона, в которую в качестве антибактериальных агентов предложено включать фотоактивные кластерные комплексы вольфрама и молибдена, генерирующие под воздействием света синглетный кислород [www.sbras.info]. Учитывая широкий спектр возможных применений, к существенным недостаткам этих материалов следует отнести их неспособность к биоразложению в природных условиях.

В настоящее время активно разрабатываются биоразлагаемые полимерные материалы с антибактериальными свойствами, содержащие в составе полимерной матрицы, в частности, полилактид (ПЛА) и/или полигидроксибутират (ПГБ). Например, описана водонепроницаемая и антибактериальная упаковочная пленка, которая содержит полиэтилен низкой плотности, полимолочную кислоту, модифицированные бамбуковые волокна, олеиновую кислоту, альгинат и антибактериальный агент, включающий фосфат циркония, цеолит, оксид меди, оксид серебра, карбонат кальция, наноразмерный диоксид титана и другие компоненты [CN111138748 (А), опубл. 12.05.2020]. К недостаткам материала следует отнести сложный многокомпонентный состав, включающий в качестве полимерной основы, наряду с полилактидом, 100-110 весовых частей полиэтилена низкой плотности, на разрушение которого в природных условиях требуется не менее 80-100 лет. В заявке [CN111333888 (А), опубл. 26.06.2020] предложен материал, который в качестве антибактериального агента включает наноразмерный диоксид титана, а полимерная матрица состоит из полимолочной кислоты, или сополимера этилена и винилацетата, или содержит мастер-батч антиблокирующего агента и вспомогательные вещества.

Другой подход к созданию новых материалов с антибактериальными свойствами связан с применением в качестве антибактериальных агентов синтетических порфиринов и их производных, используемых в антибактериальной фотодинамической терапии. Эти соединения сочетают интенсивное поглощение в видимой и ближней ИК-области, флуоресцентные свойства, высокую химическую и термическую стабильность со способностью генерировать активные формы кислорода и свободные радикалы, вызывающие окислительные деструктивные реакции в клетках бактерий. Антибактериальные свойства производных порфиринов связаны с их воздействием на клеточные стенки микроорганизмов путем изменения их структурных свойств и нарушения гидрофильно-липофильного баланса клеточной стенки контактирующего с ними микроорганизма. В серии работ, посвященных структуре и свойствам биоразлагаемых полимеров, содержащих добавки комплексов тетрафенилпорфирина (ТФП) с солями переходных металлов, сообщается о бактерицидных свойствах этих материалов. В работе [Ольхов А.А. и др. «Ультратонкие волокна поли-3-гидроксибутирата, модифицированные комплексом железа(III) с тетрафенилпорфирином» Химические волокна. 2017. №3. С.84-89] исследованы характеристики проявляющего антибактериальный эффект нетканого волокнистого материала на основе ПГБ с добавкой комплекса железа(III) с тетрафенилпорфирином. В изобретении, защищенном патентом [RU 2681319 С1, опубл. 06.03.2019], предложен бактерицидный ультраволокнистый биополимерный нетканый материал на основе ПГБ, полилактида или их смеси с добавкой комплексов марганца(III) с тетрафенилпорфирином. В качестве прототипа нами взят биоразлагаемый пленочный материал из полилактида, содержащий в качестве антибактериальной добавки комплекс хлорида марганца(III) с тетрафенилпорфирином, описанный в работе [Ю.В. Тертышная, А.В. Лобанов, А.В. Хватов «Морфология и антибактериальные свойства композитов на основе полилактида и комплекса марганца(III) с тетрафенилпорфирином» Химическая физика, 2020, том 39, №11, с. 52-57]. Общим недостатком материалов, описанных в близких аналогах и прототипе, является относительно невысокая антибактериальная активность металлопорфириновых комплексов в структуре полимерной матрицы, вследствие чего для получения материала с выраженными бактерицидными свойствами требуется применять высокие (до 2-5 масс. %) концентрации металлопорфиринового комплекса. Можно полагать, что одной из причин этого является известная способность металлопорфириновых структур к формированию молекулярных ансамблей (самоассоциатов) в растворах [Beletskaya, V.S. Tyurin, A.Yu. Tsivadze, R. Guilard, C. Stern "Supramolecular Chemistry of Metalloporphyrins" // Chem. Rev. 2009, V. 109, p.1659-1713]. Например, в работе [K.A. Zhdanova, et al. "Synthesis and photodynamic antimicrobial activity of amphiphilic meso-arylporphyrins with pyridyl moieties" // Dyes and Pigments 181 (2020), doi.org/10.1016/j.dyepig.2020.108561] показано, что комплексы солей трехвалентных металлов Fe(III) и Mn(III) с производными ТФП, содержащими пиридиновые заместители, проявляют повышенную склонность к самоассоциации в различных средах, что снижает их фотодинамическую активность в условиях реальных биологических испытаний на культурах клеток микроорганизмов. Склонность к самоассоциации комплексов трехвалентного железа с ТФП в матрице из полигидроксибутирата отмечена в работе [Ольхов А.А. и др. «Ультратонкие волокна поли-3-гидроксибутирата, модифицированные комплексом железа(III) с тетрафенилпорфирином» // Химические волокна. 2017, №3. с. 84-89]. В работе [Ю.В. Тертышная, А.В. Лобанов, А.В. Хватов «Морфология и антибактериальные свойства композитов на основе полилактида и комплекса марганца(III) с тетрафенилпорфирином» Химическая физика, 2020, том 39, №11, с. 52-57] сообщается о наличии фазовых микровключений комплекса Mn(III)-ТФП, неравномерно распределенных в матрице полилактида.

Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в расширении спектра биоразлагаемых бактерицидных полимерных материалов путем создания композиционного материала на основе полилактида, включающего новый антибактериальный агент, обеспечивающий проявление выраженной антибактериальной активности материала при меньшем, чем в аналогах и прототипе, количественном содержании антибактериального агента.

Проблема решена бактерицидным полимерным композиционным материалом на основе полилактида, включающим в качестве антибактериального агента производное тетрафенилпорфирина, отличающимся тем, что производное тетрафенилпорфирина представляет собой 5,10,15,20-тетракис(4-н-гексилоксифенил)порфирин (далее по тексту сокращенно (С₆-O)₄-ТФП), структура которого показана ниже в сравнении со структурой металлопорфириновых комплексов, используемых в близких аналогах и прототипе.

Технический результат изобретения состоит в том, что получен новый бактерицидный полимерный биоразлагаемый композиционный материал, проявляющий близкую или более высокую в сравнении с аналогами и прототипом антибактериальную активность при меньшем количественном содержании антибактериального агента.

Краткое описание иллюстраций:

На Фиг. 1 показаны микрофотографии (масштаб 100 мкм) (Olympus СХ43 (Япония) образцов композиционных пленочных материалов из полилактида, содержащих различные концентрации добавки (С₆-O)₄-ТФП:

а. - 0,2 масс. %; б. - 0,3 масс. %; в. - 0,4 масс. %; г. - 0,5 масс. %.

На Фиг. 2 показаны ИК-спектры в режиме пропускания в диапазоне 1500-450 см^-1 (Perkin Elmer Spectrum 100 (США), 21±2°С) образцов пленочных материалов из полилактида, содержащих и не содержащих добавку (С₆-O)₄-ТФП:

а. - образец не содержит добавку, б. - образец содержит добавку (С₆-O)₄-ТФП в количестве 0.4 масс. %

На Фиг. 3 показаны электронные спектры (спектрофотометр DR/4000V (HACH-Lange, США) образцов композиционных пленочных материалов на основе полилактида, содержащих различные концентрации добавки (С₆-O)₄-ТФП.

1. - 0,2 масс. %; 2. - 0,3 масс. %; 3. - 0,4 масс. %; 4. - 0,5 масс. %.

При выборе нового антибактериального агента исходили из того, что введение в тетрапиррольный макроцикл длинноцепочечных алкильных заместителей должно способствовать повышению его растворимости в неполярных растворителях и, как следствие - снижению вероятности агрегирования и более равномерному распределению вещества в полимерной матрице. Действительно, расчетная величина коэффициента распределения logP в системе октанол-вода, используемая в качестве меры молекулярной гидрофобности молекул [https://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties], для металлокомплекса Mn(III)-ТФП составляет 9,59, тогда как для (С₆-O)₄-ТФП) - 10,72, что подтверждает более высокую липофильность последнего. Экспериментальное определение липофильности методом тонкослойной хроматографии (пластины ТСХ фирмы Merck) по величине относительного удерживания в системе хлороформ : гексан (4:1) также показало более высокую липофильность предлагаемого порфиринового производного в сравнении с металлопорфириновым комплексом: R_f для (С₆-O)₄-ТФП равен 0,67, а для Mn(III)-ТФП - 0,01.

5,10,15,20-Тетракис(4-н-гексилоксифенил)порфирин получают, как описано в работе [Братина Н.А., Мишкина К.А., Формировский К.А., Миронов А.Ф. «Синтез амфифильных мезо-арилзамещенных порфиринов в органической и водно-мицеллярной средах» Макрогетероциклы. 2011, 4(2), с. 116-121] конденсацией пиррола с пара-н-гексилоксибензальдегидом, взятых в стехиометрическом соотношении 1:1 в присутствии кислорода воздуха в смеси пропионовая кислота, уксусная кислота, нитробензол 2:1:1 (v/v) при кипячении:

Продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле G60 в системе дихлорметан : гексан (1:1, v/v). Исходный пара-н-гексилоксибензальдегид получают как описано ранее [I.N. Fedulova, N.A. Bragina, Ν.V. Novikov, О.A. Ugol'nikova, A.F. Mironov "Synthesis of lipophilic tetraphenylporphyrins to design lipid-porphyrin ensembles" Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2007, V. 33, No. 6, pp.589-593]. Ниже приведены физико-химические и спектральные характеристики полученного продукта:

Rf 0.5 (CH₂Cl₂:hexane=1:1). UV-Vis (CH₂Cl₂) λmax, nm (lgε): 422 (5.49), 518 (4.02), 556 (3.90), 595 (3.55), 651 (3.66). ¹Н-ЯМР (CDCl₃), (δ, м.д.): 8.89 (с, 8Н, β-pyrrole), 8.13 (д, 8Н, α-Ph), 7.29 (д, 8Н, β-Ph), 4.26 (т, 8Н, ОСН₂), 2.00 (м, 8Н, ОСН₂СН₂), 1.66 (м, 8Н, O(СН₂)₂СН₂), 1.49 (м, 8Н, O(СН₂)₃СН₂СН₂СН₃), 1.01 (т, 12Н, O(СН₂)₅СН₃), -2.72 (уш с, 1,5Н, NH-pyrrole). MS (MALDI-TOF): m/z 1015.504 (вычислено [Μ+Η]⁺ 1015.602).

Предлагаемый бактерицидный полимерный композиционный материал может быть выполнен в форме пленки для изготовления бактерицидных покрытий и упаковки или в форме нетканого волокнистого материала для изготовления медицинской одежды, индивидуальных сред защиты, бактерицидных повязок, предметов ухода за больными и других изделий медицинского назначения.

Приготовление образцов композиционных пленочных материалов.

Для приготовления образцов композиционных пленочных материалов по изобретению взят полилактид 4032D (Nature Works, USA) M_w=1,7×10⁵ г/моль, плотность ρ=1,24 г/см³, температура плавления 155170°С. Исходный раствор полилактида для получения образцов пленочных материалов готовят растворением 4 г ПЛА в 80 г хлороформа при нагревании до 60°С. Для проведения испытаний готовят образцы пленок из полилактида, содержащие 0,2-0,5 масс. % (С₆-O)₄-ТФП. Для этого к исходному раствору при перемешивании прибавляют 20 г раствора необходимого количества (С₆-O)₄-ТФП в хлороформе. Полученные вязкие прозрачные растворы, не содержащие осадка или нерастворенных конгломератов, поливают в чашки Петри и оставляют при температуре 22±2°С на 48 часов, затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 35±2°С в течение 3 часов. Получают образцы в виде прозрачных полимерных пленок толщиной 90-100 мкм:

образец 0 (контроль) не содержит (С₆-O)₄-ТФП

образец 1 (0,2 масс. %) содержит 0,0081 г (С₆-O)₄-ТФП

образец 2 (0,3 масс. %) содержит 0,0122 г (С₆-O)₄-ТФП

образец 3 (0,4 масс. %) содержит 0,0161 г (С₆-O)₄-ТФП

образец 4 (0,5 масс. %) содержит 0,0201 г (С₆-O)₄-ТФП.

Микрофотографии полученных образцов 1-4, показанные на Фиг. 1 (а-г), демонстрируют отсутствие в пленке локальных агломератов и равномерное распределение добавки (С₆-O)₄-ТФП в полимерной матрице.

Методом ИК-спектроскопии (см. Фиг. 2) показано, что добавка (С₆-O)₄-ТФП иммобилизована в матрице полилактида. Об этом свидетельствует увеличение интенсивности полосы 1310 см^-1, относящейся к колебаниям -C=C-N= связи пиррольного фрагмента, и полос в диапазоне 910-850 см^-1, принадлежащих колебаниям -С-Н связей пиррольных колец и -С-С- связей аморфной фазы полилактида.

Пленки, содержащие добавку (С₆-O)₄-ТФП, проявляют фотоактивность - при воздействии лазерного излучения наблюдается равномерное свечение полученных образцов.

Приготовленные, как описано выше, растворы смеси ПЛА с (С₆-O)₄-ТФП в хлороформе могут быть использованы для получения методом электроформования антибактериальных волокнистых материалов, имеющих широкий спектр медицинских применений.

В Таблице 1 представлены теплофизические и физико-механические характеристики образцов полилактидных пленочных материалов, содержащих и не содержащих добавку (С₆-O)₄-ТФП. Теплофизические характеристики определяют методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) на приборе DSC 204 F1 Netzsch (Германия). Скорость сканирования 10 град/мин, навеска 5-6 мг, калибровка по индию с температурой плавления 156,6°С.Точность измерения 0,1°С. Величину степени кристалличности α_кр рассчитывают по формуле:

α_кр(%)=100×ΔH_пл/ΔH_пл^*,

где ΔH_пл - экспериментальная теплота плавления, ΔН_пл^* - теплота плавления идеального кристалла ПЛА, равная 93,1 Дж/г [Lim L-T., Auras R., Rubino Μ. "Processing technologies for poly (lactic acid)" Progress Poly. Sci. 2008, V. 33, p.820]. Физико-механические характеристики образцов определяют согласно ГОСТ 11262-80 «Пластмассы. Метод испытания на растяжение».

Как видно из Таблицы 1, введение в матрицу ПЛА добавки (С₆-O)₄-ТФП снижает температуру плавления композитной пленки на 2-3°С, при этом температура стеклования четко не фиксируется, видимо, вследствие аморфизации полилактида под влиянием добавки. В отличие от пленок по прототипу, для которых показано увеличение степени кристалличности с увеличением концентрации добавки металлокомплекса, степень кристалличности предлагаемых пленок с увеличением содержания добавки (С₆-O)₄-ТФП снижается на 4-6% по сравнению с чистым полилактидом. Этот факт может иметь важное практическое значение, поскольку снижение степени кристалличности и увеличение доли аморфной фазы в сравнении с чистым полилактидом способствует увеличению скорости биодеструкции предлагаемого композиционного материала.

Изменение теплофизических характеристик отражается на физико-механических показателях пленок: с ростом содержания добавки относительное удлинение, характеризующее эластичность материала, повышается. Сравнительные измерения, проведенные с пленками по изобретению и по прототипу, показывают, что при одинаковом количественном содержании добавки 0,5 масс. % величина относительного удлинения для пленок, содержащих (С₆-O)₄-ТФП, почти вдвое превышает этот показатель для пленок, включающих порфириновый металлокомплекс. Таким образом, замена комплекса Mn(III)-ТФП на (С₆-O)₄-ТФП позволяет получить пленочный материал, характеризующийся более высокой эластичностью, что облегчает его практическое применение. С ростом содержания (С₆-O)₄-ТФП величина прочности при растяжении пленки несколько снижается, однако такое снижение нельзя считать значительным.

На Фиг. 3 показаны электронные спектры пленок из полилактида, содержащих добавку (С₆-O)₄-ТФП в концентрации 0,2-0,5 масс. %. Образец пленочного композитного материала размером 1×2 см закрепляют в кюветном отделении спектрофотометра в плоскости, перпендикулярной направлению светового потока. В отличие от спектров незамещенных тетрафенилпорфиринов, характеризующихся сильной полосой при 420 нм и слабыми полосами в области 515-650 нм, особенностью спектров образцов композиционного пленочного материала на основе ПЛА, содержащих предлагаемую добавку, является группа пиков в области 400-440 нм. Известно, что для иммобилизованных соединений характерно батохромное смещение основного максимума поглощения (полоса Соре) на 20 нм, связанное с изменением локальной полярности среды вокруг макроцикла после удаления растворителя. Для всех полученных пленочных образцов, наряду с полосой 420 нм, наблюдается полоса 440 нм.

Испытания образцов на антибактериальную активность проведены на клеточном материале тест-культур S. aureus p 209 (золотистый стафилококк), S. typhimurium (сальмонелла), Е. coli 1257 (кишечная палочка). Тест-культуры пересевают на мясо-пептонный агар и инкубируют в течение 23 ч при 37°С. Готовят суспензию каждого микроорганизма в физиологическом растворе и устанавливают концентрацию микробных клеток по стандарту мутности 10⁴ м.к./мл. В стерильные чашки Петри помещают пленочные образцы размером 1×1 см, добавляют по 1 мл суспензии тест-культуры, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 мин, после чего добавляют 10 мл стерильного физиологического раствора и выдерживают в течение 15 мин. Затем 100 мкл материала из чашек высевают на поверхность мясо-пептидного агара. Полученные посевы инкубируют в течение 48 ч при температуре 37°С. Для контроля концентрации жизнеспособных микроорганизмов осуществляют высев суспензий тест-культур, используемых в эксперименте. Количество выросших на поверхности агара колоний жизнеспособных микроорганизмов оценивают с помощью оптического микроскопа Olympus CX43 (Япония). Антибактериальную эффективность образцов определяют как процентное соотношение количества клеток, погибших после экспозиции с образцом клеток, к количеству жизнеспособных клеток в контроле.

В Таблице 2 сопоставлены результаты испытаний на антибактериальную активность образцов предлагаемых композиционных пленочных материалов с аналогичными данными для пленок по прототипу.

Данные Табл. 2 показывают, что в сравнении с неактивным образцом пленки из чистого полилактида, все образцы, содержащие добавки (С₆-O)₄-ТФП, проявляют антибактериальную активность по отношению к взятым тест-культурам. Наиболее эффективно - до 100% подавляются бактерии кишечной палочки Е. coli 1257. В отношении золотистого стафилококка материалы по изобретению и по прототипу проявляют близкую антибактериальную активность: эффективность подавления бактерий S. aureus p 209 пленками из полилактида, содержащими добавку (С₆-O)₄-ТФП в количестве 0,4-0,5 масс. %, и добавку Mn(III)-ТФП в количестве 0,5 масс. %, составляет около 76%. В отношении S. Typhimurium антбактериальная активность пленок по изобретению выше, чем пленок по прототипу: присутствие в материале добавки (С₆-O)₄-ТФП в количестве 0,3-0,4 масс. % обеспечивает эффективность подавления бактерий сальмонеллы на 84%, в то время, как пленки с добавками комплекса Mn(III)-ТФП проявляют аналогичный уровень антибактериальной эффективности при содержании добавки в полимерной матрице в концентрации 1,5-2,0 масс. %. При одинаковом содержании добавки в 0,5 масс. % антибактериальная активность заявляемого композиционного пленочного материала в отношении S. Typhimurium на 10% выше, чем материала по прототипу.

Очевидно, что аналогичными антибактериальными свойствами обладают и нетканые материалы, полученные из растворов полилактида, содержащих добавки (С₆-O)₄-ТФП.

Таким образом, предложены новые композиционные материалы, содержащие в качестве антибактериального агента добавку 5,10,15,20-тетракис(4-н-гексилоксифенил)порфирина, и расширяющие спектр биоразлагаемых бактерицидных полимерных материалов на основе полилактида. Предложенные материалы проявляют близкий или более высокий в сравнении с ранее известными материалами уровень антибактериальной эффективности при меньшем количественном содержании антибактериального агента, а также характеризуются более высокой эластичностью и меньшей степенью кристалличности в сравнении с материалами, содержащими добавки металлопорфириновых комплексов.

Изобретение относится к области полимерных материалов, конкретно к биоразлагаемым полимерным композиционным материалам с антибактериальными свойствами и может быть использовано для придания поверхностям бактерицидных свойств, для изготовления бактерицидных упаковочных материалов и предметов медицинского назначения с антибактериальными свойствами. Предложен бактерицидный полимерный композиционный материал на основе полилактида, включающий в качестве антибактериального агента производное тетрафенилпорфирина, которое представляет собой 5,10,15,20-тетракис(4-н-гексилоксифенил)порфирин. Материал может быть выполнен в форме бактерицидной пленки или в форме бактерицидного нетканого волокнистого материала. Технический результат - близкая или более высокая антибактериальная активность при меньшем количественном содержании антибактериального агента, высокая эластичность и меньшая степень кристалличности. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Бактерицидный полимерный композиционный материал на основе полилактида, включающий в качестве антибактериального агента производное тетрафенилпорфирина, отличающийся тем, что производное тетрафенилпорфирина представляет собой 5,10,15,20-тетракис(4-н-гексилоксифенил)порфирин.

2. Бактерицидный полимерный композиционный материал по п. 1, отличающийся тем, что он выполнен в форме пленки.

3. Бактерицидный полимерный композиционный материал по п. 1, отличающийся тем, что он выполнен в форме нетканого волокнистого материала.