Группа изобретений, связанных единым изобретательским замыслом, относится к биотехнологии, пищевой промышленности, фармакологии, косметологии и может быть использована для получения бифидосодержащих продуктов.
Бифидобактерии являются важнейшими симбионтами желудочно-кишечного тракта человека. У детей к 3-месячному возрасту их доля в микробиоме составляет более 90%, что свидетельствует о ведущей роли этой группы бактерий в становлении и развитии систем гомеостаза человека с раннего возраста. Они обладают морфокинетическим действием, образуют ферменты, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, продуцируют биологически активные соединения, в частности витамины РР, В1, В6, В9, В12. Бифидобактерии выполняют иммуногенную и антимутагенную функции, а также участвуют в детоксикации экзо- и эндогенных токсических агентов, что становится особенно актуальным в современных условиях массированного антропогенного воздействия на биосферу, при котором страдает не только природа, но и сам человек.
Многоплановое позитивное воздействие на организм человека позволяет рассматривать бифидобактерии как эффективную основу для конструирования бифидосодержащей продукции различного назначения на основе перспективных штаммов бифидобактерий.
Кроме того, представителям рода Bifidobacterium присвоен статус безопасности GRAS (generally recognized as safe), что подтверждает возможность применения штаммов и метаболитов (продуцентов) штаммов бифидобактерий в производстве безопасных продуктов питания, медицинских препаратов, БАД, косметических и гигиенических средств.
В кишечнике человека в биоценозе преобладают виды Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantis (Bifidobacterium longum spp.infantis) и Bifidobacterium breve. Именно эти пять видов бифидобактерий являются доминантными и в различных сочетаниях создают условия формирования состава и нормального состояния микробиоты здорового человека. (Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериоза кишечника. Сборник трудов. Минздрав РСФСР - М.: 1986 г. стр. 67.)
Известны консорциумы пробиотических штаммов различных комбинаций, используемые для приготовления пробиотиков, продуктов лечебного питания, кисломолочных продуктов, биологически активных добавок и бифидосодержащих пищевых продуктов зарубежных и отечественных фирм-разработчиков (RU 2109054 C1, RU 2196173 C1, RU 2196174 C1, RU 2264452 C1, RU 2264450 C1, RU 2261909 C1, RU 2491334 С1, RU 2491333 C1, RU 2491332 C1, WO 2014021733, US 7807440 В2, ЕА 017595 В1).
В настоящее время в лекарственных препаратах, БАД и пробиотических продуктах, выпускаемых в России и за рубежом, используют ограниченный перечень штаммов бифидобактерий.
Было выявлено, что бифидофлора обладает определенной структурой, в соответствии с которой только консорциум бифидобактерий оказывает доминантное влияние на формирование микробиоты, характерной для здорового кишечника (доказано в 88% исследованных случаев), в то время как наличие одного или двух штаммов всегда приводит к дисбиозу (доказано в 42% случаев дисбиоза 1-2 типа и в 86% дисбиоза 3 типа). (Иванова Е.В. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной микробиоты человека. Автореферат дис. …докт.мед. наук. Челябинск 2009, стр 13)
Из них наиболее широко используемыми являются: Bifidobacterium longum spp.longum штаммы АТСС 15707, RO23, ВВ536 (Morinaga Milk Industry), SBT-2928, Я-3, B379M, ДВА-13; Bifidobacterium longum spp. infantis штамм R03, 35624 (Procter&Gamble); Bifidobacterium longum spp.infantis штаммы 73-15 и 79-43; Bifidobacterium bifidum штаммы 1 и 791, 791 БАГ, ЛВА-3, RO71, 8-3; Bifidobacterium breve штамм 79-88, 79-119, RO70; Bifidobacterium animalis spp.animalis штамм DN-173010 (Danone/Dannon); Bifidobacterium animalis spp.lactis Bbl2 (Chr.Hansen), HN019 (DR10) (Danisco); Bifidobacterium adolescentis штамм Г7513, ГО-13, MC-42.
Bifidobacterium animalis подвид lactis, в различных вариациях названия, выделенный из рубца животного, имеет наименьший размер генома. Это связано с тем, что он обитает в среде с постоянным и простым составом питательного субстрата, в условиях, не требующих постоянной адаптации микробной клетки. Подтверждением этого является наличие только двух полных копий рРНК оперонов, тогда как иные виды имеют до четырех-пяти рРНК оперонов. Пониженные адаптационные свойства штаммов В. animalis подвид lactis не приводят к формированию устойчивого эубиоза.(Бухарин О.В., Перумова Н.Б., Иванова Е.В. Биофлора при ассоциативном симбиозе человека. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - стр. 11)
Традиционно в нашей стране при создании пробиотиков для человека используются штаммы, выделенные от здоровых доноров.
Известные полиштаммовые препараты зачастую представляют собой механический набор пробиотических культур без учета их симбиотичности, способности штаммов, вводимых в состав препаратов, развиваться совместно, не подавляя друг друга. Поэтому производители вынуждены культивировать их раздельно и смешивают их непосредственно перед лиофилизацией. Это приводит к недостаточной колонизирующей активности и жизнеспособности пробиотических штаммов и слабой устойчивости к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта.
Наиболее близким аналогом (прототипом) заявленного консорциума по видовому составу является консорциум пяти видов селекционных штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ, используемый для приготовления кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств (RU 2261909 С1). Штаммы, входящие в состав консорциума, имеют близкие культуральные и биологические свойства, при совместном культивировании консорциум активно размножается на питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования, обладает специфической активностью. Готовый продукт содержит в 1 мл 109 живых клеток бифидобактерий.
Отдельные штаммы консорциума, входящие в его состав, получены из аналогичных коллекционных штаммов путем последовательных 50 циклов лиофилизированной сушки и восстановления.
Недостатком данного консорциума является сложность получения селекционных штаммов, предполагающего проведение 50 циклов последовательной лиофилизированной сушки и восстановления на тиогликолевой среде и обезжиренном молоке, при этом максимальный титр бифидобактерий составляет только 109 живых клеток бактерий в 1 мл готового продукта.
Технической проблемой, решаемой в результате создания настоящего изобретения, является разработка консорциума, включающего селекционные штаммы, подобранные по составу не только с учетом биосовместимости, но и придающие консорциуму устойчивость к широкому спектру антибиотиков, повреждающим факторам, обеспечивающим процесс пищеварения в желудочно-кишечном тракте, выраженную антагонистическую активность с наличием высокого титра бифидобактерий 1011 КОЕ в 1 г сухой биомассы и получение на его основе бифидосодержащих продуктов с высокими лечебно-профилактическими свойствами, а также упрощение получения консорциума.
Технический результат заключается в том, что предлагаемый консорциум бифидобактерий, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, и штаммы, входящие в его состав, способны активно накапливать микробную биомассу на различных питательных средах до высокой концентрации, обладают высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, являющимся причиной пищевых отравлений, а, кроме того, обладают высокой супероксиддисмутазной активностью с выраженной антиоксидантной активностью, при этом супероксиддисмутазная активность составляет не ниже 37 ед/мг белка микробной массы.
Входящие в состав консорциума штаммы могут быть легко идентифицированы с учетом предлагаемых нуклеотидных последовательностей фрагментов их ДНК.
Сущность предлагаемого технического решения заключается в следующем.
Предложен консорциум бифидобактерий, содержащий штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Федерального
Государственного Унитарного Предприятия ГосНИИгенетика Минобрнауки (ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика») под регистрационным №Ас-2035, штамм Bifidobacterium longum В379М-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2037, штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2038, штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2039, штамм Bifidobacterium breve 79-119-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным № Ас-2036, используемый для приготовления ферментированных, неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, медицинских препаратов.
Предложены следующие оригинальные пробиотические штаммы бифидобактерий, используемые для получения указанного консорциума.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2035, и нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ SEQ ID NO: 1.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum В379М-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2037, и нуклеотидная последовательность фрагмента генома этого штамма SEQ ID NO: 2.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2038 и нуклеотидная последовательность фрагмента генома этого штамма SEQ ID NO: 3.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2039 и нуклеотидная последовательность фрагмента генома этого штамма SEQ ID NO: 4.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-119-БЛ, используемый для получения консорциума депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2036, и нуклеотидная последовательность фрагмента генома данного штамма SEQ ID NO: 5.
Для получения предлагаемого консорциума первоначально осуществляют селекцию известных производственных штаммов пяти видов бифидобактерий без использования методов генетической модификации в результате 30 циклов последовательной лиофилизированной сушки и восстановления на среде «Бифилайф М», а затем посредством совместного культивирования штаммов получают консорциум.
Использованная методика отбора селекционных штаммов учитывала изучение их антибиотикорезистентности, культуральных, антагонистических, морфологических, физиолого-биохимических свойств, молекулярно-генетической идентификации и биосовместимости при совместном культивировании штаммов с учетом кинетики роста каждого из них. Это позволило создать консорциум, способный осуществлять коррекцию микроэкологических нарушений более эффективно и безопасно.
Селекция штаммов и их характеристики
1. Для получения штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium bifidum 791-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-1688. Организация, осуществившая депонирование, находится по адресу: 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1. Исходный штамм Bifidobacterium bifidum 791-МБ защищен патентом РФ №2261908. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на питательной среде «Бифилайф М» следующего состава в г/л:
Гидролизат казеина неглубокой
степени расщепления, ферментативный - 15,0 г
Дрожжевой экстракт - 5,0 г
Глюкоза - 5,0 г
Натрий хлорид - 2,5 г
Цистеин гидрохлорид - 0,75 г
Натрий углекислый - 0,8 г
Агар микробиологический - 0,075 г
MgSO4 - 0,011 г
K2НРO4 - 0,0001 г
FeSO4 Н2O - 0,00009 г
MnSO4 H2O - 0,0001 г
B1 (тиамина гидрохлорид) - 0,0002 г
В6 (пиридоксина гидрохлорид) - 0,0002 г
В3 (кальция пантотенат) - 0,001 г
Вс (фолиевая кислота) - 0,00004 г
РР (никотинамид) - 0,002 г
B2 (рибофлавин) - 0,0002 г
Глицин - 0,0056 г
Глутаминовая кислота - 0,0024 г
Аспарагиновая кислота - 0,0003 г
ПАБК-0,1 г
Лимонная кислота - 0,0001 г
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium bifidum 791-МБ в объеме 5% от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38°С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М».
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным №Ас- 2035.
Культурально-морфологические и биологические признаки штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ - палочковидные вариабельные клетки с V-образными раздвоениями на одном или двух концах, неподвижные, в мазке образуют скопления, иногда цепочки, грамположительные. Факультативный анаэроб, оптимальная температура культивирования составляет 37-38°С, рН 7,0±0,2.
Сквашивает молоко с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют.
Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70° Т, к 72 ч - 90-100° Т (на печеночной среде Блаурокка), на гидролизатно-молочной среде - до 100° Т и 180° Т, соответственно.
Максимальный титр бифидобактерий в гидролизатно-молочной среде через 24 ч культивирования составляет 1×1010 КОЕ/мл; максимальный титр бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования составляет 1-3×1010 КОЕ/мл.
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 9,8-10,2 микробного числа за 16-18 ч культивирования.
У заявляемого штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 1 представлена антагонистическая активность штамма к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов.
Анализ данных таблицы 1 показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, являющимся причиной пищевых отравлений.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5% от объема среды. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. bifidum 791-БЛ, отличающим его от штамма В. bifidum 791-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает повышенной супероксиддисмутазной активностью. СОД-активность штамма В. bifidum 791-БЛ составляет 27,7 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе.
Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии.
Условия хранения заявляемого штамма.
Свежеприготовленный штамм В. bifidum 791-БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8°С без потери активности в течение года.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа 16S рРНК.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК:
8f - aga gtt tga tec tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Исследуемый штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, причем гомология с видом Bifidobacterium bifidum составляет 97%. Анализ по RDP II 16S рРНК базе данных показал гомологию с тем же видом бактерий Bifidobacterium bifidum.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг. 1).
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium bifidum (97%).
Выделение ДНК для ПЦР
PCR Protocols. A Guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР
Каталог MBI Fermentas 1998/1999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap\jackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 1999 45(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium bifidum 791-БЛ SEQ ID NO: 1, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным.
2. Для получения штамма Bifidobacterium longum В 379М-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium longum В 379М-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под №Ас-1689. Исходный штамм защищен патентом РФ №2261907. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М».
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium longum В 379М-МБ в объеме 5% от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38°С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М».
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным №Ас- 2037.
Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2 концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет.
Факультативный анаэроб, оптимальная температура 37-38°С, рН 7,0±0,2.
Сквашивает молоко с образованием к 16-20 ч стабильного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 18 ч - 100° Т, к 20 ч - 120° Т, к 24 ч - 145° Т.
Максимальный титр бифидобактерий в молочном сгустке достигает к 18 ч культивирования и составляет 109 КОЕ/мл.
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 9-10 микробного числа за 16-18 ч культивирования.
У штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Candida albicans, Proteus vulgaris., Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 4 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов.
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, являющимися причиной пищевых отравлений.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. longum В379М-БЛ, отличающим его от штамма В. longum В379М-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД - активность штамма В. longum В379М-БЛ составляет 32,0 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии.
Условия хранения заявляемого штамма.
Свежеприготовленный штамм В. longum В379М-БЛ на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8°С без потери активности в течение года.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа 16S рРНК.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК:
8f - aga gtt tga tec tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Исследуемый штамм Bifidobacterium longum В379М-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Анализ no RDP II 16S рРНК базе данных показал наилучшую гомологию с видами бактерий Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium pullorum. По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг.2).
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК штамм Bifidobacterium longum В379М-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium longum (99%).
Выделение ДНК для ПЦР
PCR Protocols. A Guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР
Каталог MBI Fermentas 1998\1999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap\jackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol» (Praha) 1999 45(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium longum В 379М-БЛ SEQ ID NO: 2, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным.
3. Для получения штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под №Ас-1690. Исходный штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ защищен патентом РФ №2261904. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М».
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ в объеме 5% от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38°С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М».
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513 - БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным №Ас- 2038.
Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка и кукурузно-лактозной среде образует колонии в виде гвоздиков. Факультативный анаэроб, оптимальная температура 37-38°С, рН 7,0±0,2.
Сквашивает стерильное молоко с образованием к 22-24 ч стабильного плотного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 24 ч - 70° Т, и накапливает микробную массу бифидобактерий в 1 мл lg 9,0-9,4 микробных клеток.
Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70° Т, к 72 ч - 90-100° Т (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 100° Т и 180° Т, соответственно. Максимальный титр бифидобактерий в гидролизатно-молочной среде через 24 ч культивирования составляет 1×1010 КОЕ/мл.
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 9,8-10,0 микробного числа за 18-20 ч культивирования.
У штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 7 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов.
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, вызывающим пищевые отравления.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. adolescentis Г 7513 - БЛ, отличающим его от штамма В. adolescentis Г 7513-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД - активность штамма В. adolescentis Г 7513-БЛ составляет 25,0 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии.
Условия хранения заявляемого штамма.
Свежеприготовленный штамм В. adolescentis Г 7513 - БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8°С без потери активности в течение года.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа168 рРНК.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК
8f - aga gtt tga tec tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Исследуемый штамм Bifidobacterium adolescentis Г7513-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium, причем гомология с видом Bifidobacterium adolescentis составляет 97%.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг. 3).
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium adolescentis Г7513-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium adolescentis (97%).
Выделение ДНК для ПЦР
PCR Protocols. A Guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР
Каталог MBI Fermentas 1998\1999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap\jackknife analysis of tree robustness.)) Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 1999 45(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ SEQ ID NO: 3, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным.
4. Для получения штамма Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под №Ас-1692. Исходный штамм Bifidobacterium infantis 73-15-МБ защищен патентом РФ №2261906. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М)).
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium infantis 73-15-МБ в объеме 5% от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при температуре 37-38°С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М».
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным №Ас- 2039.
Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2 концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка штамм образует колонии в виде комет. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Факультативный анаэроб, оптимальная температура выращивания 37-38°С, рН питательных сред 7,0±0,2.
Сквашивает стерильное молоко к 24-28 ч с образованием плотного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 24 ч - 80° Т и штамм накапливает микробную массу бифидобактерий в 1 мл lg 10,2-10,6 микробных клеток. Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 9-10 микробного числа за 18-22 ч культивирования.
Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 10 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов.
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, вызывающим пищевые отравления.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. infantis 73-15-БЛ, отличающим его от штамма В. infantis 73-15-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД - активность штамма В. infantis 73-15-БЛ составляет 29 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии.
Условия хранения заявляемого штамма.
Свежеприготовленный штамм В. infantis 73-15-БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8°С без потери активности в течение года.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа168 рРНК.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК:
8f - aga gtt tga tec tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Исследуемый штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Анализ no RDP II 16S рРНК базе данных показал наилучшую гомологию с видами бактерий Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium pseudolongum.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг. 4).
Исследуемый штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ относится к виду Bifidobacterium infantis. Вид Bifidobacterium infantis в настоящее время относят к виду Bifidobacterium longum subsp.infantis. По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium longum subsp.infantis (97%).
Выделение ДНК для ПЦР
PCR Protocols. A Guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР
Каталог MBI Fermentas 1998\1999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap\jackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 1999 45(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium infantis 73-15 - БЛ SEQ ID NO: 4, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным.
5. Для получения штамма Bifidobacterium breve 79-119 - БЛ проводилась селекция штамма Bifidobacterium breve 79-119-МБ, который депонирован 15.07.04 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным №Ас-1691. Исходный штамм Bifidobacterium breve 79-119-МБ защищен патентом РФ №2261905. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных циклов лиофилизированной сушки и восстановления на указанной ранее питательной среде «Бифилайф М».
Первичный посевной материал производственного штамма Bifidobacterium breve 79-119-МБ в объеме 5% от объема среды культивирования вносили в вышеуказанную среду и культивировали при 37-38°С 24 часа. Далее было проведено 30 циклов сушка-восстановление на питательной среде «Бифилайф М».
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium breve 79-119-БЛ, который депонирован 16.11.2016 в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика Минобрнауки под регистрационным №Ас- 2036.
Культурально-морфологические и биологические признаки - клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с У-образными раздвоениями на одном или двух концах; неподвижные, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Факультативный анаэроб, оптимальная температура выращивания 37-38°С, рН 7,0±0,2.
Сквашивает молоко с образованием плотного сгустка к 16-18 часам. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 18 ч - 120° Т, к 24 ч- 140° Т. Штамм максимально накапливает микробную массу бифидобактерий к 18±2 ч культивирования, достигая в 1 мл 109 КОЕ/мл.
Штамм растет на используемых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 10,2 микробного числа за 16-18 ч культивирования.
Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 13 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов.
Антагонистическую активность моноштамма бифидобактерий определяли по зоне задержки роста тест-культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов.
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, вызывающим пищевые отравления.
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С.
Кроме того, производственно-полезным признаком штамма В. breve 79-119-БЛ, отличающим его от штамма В. breve 79-119-МБ, является то, что выращенная в стационарных условиях на питательной среде «Бифилайф М» в объеме 300 см3 культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. Выявленная СОД-активность штамма В. breve 79-119-БЛ свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника на фоне антибиотикотерапии. У заявляемого штамма обнаружена выраженная антиоксидантная активность: супероксиддисмутазная активность штамма - 27,0 ед/мг белка микробной массы.
Условия хранения заявляемого штамма.
Свежеприготовленный штамм В. breve 79-119-БЛ хранят на питательной среде с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатин, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при температуре 6-8°С без потери активности в течение года.
Генетическую идентификацию штамма осуществляли с помощью анализа 16S рРНК.
Консервативные праймеры для наработки 16S рДНК:
8f - aga gtt tga tec tgg etc ag
926r - ccg tea att cct ttr agt tt
1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt
Таблица 14
Гомология секвенированного фрагмента ДНК депонируемого штамма с предполагаемым видом и наиболее близкими видами:
Distance Matrix
Исследуемый штамм Bifidobacterium breve 79-119-БЛ принадлежит к следующей систематической группе: Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. Анализ no RDP II 16S рРНК базе данных показал гомологию с тем же видом бактерий Bifidobacterium breve.
По данным анализа было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами (фиг.5)
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК тестируемый штамм Bifidobacterium breve 79-119-БЛ можно отнести к виду Bifidobacterium breve (97%).
Выделение ДНК для ПЦР
PCR Protocols. A Guide to methods and applications.
Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Условия ПЦР
Каталог MBI Fermentas 1998\1999, 146-157.
Pavlicek A et al «Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap\jackknife analysis of tree robustness.» Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha) 1999 45(3) 97-9.
В результате получена нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма Bifidobacterium breve 79-119 - БЛ SEQ ID NO: 5, идентичная таковой, представленной на машиночитаемом носителе.
Сведения о безопасности использования штамма: штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием геннотехнических методик; штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным.
Получение консорциума и его характеристики
1-й пассаж - Каждый штамм лиофилизированных монокультур Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, Bifidobacterium breve 79-119-БЛ ресуспендируют на питательной среде «Бифилайф М» до восьмой пробирки с последующим инкубированием при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж - Полученные культуры каждого штамма из пробирок 10-7 и 10-8 (в посевной дозе 5% от объема питательной среды «Бифилайф М») инокулируют в отдельные емкости. Время культивирования определяется в соответствии с длительностью экспоненциальной фазы роста каждого из них.
3-й пассаж - Засев инокулятов монокультур в ферментер производится поэтапно в количестве 3-5% каждого штамма от объема питательной среды. Процесс совместного культивирования длится 10-12 часов, рН готовой биомассы составляет 4,6-5,2. К полученной биомассе добавляют защитные среды (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не выше минус 45°С, лиофилизируют, получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г.Консорциум хорошо хранится при температуре 6-8°С без потери активности в течение одного года.
Созданный консорциум бифидобактерий показал высокую сочетаемость пяти штаммов бифидобактерий между собой. Совместное культивирование смешанной популяции всех пяти штаммов протекает существенно быстрее по сравнению с раздельным культивированием штаммов.
Культурально-морфологические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум - клетки штаммов микроорганизмов консорциума представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. Спор не образуют. Морфология колоний неоднородна и зависит от входящих в консорциум штаммов, сохраняя признаки каждого из них в совокупной культуре. В жидких и полужидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза.
Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум.
Факультативные анаэробы. Оптимальная температура выращивания 37-38°С, рН питательных сред - 7,0±0,2. Каталазу не образуют, разжижение желатины отсутствует. Ферментативная активность отдельных штаммов и консорциума по данным ANAEROtest-23 представлена в таблице 16. В качестве иллюстрации в таблице представлено, как расширяется спектр ферментативной активности штаммов при совместном культивировании: увеличивается число усвоенных субстратов.
Примечание: (+) -ферментирует; (-) - не ферментирует; (±) - вариабельно; 0 - нет данных.
Кислотообразующая активность: к 24 ч - 150° Т, к 72 ч - 180° Т (на питательной среде «Бифилайф М»), на гидролизатно-молочной среде - до 140-160° Т и 170-190° Т, соответственно.
Консорциум активно размножается на средах разного состава. In vitro на стандартных питательных средах, при температуре Т 37°С консорциум накапливает биомассу до высокой концентрации пробиотических микроорганизмов - 1011 КОЕ в 1 г биомассы за счет отсутствия взаимного ингибирования отдельных штаммов. (Фиг 6)
Максимальный титр бифидобактерий консорциума в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов к 22 ч составляет 2×1010 КОЕ/мл, на кукурузно-лактозной среде к 20 ч составляет 2×1010 КОЕ/мл, на питательной среде «Бифилайф М» после лиофилизации получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г.
Бифидобактерии консорциума способны утилизировать свободные аминокислоты в стерильном обезжиренном молоке, такие как: валин, метионин, аланин, аргинин, изолейцин, глицин.
Консорциум проявляет антагонистическую активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Escherichia coli, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Shigella fexneri, Candida albicans, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis. В таблице 17 представлена антагонистическая активность к некоторым из вышеупомянутых микроорганизмов.
Антагонистическую активность консорциума штаммов бифидобактерий определяли методом развивающихся смешанных популяций при совместном выращивании с патогенными микроорганизмами по зоне задержки роста тест-культур методом перпендикулярных штрихов.
Синергидный эффект консорциума проявляется также в большей антагонистической активности консорциума по сравнению с прототипом.
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый консорциум оказывает наибольшее антагонистическое действие на основные тест-культуры, вызывающие пищевые отравления.
Определение уровней устойчивости штаммов бифидобактерий к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде для каждого штамма в отдельности. В качестве питательной среды использовали стерильное обезжиренное молоко.
В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовые культуры бифидобактерий в количестве 5% от питательной среды. В контрольный образец вносили только биомассу изучаемого штамма бифидобактерий. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С. Штамм устойчив к антибиотикам, когда разница между титруемой кислотностью в контрольном и опытном образцах составляет не более 30° Т.
В таблице 18 представлена устойчивость к антибиотикам отдельных штаммов заявляемого консорциума.
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что штаммы бифидобактерий устойчивы к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков:
В. bifidum 791-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, линкомицину, тетрациклину, сульфадимидину, стрептомицину;
В. longum В379М-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, линкомицину, олеандомицину, офлаксацину, стрептомицину, тетрациклину, сульфадимидину, бензатина бензилпенициллину.
В. adolescentis Г7513-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, гентамицину, линкомицину, олеандомицину, тетрациклину, офлаксацину, сульфадимидину, стрептомицину, бензатина бензилпенициллину.
В. infantis 73-15-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, тетрациклину, линкомицину, сульфадимидину, стрептомицину.
В. breve 79-119-БЛ - к амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, линкомицину, тетрациклину, сульфадимидину, стрептомицину.
Аналогичное исследование в отношении заявленного консорциума бифидобактерий показало, что он обладает устойчивостью, по крайней мере, к 12-ти антибиотикам: амикацину, тетрациклину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, офлаксацину, сульфадимидину, стрептомицину, ампициллину, линкомицину, олеандомицину и бензатина бензилпенициллину.
Способность консорциума пяти штаммов бифидобактерий Bifidobacteruim bifidum 791-БЛ, Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, Bifidobacterim breve 79-119-БЛ активно накапливать микробную биомассу на различных питательных средах за 20-22 ч выращивания, высокая антибиотическая и супероксиддисмутазная активность с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность консорциума не ниже 37 ед/мг белка микробной массы, проявляемая специфическая активность позволили использовать консорциум в приготовлении ферментированных, неферментированных пищевых продуктов, БАД, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.
Проведенные исследования показали, что при совместном культивировании консорциума бифидобактерий на питательной среде «Бифилайф М» отмечается более активное развитие биомассы бифидобактерий в консорциуме по сравнению с раздельным культивированием и не происходит взаимного ингибирования культур (таблица 19).
Консорциум можно культивировать на различных питательных средах со стабильно высокими показателями КОЕ/мл пробиотических микроорганизмов и продуцируемых органических кислот. Результаты культивирования представлены в таблице 20.
Полученный консорциум и штаммы, входящие в состав консорциума могут быть использованы в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве пищевых продуктов, продуктов функционального питания, продуктов диетического (лечебного и профилактического) питания, биологически активных добавок (БАД), косметических, гигиенических средств, медицинских и ветеринарных препаратов.
При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, изготовленных на его основе. Употребление в пищу продуктов, изготовленных с применением заявленного консорциума, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно-патогенной микрофлоры, нормализации кислотности, коррекции кишечного дисбиоза, и восстановлению нормальной микрофлоры.
Использование заявленного консорциума и штаммов, входящих в состав консорциума в производстве ферментированных, неферментированных пищевых продуктов, БАД, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств - кремов, салфеток, лосьонов тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молочка обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.
Реализация назначения заявляемого консорциума бифидобактерий представлена на следующих примерах.
Пример 1. Использование предлагаемого консорциума штаммов бифидобактерий в составе закваски для приготовления кисломолочных продуктов.
Получают консорциум следующим образом.
1-ый пассаж - Каждый штамм лиофилизированных монокультур Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, Bifidobacterium longum В 379М-БЛ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, Bifidobacterium breve 79-119-БЛ ресуспендируют до восьмой пробирки на питательной среде «Бифилайф М» с последующим инкубированием при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-ой пассаж- Полученные культуры каждого штамма из пробирок разведения 10-7 и 10-8 (в посевной дозе 5% от объема питательной среды «Бифилайф М») инокулируют в отдельные емкости. Время культивирования определяется в соответствии с длительностью экспоненциальной фазы роста каждого из них.
3-ий пассаж - засев инокулятов монокультур в ферментер производится поэтапно в количестве 3-5% каждого штамма от объема питательной среды. Процесс совместного культивирования длится 10-12 часов. рН готовой биомассы составляет 4,6-5,2.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную как показано выше, в объеме не более 5% (от объема молока) вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают.
Пример 2. Использование консорциума штаммов бифидобактерий в составе БАД.
В биомассу консорциума бифидобактерий, полученную как показано в примере 1, вносят различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживаемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве БАД лечебно-профилактического действия.
Можно получить сухую биологически активную добавку, для этого к биомассе, полученной по Примеру 1 добавляют защитные среды (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не выше минус 45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г, который можно использовать в качестве биологически активной добавки, внося ее в пищевое сырье непосредственно перед употреблением.
Пример 3. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения бифидосодержащего медицинского препарата.
В биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким титром бифидобактерий, добавляют защитные среды (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко). Полученную суспензию замораживают при температуре не выше минус 45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г, который можно использовать в качестве бифидосодержащего медицинского препарата.
Пример 4. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения кваса или сока.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, в объеме не более 5% от объема нормализованной смеси (квас или сок) вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 107 КОЕ/мл. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.
Пример 5. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения косметического средства.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, разрушают нагреванием в автоклаве или осуществляют мембранную фильтрацию. Полученные биологически активные компоненты охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.
Пример 6. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства варено-копченых колбас.
Биомассу консорциума бифидобактерий, полученную согласно Примеру 1, в объеме не более 5% от объема фарша вносят в приготовленный колбасный фарш после добавления соли, пряностей и раствора нитрита натрия. После формования колбасные батоны направляют на осадку, которая осуществляется на рамах при температуре 22°С, влажности 90%. Продолжительность осадки 6 часов. Варка и копчение осуществляются по стандартной технологии.
Пример 7. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства сырокопченых колбас.
Консорциум бифидобактерий в сухом виде, полученный по Примеру 2, предварительно восстанавливают в кипяченой охлажденной воде при температуре 37°С, либо активизируют на стерильном коровьем обезжиренном молоке при температуре 37°С в течение 8-10 часов до кислотности 60-65° Т. Полученную биомассу консорциума бифидобактерий вносят в приготовленный колбасный фарш, при этом дозировка вносимого восстановленного консорциума составляет 0,1-0,2% от массы фарша, а дозировка активизированного консорциума составляет 2-5% от массы фарша. Затем обогащенное колбасное сырье обрабатывается по традиционной схеме согласно технологии получения сырокопченых колбас.
Пример 8. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства обогащенной сухой детской молочной смеси.
Небольшое количество сухой молочной смеси тщательно перемешивают с сухим концентратом консорциума бифидобактерий, полученным согласно Примеру 2 с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г из расчета не менее 100 г концентрата на 1 т сухой молочной смеси. Затем всю оставшуюся партию молочной смеси тщательно перемешивают с обогащенной сухой молочной смесью для достижения содержания бифидобактерий не менее 107 КОЕ/г.
Пример 9. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства обогащенного пива.
К 1 тонне слабоалкогольного пива добавляют 100 г биомассы консорциума, полученного по Примеру 2 и тщательно перемешивают. Титр бифидобактерий в готовом пиве составляет не менее 107 КОЕ/мл. Вкус, цвет, пенообразование и другие характеристики пива не изменяются.
Пример 10. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства мороженого.
Для получения мороженого в молоко вносят сливки, полученную смесь нагревают до температуры 35°С, вносят сухие ингредиенты: сахар-песок, стабилизатор, нагревают до температуры 85°С, гомогенизируют, охлаждают до температуры 6°С, вносят сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно Примеру 2 с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г в количестве 1-5% к массе смеси.
Пример 11. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства кормовой добавки в животноводстве и птицеводстве.
Для приготовления 100 кг биологически активной кормовой добавки сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно Примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г добавляют в количестве 0,01% - 1% к массе основного корма и тщательно перемешивают.
Пример 12. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства зубной пасты.
Сухой бактериальный концентрат консорциума бифидобактерий, полученный согласно Примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г, вводят в состав зубной пасты из расчета 0,01 г бактериального концентрата на 100 г пасты.
Пример 13. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства мягкого сычужного сыра.
Нормализованное молоко, подвергают тепловой обработке при температуре 74-76°С в течение 1-5 мин и охлаждают до температуры заквашивания 37-38°С, вносят 40%-ный водный раствор хлористого кальция из расчета 50 мл на 100 кг молока, 1% сухого бактериального концентрата консорциума бифидобактерий, полученного согласно Примеру 2, с содержанием бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/г. Смесь перемешивают и вносят раствор молокосвертывающего фермента из расчета 1,0-1,2 г на 100 кг молока, затем осуществляют свертывание. Последующее получение мягкого сыра осуществляют по стандартной технологии.
Пример 14. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для производства рассольного зрелого сыра.
Свертывание молока проводят при температуре 32-34°С в течение 30-45 мин, вносят комбинированную закваску в количестве 1,0-2,0%, состоящую из солеустойчивых чистых культур мезофильных молочнокислых стрептококков; консорциума бифидобактерий, полученного по Примеру 1; мезофильных молочнокислых палочек. Закваски бифидобактерий, стрептококков и мезофильных молочнокислых палочек готовят отдельно. Стрептококки, бифидобактерии и мезофильные молочнокислые палочки вносят в производственную закваску. Затем к полученной смеси добавляют хлористый кальций и сычужный фермент для получения сгустка. Последующее получение рассольного зрелого сыра осуществляют по стандартной технологии.
В результате заявленного изобретения получен консорциум на основе пяти селекционных штаммов бифидобактерий, более устойчивый к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта при прохождении бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте, что выражается в повышенной колонизирующей активности. Консорциум обладает выраженной антиоксидантной активностью и пробиотическим действием при отсутствии взаимного ингибирования отдельных штаммов. Заявляемый консорциум является высокотехнологичным, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки культивирования с высокой концентрацией пробиотических микроорганизмов - 1011 КОЕ/г.
Используемая методика отбора селекционных штаммов, предполагающая изучение их антибиотикорезистентности, культуральных, антагонистических, морфологических, физиолого-биохимических свойств и молекулярно-генетической идентификации, позволила создать консорциум, способный осуществлять коррекцию микроэкологических нарушений более эффективно и безопасно и расширить арсенал пробиотических средств.
Перечень нуклеотидных последовательностей фрагментов генома штаммов, входящих в консорциум, представлен в соответствии со Стандартом ВОИС ST 25. Справки о депонировании штаммов и перечень нуклеотидных последовательностей на машиночитаемом носителе прилагаются.
--->
Перечень последовательностей
<110> Общество с ограниченной ответственностью «Научно-производственное
объединение Бифилайф» (ООО «НПО Бифилайф»)
Obschestvo s ogranichennoj otvetstvennost'ju «Nauchno-proizvodstvennoe
ob'jedinenie Bifilajf » (OOO «NPO Bifilajf »)
<120>Консорциум бифидобактерий, используемый для приготовления
бифидосодержащих продуктов,и штаммы, входящие в состав консорциума.
<160> 5
<210> 1
<211> 470
<212> ДНК
<213> Штамм Bifidobacterium bifidum 791-БЛ
<400> 1
aacgtggtgc agctaatagc gtgaccgacc tgccccatgc tccggaatag ctcctcggaa 60
acgggtggta atgccggatg tcccacatga tcgcatataa ttgtgggaaa gattctatcg 120
gcatgggatg gggtcgcgtc ctatcagctt gttggtgagg taacggctca ccaaggcttc 180
gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacattggg actgagatac ggcccagact 240
cctacgggag gcagcagtgg gagaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg 300
ccgcgtgagg gatggaggcc ttcgggttgt aaacctcttt tgtttgggag caagccttcg 360
ggtgagtgta cctttcgaat aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 420
tagggcgcaa gcgttatccg gatttattgg gcgtaaaggg ctcgtagggc 470
<210> 2
<211> 418
<212> ДНК
<213> Штамм Bifidobacterium longum В 379М-БЛ
<400> 2
tttatcgggg agcaagcgag agtgagttta cccgttgaat aagcaccggc taacttacgt 60
gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagg 120
tgtctcgtag gcggttcgtc gcgtccggtg tgaaagtcca tcgcttaacg gtggatccgc 180
gccgggtacg ggcgggcttg agtgcggtag gggagactgg aattcccggt gtaacgtgtg 240
tgaatgtgta gatatcggga agaacaccaa tggcgaaggc aggtctctgg gccgttactg 300
acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 360
taaacggtgg atgctggatg tggggcccgt tccacgggtt ccgtgtcgga gctaacgc 418
<210> 3
<211> 719
<212> ДНК
<213> Штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513 - БЛ
<400> 3
ggaaacgggt gttaatgcgg gatgttccag ttgaccgcat gttcttctgg gaaagctttt 60
tgcggtatgg gatggggtcg cgtcttatca gcttgatggc gggttaacgg cccaccatgg 120
cttcgacggg agcgggcctg agagggcgac cggccacatt gggactgaga tacggcccag 180
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga 240
cgccgcgtgc gggatgacgg ccttcgggtt gtaaaccgct tttgactggg agcaagccct 300
tcggggtgag tgtacctttc gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 360
tacgtagggt gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgta ggcggttcgt 420
cgcgtccggt gtgaaagtcc atcgcttaac ggtggatccg cgccgggtac gggcgggctt 480
gagtgcggta ggggagactg gaattcccgg tgtaacggtg gaatgtgtag atatcgggaa 540
gaacaccaat ggcgaaggca ggtctctggg ccgtcactga cgctgaggag cgaaagcgtg 600
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtgga tgctggatgt 660
ggggaccatt ccacggtctc cgtgtcggag ccaacgcgtt aagcatcccg cctggggag 719
<210> 4
<211> 838
<212> ДНК
<213> Штамм Bifidobacterium infantis 73-15 – БЛ
<400> 4
gacgtcgtta acacagtgca agctctgaac gggatccatc gaagcattgc ttggtggtga 60
gagtggcgaa cgggtgagta ctgcgtgacc gacctgcccc atagcaccgg aatagctcct 120
ggaaacgggt ggtaatgccg gatgctccag ttgatcgcat ggtcttctgg gaaagcaaac 180
gcggtatggg atggggtcgc gtcctatcaa cattgacggc ggggtaacgg cccaccgtgg 240
cttcgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacat tgggactgag atacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcg 360
acgccgcgtg agggatggag gccttcgggt tgtaaacctc ttttatcggg gagcaagcga 420
gagtgagttt acccgttgaa taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480
gtagggtgca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgtaggc ggttcgtcgc 540
gtccggtgtg aaagtccatc gcttaacggt ggatccgcgc cgggtacggg cgggcttgag 600
tgcggtaggg gagactggaa ttcccggtgt aacgtgtgtg aatgtgtaga tatcgggaag 660
aacaccaatg tgcgaaggca ggtctctggg ccgttactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtgga tgctggatgt 780
ggggcccgtt ccacgggttc cgtgtcggag ctaacgcgtt agcatccctg ccttggga 838
<210> 5
<211> 721
<212> ДНК
<213> Штамм Bifidobacterium breve 79-119 - БЛ
<400>5
aaacgtggtg gtaattgcct gatgctccat cacaccgcat ggtgtgttgg gaaagccttt 60
gcggcatggg atggggtccc gtcctatcag cttgatggcg gggtaactgc ccaccatggc 120
ttcgacaggt agccggcctg agacggcgac cggccacatt gggactgaga tacggcccag 180
actcctacag gaggcagcag tggagaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga 240
cgccgcgtga gggatggagg ccttcgggtt gtaaacctct tttgttaggg agcaaggcac 300
tttgtgttga gtgtaccttt cgaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 360
tacgtagggt gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgta ggcggttcgt 420
cgcgtccggt gtgaaagtcc atcgcttaac ggtggatccg cgccgggtac gggcgggctt 480
gagtgcggta ggggagactg gaattcccgg tgtaacggtg gaatgtgtag atatcgggaa 540
gaacaccaat ggcgaaggca ggtctctggg ccgttactga cgctgaggag cgaaagcgtg 600
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtgga tgctggatgt 660
ggggcccgtt ccacgggttc cgtgtcggag ctaacgcgtt tagtcatccc tgctttggga 720
g 721
<---
Группа изобретений относится к консорциуму бифидобактерий, используемому для приготовления бифидосодержащих продуктов, и штаммам, входящим в состав консорциума. Предложены штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-203, штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum В379М-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2037, штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2038, штамм бифидобактерий Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2039, а также штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-119-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2036. Предложен также консорциум, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов и содержащий указанные штаммы. Указанные штаммы способны активно накапливать микробную биомассу на различных питательных средах до высокой концентрации, обладают высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам, являющимся причиной пищевых отравлений, а также обладают высокой супероксиддисмутазной активностью с выраженной антиоксидантной активностью. Супероксиддисмутазная активность штаммов составляет не ниже 37 ед./мг белка микробной массы. Группа изобретений может быть использована для приготовления бифидосодержащих продуктов. 6 н.п. ф-лы, 6 ил., 20 табл., 14 пр.
1. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2035 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
2. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum В379М-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2037 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.
3. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis Г 7513-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2038 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
4. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium infantis 73-15-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2039 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.
5. Штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-119-БЛ, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, депонированный в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» под регистрационным №Ас-2036 и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5.
6. Консорциум бифидобактерий, содержащий штаммы по пп. 1-5 и используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов.
