КОНСОРЦИУМ БИФИДОБАКТЕРИЙ Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г-7513- МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛО-МОЛОЧНЫХ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, БИФИДОСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ, КОСМЕТИЧЕСКИХ И ГИГИЕНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A61K7/00 A61K7/42 A23C9/12 A23L1/29 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано для получения консорциума бифидобактерий в производстве продуктов функционального питания и препаратов-пробиотиков, неферментированных продуктов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.

Препараты и бифидосодержащие продукты широко используют для лечения и профилактики дисбактериозов различной этиологии, нормализации работы желудочно-кишечного тракта человека и животных, стрессовых влияний, длительной антибиотико-химиотерапии.

Как известно, в кишечнике взрослого человека с наибольшей частотой в биоценозе преобладают виды Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, а виды Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium breve - преимущественно у детей грудного возраста.

Известны консорциумы штаммов бифидобактерий различных комбинаций, используемые для приготовления пробиотиков, продуктов лечебного питания, кисломолочных продуктов, биологически активных добавок и бифидосодержащих ферментированных и неферментированных продуктов зарубежных и отечественных фирм-разработчиков (патент США 6335040, 01.01.2002, заявка США 2002015990, 07.02.2002, RU 2109054 C1, 20.04.1998, WO 98/44090, 08.10.1998, RU 2196173 С1, 10.01.2003, RU 2196174 C1, 10.01.2003).

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является консорциум 5-ти штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B 379 M, Bifidobacterium infantis Г 73-15, Bifidobacterium breve 79-119-МБ, используемый для приготовления кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов, биологически активных пищевых добавок и бактерийных препаратов. Штаммы имеют близкие культуральные и физиолого-биохимические свойства, консорциум активно размножается в питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования, обладает специфической активностью. Готовый продукт содержит в 1 мл 10⁹ живых клеток бактерий. Содержание в 1 дозе препарата не менее 10⁷ живых клеток бифидобактерий (RU 2109054 С1, 20.04.1998).

Недостатком известных консорциумов можно считать их слабую устойчивость к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную колонизирующую активность и жизнеспособность при прохождении пищеварительного тракта.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание консорциума штаммов бифидобактерий, более устойчивого к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта при прохождении бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте и повышения таким образом его колонизирующей активности при прохождении пищеварительного тракта, выраженной антиоксидантной активностью и пробиотическим действием, проявляемым в условиях как in vivo, так и in vitro.

Консорциум получен также путем сочетания пяти штаммов бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-МБ, ВКПМ Ac-1688; Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, ВКПМ Ac-1689; Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, ВКПМ Ас-1690;, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, ВКПМ Ac-1692; Bifidobacterium breve 79-119-МБ, ВКПМ Ас-1691, характерной особенностью которых является высокая антибиотикоустойчивость с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность консорциума не ниже 24,9 ед/мг белка и пробиотическое действие культур, используемых в производстве. проявляется при потреблении пищевых продуктов и продуктов функционального питания.

Штамм Bifidobacterium bifidum 791-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacterium bifidum 791 путем последовательного перепассирования на тиогликолевой среде и обезжиренном молоке (50 пассажей) депонирован в ВКПМ ВНИИгенетика под номером. ВКПМ Ac-1688.

Штамм Bifidobacterium longum В 379 М-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacterium longum путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгенетика под номером ВКПМ Ас-1689.

Штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, получен из коллекционного штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восставновления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгенетика под номером ВКПМ Ас-1690.

Штамм Bifidobacterium infantis 73-15-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacterium infantis 73-15 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгенетика под номером ВКПМ Ас-1692.

Штамм Bifidobacterium breve 79-119-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacterium breve 79-119 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгенетика под номером ВКПМ Ас-1691.

Созданный консорциум бифидобактерий показал высокую сочетаемость пяти штаммов бифидобактерий между собой, совместное культивирование смешанной популяции всех 5-ти штаммов предположительно протекает аналогично раздельному культивированию штаммов. В среднем количество клеток по сравнению с исходным количеством увеличивалось в сотни раз за 14-16 ч культивирования при оптимальной температуре. Консорциум сохранил свои специфические свойства в течение 2-х лет.

Культурально-морфологические признаки консорциума

Клетки штаммов микроорганизмов представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. В жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Логарифмическая фаза заканчивается к 24 ч.

Физиолого-биохимические признаки консорциума

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37,5°С, рН питательных сред - 7,2-7,4. Каталазу не образует, разжижение желатины отсутствует. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и L+ молочной кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 3,9-41. Маннозу, целлобиозу, ксилозу, маннит, сорбит, салицин, инулин, арабинозу не ферментирует.

Кислотообразующая активность: к 24 ч - 105°Т, к 72 ч - 160-195°Т (на тиогликолевой среде), на гидролизатно-молочной среде - до 140-160°Т и 200-220°Т соответственно.

Консорциум активно размножается на средах разного состава. Максимальный титр бифидобактерий консорциума в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов к 20 ч составляет 2×10⁸ КОЕ/мл. Максимальный титр бифидобактерий на кукурузно-лактозной среде наблюдается к 16 ч и составляет 2×10⁹ КОЕ/мл, на тиогликолевой среде к 16 ч накапливается до 1-3×10⁹ КОЕ/мл.

Бифидобактерии консорциума способны утилизировать свободные аминокислоты в стерильном обезжиренном молоке, такие как: валин, метионин, аланин, аргинин, изолейцин, глицин.

ДНК относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,57, молярный процент содержания ГЦ в ДНК равен 61,3.

Консорциум проявляет антагонистическую активность по отношению к тест-культурам, полученным из ГИСК им Л.А.Тарасевича: Е.coli B-125, Staphilococcus aureus 209-Р, шигеллам Зонне, Флекснера (таблица 1).

Консорциум устойчив к амикоцину, бензилпенициллину, гентамицину, стрептомицу, канамицину, тетрациклину, офлоксалину (таблица 2).

Способность консорциума пяти штаммов бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активно накапливать микробную биомассу на различных питательных средах за 16-20 ч выращивания, высокая антибиотическая и супероксиддисмутазная активность с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность консорциума не ниже 24,9 ед/мг белка микробной массы, проявляемая специфическая активность позволили использовать его в приготовлении кисломолочных, неферментируемых продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.

Проведенные исследования показали, что при совместном культивировании на тиогликолевой среде при значении рН 7,0-7,3 и кукурузно-лактозной среде при значении рН 6,8-7,0 в стационарных условиях изучаемые штаммы бифидобактерий антагонизма по отношению друг к другу не проявляют. Отмечено, что при совместном развитии отмечается лучшее развитие штаммов В.adolescentis Г 5315-МБ, В.bifidum 791-МБ, В.longum В 379 М-МБ и наименьшее - В.infantis 73-15-МБ и В.breve 79-119-МБ.

Антагонистическую активность консорциума штаммов бифидобактерий определяли методом развивающихся смешанных популяций при совместном выращивании с патогенными тест-микроорганизмами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов.

Таблица 1КонсорциумЗона задержки роста тест-культур (мм) Е.coliSh.SonneS.aureusCandida albucansзаявляемый консорциум24-24,821,7-23,217,6-19,218,8-20,3аналог22,7-23,120,4-21,518,4-19,018,3-19,9

Наибольшее антагонистическое действие консорциум оказывает на Staphilococcus aureus и Shigella sonnei, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисломолочных продуктов.

Определение уровней устойчивости штаммов бифидобактерий к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде для каждого штамма в отдельности. Устойчивость определяли на стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовые культуры бифидобактерий в количестве 5%. В контрольный образец вносили только биомассу изучаемого штамма бифидобактерий. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре 37-38°С. Штамм устойчив к антибиотикам, когда разница между титруемой кислотностью в контрольном и опытном образцах составляет не более 30°Т.

Анализ полученных данных свидельствует о том, что штаммы бифидобактерий устойчивы к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков:

В.bifidum 791-МБ - к ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину;

B.longum В 379 М-МБ - к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, олеандомицину, офлаксацину, стрептомицину, экстенциллину.

B.adolescentis Г7513-МБ - к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, олеандомицину, офлаксацину, стрептомицину, экстенциллину.

B.infantis 73-15-МБ - к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину.

В.breve 79-119-МБ - к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину.

Аналогичное исследование в отношении заявленного консорциума бифидобактерий показал, что он обладает устойчивостью к, по крайней мере, 6-ти антибиотикам: амикоцину, тетрациклину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, офлаксацину, стрептомицину.

Условия хранения заявляемого консорциума.

Консорциум хранят на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Консорциум хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.

Основным производственно-полезным признаком заявляемого консорциума бифибобактерий, отличающим его от известных, следует считать выраженную супероксиддисмутазную активность, которая составляет 24,9 ед/мг белка, содержащегося в микробной массе.

Выявленная СОД-активность консорциума бифидобактерий свидельствует о его выраженном пробиотическом действии, которое может проявляться в условиях in vivo, так и как in vitro. Высокая активность кислотообразования, антибиотикоустойчивость к широкому спектру основных антибиотиков способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.

Полученный консорциум может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный консорциум, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза и восстановлению бифидофлоры.

Использование заявленного консорциума в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, например: кремов, салфеток, лосьонов, тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.

Пример 1. Использование консорциума штаммов бифидобактерий в составе закваски для приготовления кисломолочных продуктов.

1-ый пассаж - Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы вносят по отдельности в среду выращивания и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Выращивают до появления отдельных колоний в последнем разведении при 37,5-38°С или 1 дозу сухой биомассы каждого штамма вносят в две пробирки с 30 мл питательной среды в каждой. Выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру каждого из штаммов объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж (продукт) - Полученную биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 10 живых бифидобактерий.

Пример 2. Использование консорциума штаммов бифидобактерий в составе биологически активной добавки.

1-ый пассаж - Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15 МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

Получение биологически активной добавки - Полученную биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, вносят в питательную среду не более 5% и выращивают до получения биомассы с высоким, не менее 10⁸/мл, титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁷/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.

Пример 3. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения бифидосодержащего препарата.

1-ый пассаж - Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15 МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

Получение бифидосодержащего препарата - К выросшей биомассе консорциума, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, титром бифидобактерий, добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата. Согласно НТД на сухой бифидумбактерин (ФС-1.32 ВС 94) допускается содержание в 1 дозе препарата не менее 10⁷ живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения кваса или сока.

1-ый пассаж - Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15 МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж (получение продукта) - Выросшую биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 10⁸. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.

Пример 5. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения косметического средства.

1-ый пассаж - Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж (получение косметического средства) - Выросшую биомассу смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 10⁹ клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.

Изобретение относится к биотехнологии, касается консорциума штаммов бифидобактерий, который может быть использован для приготовления различных форм бактерийных препаратов, препаратов-пробиотиков на его основе, функциональных продуктов питания, биологически активных добавок, неферментированных продуктов, кисломолочных продуктов косметических и гигиенических средств. Для получения консорциума использованы следующие штаммы бифидобактерий, депонированные в ВКПМ ВНИИгенетика: Bifidobacterium bifidum 791-МБ ВКПМ Ac-1688, Bifidobacterium longum В 379М-МБ ВКПМ Ac-1689, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ ВКПМ Ac-1690, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ ВКПМ Ac-1692, Bifidobacterium breve 79-119-МБ ВКПМ Ac-1691, характерной особенностью которых является высокая антибиотическая и супероксиддисмутазная активность с выраженной антиоксидантной активностью. Супероксиддисмутазная активность консорциума не ниже 24,9 ед/мг белка микробной массы. Проявляемая специфическая активность, способность к утилизации широкого спектра аминокислот, высокая антибиотикоустойчивость позволили повысить устойчивость консорциума к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта при прохождении бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте и способствовали повышению таким образом его колонизирующей активности. 2 табл.

Консорциум бифидобактерий Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1688, Bifidobacterium longum ВКПМ Ac-1689, Bifidobacterium adolescentis ВКПМ Ac-1690, Bifidobacterium infantis ВКПМ Ac-1692, Bifidobacterium breve ВКПМ Ac-1691, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.