ТРЕХМЕРНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СЕТКИ С РАСПОЛОЖЕННЫМИ В НИХ КАНАЛАМИ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 B01J19/00 C12N11/08 G01N33/543 

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке в соответствии с 35 U.S.С. § 119(e) испрашивается приоритет по Европейской заявке №15201355, поданной 18 декабря 2015 г., и по заявке U.S. №15/008728, поданной 28 января 2016 г., содержания которых во всей их полноте включены в настоящее изобретение в качестве ссылки.

2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В публикации U.S. №2008/0293592 описан способ ковалентной иммобилизации биомолекул-зондов на органических поверхностях с помощью обладающих фотохимической реакционной способностью сшивающих реагентов. На практике показано, что способ является полезным, поскольку он позволяет провести иммобилизацию биомолекул-зондов на

нереакционноспособных поверхностях, таких как силанизированные стеклянные подложки и субстраты, изготовленные из стандартных промышленных пластмасс. Полимер используют в способе, описанном в US 2008/0293592, для получения типа трехмерной сетки, с которыми биомолекулы-зонды могут быть связаны на поверхности сетки или внутри сетки. По сравнению с органической поверхностью, на которой биомолекулы-зонды иммобилизуются только в двухмерной форме, трехмерная иммобилизация биомолекул в полимерных и/или сополимерных сетках обеспечивает более значительную плотность биомолекул-зондов на органической поверхности. Это увеличивает количество анализируемого вещества, которое может связаться с единицей площади органической поверхности. Таким образом, использование поверхности в качестве биологического сенсора обеспечивает более высокую точность измерения и высокую скорость измерения.

Однако недостатком способов и полимерных сеток, описанных в U.S. 2008/0293592, является то, что молекулы анализируемого вещества или компоненты анализируемого вещества, которые связываются с биомолекулами-зондами, находящимися на поверхности полимерной сетки или вблизи от нее, могут блокировать сетку. Последующие молекулы анализируемого вещества или компоненты анализируемого вещества, а также еще не связавшиеся биомолекулы-зонды, находящиеся на большем расстоянии от поверхности сетки в ее внутренней части, больше не могут участвовать в связывании.

Таким образом, необходимы улучшенные полимерные сетки.

3. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к трехмерным полимерным сеткам, включающим сшитый полимер и один или большее количество каналов, которые простираются от поверхности и/или от положения вблизи от поверхности сетки во внутреннюю часть сетки. Сетки предпочтительно ковалентно связаны с поверхностью. Один или большее количество зондов, таких как биомолекула, можно иммобилизовать на поверхности сетки и повсюду во внутренней части сетки и получить сенсор для обнаружения наличия и/или измерения количества анализируемого вещества в образце. Например, нуклеиновые кислоты-зонды можно использовать для обнаружения комплементарных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце, и антитела-зонды можно использовать для обнаружения антигенов, содержащихся в образце. Сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают более быструю гибридизацию данного количества анализируемого вещества, чем сетки, не содержащие каналов, поскольку каналы могут эффективно увеличивать площадь поверхности сетки, открывая большее количество зондов для образца в данный момент времени. Кроме того, сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут связать большее количество анализируемого вещества, чем такой же объем сетки, не содержащей каналы, поскольку каналы уменьшают или устраняют затруднение, вследствие которого анализируемое вещество или другие компоненты образца, связанные с зондами на поверхности сетки или вблизи от нее, блокируют доступ к зондам, находящимся во внутренней части сетки. Другим преимуществом сеток, предлагаемых в настоящем изобретении, является то, что большое количество анализируемого вещества, поступающее благодаря каналам, обеспечивает более высокую чувствительность при обнаружении анализируемого вещества, чем возможная при использовании сетки, не содержащей каналы, т.е. можно увеличить отношение сигнал/шум по сравнению с использованием сеток, не содержащих каналы, поскольку данное количество анализируемого вещества может сконцентрироваться в меньшем объеме сетки. Еще одним преимуществом сеток, предлагаемых в настоящем изобретении, является то, что большое количество анализируемого вещества, поступающее благодаря каналам, обеспечивает количественное определение в более широком диапазоне концентраций анализируемого вещества, чем при использовании сеток, не содержащих каналы.

Настоящее изобретение также относится к массивам, включающим множество трехмерных сеток, предлагаемых в настоящем изобретении, и субстрат. Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать для обнаружения и/или измерения содержания одного или большего количества анализируемых веществ одновременно в одном или большем количестве образцов. Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно промыть и повторно использовать, и обеспечить значительную экономию затрат по сравнению с однократным использованием массивов. Другим преимуществом массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, является то, что их можно получить простым образом, поскольку все компоненты, необходимые для получения отдельной сетки, можно нанести в виде единой смеси на поверхность субстрата во время процедуры получения.

Настоящее изобретение также относится к способам получения трехмерных сеток и массивов, предлагаемых в настоящем изобретении. Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получить путем сшивки полимера в присутствии кристаллов соли, предпочтительно игольчатых кристаллов соли, и путем последующего растворения кристаллов соли с образованием каналов в сшитой полимерной сетке.

Настоящее изобретение также относится к способам применения трехмерных сеток и массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, для обнаружения и/или измерения содержания анализируемого вещества в образце, предпочтительно в жидком образце.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведено схематичное представление смеси, которая включает биомолекулу-зонд (1) и полимер (3), включающий две обладающие фотохимической реакционной способностью группы (4) в одной молекуле, растворенной в водном растворе соли.

На фиг. 2 представлено сечение капли смеси (5), приведенной на фиг. 1, обладающей поверхностью (10), находящейся на пятне (7) органической поверхности (2), которая расположена на нагревающем держателе (6).

На фиг. 3 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 2, после нагревания смеси, где в растворе соли образовались игольчатые кристаллы соли (8), простирающиеся от зародышей кристаллизации (9).

На фиг. 4 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 3, после сушки и облучения смеси излучением в видимой области спектра (11) с образованием полимерной сетки (15), обладающей поверхностью (16).

На фиг. 5 приведено схематичное представление смеси, приведенной на фиг. 1, после облучения излучением в видимой области спектра.

На фиг. 6 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 4, после растворения кристаллов соли в растворителе (12) с образованием каналов (13).

На фиг. 7 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 2, после охлаждения смеси на охлаждающем держателе (14), где в растворе соли образовались игольчатые кристаллы соли.

На фиг. 8 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 7, после сушки и облучения смеси излучением в видимой области спектра.

На фиг. 9 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 8, после растворения кристаллов соли в растворителе.

На фиг. 10 представлен путь реакции образования сополимера (диметилакриламид - метакрилоилоксибензофенон - 4-винилбензолсульфонат натрия).

На фиг. 11 представлен вид в перспективе биочипа (17), обладающего органической поверхностью (2), на которой полимерные сетки (15) находятся в пятнах (7), расположенных в виде матрицы из строк и столбцов.

На фиг. 12 представлен вид сверху биочипа (17), приведенного на фиг. 11, в котором каждая полимерная сетка (15) обладает диаметром (D) и в котором строки и столбцы разделены расстоянием Y и расстоянием X соответственно, измеренным от центральных точек полимерных сеток (15).

На фиг. 13 представлен биосенсор (17'), включающий гибкую ленту субстрата (18), обладающего органической поверхностью (2), на которой полимерные сетки (15), обладающие диаметром (D), находятся в пятнах (7), разделенных расстоянием X, измеренным от центральных точек полимерных сеток.

На фиг. 14 приведена таблица, в которой представлены средние значения измеренных величин и стандартные погрешности средних значений для разных пятен примера 2.

На фиг. 15 приведено графическое представление средних значений измеренных величин, полученных с помощью массива раздела 7.2.1.

На фиг. 16 приведено графическое представление средних значений измеренных величин, полученных с помощью массива раздела 7.2.2.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

5.1. Трехмерные полимерные сетки

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, включают сшитый полимер, например, полимер, соответствующий публикациям Rendl et al, 2011, Langmuir 27:6116-6123 или US 2008/0293592, содержания которых во всей их полноте включены в настоящее изобретение в качестве ссылки. Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, дополнительно включают один или большее количество каналов и необязательно могут дополнительно включать один или большее количество зондов, иммобилизованных на сетке.

Полимеры, которые можно использовать для получения сеток, описаны в разделе 5.1.1. Сшивающие реагенты, которые можно использовать для получения сеток, описаны в разделе 5.1.2. Характеристики одного или большего количества каналов описаны в разделе 5.1.3. Зонды, которые можно иммобилизовать на сетках, описаны в разделе 5.1.4.

5.1.1. Полимеры

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать сшитый гомополимер, сополимер, смеси гомополимеров, смеси сополимеров или смеси одного или большего количества гомополимеров и одного или большего количества сополимеров. Термин "полимер" при использовании в настоящем изобретении включает гомополимеры и/или сополимеры. Термин "сополимер" при использовании в настоящем изобретении включает полимеры, полимеризованные из двух или большего количества типов мономеров (например, биополимеры, тройные сополимеры, четверные сополимеры и т.п.). Сополимеры включают чередующиеся сополимеры, периодические сополимеры, статистические сополимеры, случайные сополимеры, блок-сополимеры, линейные сополимеры и разветвленные сополимеры. Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать любую комбинацию указанных выше типов полимеров. Реагенты и методики получения таких полимеров известны в данной области техники (см., например, Ravve, A., Principles of Polymer Chemistry, Springer Science + Business Media, 1995; Cowie, J.M.G., Polymers: Chemistry & Physics of Modern Materials, 2^nd Edition, Chapman & Hall, 1991; Chanda, M., Introduction to Polymer Science and Chemistry: A Problem-Solving Approach, 2^nd Edition, CRC Press, 2013; Nicholson, J.W., The Chemistry of Polymers, 4^th Edition, RSC Publishing, 2012; содержания которых во всей их полноте включены в настоящее изобретение в качестве ссылки).

Предпочтительными полимерами являются гидрофильные и/или содержащие гидрофильные группы. Полимер может быть растворим в воде. В одном варианте осуществления полимером является сополимер, который полимеризован из двух или большего количества типов мономеров, выбранных для обеспечения желательной степени растворимости в воде. Например, растворимость сополимера в воде можно регулировать путем изменения количества заряженного мономера, например, 4-винилсульфоната натрия, использующегося для получения сополимера.

После сшивки растворимые в воде полимеры образуют набухающие в воде гели или гидрогели. Гидрогели абсорбируют водные растворы посредством водородных связей с молекулами воды. Полную емкость при абсорбции и набухании гидрогеля можно регулировать путем изменения типа и количества сшивающих реагентов, использующихся для получения геля. Полимеры с низкой плотностью сшивок обычно обладают большей емкостью при абсорбции и набухают в большей степени, чем полимеры с высокой плотностью сшивок, но прочность геля полимеров с высокой плотностью сшивок обычно выше и она может обеспечивать сохранение формы сетки даже при умеренном давлении.

Способность гидрогеля абсорбировать воду зависит от концентрации ионов в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления гидрогель, предлагаемый в настоящем изобретении, может абсорбировать массу деионизованной дистиллированной воды, до 50 раз превышающую его массу (объем, в 5-50 раз превышающий его объем), и массу физиологического раствора, до 30 раз превышающую его массу (объем, в 4-30 раз превышающий его объем). Сниженная способность абсорбировать физиологический раствор обусловлена наличием одновалентных катионов, которые препятствуют связыванию полимера с молекулами воды.

Трехмерная сетка, предлагаемая в настоящем изобретении, может включать сополимер, который полимеризован из одного, двух, трех или большего трех типов мономеров, где один, два, три или больше трех типов мономеров включают полимеризующуюся группу, независимо выбранную из группы, включающей акрилатную группу (например, акрилатную, метакрилатную, метилметакрилатную, гидроксиэтилметакрилатную, этилакрилатную, 2-фенилакрилатную), акриламидную группу (например, акриламидную, метакриламидную, диметилакриламидную, этилакриламидную), итаконатную группу (например, итаконатную, 4-метилитаконатную, диметилитаконатную) и стирольную группу (например, стирольную, 4-метилстирольную, 4-этоксистирольную). Предпочтительными полимеризующимися группами являются акрилатная, метакрилатная, этакрилатная, 2-фенилакрилатная, акриламидная, метакриламидная, итаконатная и стирольная. В некоторых вариантах осуществления в один из мономеров, использующийся для получения сополимера, вводят, например, 4-винилбензолсульфонат натрия.

Полимер, использующиеся для получения сетки, предлагаемой в настоящем изобретении, может включать по меньшей мере одну, по меньшей мере две или больше, чем две сшивающие группы в одной молекуле. Сшивающая группа является группой, которая ковалентно связывает молекулы полимера сетки друг с другом и необязательно с зондами и/или субстратом. Сополимеры, которые полимеризованы из двух или большего количества мономеров (например, мономеры, включающие полимеризующуюся группу, независимо выбранную из числа описанных в предыдущем абзаце), по меньшей мере один из которых включает сшивающий реагент, являются подходящими для получения трехмерной сетки, предлагаемой в настоящем изобретении. Типичные сшивающие реагенты описаны в разделе 5.1.2. Предпочтительным мономером, включающим сшивающий реагент, является метакрилоилоксибензофенон (МАБФ) (см. фиг. 10).

В предпочтительном варианте осуществления сополимер представляет собой биополимер или тройной сополимер, включающий сшивающий реагент. В особенно предпочтительном варианте осуществления сополимером является сополимер (диметилакриламид - метакрилоилоксибензофенон - 4-винилбензолсульфонат натрия) (см. фиг. 10).

5.1.2. Сшивающие реагенты

Сшивающие реагенты (или сшивающие агенты), подходящие для получения сшивок в трехмерных сетках, включают активируемые ультрафиолетовым излучением (например, длинноволновым УФ излучением), излучением в видимой области спектра и нагреванием. Типичные сшивающие реагенты, активируемые УФ излучением, включают бензофенон, тиоксантоны (например, тиоксантен-9-он, 10-метилфенотиазин) и бензоиновые эфиры (например, метиловый эфир бензоина, этиловый эфир бензоина). Типичные сшивающие реагенты, активируемые излучением в видимой области спектра, включают этилэозин, эозин Y, бенгальский розовый, камфорхинон и эритрозин. Типичные сшивающие реагенты, активируемые нагреванием, включают 4,4'-азобис(4-циклопентановую) кислоту и 2,2-азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан]дигидрохлорид и бензоилпероксид. Также можно использовать другие сшивающие реагенты, известные в данной области техники, например, которые при облучении могут образовывать радикалы или другие реакционноспособные группы.

5.1.3. Каналы

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат один или большее количество каналов.

При использовании в настоящем изобретении "канал" представляет собой удлиненный проход в сетке, который (1) является в основном прямым и (2) в гидратированном состоянии сетки обладает минимальным сечением, которое равно не менее 500 нм, и длиной, которая по меньшей мере в 5 раз и предпочтительно по меньшей мере в 10 раз больше минимального сечения прохода. Например, длина канала может быть в 5-15 раз, 5-10 раз или 10-15 раз больше минимального сечения канала. Канал, который является "в основном прямым", является таким, который простирается от точки зародышеобразования в одном направлении без изменения направления более, чем на 45 градусов в любом направлении, т.е. в направлении X, Y или Z.

"Гидратированное состояние сетки" означает, что сетка находится в равновесном состоянии по абсорбции воды, т.е. в водном растворе она абсорбирует столько воды, сколько из нее десорбируется.

Каналы могут обеспечить доступ к внутренней части сетки. Хотя каналы могут обладать относительно большим сечением, сетка может оставаться механически стабильной, поскольку размер отверстий сетки может быть значительно меньше, чем сечение канала. Каналы могут образовывать некую магистраль, через которую анализируемые вещества могут быстро попадать во внутреннюю часть сетки. Перенос анализируемых веществ в канал может происходить путем диффузии и/или конвекции.

Каналы могут простираться от поверхности или от положения вблизи от поверхности сетки во внутреннюю часть сетки. Например, один или большее количество каналов могут простираться от точки, которая находится на расстоянии менее 10 мкм, менее 9 мкм, менее 8 мкм, менее 7 мкм, менее 6 мкм, менее 5 мкм, менее 4 мкм, менее 3 мкм, менее 2 мкм, менее 1 мкм от поверхности сетки, или простирается во внутреннюю часть от точки на поверхности сетки. Сетка может содержать множество каналов (например, от 2 до 100, от 2 до 50, от 2 до 25, от 2 до 10, от 10 до 50, от 10 до 25 или от 25 до 50), каждый из которых может простираться от поверхности или от положения вблизи от поверхности сетки во внутреннюю часть сетки. В предпочтительных вариантах осуществления сетка содержит 10, 20, 30, 40 или 50 каналов, или количество каналов, находящееся в диапазоне между любыми двумя из указанных выше значений (например, от 10 до 50, от 20 до 40, от 30 до 50, от 10 до 20, от 20 до 30, от 30 до 40 или от 40 до 50 каналов). В особенно предпочтительном варианте осуществления сетка содержит от 10 до 50 каналов.

В некоторых вариантах осуществления длина по меньшей мере одного канала составляет от 10 до 100%, от 10% до 90%, от 10% до 80%, от 10% до 70%, от 10% до 60%, от 10% до 50%, от 10% до 40%, от 10% до 30%, от 10% до 15%, от 10% до 20%, от 10% до 25%, от 10 до 30%, от 15% до 20%, от 15% до 25%, от 15% до 30%, от 20 до 25% или от 25% до 30% от наибольшего размера сетки. В предпочтительных вариантах осуществления длина по меньшей мере одного канала составляет примерно 10%, 20%, 30%, 40% или 50% от наибольшего размера сетки и в некоторых вариантах осуществления он обладает длиной, находящейся в диапазоне между любыми двумя из указанных выше значений (например, от 10% до 50%, от 10% до 30%, от 30% до 50%, от 10% до 20%, от 20% до 30%, от 30% до 40% или от 40% до 50% от наибольшего размера сетки). В особенно предпочтительном варианте осуществления длина составляет от 10% до 50% от наибольшего размера сетки.

В некоторых вариантах осуществления сетка включает по меньшей мере один канал, обладающий минимальным сечением, которое по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз или по меньшей мере в 20 раз больше размера отверстий сетки (например, в 5-10 раз, 5-15 раз, 5-20 раз, 5-25 раз, 5-30 раз, 10-15 раз, 10-20 раз, 10-25 раз, 10-30 раз, 10-15 раз, 10-20 раз, 10-25 раз, 10-30 раз, 15-20 раз, 15-25 раз, 15-30 раз, 20-25 раз, 20-30 раз или 25-30 раз больше размера отверстий сетки). В предпочтительных вариантах осуществления сетка включает по меньшей мере один канал, обладающий минимальным сечением, которое в 10-30 раз больше размера отверстий. Это обеспечивает высокую стабильность полимерной сетки и также может предупредить проникновение в сетку и связывание нежелательно больших молекул или компонентов, содержащихся в образце.

Сетка может обладать отверстиями размером (измеренным в гидратированном состоянии сетки), равным, например, от 5 до 75 нм (например, от 10 до 20 нм, от 10 до 30 нм, от 10 до 40 нм, от 10 до 50 нм, от 20 до 30 нм, от 20 до 40 нм, от 20 до 50 нм, от 30 до 40 нм, от 30 до 50 нм или от 40 до 50 нм).

Сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать множество каналов (например, от 2 до 100, от 2 до 50, от 2 до 25, от 2 до 10, от 10 до 50, от 10 до 25 или от 25 до 50) и каждый канал независимо может обладать одной или большим количеством из характеристик, описанных в этом разделе. В некоторых вариантах осуществления большинство каналов обладает одной или большим количеством характеристик, описанных в этом разделе. В особенно предпочтительном варианте осуществления сетка содержит от 10 до 50 каналов, каждый из которых обладает одной или большим количеством из характеристик, описанных в этом разделе.

Предпочтительные трехмерные сетки содержат множество каналов, которые сходятся в точке, расположенной в сетке, и расположены так, что, начиная от поверхности сетки по направлению к внутренней части боковое расстояние между каналами уменьшается. В некоторых вариантах осуществления множество каналов простирается приблизительно радиально от точки, расположенной во внутренней части сетки. В некоторых вариантах осуществления трехмерная сетка содержит несколько множеств каналов (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 множеств каналов), каждое множество сходится в разных точках в сетке. В некоторых объектах множество (или каждое множество) соединено в точке их схождения.

Наличие канала в сетке можно проверить по следующей методике: Сетку вводят во взаимодействие с водной жидкостью при комнатной температуре, например, в чашке. Жидкость содержит множество наночастиц, которые меньше, чем размер отверстий сетки, и меньше, чем минимальное сечение канала. Таким образом, наночастицы могут попасть в канал и распределиться вдоль канала. Если не ограничиваться теорией, то можно полагать, что это может происходить вследствие броуновского движения молекул и/или конвекции в жидкости в канале. Такие наночастицы известны, как квантовые точки. Они могут, например, обладать диаметром, равным примерно 10 нм.

Инкубационный период выбирают так, чтобы сетка в жидкости была полностью гидратированной, т.е. чтобы сетка в среднем поглощала такое же количество воды, как то, которое она выделяет. Инкубационный период может составлять, например, 1 ч. Проникновение наночастиц в канал можно ускорить путем перемещения сетки и/или жидкости во время инкубации, например, путем обеспечения вибрации сетки и/или жидкости, предпочтительно с помощью ультразвуковых волн.

После завершения инкубации жидкость отделяют от сетки, например, путем сливания жидкости из чашки или извлечения сетки из чашки.

Затем гидратированную сетку замораживают, например, с помощью жидкого азота. Затем замороженную сетку с помощью криомикротома можно нарезать по параллельным плоскостям и получить тонкие срезы. Плоскости среза расположены перпендикулярно продольной протяженности канала и проходят в канал. Нарезку предпочтительно проводят с помощью охлажденного жидким азотом алмазного ножа. Толщина срезов может равняться, например, примерно 100 нм или 200 нм.

С помощью микроскопа определяют положения наночастиц, находящихся на дисках, полученных нарезкой замороженной сетки. Наночастицы могут быть флуоресцирующими и при необходимости подсвеченными, чтобы их было легче отличить от сетки. Положения наночастиц можно определить с помощью подходящего программного обеспечения, включающего методику обработки изображений. Для исследования дисков предпочтительно использовать конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с флуоресцентной оптикой или электронный микроскоп.

Информацию о геометрии и/или положениях наночастиц, полученную таким образом, можно с помощью компьютера использовать для построения трехмерной геометрической модели распределения наночастиц в сетке. Затем модель можно использовать для определения того, включает ли расположение наночастиц в сетке по меньшей мере один в основном прямой участок, сечение которого ни в коем случае не меньше 500 нм и длина которого по меньшей мере в 5 раз больше его наименьшего сечения. Если это условие выполнено, считают, что сетка включает по меньшей мере один канал.

Альтернативно, трехмерное распределение наночастиц в сетке можно исследовать с помощью микро-3D рентгеновской компьютерной томографии.

5.1.4. Зонды

Зонд, иммобилизованный на сетке, предлагаемой в настоящем изобретении, может представлять собой биомолекулу или молекулу, которая связывается с биомолекулой, например, компонент специфически взаимодействующей системы комплементарных связывающихся компонентов (рецептор/лиганд). Например, зонды могут включать нуклеиновые кислоты и их производные (такие как РНК, ДНК, замкнутые нуклеиновые кислоты (ЗНК) и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК)), белки, пептиды, полипептиды и их производные (такие как глюкозамин, антитела, фрагменты антител и ферменты), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота, моноглицериды, диглицериды и триглицериды), углеводы, ингибиторы ферментов, субстраты ферментов, антигены и эпитопы. Зонды также могут включать более крупные и составные структуры, такие как липосомы, мембраны и фрагменты мембран, клетки, лизаты клеток, фрагменты клеток, споры и микроорганизмы.

Специфически взаимодействующая система комплементарных связывающихся компонентов может быть основана, например, на взаимодействии нуклеиновой кислоты с комплементарной нуклеиновой кислотой, взаимодействии ПНК с нуклеиновой кислотой или взаимодействии фермент/субстрат, рецептор/лиганд, лектин/сахар, антитело/антиген, авидин/биотин или стрептавидин/биотин.

Нуклеиновые кислоты-зонды могут представлять собой ДНК или РНК, например, олигонуклеотид или аптамер, ЗНК, ПНК или ДНК, включающую метакрилатную группу на 5'-конце (5' Acrydite™). Зонды-олигонуклеотиды могут включать, например, от 12 до 30, от 14 до 30, от 14 до 25, от 14 до 20, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 16 до 30, от 16 до 25, от 16 до 20, от 15 до 40, от 15 до 45, от 15 до 50, от 15 до 60, от 20 до 55, от 18 до 60, от 20 до 50, от 30 до 90, от 20 до 100, от 20 до 60, от 40 до 80, от 40 до 100, от 20 до 120, от 20 до 40, от 40 до 60, от 60 до 80, от 80 до 100, от 100 до 120 или от 12 до 150 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления зонд-олигонуклеотид включает от 15 до 60 нуклеотидов.

При использовании нуклеиновой кислоты-зонда весь зонд или только часть зонда может быть комплементарна последовательности-мишени. Часть зонда, комплементарная последовательности-мишени, предпочтительно включает не менее 12 нуклеотидов и более предпочтительно не менее 15, не менее 18 или не менее 20 нуклеотидов. В нуклеиновых кислотах-зондах, включающих более 40 или 50 нуклеотидов, часть зонда, комплементарная последовательности-мишени, может включать не менее 25, не менее 30 или не менее 35 нуклеотидов.

Антитело может представлять собой, например, поликлональное, моноклональное или химерное антитело или его фрагмент, связывающий антиген (т.е. "антиген-связывающая часть"), или одну его цепь, белки слияния, включающие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена, включая, например, без наложения ограничений, одноцепочечные (scFv) и доменные антитела (например, доменные антитела человека, верблюда или акулы), максиантитела, миниантитела, интраантитела, диатела, триатела, тетратела, vNAR и bis-scFv (см. например, публикацию Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech 23:1126-1136). Антитела включают антитела любого класса, такие как IgG, IgA или IgM (или их подкласс), и антитела не должны относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности С-домена тяжелых цепей антитела иммуноглобулинов можно отнести к разным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂ - "Антитела" также включают любой из указанных выше типов антитело/иммуноглобулин.

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать один тип зонда или больше, чем один тип зонда (например, 2, 3, 4 или 5, или большее количество типов). Трехмерные сетки могут включать больше одного типа зонда для одной и той же мишени (например, антитела, связывающие разные эпитопы одной и той же мишени) и/или включать зонды, которые связывают множество мишеней.

Сетки могут включать меченую (например, флуоресцентно меченую) контрольную молекулу зонда, которую можно использовать, например, для определения количества зонда, содержащегося в сетке.

Зонды могут быть распределены по сетке (например, на поверхности и во внутренней части сетки). Предпочтительно, если по меньшей мере один зонд расположен не на поверхности сетки и соприкасается по меньшей мере с одним каналом. Тогда расположенный таким образом зонд непосредственно доступен для молекул анализируемого вещества или компонентов анализируемого вещества через канал. В некоторых вариантах осуществления большинство зондов расположено во внутренней части сетки.

Один или большее количество зондов можно иммобилизовать на сетке ковалентно или нековалентно. Например, зонд можно сшить со сшитым полимером или зонд можно нековалентно связать с сеткой (например, путем связывания с молекулой, ковалентно связанной с сеткой). В предпочтительном варианте осуществления один или большее количество зондов сшиты со сшитым полимером. В некоторых вариантах осуществления большинство зондов ковалентно связаны во внутренней части сетки (например, так, что по меньшей мере часть зондов соприкасается с каналом).

Если не ограничиваться теорией, то авторы полагают, что способы, описанные в разделе 5.3 для получения трехмерных сеток в присутствии кристаллов соли (в особенности кристаллов фосфата), могут привести к большей концентрации молекул зонда на границе раздела между полимером и каналом или вблизи от нее вследствие электростатических взаимодействий между молекулами-зондами (в особенности молекулами-зондами нуклеиновых кислот) и кристаллами соли. Поэтому в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сеткам, предлагаемым в настоящем изобретении, в которых плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом. В различных вариантах осуществления плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом.

Плотность молекул зонда в сетке можно проверить по следующей методике:

Сетку вводят во взаимодействие с водной жидкостью при комнатной температуре, например, в чашке. Жидкость содержит множество наночастиц, присоединенных к фрагменту, который взаимодействует с молекулами-зондами в сетке, например, со стрептавидином, если молекулы-зонды биотинилированы. Размер наночастиц меньше, чем размер отверстий сетки, и меньше, чем минимальное сечение канала, что обеспечивает распределение наночастиц по полимеру. Подходящие наночастицы являются квантовыми точками диаметром 2-5 нм.

Инкубационный период выбирают так, чтобы сетка в жидкости была полностью гидратированной, т.е. чтобы сетка в среднем поглощала такое же количество воды, как то, которое она выделяет. Инкубационный период может составлять, например, 1 ч. Проникновение наночастиц в канал можно ускорить путем перемещения сетки и/или жидкости во время инкубации, например, путем обеспечения вибрации сетки и/или жидкости, предпочтительно с помощью ультразвуковых волн.

После завершения инкубации жидкость отделяют от сетки, например, путем сливания жидкости из чашки или извлечения сетки из чашки.

Затем гидратированную сетку замораживают, например, с помощью жидкого азота. Затем замороженную сетку с помощью криомикротома можно нарезать по параллельным плоскостям и получить тонкие срезы. Плоскости среза расположены перпендикулярно продольной протяженности канала и проходят в канал. Нарезку предпочтительно проводят с помощью охлажденного жидким азотом алмазного ножа. Толщина срезов может равняться, например, примерно 100 нм или 200 нм.

С помощью микроскопа определяют положения наночастиц, находящихся на дисках, полученных нарезкой замороженной сетки. Наночастицы могут быть флуоресцирующими и при необходимости подсвеченными, чтобы их было легче отличить от сетки. Положения наночастиц можно определить с помощью подходящего программного обеспечения, включающего методику обработки изображений. Для исследования дисков предпочтительно использовать конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с флуоресцентной оптикой или электронный микроскоп.

Информацию о геометрии и/или положениях наночастиц, полученную таким образом, можно с помощью компьютера использовать для построения трехмерной геометрической модели распределения наночастиц в сетке. Затем модель можно использовать для определения того, отражает ли распределения наночастиц наличие большей плотности молекул-зондов вблизи стенок каналов.

5.2. Массивы

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно расположить (например, осадить) на субстрате и их предпочтительно иммобилизуют на субстрате (например, с помощью ковалентной сшивки сетки и субстрата). Множество сеток можно иммобилизовать на субстрате с образованием массива, применимого, например, в качестве биочипа.

Подходящие субстраты включают органические полимеры, например, сополимеры циклоолефинов (СЦО), полистирол, полиэтилен, полипропилен и полиметилметакрилат (РММА, Plexiglas®). Фирма Ticona продает подходящий СЦО под торговым названием Topas®. Неорганические материалы (например, металл, стекло) также можно использовать в качестве субстрата. На такие субстраты можно нанести покрытие из органических молекул для обеспечения сшивки сетки и поверхности субстрата. Например, на неорганические поверхности можно нанести самоагрегированные монослои (САМ). Сами САМ могут быть совершенно нереакционноспособным и например, включают или состоят из чистых алкилсиланов. Другие субстраты также могут быть подходящими для сшивки с трехмерной сеткой, если они могут участвовать в стабильных связях с органическими молекулами при свободнорадиальных реакциях (например, борорганические соединения).

Субстрат может быть жестким или эластичным. В некоторых вариантах осуществления субстрат находится в форме планшета (например, прямоугольного планшета, квадратного планшета, круглого диска и т.п.). Например, субстрат может включать микропланшет и трехмерные сетки могут быть расположены в лунках планшета.

Отдельные сетки могут быть расположены на разных пятнах на поверхности субстрата, например, в матрице, включающей множество столбцов и строк. В варианте осуществления, представленном на фиг. 11, сетки расположены на 36 пятнах, сгруппированных в 6 столбцов и 6 строк. Предусмотрены массивы, обладающие разным количеством строк и столбцов, количества каждых из которых можно выбрать независимо (например, от 2 до 64 столбцов и от 2 до 64 строк). Столбцы могут быть разделены расстоянием X и строки могут быть разделены расстоянием Y (например, как показано на фиг. 12), так что образуется сетка пятен, на которых могут быть расположены отдельные сетки. X и Y можно выбрать так, что сетки, расположенные на пятнах решетки, не соприкасаются друг с другом в дегидратированном состоянии и не соприкасаются друг с другом в гидратированном состоянии. Размеры X и Y могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления X и Y являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления X и Y являются разными. В некоторых вариантах осуществления X и Y независимо выбраны из числа расстояний, равных не менее примерно 500 мкм (например, от 500 мкм до 5 мм, от 500 мкм до 4 мм, от 500 мкм до 3 мм, от 500 мкм до 2 мм или от 500 мкм до 1 мм). В некоторых вариантах осуществления X и Y оба равны примерно 500 мкм. В других вариантах осуществления X и Y оба равны 500 мкм.

В некоторых вариантах осуществления субстрат является лентообразным (например, как показано на фиг. 13). Сетки могут быть расположены в виде одной строки, простирающейся в продольном направлении лентообразной органической поверхности, или могут быть расположены в виде множества строк, простирающихся в продольном направлении лентообразной поверхности. Строки и столбцы в таких лентообразных массивах могут обладать размерами решетки X и Y, как описано выше.

Каждая отдельная сетка может занимать участок поверхности массива, который является круглым или в основном круглым. Обычно диаметр участка на поверхности массива, покрытого отдельными сетками (т.е. диаметр пятна), равен от 80 мкм до 1000 мкм. В различных вариантах осуществления диаметр пятна равен 80 мкм, 100 мкм, 120 мкм, 140 мкм, 160 мкм, 180 мкм, 200 мкм, 300 мкм, 400 мкм, 500 мкм, 600 мкм, 700 мкм, 800 мкм, 900 мкм или 1000 мкм, или выбран из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений, например, от 80 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 120 мкм, от 120 мкм до 140 мкм, от 120 мкм до 180 мкм, от 140 мкм до 160 мкм, от 160 мкм до 180 мкм, от 180 мкм до 200 мкм, от 120 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 400 мкм, от 160 мкм до 600 мкм или от 120 мкм до 700 мкм и т.д., и т.п. В предпочтительном варианте осуществления диаметр находится в диапазоне от 100 мкм до 200 мкм или в его поддиапазоне.

Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, обычно содержат не менее 8 отдельных трехмерных сеток. В некоторых объектах массивы включают не менее 16, не менее 24, не менее 48, не менее 96, не менее 128, не менее 256, не менее 512 или не менее 1024 отдельных трехмерных сеток. В некоторых вариантах осуществления массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат 24, 48, 96, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096 или 8192 отдельных сеток или содержат количество трехмерных сеток, выбранное из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений, например, от 8 до 128, от 8 до 512, от 24 до 8192, от 24 до 4096, от 48 до 2048, от 96 до 512, от 128 до 1024, от 24 до 1024, от 48 до 512, от 96 до 1024 или от 128 до 512 трехмерных сеток и т.д., и т.п. В предпочтительном варианте осуществления количество трехмерных сеток в массиве находится в диапазоне от 8 до 1024. В особенно предпочтительном варианте осуществления количество трехмерных сеток в массиве находится в диапазоне от 25 до 400.

Отдельные сетки, которые включают массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут содержать одинаковые или разные зонды (например, каждая сетка может содержать особый набор зондов, множество сеток может содержать одинаковый набор зондов и другие сетки могут содержать другой набор или другие наборы зондов, или все сетки могут содержать один и тот же набор зондов). Например, сетки, находящиеся в одной строке матрицы, могут содержать одинаковые зонды и сетки, находящиеся в разных строках матрицы, могут содержать разные зонды.

Обычно для отдельных сеток массива диаметры пятен и/или объемы отдельных сеток отличаются друг от друга не более, чем на 20%, не более, чем на 15%, не более, чем на 10% или не более, чем на 5%.

В некоторых вариантах осуществления массивы включают одну или большее количество отдельных сеток (например, пятна в массиве) с одним или большим количеством контрольных олигонуклеотидов или молекул-зондов. Контрольные олигонуклеотиды могут быть мечеными, например, флуоресцентно мечеными, для использования в качестве пространственного контроля (для пространственной ориентации массива) и/или определения количества молекул-зондов, связанных с сетками, например, при промывке и повторном использовании массива, предлагаемого в настоящем изобретении (т.е. для "контроля возможности повторного использования"). Зонды для пространственного контроля и контроля возможности повторного использования (которые могут быть одинаковыми или разными зондами) в разделе 7.2 названы "маячками", когда один и тот же зонд используют для обеих целей.

Одно и то же пятно в массиве или разные пятна в массиве могут дополнительно включать немеченый зонд, который является комплементарным известной мишени. При использовании для исследования гибридизации путем определения интенсивности сигнала гибридизации немеченого зонда с меченой мишенью можно определить эффективность реакции гибридизации. Если отдельную сетку (т.е. пятно в массиве) используют для контроля возможности повторного использования и/или пространственного контроля и контроля гибридизации, для мечения молекулы-мишени можно использовать флуоресцентный фрагмент, не такой, как флуоресцентный фрагмент для зондов для контроля возможности повторного использования или пространственного контроля.

В некоторых вариантах осуществления массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно повторно использовать не менее 5 раз, не менее 10 раз, не менее 20 раз, не менее 30 раз, не менее 40 раз или не менее 50 раз (например, от 5 до 20 раз, от 5 до 30 раз, от 10 до 50 раз, от 10 до 20 раз, от 10 до 30 раз, от 20 до 40 раз или от 40 до 50 раз, предпочтительно повторно использовать массив от 10 до 50 раз). Массив можно промыть раствором соли при условиях, обеспечивающих денатурацию (например, при низкой концентрации соли и высокой температуре). Например, между использованиями массив можно промыть 1-10 мМ фосфатным буфером при температуре, равной 80-90°С. Температуру промывки можно выбрать на основе протяженности (Tm) гибрида мишень : зонд.

Целостность массива можно определить с помощью зонда для "контроля возможности повторного использования". Зонд для контроля возможности повторного использования может быть флуоресцентно меченым или его можно образовать путем гибридизации с флуоресцентно меченой комплементарной нуклеиновой кислотой. Флуоресцентная метка флуоресцентно меченого зонда для контроля возможности повторного использования может обесцветиться при повторяющемся возбуждении до того, как будет нарушена целостность нуклеиновой кислоты; в таких случаях любые дополнительные повторные использования могут включать обнаружение гибридизации с флуоресцентно меченой комплементарной нуклеиновой кислотой в качестве контроля. Обычно массив, предлагаемый в настоящем изобретении, стабилен в течение не менее 6 месяцев.

В различных вариантах осуществления интенсивность сигнала флуоресценции флуоресцентно меченого зонда для контроля возможности повторного использования составляет не менее 99%, 95% 90%, 80%, 70%, 60% или 50% от начальной интенсивности своего сигнала флуоресценции после 5, 10, 20, 30, 40 или 50 использований. Предпочтительно, если интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования составляет не менее 75% от интенсивности своего сигнала флуоресценции после 5 или 10 использований. Массив можно продолжать повторно использовать, пока интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования составляет не менее 50% от интенсивности своего сигнала флуоресценции, например, после 20, 30, 40 или 50 повторных использований. Интенсивность сигнала флуоресценции контрольного зонда можно определять после каждого повторного использования, после каждого второго повторного использования, после каждого третьего повторного использования, после каждого четвертого повторного использования, после каждого пятого повторного использования, после каждого шестого повторного использования, после каждого седьмого повторного использования, после каждого восьмого повторного использования, после каждого девятого повторного использования, после каждого десятого повторного использования или комбинации указанных выше. Например, интенсивность сигнала можно определять периодически через 5 или 10 повторных использований вначале и частоту определения увеличивать при увеличении количества повторных использований так, что ее определяют после каждого повторного использования после некоторого количества (например, 5, 10, 20, 30, 40 или 50) использований. В некоторых вариантах осуществления частота определения составляет в среднем один раз после 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5 или 10 использований или в среднем находится в диапазоне между любыми двумя из указанных выше значений, например, один раз после 1-2 использований, один раз после 1-1,5 использований, один раз после 1-3 использований или один раз после 1,5-3 использований.

Следует отметить, что термины "пространственный контроль", "контроль возможности повторного использования" и "контроль гибридизации" включены для удобства и ссылок, и они не предназначены для указания на то, что зонды для "пространственного контроля", "контроля возможности повторного использования" и "контроля гибридизации" можно использовать сами по себе. 5.3. Способы получения трехмерных полимерных сеток В одном объекте способы, предлагаемые в настоящем изобретении для получения трехмерных полимерных сеток, включают (а) обработку смеси, включающей водный раствор соли, полимер, сшивающий реагент и необязательно один или большее количество зондов, при условиях, обеспечивающих образование кристаллов соли, (b) обработку смеси при условиях, обеспечивающих сшивку, для сшивки полимера с образованием сшитой полимерной сетки и (с) взаимодействие сшитой полимерной сетки с растворителем для растворения кристаллов соли и образования одного или большего количества каналов.

Способы могут дополнительно включать стадию образования смеси путем объединения водного раствора соли, полимера, сшивающего реагента и необязательно одного или большего количества зондов, и/или дополнительно включать стадию нанесения смеси на субстрат (например, субстрат, описанный в разделе 5.2) до обработки смеси при условиях, обеспечивающих образование соли. Если использующийся полимер содержит предварительно присоединенный сшивающий реагент (например, при использовании сополимера, полимеризованного из мономера, включающего сшивающий реагент), то стадия образования смеси может включать объединение водного раствора соли с полимером и необязательно с одним или большим количеством зондов.

Каналы, образованные путем растворения кристаллов соли, могут обладать одной или большим количеством из характеристик, описанных в разделе 5.1.3.

Смесь можно нанести на субстрат до обработки смеси при условиях, обеспечивающих образование соли, например, путем распыления смеси на поверхность субстрата (например, на 1024 центра на поверхности). Смесь можно нанести на поверхность, например, с помощью устройства для нанесения пятен ДНК на чип или струйного принтера. В предпочтительном варианте осуществления смесь распыляют с помощью струйного принтера. Это обеспечивает простое и быстрое нанесение смеси на большое количество пятен на субстрате. Пятна могут быть расположены, например, в форме матрицы в нескольких строках и/или столбцах. Предпочтительно, если содержание соли в смеси во время печати меньше предельного значения растворимости, так чтобы смесь не кристаллизовалась в печатающей головке принтера. Объем смеси, наносимой на отдельные пятна, может составлять, например, 100 пл, 200 пл, 300 пл, 400 пл, 500 пл, 750 пл, 1 нл, 2 нл, 3 нл, 4 нл или 5 нл, или может быть выбран из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений (например, от 100 пл до 5 нл, от 100 пл до 1 нл, от 300 пл до 1 нл, от 200 пл до 750 нл, от 100 пл до 500 пл, от 200 пл до 2 нл, от 500 пл до 2 нл, от 1 нл до 2 нл и т.д., и т.п.). В предпочтительных вариантах осуществления объем пятна равен от 200 пл до 4 нл.

Диаметр отдельных пятен зависит от состава смеси, объема наносимой смеси и химических характеристик поверхности субстрата. Диаметры пятен обычно находятся в диапазоне от 80 мкм до 1000 мкм и его можно обеспечить путем изменения указанных выше параметров. В различных вариантах осуществления диаметры пятен равны 80 мкм, 100 мкм, 120 мкм, 140 мкм, 160 мкм, 180 мкм, 200 мкм, 300 мкм, 400 мкм, 500 мкм, 600 мкм, 700 мкм, 800 мкм, 900 мкм или 1000 мкм, или могут быть выбраны из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений, например, от 80 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 120 мкм, от 120 мкм до 140 мкм, от 120 мкм до 180 мкм, от 140 мкм до 160 мкм, от 160 мкм до 180 мкм, от 180 мкм до 200 мкм, от 120 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 400 мкм, от 160 мкм до 600 мкм или от 120 мкм до 700 мкм и т.д., и т.п. В предпочтительном варианте осуществления диаметр находится в диапазоне от 100 мкм до 200 мкм или в его поддиапазоне.

Подходящие полимеры, сшивающие реагенты и зонды, которые можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, описаны в разделах 5.1.1, 5.1.2 и 5.1.4 соответственно. В некоторых вариантах осуществления полимер, использующийся в способах, содержит по меньшей мере одну сшивающую группу в одной молекуле полимера. В предпочтительном варианте осуществления полимер содержит по меньшей мере две сшивающие группы в одной молекуле. В особенно предпочтительном варианте осуществления полимер содержит по меньшей мере две обладающие фотохимической реакционной способностью группы в одной молекуле. В этих вариантах осуществления отдельные молекулы полимера и сшивающего реагента не требуются.

Подходящие соли, которые можно включать в смесь, описаны в разделе 5.3.1. Подходящие условия, обеспечивающие образование соли, описаны в разделе 5.3.2. Подходящие условия, обеспечивающие сшивку, описаны в разделе 5.3.3. Подходящие растворители для растворения кристаллов соли описаны в разделе 5.3.4.

5.3.1. Соль

Соль можно выбрать по ее совместимости с одним или большим количеством зондов. В идеальном случае соль обладает одной или большим количеством из следующих характеристик, (i) соль нетоксична для зондов (например, соль не денатурирует зонды), (и) соль не вступает в химическую реакцию с зондами, (iii) соль не взаимодействует с флуорофорами, такими как цианиновые красители, которые являются подходящими для оптической маркировки зондов, (iv) соль не вступает в химическую реакцию с анализируемыми веществами, детектирующими молекулами и/или связывающимися с ними компонентами, и/или (v) соль образует игольчатые кристаллы.

В предпочтительном варианте осуществления раствор соли включает одновалентные катионы. Смесь может включать гидрофосфат натрия и/или дигидрофосфат натрия, которые в водном растворе выделяют катионы Na⁺ и фосфатные ионы РО₄^3-. Фосфат натрия легко растворим в воде и образует бесцветные кристаллы.

В особенно предпочтительном варианте осуществления смесь включает гидрофосфат калия (K₂HPO₄) и/или дигидрофосфат калия (KH₂PO₄). Это соли превосходно растворимы в воде и поэтому могут образовать большое количество игольчатых кристаллов соли в смеси.

5.3.2. Условия, обеспечивающие образование кристаллов соли

Условия, обеспечивающие образование кристаллов соли, могут включать образование в смеси по меньшей мере одного кристалла соли, предпочтительно игольчатого кристалла соли, путем дегидратации смеси или охлаждения смеси, пока относительное содержание соли в смеси не увеличивается до превышающего предел растворимости, и это означает, что смесь пересыщена солью. Это стимулирует рост кристаллов соли по направлению к поверхности смеси из зародыша кристаллизации, расположенного в объеме смеси.

Смесь можно дегидратировать путем нагревания смеси, вакуумирования смеси и/или снижения влажности атмосферы вокруг смеси.

Смесь можно нагреть (например, от примерно 50°С до примерно 70°С) путем размещения смеси на нагревательной подложке или поверхности, нагревания подложки или поверхности, на которую помещена смесь (например, от примерно 50°С до примерно 70°С), и/или взаимодействия смеси с горячим газом (например, воздухом, азотом или диоксидом углерода, температура которого выше температуры смеси), так чтобы вода выпаривалась из смеси. Взаимодействие с горячим газом, например, можно обеспечить путем помещения смеси в нагревательную печь. Во время переноса в нагревательную печь смесь предпочтительно поддерживают во влажном состоянии, предпочтительно при относительной влажности, превышающей 75%. В результате этого возникает противодействие неконтролируемому образованию кристаллов соли во время переноса смеси в нагревательную печь. Это обеспечивает образование более длинных, игольчатых кристаллов соли в нагревательной печи. Путем нагревания смеси также можно активировать термически активируемые сшивающие реагенты, если они содержатся, и таким образом сшить полимер.

В некоторых вариантах осуществления температура нагревательной подложки и/или воздуха, использующегося для дегидратации смеси, на 20°С или более выше температуры смеси до нагревания смеси, но ниже 100°С.

Смесь можно охладить (например, от примерно 5°С до примерно 15°С) путем размещения смеси на охлаждающей подложке или поверхности, путем охлаждения подложки или поверхности, на которую помещена смесь (например, от примерно 5°С до примерно 15°С) и/или взаимодействия смеси с холодным газом (например, воздухом, азотом или диоксидом углерода, температура которого ниже температуры смеси). При охлаждении зависящий от температуры предел растворимости соли в смеси снижается, пока смесь в конечном счете не станет пересыщена солью. Это стимулирует образование одного или большего количества кристаллов соли, предпочтительно игольчатых. В некоторых вариантах осуществления смесь охлаждают путем выдерживания в холодной камере с низкой влажностью (например, при температуре от 0°С до 10°С, относительной влажности <40%).

Во время образования одного или большего количества кристаллов соли температуру в смеси предпочтительно поддерживают выше температуры точки росы атмосферы вокруг смеси. Это препятствует разбавлению смеси водой, конденсирующейся из атмосферы, что могло бы привести к уменьшению относительного содержания соли в смеси.

5.3.3. Условия, обеспечивающие сшивку

Условия, обеспечивающие сшивку, можно выбрать на основании типа использующегося сшивающего реагента. Например, при использовании сшивающий реагента, активируемого ультрафиолетовым излучением (например, бензофенона, тиоксантона или бензоинового простого эфира), условия, обеспечивающие сшивку, могут включать обработку смеси ультрафиолетовым (УФ) излучением. В некоторых вариантах осуществления используют УФ излучение, обладающее длиной волны, равной от примерно 250 нм до примерно 360 нм (например, 260±20 нм или 355±20 нм). Использование УФ излучения с меньшей энергией/большей длиной волны (например, 360 нм УФ излучения по сравнению с 254 нм УФ излучением) может потребовать более длительного облучения. При использовании сшивающего реагента, активируемого излучением в видимой области спектра (например, этилэозина, эозина Y, бенгальского розового, камфорхинона или эритрозина), условия, обеспечивающие сшивку, могут включать обработку смеси излучением в видимой области спектра. При использовании термически активируемого сшивающего реагента (например, 4,4'-азобис(4-циклопентановой)кислоты и 2,2-азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан]дигидрохлорида или бензоилпероксида) условия, обеспечивающие сшивку, могут включать нагревание смеси.

Продолжительность и интенсивность воздействия условий сшивки можно выбрать для обеспечения сшивки молекул полимера с молекулами другого полимера, сшивки молекул полимера с молекулами-зондами (если они содержатся) и сшивки молекул полимера с молекулами субстрата или органическими молекулами, находящимися на субстрате (если они содержатся). Продолжительность и интенсивность воздействия условий сшивки для смеси, содержащей зонды, можно определить экспериментально, например, для балансирования прочности иммобилизации и нативности молекул-зондов.

5.3.4. Растворение кристалла соли

После сшивки полимер, один или большее количество кристаллов соли могут растворяться в растворителе таким образом, что в сетке образуется по меньшей мере один канал, указанный канал простирается, начиная от поверхности и/или от положения вблизи от поверхности во внутреннюю часть сетки. Предпочтительно, если после растворения кристаллов соли в растворителе на месте, где был кристалл соли, в соответствии с принципом "потери" формы образуется полый удлиненный канал. Каналы обеспечивают проникновение анализируемых веществ через канал во внутреннюю часть сетки и специфическое связывание с зондом, находящимся во внутренней части сетки. При использовании массива, полученного способом, предлагаемым в настоящем изобретении, в качестве биологического сенсора становится возможным высокая точность измерения и высокая скорость измерения.

Растворитель для растворения одного или большего количества кристаллов соли можно выбрать таким образом, чтобы он был совместим с полимером и зондами, если они содержатся (например, растворитель можно выбрать так, чтобы он не растворял полимер и зонды). Предпочтительно, если использующимся растворителем являлся буфер на водной основе, такой как разбавленный фосфатный буфер. Метанол, этанол, пропанол или смесь этих жидкостей можно добавить к буферу, чтобы облегчить удаление несвязанного полимера из сетки.

После удаления кристаллов соли сетка может схлопнуться вследствие сушки и ее можно повторно гидратировать. Сушка сетки полезна для транспортировки и стабилизации биомолекул-зондов.

5.3.5. Способы применения трехмерных сеток

Сетки и массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать для определения наличия или отсутствия анализируемого вещества в образце, предпочтительно в жидком образце. Поэтому настоящее изобретение относится к способам определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце или множестве образцов, включающим взаимодействие сетки или массива, предлагаемого в настоящем изобретении, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом, с образцом или множеством образцов, и обнаружение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в образце или множестве образцов. Если в способах используют массивы, содержащие разные типы зондов, способные связываться с разными типами анализируемого вещества, то наличие разных типов анализируемых веществ можно установить путем обнаружения связывания разных типов анализируемых веществ с зондами. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию определения количества анализируемого вещества или анализируемых веществ, связанных с массивом.

Анализируемым веществом может быть, например, нуклеиновая кислота, такая как ампликон полимеразной цепной реакции (ПЦР). В некоторых вариантах осуществления ампликон ПЦР амплифицирован из биологического образца или образца окружающей среды (например, кровь, сыворотка, плазма, ткань, клетки, слюна, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, молоко, слезы, кал, пот, сперма, цельные клетки, компонент клетки, клеточный мазок или их экстракт или производное). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является меченой (например, флуоресцентно меченой).

Анализируемое вещество, помещенное на поверхность сетки, может проникать во внутреннюю часть сетки через канал для специфического связывания с зондом (например, биомолекулой), ковалентно связанном там с полимером. При использовании массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, с сетками, иммобилизованными на нем в качестве биологического сенсора, становится возможным высокая точность измерения и высокая скорость измерения.

Сетки и массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно регенерировать после использования в качестве биосенсора и можно использовать несколько раз (например, 5 раз, не менее 10 раз, не менее 20 раз, не менее 30 раз, не менее 40 раз или не менее 50 раз). Если молекулами-зондами являются ДНК, это можно обеспечить, например, путем нагревания сетки (сеток) в 1 × забуференном фосфатом физиологическом растворе при температуре, равной от 80°С до 90°С, в течение примерно 10 мин. Затем забуференный фосфатом физиологический раствор можно заменить на новый забуференный фосфатом физиологический раствор для вымывания денатурированной ДНК из сетки (сеток). Если молекулами-зондами сетки (сеток) или массива являются антигены, сетку (сетки) или массив можно регенерировать путем обработки сетки (сеток) 0,1 н. раствором NaOH в течение примерно 10 мин. Затем 0,1 н. раствор NaOH можно заменить на забуференный фосфатом физиологический раствор для вымывания антигенов из сетки. Таким образом, некоторые варианты осуществления способов применения сеток и массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, включают применение сетки или массива, который промывали до взаимодействия с образцом или множеством образцов.

5.4. Применение массивов, предлагаемых в настоящем изобретении

Поскольку массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают экономичное определение наличия нуклеиновых кислот в образце и их количественное определение, оно имеет непосредственное отношение к затруднениям, связанным со здоровьем и болезнями людей и животных, не являющихся людьми.

В этих случаях применения препарат, содержащий молекулу-мишень, получают или экстрагируют из биологических источников или источников окружающей среды по протоколам, известным в данной области техники. Молекулы-мишени можно получить или экстрагировать из клеток и тканей организмов всех таксономических классов, включая вирусы, бактерии и эукариоты, прокариоты, одноклеточные организмы, растения, грибы и животных всех типов и классов. Животными могут быть позвоночные, млекопитающие, приматы и предпочтительно люди. Кровь, сыворотка, плазма, ткань, клетки, слюна, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, молоко, слезы, кал, пот, сперма, цельные клетки, компонент клетки и клеточные мазки являются подходящими источниками молекул-мишеней.

Молекулами-мишенями предпочтительно являются нуклеиновые кислоты, амплифицированные (например, с помощью ПЦР) из любых из указанных выше источников).

Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать зонды, которые применимы для обнаружения патогенов людей и животных, не являющихся людьми. Такие зонды включают олигонуклеотиды, комплементарные по меньшей мере частично бактериальным, вирусным или грибковым мишеням или любой комбинации бактериальных, вирусных и грибковых мишеней.

Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать зонды, применимые для обнаружения экспрессии генов в клетках людей и животных, не являющихся людьми, например, экспрессии генов, связанной с заболеванием или нарушением, таким как рак, сердечно-сосудистое заболевание или метаболическое заболевание, для диагностики субъекта, мониторинга лечения субъекта или прогноза результата лечения субъекта. Затем информация об экспрессии генов может обеспечивать прослеживание прогрессирования или ремиссии заболевания и такая информация может содействовать мониторингу завершения лечения или изменению проведения начального лечения. 6.

ТИПИЧНЫЕ ПРОТОКОЛЫ

Приведенные ниже типичные протоколы, в которых использованы номера, находящиеся на прилагаемых чертежах, входят в объем настоящего изобретения, и их можно использовать для полимеров, сшивающих реагентов и зондов разделов 5.1.1, 5.1.2 и 5.1.4 соответственно. Другие полимеры (включая сополимеры) и сшивающие группы, подходящие для применения в описанных ниже методиках, описаны в публикациях Rendl et al., 2011, Langmuir 27:6116-6123 и в US 2008/0293592, содержания которых включены в настоящее изобретение в качестве ссылки. В одном варианте осуществления используют смесь полимеров раздела 7.1.

6.1. Типичный протокол 1

Планшет с органической поверхностью (2) помещают на нагревающий держатель (6). Температуры от 50°С до 70°С являются подходящими. Смесь (5), содержащую полимер (3), биомолекулы-зонды (1) и водный раствор соли, наносят в виде пятен на органическую поверхность (2) с помощью стандартного устройства для нанесения пятен ДНК на чип (например, Scienion, Germany). Объемы, наносимые с помощью печати на каждое пятно (7), равны от 0,5 до 4 нл (см. фиг. 2). Жидкость из этих пятен почти сразу испаряется, что приводит к очень быстрому образованию зародышей кристаллов соли (8). После образования зародышей игольчатые кристаллы соли могут простираться по меньшей мере от одного зародыша кристаллизации (9), находящегося в объеме смеси (5), к поверхности (10) смеси (5) (см. фиг. 3). После образования зародышей кристаллов (8) пятна (7) в УФ сшивающем реагенте сразу облучают УФ излучением (11) (см. фиг. 4), так что биомолекулы-зонды (1) ковалентно связываются с полимером (3) и полимер (3) связывается с органической поверхностью (2) и сшивается (см. фиг. 5). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы высушенная, сшитая смесь (5) не поглотила влагу и повторно не стала жидкой.

Затем высушенную, сшитую смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12) для кристаллов (8), так что на местах, на которых находились кристаллы (8), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются каналы (13) (см. фиг. 6). Затем растворитель (12) удаляют. Каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулой-зондом (1) и также с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе.

6.2. Типичный протокол 2

Смесь (5), содержащую полимер (3), биомолекулы-зонды (1) и водный раствор соли, наносят в виде пятен на органическую поверхность (2), находящуюся на планшете, с помощью стандартного устройства для нанесения пятен ДНК на чип (например, Scienion, Germany). Объемы, наносимые с помощью печати на каждое пятно (7), равны от 0,5 до 4 нл (см. фиг. 2). Планшет с пятнами (7) на органической поверхности (2) помещают на охлаждающий держатель (14) (см. фиг. 7). Температуры от 5°С до 15°С являются подходящими. Жидкость этих пятен охлаждают до пересыщения буфера, что почти сразу приводит образованию зародышей кристаллов. После образования зародышей игольчатые кристаллы соли (8) могут простираться по меньшей мере от одного зародыша кристаллизации (9), находящегося в объеме смеси (5), к поверхности (10) смеси (5). После печати эти мишени помещают в печь (например, при 70°С) для полного высыхания. После образования зародышей кристаллов пятна в УФ сшивающем реагенте сразу облучают УФ излучением (11) (см. фиг. 8), так что биомолекулы-зонды (1) ковалентно связываются с полимером (3) и полимер (3) ковалентно связывается с органической поверхностью (2) и сшивается. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы высушенная, сшитая смесь не поглотила влагу и повторно не стала жидкой.

Затем высушенную, сшитую смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12) для растворения кристаллов (8), так что на местах, на которых находились кристаллы (8), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются каналы (13). Затем растворитель (12) удаляют. Каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулой-зондом (1) и с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе.

Как можно видеть на фиг. 9, в сетке (15) можно образовать множество каналов (13). Каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) по меньшей мере до одной точки, расположенной в сетке (15). Каналы (13) можно расположить таким образом, что, начиная от поверхности (16) по направлению к внутренней части, уменьшается боковое расстояние между каналами (13).

6.3. Типичный протокол 3

Смесь (5), содержащую полимер (3), биомолекулы-зонды (1) и водный раствор соли, печатают на органической поверхности (2) планшета при нормальных условиях, при влажности, находящейся в диапазоне 40-80%, предпочтительно 50-70%. Смесь может находиться вблизи от насыщения, например, 400 мМ фосфат натрия, рН 8. Объемы, наносимые с помощью печати на каждое пятно (7), равны от 0,5 до 4 нл. Влажность в камере для печати приводит к тому, что пятна (7) остаются жидкими без образования кристалла (т.е. образование зародышей не происходит). Затем планшет помещают в контейнер, например в картонную коробку. Для переноса на планшет, обладающий органической поверхностью (2), надевают крышки. Затем планшет с пятнами (7) на органической поверхности (2) помещают в сушильную печь или на нагревательную плитку, чтобы быстро вызвать образование зародышей, так что игольчатые кристаллы соли (8) простираются по меньшей мере от одного зародыша кристаллизации (9), находящегося в объеме смеси, по направлению к поверхности (10) смеси (5).

Температура печи/нагревательной плитки должна быть на 20°С или более выше температуры печати. Температуры выше 100°С необязательны.

После сушки смесь облучают для сшивки полимера (3), биомолекул-зондов (1) и органической поверхности (2).

Затем высушенную, сшитую смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12), так что на местах, на которых находились кристаллы (8), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются каналы (13). Затем растворитель (12) удаляют. Каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулами-зондами (1) и с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе. 6.4. Типичный протокол 4

Альтернативно, планшет с пятнами (7) на органической поверхности (2), подготовленный, как описано в типичном протоколе 3, можно охладить для обеспечения образования зародышей, помещая его в холодную камеру с низкой влажностью (например, при температуре <10°С, относительной влажности <40%). Сушку можно провести путем снижения влажности или путем вакуумирования после начала образования зародышей. После образования зародышей игольчатые кристаллы соли (8) могут простираться по меньшей мере от одного зародыша кристаллизации (9), находящегося в объеме смеси (5), по направлению к поверхности (10) смеси (5). Планшет с пятнами (7) на органической поверхности (2) помещают в печь при 60°-70°С на 1 ч для полного высыхания пятна. Пятна (7) облучают УФ излучением с энергией 1,00 Дж при 254 нм в УФ сшивающем реагенте, т.е. Stratalinker 2400. Для этого планшет с пятнами (7) на органической поверхности (2) можно поместить в центр камеры, располагая его короткую сторону параллельно двери камеры. Затем крышку удаляют и начинает действовать сшивающий реагент. После окончания работы прибора массив извлекают и закрывают крышкой.

Альтернативно, можно использовать другие сшивающие при воздействии УФ излучения реагенты при такой же длине волны (например, 240-270 нм) или боле значительных длинах волн, например, 360 нм.

Затем смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12) для растворения кристаллов (8), так что так что на местах, на которых находились кристаллы (8), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются каналы (13). Затем растворитель (12) удаляют. Каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулами-зондами (1) и с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе.

7. ПРИМЕРЫ

7.1. Пример 1: Образование трехмерной полимерной сетки с каналами Исходный раствор полимера 10 мг/мл получают путем растворения 10 мг

сшитого сополимера диметилакриламид - 5% метакрилоилоксибензофенона - 2,5% 4-винилбензолсульфоната натрия в 1,0 мл не содержащей ДНКазы воды. Это делают путем энергичного встряхивания и взбалтывания в течение примерно 5 мин, пока не растворится весь видимый полимер. Затем исходный раствор оборачивают фольгой для защиты от света и помещают в холодильник на ночь для обеспечения полного растворения полимера и уменьшения количества пены. Полимер содержит по меньшей мере две обладающие фотохимической реакционной способностью группы в одной молекуле.

Смесь, включающую полимер, зонды-олигонуклеотиды ДНК и фосфат натрия, получают путем смешивания 10 мкл 100 мкМ исходного раствора зонда-олигонуклеотида ДНК, 5 мкл 10 мг/мл исходного раствора полимера (для обеспечения концентрации полимера в смеси, равной 1 мг/мл) и 35 мкл 500 мМ буфера на основе фосфата натрия, рН 8.

Смесь используют для получения трехмерной сетки, предлагаемой в настоящем изобретении, по методике любого из типичных протоколов 1 - 4.

7.2. Пример 2: Применение трехмерной полимерной сетки для обнаружения бактерий

7.2.1. Получение массива, предлагаемого в настоящем изобретении Олигонуклеотиды для иммобилизации растворяли при концентрации, равной 20 мкМ в 400 мМ буфера на основе фосфата натрия, рН 7, содержащего 1 мг/мл обладающего фотохимической реакционной способностью полимера, описанного в примере 1. Каждый олигонуклеотид включал 30-35 нуклеотидов, комплементарных целевой ДНК, и хвост, включающий 15 тимидинов (весь олигонуклеотид включал 45-50 нуклеотидов).

Смесь использовали для печати следующих пятен на органической поверхности планшета с получением массива:

LL: Так называемые маячки. Су5-меченый ДНК олигонуклеотид (0,2 мкМ), полимер и немеченый олигонуклеотид 19,8 мкМ с обеспечением полной концентрации олигонуклеотида, равной до 20 мкМ.

GN: Олигонуклеотид, специфический по отношению к грамотрицательным бактериям.

GP: Олигонуклеотид, специфический по отношению к грамположительным бактериям.

S.Aure_1: Олигонуклеотид, специфический по отношению к бактериям Staphylococcus aureus.

S.Aure_2: Олигонуклеотид, специфический по отношению к бактериям Staphylococcus aureus.

E.coli_1: Олигонуклеотид, специфический по отношению к бактериям Escherichia coli.

E.coli_2: Олигонуклеотид, специфический по отношению к бактериям Escherichia coli.

Для исключения образования кристаллов соли на планшете-источнике (т.е. планшете, из которого брали смесь) этот планшет держали при температуре окружающей среды (22°С).

96-Луночный планшет Greiner с плоским совершенно прозрачным дном с органической поверхностью охлаждали до 10°С, чтобы исключить высыхание напечатанных пятен. С помощью принтера Scienion® SciFlex 5 с головкой PDC 90 на органической поверхности печатали по 8 капель на пятно, что приводило к объему пятна, равному примерно 1,4 нл. Влажность принтера поддерживали при относительной влажности, равной 60-65%.

Затем с помощью автоматической камеры, установленной на печатающей головке, проверяли размер пятен, чтобы предупредить высушивание или образование кристаллов в пятнах. Все пятна все еще являлись влажными и обладали одинаковым размером. Образование кристаллов не обнаруживалось.

Затем 96-луночный планшет герметично закрывали крышкой для предупреждения высыхания и сразу помещали на нагревательную плитку (70°С) в печи для сушки для инициирования образования кристаллов и сушки пятен.

После выдерживания в течение 1 ч при 70°С для обеспечения надлежащей сушки пятен планшет облучали с энергией 1 Дж при 254 нм в Stratalinker® 2000.

7.2.2. Получение контрольного массива

Использовали процедуру, сходную с описанной в разделе 7.2.1, но планшет-мишень держали при температуре окружающей среды в основном так, как описано в публикации Rendl et al., 2011, Langmuir 27:6116-6123. После печати размеры некоторых пятен были уменьшены, т.е. сразу после печати некоторые из пятен, находящихся в случайных положениях в массиве, высыхали и в них происходило разделение фаз. Затем планшет извлекали из принтера и направляли на процедуру сушки образца, как описано выше, но без крышки, после чего происходила дополнительная сушка.

7.2.3. Исследование гибридизации

Перед использованием планшеты промывали в устройстве для промывки планшетов 3 раза с помощью 300 мкл промывочного буфера (100 мМ фосфат натрия рН 7) и затем буфер заменяли на 1 мМ раствор фосфата натрия, рН 7. Планшеты нагревали в течение 10 мин при 90°С во встряхивающем устройстве с подогревом для экстракции несвязанной ДНК и полимера. Затем буфер заменяли на 100 мМ буфер на основе фосфата натрия с использованием автоматического устройства для промывки 96-луночного планшета.

Смесь 20 мл Су5-меченого продукта ПЦР и 30 мл буфера на основе фосфата натрия (250 мМ, рН 7) инкубировали на массивах в течение 10 мин при 80°С и 30 мин при 55°С во встряхивающем устройстве с подогревом. Затем планшеты трижды промывали 100 мМ буфером на основе фосфата натрия, рН 7, в устройстве для промывки 96-луночного планшета. Планшеты с буфером сканировали в считывающем устройстве Sensovation® Flair и измеряли интенсивности для разных пятен.

7.2.4. Результаты

Исследовали 8 массивов, полученных по методике раздела 7.2.1, и 8 массивов, полученных по методике раздела 7.2.2, и данные обрабатывали с помощью электронной таблицы. Рассчитаны и сопоставлены средние значения и стандартные погрешности средних значений (СПС). Результаты приведены на фиг. 14-16.

8. Пример 3: Повторное использование трехмерных полимерных сеток массива

Несколько массивов получали по методике, описанной в разделе 7.2.1, они включали маячок, содержащий флуоресцентно меченые олигонуклеотиды. Массивы повторно использовали в исследованиях гибридизации и между проведениями гибридизации промывали по следующей методике:

(a) массивы трижды промывали 100 мМ фосфатным буфером, рН 7;

(b) затем буфер заменяли на 1 мМ фосфатный буфер, рН 7; и

(c) затем массивы нагревали до 80°С и промывали в горячем виде 100 мМ фосфатным буфером, рН 7.

Между использованиями определяли интенсивность флуоресцентного сигнала маячка. После 10 использований интенсивность флуоресцентного сигнала уменьшалась менее, чем на 25% от его интенсивности. Массивы повторно использовали, пока интенсивность сигнала эталонного пятна, гибридизированного с эталонной ДНК (внутренний контроль), не уменьшалась на 50%.

9. КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В качестве примеров настоящего изобретения ниже представлены конкретные варианты осуществления.

1. Трехмерная сетка, обладающая поверхностью и внутренней частью, включающая (а) сшитый полимер, (b) один или большее количество каналов и (с) необязательно молекулы-зонды, иммобилизованные в сетке, указанная трехмерная сетка необязательно ковалентно связана с поверхностью субстрата.

2. Трехмерная сетка по варианту осуществления 1, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 10 мкм от поверхности сетки.

3. Трехмерная сетка по варианту осуществления 2, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 9 мкм от поверхности сетки.

4. Трехмерная сетка по варианту осуществления 3, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 8 мкм от поверхности сетки.

5. Трехмерная сетка по варианту осуществления 4, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 7 мкм от поверхности сетки.

6. Трехмерная сетка по варианту осуществления 5, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 6 мкм от поверхности сетки.

7. Трехмерная сетка по варианту осуществления 6, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 5 мкм от поверхности сетки.

8. Трехмерная сетка по варианту осуществления 7, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 4 мкм от поверхности сетки.

9. Трехмерная сетка по варианту осуществления 8, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 3 мкм от поверхности сетки.

10. Трехмерная сетка по варианту осуществления 9, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 2 мкм от поверхности сетки.

11. Трехмерная сетка по варианту осуществления 10, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 1 мкм от поверхности сетки.

12. Трехмерная сетка по варианту осуществления 11, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов простирается во внутреннюю часть от точки на поверхности сетки.

13. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-12, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет не менее 10% от наибольшего размера сетки.

14. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 100% от наибольшего размера сетки.

15. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет не менее 15% от наибольшего размера сетки.

16. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет не менее 20% от наибольшего размера сетки.

17. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14 в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет не менее 25% от наибольшего размера сетки.

18. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 90% от наибольшего размера сетки.

19. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 80% от наибольшего размера сетки.

20. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 70% от наибольшего размера сетки.

21. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 60% от наибольшего размера сетки.

22. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 50% от наибольшего размера сетки.

23. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 40% от наибольшего размера сетки.

24. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 30% от наибольшего размера сетки.

25. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 25% от наибольшего размера сетки.

26. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 20% от наибольшего размера сетки.

27. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 10% до 15% от наибольшего размера сетки.

28. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 15% до 20% от наибольшего размера сетки.

29. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 15% до 25% от наибольшего размера сетки.

30. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 15% до 35% от наибольшего размера сетки.

31. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 20% до 25% от наибольшего размера сетки.

32. Трехмерная сетка по варианту осуществления 13 или варианту осуществления 14, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает длиной, которая составляет от 25% до 30% от наибольшего размера сетки.

33. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-32, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 5 раз больше размера отверстий сетки.

34. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 10 раз больше размера отверстий сетки.

35. Трехмерная сетка по варианту осуществления 34, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 15 раз больше размера отверстий сетки.

36. Трехмерная сетка по варианту осуществления 35, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 20 раз больше размера отверстий сетки.

37. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 5-10 раз больше размера отверстий сетки.

38. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 5-15 раз больше размера отверстий сетки.

39. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 5-20 раз больше размера отверстий сетки.

40. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 5-25 раз больше размера отверстий сетки.

41. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 5-30 раз больше размера отверстий сетки.

42. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 10-15 раз больше размера отверстий сетки.

43. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 10-20 раз больше размера отверстий сетки.

44. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 10-25 раз больше размера отверстий сетки.

45. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 10-30 раз больше размера отверстий сетки.

46. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 15-20 раз больше размера отверстий сетки.

47. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 15-25 раз больше размера отверстий сетки.

48. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 15-30 раз больше размера отверстий сетки.

49. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 20-25 раз больше размера отверстий сетки.

50. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 20-30 раз больше размера отверстий сетки.

51. Трехмерная сетка по варианту осуществления 33, в которой по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладает минимальным сечением, которое 25-30 раз больше размера отверстий сетки.

52. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-51, включающая множество каналов.

53. Трехмерная сетка по варианту осуществления 52, в которой множество каналов составляет не менее 5 каналов.

54. Трехмерная сетка по варианту осуществления 53, в которой множество каналов составляет не менее 10 каналов.

55. Трехмерная сетка по варианту осуществления 54, в которой множество каналов составляет не менее 15 каналов.

56. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 52-55, в которой множество каналов составляет до 50 каналов.

57. Трехмерная сетка по варианту осуществления 52, в которой множество каналов составляет от 10 до 50 каналов.

58. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 52-57, в которой множество каналов сходится в точке во внутренней части сетки, так что боковое расстояние между каналами уменьшается при переходе от поверхности к точке во внутренней части.

59. Трехмерная сетка по варианту осуществления 58, в которой множество каналов соединены в точке их схождения.

60. Трехмерная сетка по варианту осуществления 58, в которой большинство каналов в сетке сходится в одной или большем количестве точек во внутренней части сетки, так что боковое расстояние между каналами уменьшается при переходе от поверхности к точке во внутренней части.

61. Трехмерная сетка по варианту осуществления 60, в которой множество каналов, которые сходятся в одной и той же точке во внутренней части сетки, соединены в точке их схождения.

62. Трехмерная сетка по варианту осуществления 60, в которой большинство каналов в сетке соединены с другими каналами в одной или большем количестве точек схождения в сетке.

63. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 52-62, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 10 мкм от поверхности сетки.

64. Трехмерная сетка по варианту осуществления 63, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 9 мкм от поверхности сетки.

65. Трехмерная сетка по варианту осуществления 64, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 8 мкм от поверхности сетки.

66. Трехмерная сетка по варианту осуществления 65, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 7 мкм от поверхности сетки.

67. Трехмерная сетка по варианту осуществления 66, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 6 мкм от поверхности сетки.

68. Трехмерная сетка по варианту осуществления 67, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 5 мкм от поверхности сетки.

69. Трехмерная сетка по варианту осуществления 68, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 4 мкм от поверхности сетки.

70. Трехмерная сетка по варианту осуществления 69, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 3 мкм от поверхности сетки.

71. Трехмерная сетка по варианту осуществления 70, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 2 мкм от поверхности сетки.

72. Трехмерная сетка по варианту осуществления 71, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 1 мкм от поверхности сетки.

73. Трехмерная сетка по варианту осуществления 72, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке простирается во внутреннюю часть от точки на поверхности сетки.

74. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 52-73, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет не менее 10% от наибольшего размера сетки.

75. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 100% от наибольшего размера сетки.

76. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет не менее 15% от наибольшего размера сетки.

77. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет не менее 20% от наибольшего размера сетки.

78. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет не менее 25% от наибольшего размера сетки.

79. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 90% от наибольшего размера сетки.

80. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 80% от наибольшего размера сетки.

81. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 70% от наибольшего размера сетки.

82. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 60% от наибольшего размера сетки.

83. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 50% от наибольшего размера сетки.

84. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 40% от наибольшего размера сетки.

85. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 30% от наибольшего размера сетки.

86. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 25% от наибольшего размера сетки.

87. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 20% от наибольшего размера сетки.

88. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 10% до 15% от наибольшего размера сетки.

89. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 15% до 20% от наибольшего размера сетки.

90. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 15% до 25% от наибольшего размера сетки.

91. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 15% до 30% от наибольшего размера сетки.

92. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 20% до 25% от наибольшего размера сетки.

93. Трехмерная сетка по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает длиной, которая составляет от 25% до 30% от наибольшего размера сетки.

94. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 52-93, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 5 раз больше размера отверстий сетки.

95. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 10 раз больше размера отверстий сетки.

96. Трехмерная сетка по варианту осуществления 95, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 15 раз больше размера отверстий сетки.

97. Трехмерная сетка по варианту осуществления 96, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 20 раз больше размера отверстий сетки.

98. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 5-10 раз больше размера отверстий сетки.

99. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 5-15 раз больше размера отверстий сетки.

100. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 5-20 раз больше размера отверстий сетки.

101. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 5-25 раз больше размера отверстий сетки.

102. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 5-30 раз больше размера отверстий сетки.

103. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 10-15 раз больше размера отверстий сетки.

104. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 10-20 раз больше размера отверстий сетки.

105. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 10-25 раз больше размера отверстий сетки.

106. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 10-30 раз больше размера отверстий сетки.

107. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 15-20 раз больше размера отверстий сетки.

108. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 15-25 раз больше размера отверстий сетки.

109. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 15-30 раз больше размера отверстий сетки.

110. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 20-25 раз больше размера отверстий сетки.

111. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 20-30 раз больше размера отверстий сетки.

112. Трехмерная сетка по варианту осуществления 94, в которой по меньшей мере множество каналов или в которой большинство каналов в сетке обладает минимальным сечением, которое 25 - 30 раз больше размера отверстий сетки.

113. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-112, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 5 нм - 75 нм.

114. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 10 нм - 50 нм.

115. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 10 нм - 40 нм.

116. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 10 нм до 30 нм.

117. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 10 нм до 20 нм.

118. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 20 нм до 50 нм.

119. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 20 нм до 40 нм.

120. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 20 нм до 30 нм.

121. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 30 нм до 50 нм.

122. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 30 нм до 40 нм.

123. Трехмерная сетка по варианту осуществления 113, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером 40 нм до 50 нм.

124. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-123, в которой сшитый полимер представляет собой набухающий в воде полимер.

125. Трехмерная сетка по варианту осуществления 124, в которой набухающий в воде полимер может абсорбировать массу деионизованной дистиллированной воды, до 50 раз превышающую его массу.

126. Трехмерная сетка по варианту осуществления 124 или варианту осуществления 125, в которой набухающий в воде полимер может абсорбировать объем деионизованной дистиллированной воды, в 5-50 раз превышающий его объем.

127. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 124-126, в которой набухающий в воде полимер может абсорбировать массу физиологического раствора, до 30 раз превышающую его массу.

128. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 124-127, в которой набухающий в воде полимер может абсорбировать объем физиологического раствора, в 4-30 раз превышающий его объем.

129. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-128, в которой сшитый полимер включает сшитый гомополимер.

130. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-128, в которой сшитый полимер включает сшитый сополимер.

131. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-128, в которой сшитый полимер включает сшитую смесь гомополимера и сополимера.

132. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 129-131, в которой сшитый полимер включает полимер, полимеризованный из одного или большего количества типов мономеров.

133. Трехмерная сетка по варианту осуществления 132, в которой каждый тип мономера содержит полимеризующуюся группу, независимо выбранную из группы, включающей акрилатную группу, метакрилатную группу, этакрилатную группу, 2-фенилакрилатную группу, акриламидную группу, метакриламидную группу, итаконатную группу и стирольную группу.

134. Трехмерная сетка по варианту осуществления 133, в которой по меньшей мере один тип мономера в полимере содержит метакрилатную группу.

135. Трехмерная сетка по варианту осуществления 134, в которой по меньшей мере один тип мономера, содержащий метакрилатную группу, представляет собой метакрилоилоксибензофенон (МАБФ).

136. Трехмерная сетка по варианту осуществления 132, в которой сшитый полимер включает сополимер, полученный сополимеризацией диметилакриламида (ДМАА), метакрилоилоксибензофенона (МАБФ) и 4-винилбензолсульфоната натрия (SSNa).

137. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-136, в которой молекулы-зонды ковалентно связаны с сеткой.

138. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-137, в которой большинство молекул-зондов иммобилизовано во внутренней части сетки.

139. Трехмерная сетка по варианту осуществления 138, в которой по меньшей мере часть молекул-зондов соприкасается с каналом.

140. В различных вариантах осуществления плотность зондов по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% больше на границе раздела между полимером и каналами, чем на участках полимера, не соседних с каналом.

141. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-139, в которой плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами в среднем по меньшей мере на 10% больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом.

142. Трехмерная сетка по варианту осуществления 140, в которой плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами в среднем по меньшей мере на 20% больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом.

143. Трехмерная сетка по варианту осуществления 140, в которой плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами в среднем по меньшей мере на 30% больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом.

144. Трехмерная сетка по варианту осуществления 140, в которой плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами в среднем по меньшей мере на 40% больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом.

145. Трехмерная сетка по варианту осуществления 140, в которой плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами в среднем по меньшей мере на 50% больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом.

146. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-145, в которой молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту, производное нуклеиновой кислоты, пептид, полипептид, белок, углевод, липид, клетку, лиганд или их комбинацию, предпочтительно в которой молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты.

147. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-146, в которой молекулы-зонды включает антитело, фрагмент антитела, антиген, эпитоп, фермент, субстрат фермента, ингибитор фермента, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

148. Трехмерная сетка по любому из вариантов осуществления 1-147, в которой молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту.

149. Трехмерная сетка по варианту осуществления 148, в которой нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид.

150. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 12 до 30 нуклеотидов.

151. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 14 до 30 нуклеотидов.

152. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 14 до 25 нуклеотидов.

153. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 14 до 20 нуклеотидов.

154. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 15 до 30 нуклеотидов.

155. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 15 до 25 нуклеотидов.

156. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 15 до 20 нуклеотидов.

157. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 16 до 30 нуклеотидов.

158. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 16 до 25 нуклеотидов.

159. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 16 до 20 нуклеотидов.

160. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 15 до 40 нуклеотидов.

161. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 15 до 45 нуклеотидов.

162. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 15 до 50 нуклеотидов.

163. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 15 до 60 нуклеотидов.

164. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 20 до 55 нуклеотидов.

165. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 18 до 60 нуклеотидов.

166. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 20 до 50 нуклеотидов.

167. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 30 до 90 нуклеотидов.

168. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 20 до 100 нуклеотидов.

169. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 20 до 60 нуклеотидов.

170. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 40 до 80 нуклеотидов.

171. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 40 до 100 нуклеотидов.

172. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 20 до 120 нуклеотидов.

173. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 20 до 40 нуклеотидов.

174. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 40 до 60 нуклеотидов.

175. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 60 до 80 нуклеотидов.

176. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 80 до 100 нуклеотидов.

177. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 100 до 120 нуклеотидов.

178. Трехмерная сетка по варианту осуществления 149, в которой олигонуклеотид включает от 12 до 150 нуклеотидов.

179. Массив, включающий множество трехмерных сеток по любому из вариантов осуществления 1-178 на субстрате.

180. Массив по варианту осуществления 179, в котором трехмерные сетки иммобилизованы на субстрате.

181. Массив по варианту осуществления 180, в котором трехмерные сетки иммобилизованы на субстрате с помощью ковалентных связей между сетками и субстратом.

182. Массив по любому из вариантов осуществления 179-181, в котором субстрат включает органический полимер или неорганический материал, содержащий самоагрегированный монослой органических молекул на поверхности неорганического материала.

183. Массив по варианту осуществления 182, в котором субстрат включает органический полимер, выбранный из группы, включающей сополимеры циклоолефинов, полистирол, полиэтилен, полипропилен и полиметилметакрилат.

184. Массив по варианту осуществления 183, в котором субстрат включает сополимер циклоолефина, полистирол или полиметилметакрилат.

185. Массив по варианту осуществления 182, в котором субстрат включает неорганический материал, содержащий алкилсилановый самоагрегированный монослой на поверхности неорганического материала.

186. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 8 трехмерных сеток.

187. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 16 трехмерных сеток.

188. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 24 трехмерных сеток.

189. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 48 трехмерных сеток.

190. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 96 трехмерных сеток.

191. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 128 трехмерных сеток.

192. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 256 трехмерных сеток.

193. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 512 трехмерных сеток.

194. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает не менее 1024 трехмерных сеток.

195. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает от 24 до 8192 трехмерных сеток.

196. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает от 24 до 4096 трехмерных сеток.

197. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает от 24 до 2048 трехмерных сеток.

198. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает от 24 до 1024 трехмерных сеток.

199. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает 24 трехмерные сетки.

200. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает 48 трехмерных сеток.

201. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает 96 трехмерных сеток.

202. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает 128 трехмерных сеток.

203. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает 256 трехмерных сеток.

204. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает 512 трехмерных сеток.

205. Массив по любому из вариантов осуществления 179-185, который включает 1024 трехмерные сетки.

206. Массив по любому из вариантов осуществления 179-205, в котором каждая из трехмерных сеток находится в отдельном пятне на субстрате.

207. Массив по варианту осуществления 206, в котором пятна расположены в столбцах и/или строках.

208. Массив по любому из вариантов осуществления 179-207, в котором субстрат включает микропланшет и трехмерные сетки расположены в лунках планшета.

209. Массив по любому из вариантов осуществления 179-208, в котором множество трехмерных сеток включает две или большее количество трехмерных сеток, включающих разные типы молекул-зондов.

210. Массив по любому из вариантов осуществления 179-209, в котором множество трехмерных сеток включает две или большее количество трехмерных сеток, включающих одинаковые типы молекул-зондов.

211. Массив по любому из вариантов осуществления 179-210, в котором большинство трехмерных включает одинаковые типы молекул-зондов или в котором все трехмерные сетки включают одинаковые типы молекул-зондов.

212. Массив по любому из вариантов осуществления 179-211, в котором множество трехмерных сеток включает одну или большее количество трехмерных сеток, включающих меченые контрольные молекулы-зонды.

213. Массив по варианту осуществления 212, в котором меченые контрольные молекулы-зонды являются флуоресцентно мечеными.

214. Массив по варианту осуществления 212 или варианту осуществления 213, в котором по меньшей мере одна контрольная молекула зонда предназначена для пространственного контроля.

215. Массив по любому из вариантов осуществления 179-214, который можно использовать повторно.

216. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 5 раз.

217. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 10 раз.

218. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 20 раз.

219. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 30 раз.

220. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 40 раз.

221. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 50 раз.

222. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 60 раз.

223. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 70 раз.

224. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 80 раз.

225. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 90 раз.

226. Массив по варианту осуществления 215, который можно использовать повторно не менее 100 раз.

227. Массив по любому из вариантов осуществления 215-226, в котором по меньшей мере одна трехмерная сетка предназначена для контроля возможности повторного использования.

228. Массив по варианту осуществления 227, в котором для контроля возможности повторного использования используют флуоресцентно меченый зонд.

229. Массив по варианту осуществления 228, в котором контроль возможности повторного использования также представляет собой пространственный контроль.

230. Способ получения трехмерной сетки, обладающей поверхностью и внутренней частью, включающей (а) сшитый полимер и (b) один или большее количество каналов, включающий:

(а) обработку смеси при условиях, обеспечивающих образование кристаллов соли, указанная смесь включает (i) водный раствор соли (ii), полимер и (iii) сшивающий реагент и необязательно расположена на поверхности субстрата, тем самым образование смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли;

(b) обработку смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли, при условиях, обеспечивающих сшивку, тем самым образование сшитой полимерной сетки, содержащей один или большее количество кристаллов соли; и

(c) взаимодействие сшитой полимерной сетки, содержащей один или большее количество кристаллов соли, с растворителем, в котором растворим один или большее количество кристаллов соли, тем самым растворение кристаллов соли и образование одного или большего количества каналов вместо кристаллов соли; тем самым образование трехмерной сетки, включающей сшитый полимер и один или большее количество каналов.

231. Способ по варианту осуществления 230, в котором условия, обеспечивающие образование соли, включают образование одного или большего количества игольчатых кристаллов.

232. Способ по варианту осуществления 230 или варианту осуществления 231, в котором по меньшей мере один из одного или большего количества каналов обладают характеристиками каналов сеток по любому из вариантов осуществления 2-51.

233. Способ по варианту осуществления 230 или варианту осуществления 231, в котором получают трехмерную сетку, обладающую поверхностью и внутренней частью, включающую (а) сшитый полимер и (b) множество каналов.

234. Способ по варианту осуществления 233, в котором множество каналов обладает характеристиками множества каналов сеток по любому из вариантов осуществления 53-112.

235. Способ по любому из вариантов осуществления 230-234, в котором условия, обеспечивающие образование соли, включают дегидратацию смеси.

236. Способ по варианту осуществления 235, который включает дегидратацию смеси путем нагревания смеси, вакуумирования смеси, снижения влажности атмосферы вокруг смеси или их комбинации.

237. Способ по варианту осуществления 236, который включает дегидратацию смеси путем вакуумирования смеси.

238. Способ по варианту осуществления 236, который включает дегидратацию смеси путем нагревания смеси.

239. Способ по варианту осуществления 238, в котором нагревание смеси включает взаимодействие смеси с газом, температура которого выше температуры смеси.

240. Способ по любому из вариантов осуществления 230-234, в котором условия, обеспечивающие образование соли, включают охлаждение смеси, пока смесь не станет пересыщена солью.

241. Способ по варианту осуществления 240, который включает охлаждение смеси путем взаимодействия смеси с газом, температура которого ниже температуры смеси.

242. Способ по любому из вариантов осуществления 230-241, в котором температуру смеси на стадии (а) поддерживают выше температуры точки росы атмосферы вокруг смеси.

243. Способ по любому из вариантов осуществления 230-242, в котором сшивающий реагент активируют ультрафиолетовым (УФ) излучением и условия, обеспечивающие сшивку, включают обработку смеси ультрафиолетовым излучением.

244. Способ по любому из вариантов осуществления 230-242, в котором сшивающий реагент активируют излучением в видимой области спектра и условия, обеспечивающие сшивку, включают обработку смеси излучением в видимой области спектра.

245. Способ по любому из вариантов осуществления 230-242, в котором сшивающий реагент активируют нагреванием и условия, обеспечивающие сшивку, включают нагревание смеси.

246. Способ по любому из вариантов осуществления 230-245, в котором водный раствор соли включает одновалентные катионы.

247. Способ по варианту осуществления 246, в котором одновалентные катионы включают Na⁺и/или K⁺, предпочтительно в котором одновалентные катионы включают Na⁺и K⁺.

248. Способ по варианту осуществления 247, в котором водный раствор соли включает раствор, полученный методике, включающей растворение гидрофосфата натрия, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата калия, дигидрофосфата калия или их комбинации в воде или водном растворе.

249. Способ по любому из вариантов осуществления 230-248, в котором полимер представляет собой растворимый в воде полимер.

250. Способ по любому из вариантов осуществления 230-249, в котором полимер включает гомополимер.

251. Способ по любому из вариантов осуществления 230-249, в котором полимер включает сополимер.

252. Способ по любому из вариантов осуществления 230-249, в котором полимер включает смесь гомополимера и сополимера.

253. Способ по любому из вариантов осуществления 249-252, в котором полимер включает полимер, полимеризованный из одного или большего количества типов мономеров.

254. Способ по варианту осуществления 253, в котором каждый тип мономера содержит полимеризующуюся группу, независимо выбранную из группы, включающей акрилатную группу, метакрилатную группу, этакрилатную группу, 2-фенилакрилатную группу, акриламидную группу, метакриламидную группу, итаконатную группу и стирольную группу.

255. Способ по варианту осуществления 254, в котором по меньшей мере один тип мономера в полимере содержит метакрилатную группу.

256. Способ по варианту осуществления 255, в котором по меньшей мере один тип мономера, содержащий метакрилатную группу, представляет собой метакрилоилоксибензофенон (МАБФ).

257. Способ по варианту осуществления 253, в котором полимер включает сополимер, полученный сополимеризацией диметилакриламида (ДМАА), метакрилоилоксибензофенона (МАБФ) и 4-винилбензолсульфоната натрия (SSNa).

258. Способ по любому из вариантов осуществления 230-257, в котором полимер представляет собой сополимер, включающий сшивающий реагент.

259. Способ по варианту осуществления 258, в котором полимер включает по меньшей мере два сшивающие реагенты в одной молекуле полимера.

260. Способ по любому из вариантов осуществления 230-259, в котором сшивающий реагент выбран из группы, включающей бензофенон, тиоксантон, бензоиновый простой эфир, этилэозин, эозин Y, бенгальский розовый, камфорхинон, эритрозин, 4,4'-азобис(4-циклопентановую) кислоту 2,2-азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан]дигидрохлорид и бензоилпероксид.

261. Способ по варианту осуществления 260, в котором сшивающим реагентом является бензофенон.

262. Способ по любому из вариантов осуществления 230-261, в котором растворителем является вода или буфер на водной основе.

263. Способ по варианту осуществления 262, в котором растворителем является вода.

264. Способ по варианту осуществления 262, в котором растворителем является буфер на водной основе.

265. Способ по варианту осуществления 264, в котором буфер на водной основе включает фосфат, метанол, этанол, пропанол или их смесь.

266. Способ по любому из вариантов осуществления 230-265, в котором смесь на стадии (а) дополнительно включает молекулы-зонды.

267. Способ по варианту осуществления 266, в котором по меньшей мере некоторые, большинство или все молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту, производное нуклеиновой кислоты, пептид, полипептид, белок, углевод, липид, клетку, лиганд или их комбинацию.

268. Способ по варианту осуществления 267, в котором по меньшей мере некоторые из молекул-зондов включают нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты.

269. Способ по варианту осуществления 267, в котором по меньшей мере большинство молекул-зондов включают нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты.

270. Способ по варианту осуществления 267, в котором все молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты.

271. Способ по варианту осуществления 266, в котором по меньшей мере некоторые, большинство или все молекулы-зонды включает антитело, фрагмент антитела, антиген, эпитоп, фермент, субстрат фермента, ингибитор фермента, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

272. Способ по варианту осуществления 271, в котором по меньшей мере некоторые из молекул-зондов включают нуклеиновую кислоту.

273. Способ по варианту осуществления 271, в котором по меньшей мере большинство молекул-зондов включает нуклеиновую кислоту.

274. Способ по варианту осуществления 271, в котором все молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту.

275. Способ по любому из вариантов осуществления 272-274, в котором нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид.

276. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 12 до 30 нуклеотидов.

277. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 14 до 30 нуклеотидов.

278. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 14 до 25 нуклеотидов.

279. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 14 до 20 нуклеотидов.

280. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 30 нуклеотидов.

281. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 25 нуклеотидов.

282. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 20 нуклеотидов.

283. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 16 до 30 нуклеотидов.

284. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 16 до 25 нуклеотидов.

285. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 16 до 20 нуклеотидов.

286. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 40 нуклеотидов.

287. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 45 нуклеотидов.

288. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 50 нуклеотидов.

289. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 60 нуклеотидов.

290. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 55 нуклеотидов.

291. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 18 до 60 нуклеотидов.

292. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 50 нуклеотидов.

293. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 30 до 90 нуклеотидов.

294. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 100 нуклеотидов.

295. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 120 нуклеотидов.

296. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 40 нуклеотидов.

297. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 60 нуклеотидов.

298. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 40 до 80 нуклеотидов.

299. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 40 до 100 нуклеотидов.

300. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 40 до 60 нуклеотидов.

301. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 60 до 80 нуклеотидов.

302. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 80 до 100 нуклеотидов.

303. Способ по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 100 до 120 нуклеотидов.

304. Способ от по варианту осуществления 275, в котором олигонуклеотид включает от 12 до 150 нуклеотидов.

305. Способ по любому из вариантов осуществления 230-304, дополнительно включающий до стадии (а) стадию нанесения смеси на поверхность субстрата.

306. Способ по варианту осуществления 305, в котором смесь наносят в объеме, равном от 100 пл до 5 нл.

307. Способ по варианту осуществления 305, в котором смесь наносят в объеме, равном от 100 пл до 1 нл.

308. Способ по варианту осуществления 305, в котором смесь наносят в объеме, равном от 200 пл до 1 нл.

309. Способ по любому из вариантов осуществления 305-308, в котором стадия нанесения смеси на субстрат включает распыление смеси на поверхность субстрата.

310. Способ по варианту осуществления 309, в котором смесь распыляют с помощью струйного принтера.

311. Способ по любому из вариантов осуществления 305-310, в котором субстрат включает органический полимер или неорганический материал, содержащий самоагрегированный монослой органических молекул на поверхности.

312. Способ по варианту осуществления 311, в котором субстрат включает органический полимер.

313. Способ по варианту осуществления 312, в котором органический полимер выбран из группы, включающей сополимеры циклоолефинов, полистирол, полиэтилен, полипропилен и полиметилметакрилат.

314. Способ по варианту осуществления 313, в котором субстрат включает полиметилметакрилат, полистирол или сополимеры циклоолефинов.

315. Способ по варианту осуществления 311, в котором субстрат включает неорганический материал, содержащий алкилсилановый самоагрегированный монослой на поверхности.

316. Способ по любому из вариантов осуществления 305-315, в котором субстрат включает микропланшет.

317. Способ по любому из вариантов осуществления 305-316, в котором полимер сшивают с поверхностью на стадии (b).

318. Способ по варианту осуществления 317, в котором получают набухающий в воде полимер, который сшивают с поверхностью.

319. Способ по варианту осуществления 318, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать массу деионизованной дистиллированной воды, до 50 раз превышающую его массу.

320. Способ по варианту осуществления 318 или варианту осуществления 319, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать объем деионизованной дистиллированной воды, в 5 - 50 раз превышающий его объем.

321. Способ по любому из вариантов осуществления 318-320, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать массу физиологического раствора, до 30 раз превышающую его массу.

322. Способ по любому из вариантов осуществления 318-321, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать объем физиологического раствора, в 4-30 раз превышающий его объем.

323. Способ получения массива, включающий образование множества трехмерных сеток способом по любому из вариантов осуществления 230-322 на отдельных пятнах на поверхности одного того же субстрата.

324. Способ по варианту осуществления 323, в котором трехмерные сетки образуются одновременно.

325. Способ по варианту осуществления 323, в котором трехмерные сетки образуются последовательно.

326. Способ по любому из вариантов осуществления 323-325, дополнительно включающий сшивку множества трехмерных сеток с поверхностью субстрата.

327. Способ получения массива, включающий размещение множества трехмерных сеток (а) по любому из вариантов осуществления 1-178 или (b) полученных или получаемых способом по любому из вариантов осуществления 230-322, на отдельных пятнах на поверхности одного и того же субстрата.

328. Способ по любому из вариантов осуществления 323-327, дополнительно включающий сшивку множества трехмерных сеток с поверхностью.

329. Способ получения массива, включающий размещение множества трехмерных сеток, полученных или получаемых способом по любому из вариантов осуществления 305-322, на отдельных пятнах на поверхности одного и того же субстрата.

330. Способ по варианту осуществления 329, в котором размещение включает нанесение смесей, из которых образуются трехмерные сетки, на отдельные пятна.

331. Способ по любому из вариантов осуществления 323-330, в котором пятна расположены в столбцах и/или строках.

332. Трехмерная сетка, полученная или получаемая способом по любому из вариантов осуществления 230-322.

333. Массив, включающий множество трехмерных сеток по варианту осуществления 332 на субстрате.

334. Массив, полученный или получаемый способом по любому из вариантов осуществления 323-331.

335. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 8 трехмерных сеток.

336. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 16 трехмерных сеток.

337. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 24 трехмерных сеток.

338. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 48 трехмерных сеток.

339. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 96 трехмерных сеток.

340. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 128 трехмерных сеток.

341. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 256 трехмерных сеток.

342. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 512 трехмерных сеток.

343. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает не менее 1024 трехмерных сеток.

344. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает от 24 до 8192 трехмерных сеток.

345. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает от 24 до 4096 трехмерных сеток.

346. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает от 24 до 2048 трехмерных сеток.

347. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает от 24 до 1024 трехмерных сеток.

348. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает 24 трехмерные сетки.

349. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает 48 трехмерных сеток.

350. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает 96 трехмерных сеток.

351. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает 128 трехмерных сеток.

352. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает 256 трехмерных сеток.

353. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает 512 трехмерных сеток.

354. Массив по варианту осуществления 333 или варианту осуществления 334, который включает 1024 трехмерные сетки.

355. Массив по любому из вариантов осуществления 333-354, в котором трехмерные сетки включают молекулы-зонды и две или большее количество из трехмерных сеток включают разные типы молекул-зондов.

356. Массив по любому из вариантов осуществления 333-355, в котором трехмерные сетки включают молекулы-зонды и две или большее количество трехмерных включают одинаковые типы молекул-зондов.

357. Массив по любому из вариантов осуществления 333-354, в котором трехмерные сетки включают молекулы-зонды и каждая из трехмерных включает одинаковые типы молекул-зондов.

358. Массив по любому из вариантов осуществления 333-357, в котором множество трехмерных сеток включает одну или большее количество трехмерных сеток, включающих меченые контрольные молекулы-зонды.

359. Массив по варианту осуществления 358, в котором меченые контрольные молекулы-зонды являются флуоресцентно мечеными.

360. Массив по любому из вариантов осуществления 333-359, в котором субстрат включает микропланшет и каждая лунка микропланшета содержит не более одной трехмерной сетки.

361. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце, включающий:

(a) взаимодействие трехмерной сетки по любому из вариантов осуществления 1-178 или 332 или массива по любому из вариантов осуществления 179-229 или 333-360, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом, с образцом; и

(b) обнаружение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в трехмерной сетке или массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в образце.

362. Способ по варианту осуществления 361, который дополнительно включает промывку сетки или массива, включающего молекулы-зонды, между стадиями (а) и (b).

363. Способ по варианту осуществления 361 или варианту осуществления 362, который дополнительно включает взаимодействие сетки или массива, включающего молекулы-зонды, с блокирующим реагентом до стадии (а).

364. Способ по любому из вариантов осуществления 361-363, дополнительно включающий определение количества анализируемого вещества, связанного с трехмерной сеткой или массивом, включающим молекулы-зонды.

365. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов, включающий:

(a) взаимодействие массива по любому из вариантов осуществления 179-229 или 333-360, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом, с образцом; и

(b) обнаружение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов.

366. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов, включающий:

(a) взаимодействие массива по любому из вариантов осуществления 179-229 или 333-360, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом, с образцом, и включающего контрольные молекулы-зонды, в котором массив использовали и промывали до стадии (а); и

(b) обнаружение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов.

367. Способ определения того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества, включающий:

(a) взаимодействие массива по любому из вариантов осуществления 179-229 или 333-360, содержащих разные типы молекул-зондов, которые способны связываться с разными типами анализируемых веществ, с образцом; и

(b) обнаружение связывания анализируемых веществ с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества.

368. Способ определения того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества, включающий:

(a) взаимодействие массива по любому из вариантов осуществления 179-229 или 333-360, включающего разные типы молекул-зондов, которые способны связываться с разными типами анализируемых веществ, с образцом, и включающего контрольные молекулы-зонды, в котором массив использовали и промывали до стадии (а); и

(b) обнаружение связывания анализируемых веществ с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества.

369. Способ по любому из вариантов осуществления 365-368, в котором:

(a) субстрат массива включает микропланшет;

(b) каждая лунка микропланшета содержит не более одной трехмерной сетки; и

(c) взаимодействие массива с образцами включает взаимодействие каждой лунки не более, чем с одним образцом.

370. Способ по любому из вариантов осуществления 365-369, который дополнительно включает промывку массива, включающего молекулы-зонды, между стадиями (а) и (b).

371. Способ по любому из вариантов осуществления 365-370, который дополнительно включает взаимодействие массива, включающего молекулы-зонды, с блокирующим реагентом до стадии (а).

372. Способ по любому из вариантов осуществления 365-371, дополнительно включающий определение количества анализируемого вещества или анализируемых веществ, связанных с массивом.

373. Способ по любому из вариантов осуществления 361-372, дополнительно включающий повторное использование массива.

374. Способ по варианту осуществления 373, в котором массив повторно используют не менее 5 раз.

375. Способ по варианту осуществления 373, в котором массив повторно используют не менее 10 раз.

376. Способ по варианту осуществления 373, в котором массив повторно используют не менее 20 раз.

377. Способ по варианту осуществления 373, в котором массив повторно используют не менее 30 раз.

378. Способ по варианту осуществления 373, в котором массив повторно используют не менее 40 раз.

379. Способ по варианту осуществления 373, в котором массив повторно используют не менее 50 раз.

380. Способ по варианту осуществления 374, который включает повторное использование массива от 5 до 20 раз.

381. Способ по варианту осуществления 374, который включает повторное использование массива от 5 до 30 раз.

382. Способ по варианту осуществления 374, который включает повторное использование массива от 10 до 50 раз.

383. Способ по варианту осуществления 374, который включает повторное использование массива от 10 до 20 раз.

384. Способ по варианту осуществления 374, который включает повторное использование массива от 10 до 30 раз.

385. Способ по варианту осуществления 374, который включает повторное использование массива от 20 до 40 раз.

386. Способ по варианту осуществления 374, который включает повторное использование массива от 40 до 50 раз.

387. Способ по любому из вариантов осуществления 373-386, который включает промывку массива между повторными использованиями.

388. Способ по варианту осуществления 387, в котором массив промывают при условиях, обеспечивающих денатурацию.

389. Способ по варианту осуществления 388, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива.

390. Способ по варианту осуществления 388, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают обработку массива солью в низких концентрациях.

391. Способ по варианту осуществления 388, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива и обработку массива солью в низких концентрациях.

392. Способ по варианту осуществления 388, в котором обработку при условиях, обеспечивающих денатурацию, исключают перед повторным использованием.

393. Способ по варианту осуществления 392, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива, и в котором температуру снижают перед повторным использованием.

394. Способ по варианту осуществления 392, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают обработку массива солью в низких концентрациях и в котором концентрацию соли повышают перед повторным использованием.

395. Способ по варианту осуществления 392, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива и обработку массива солью в низких концентрациях и в котором температуру снижают и концентрацию соли повышают перед повторным использованием.

396. Способ по любому из вариантов осуществления 373-395, в котором массив включает по меньшей мере одну трехмерную сетку, включающую флуоресцентно меченый олигонуклеотид, для контроля возможности повторного использования.

397. Способ по варианту осуществления 396, который включает определение интенсивности сигнала флуоресценции.

398. Способ по варианту осуществления 397, в котором интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования после 10 использований составляет не менее 70% от исходного значения.

399. Способ по варианту осуществления 398, в котором интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования после 20 использований составляет не менее 50% от исходного значения.

400. Способ по любому из вариантов осуществления 396-399, в котором массив больше повторно не используют после того, как интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования станет составлять менее 50% от исходного значения.

401. Способ по любому из вариантов осуществления 361-400, в котором анализируемым веществом является нуклеиновая кислота.

402. Способ по варианту осуществления 401, в котором нуклеиновая кислота представляет собой ампликон полимеразной цепной реакции (ПЦР).

403. Способ по варианту осуществления 401, в котором ампликон ПЦР амплифицирован из биологического образца или образца окружающей среды.

404. Способ по варианту осуществления 403, в котором ампликон ПЦР амплифицирован из биологического образца.

405. Способ по варианту осуществления 403, в котором ампликон ПЦР амплифицирован из образца окружающей среды.

406. Способ по варианту осуществления 404, в котором биологическим образцом является кровь, сыворотка, плазма, ткань, клетки, слюна, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, молоко, слезы, кал, пот, сперма, цельные клетки, компонент клетки, клеточный мазок или их экстракт или производное.

407. Способ по варианту осуществления 406, в котором биологическим образцом является кровь, сыворотка или плазма млекопитающего или их экстракт.

408. Способ по варианту осуществления 407, в котором биологическим образцом является кровь, сыворотка или плазма человека или крупного рогатого скота или их экстракт.

409. Способ по варианту осуществления 406, в котором биологическим образцом является молоко или его экстракт.

410. Способ по варианту осуществления 409, в котором биологическим образцом является коровье молоко или его экстракт.

411. Способ по любому из вариантов осуществления 401-410, в котором нуклеиновая кислота является меченой.

412. Способ по варианту осуществления 411, в котором нуклеиновая кислота является флуоресцентно меченой.

413. Трехмерная сетка (15), обладающая поверхностью (16) и внутренней частью, включающая:

(a) сшитый полимер (3), ковалентно связанный с поверхностью (2) субстрата;

(b) один или большее количество каналов (13); и

(c) молекулы-зонды, иммобилизованные (1) в сетке (15), необязательно в которой

(i) молекулы-зонды (1) ковалентно связаны с сеткой (15) и/или

(ii) большинство молекул-зондов (1) иммобилизовано во внутренней части сетки

(15) и/или

(iii) большинство молекул-зондов (1) соприкасается с каналом (13).

414. Трехмерная сетка (15) по варианту осуществления 413, в которой по меньшей мере один или по меньшей мере большинство каналов (13) обладает одной, двумя или тремя из следующих характеристик:

(a) канал (13) простирается во внутреннюю часть отточки, которая находится на расстоянии менее 5 мкм от поверхности (16) сетки (15) или простирается во внутреннюю часть от точки на поверхности (16) сетки (15);

(b) канал (13) обладает длиной, которая составляет не менее 10 или не менее 20% от наибольшего размера сетки (15); и

(c) канал (13) обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 15 раз больше размера отверстий сетки (15).

415. Трехмерная сетка (15) по варианту осуществления 414, в которой по меньшей мере один или по меньшей мере большинство каналов (13) (a) обладает длиной, которая составляет от 10% до 40% или от 15% до 25% от наибольшего размера сетки (15) и/или

(b) обладает минимальным сечением, которое в 5-10 раз или в 10-25 раз больше размера отверстий сетки (15).

416. Трехмерная сетка (15) по любому из вариантов осуществления 413-415, включающая не менее 5 каналов (13), не менее 10 каналов (13) или не менее 15 каналов (13), необязательно в которой множество каналов (13) сходится в точке во внутренней части сетки (15), так что боковое расстояние между каналами (13) уменьшается при переходе от поверхности (16) сетки (15) к точке во внутренней части и необязательно в которой каждый канал (13) независимо обладает одной, двумя или тремя из следующих характеристик:

(a) канал (13) простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 10 мкм, менее 9 мкм, менее 8 мкм, менее 7 мкм, менее 6 мкм, менее 5 мкм, менее 4 мкм, менее 3 мкм, менее 2 мкм, менее 1 мкм от поверхности (16) сетки (15) или на поверхности (16) сетки (15);

(b) канал (13) обладает длиной, которая составляет не менее 10%, не менее 15%, не менее 20% или не менее 25% от наибольшего размера сетки (15) и; и/или

(c) канал (13) обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз или по меньшей мере в 20 раз больше размера отверстий сетки (15).

417. Трехмерная сетка (15) по любому из вариантов осуществления 413-

416, где сетка (15) в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 5 до 75 нм или от 10 до 50 нм.

418. Массив, включающий множество трехмерных сеток (15) по любому из вариантов осуществления 413-417 на субстрате, необязательно в котором (а) трехмерные сетки (15) иммобилизованы на субстрате и/или (b) каждая из трехмерных сеток (15) находится в отдельном пятне (7) на субстрате.

419. Массив по варианту осуществления 418, включающий не менее 8 или не менее 48 трехмерных сеток (15), необязательно в котором количество трехмерных сеток (15) в массиве находится в диапазоне от 24 до 1024.

420. Массив по варианту осуществления 418 или варианту осуществления 419, в котором множество трехмерных сеток (15) включает одну или большее количество трехмерных сеток (15), включающих меченые контрольные молекулы-зонды (1), необязательно в котором меченые контрольные молекулы-зонды (1) являются флуоресцентно мечеными.

421. Массив по любому из вариантов осуществления 418-420, который можно использовать повторно, необязательно где массив можно повторно использовать не менее 10 раз.

422. Способ получения трехмерной сетки (15) по любому из вариантов осуществления 413-417, включающий стадии:

(a) обработку смеси (5), находящейся на поверхности (2) субстрата, смеси при условиях, обеспечивающих образование игольчатых кристаллов, указанная смесь (5) включает

(i) водный раствор соли, который необязательно является раствором соли одновалентного катиона,

(ii) полимер и (iii) сшивающий реагент, тем самым образование смеси (5), содержащей один или большее количество игольчатых кристаллов соли (8);

(b) обработку смеси (5), содержащей один или большее количество кристаллов соли (8), при условиях, обеспечивающих сшивку, тем самым образование сшитой полимерной сетки (15), содержащей один или большее количество игольчатых кристаллов соли (8); и

(c) взаимодействие сшитой полимерной сетки (15), содержащей один или большее количество кристаллов соли, (8) с растворителем, в котором растворим один или большее количество кристаллов соли (8), тем самым растворение игольчатых кристаллов соли (8) и образование одного или большего количества каналов (13) вместо кристаллов соли (8).

423. Способ по варианту осуществления 422, в котором:

(а) условия, обеспечивающие образование игольчатых кристаллов соли, включают:

(i) дегидратацию смеси (5) необязательно путем нагревания смеси (5) (необязательно путем взаимодействия смеси (5) с газом, температура которого выше температуры смеси (5)), путем вакуумирования смеси (5) и/или снижения влажности атмосферы вокруг смеси (5); или

(ii) охлаждение смеси (5) необязательно путем взаимодействия смеси (5) с газом, температура которого ниже температуры смеси (5); и/или

(b) в котором растворителем является буфер на водной основе, указанный буфер необязательно включает фосфат, метанол, этанол, пропанол или их смесь.

424. Способ по варианту осуществления 422 или варианту осуществления 423, в котором смесь (5) на стадии (а) дополнительно включает молекулы-зонды (1).

425. Способ по любому из вариантов осуществления 422-424, дополнительно включающий до стадии (а) стадию нанесения смеси (5) на поверхность (2) субстрата, необязательно в объеме, равном от 100 пл до 5 нл, в объеме, равном от 100 пл до 1 нл, или в объеме, равном от 500 пл до 2 нл.

426. Способ получения массива, включающий (а) получение множества трехмерных сеток (15) способом по любому из вариантов осуществления 422-425 на отдельных пятнах (7) на поверхности (2) одного того же субстрата и (b) сшивку множества трехмерных сеток (15) с поверхностью (2) субстрата.

427. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце, включающий:

(a) взаимодействие трехмерной сетки (15) по любому из вариантов осуществления 413-417, включающей молекулы (1) зондов, которые способны связываться с анализируемым веществом, с образцом, необязательно в котором трехмерная сетка (15) расположена в массиве по любому из вариантов осуществления 418-421; и

(b) обнаружение и необязательно количественное определение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами (1) в трехмерной сетке (15) или массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в образце, и необязательно количества анализируемого вещества.

428. Способ по варианту осуществления 427, в котором:

(a) сетку (15) или массив использовали и промывали до стадии (а), необязательно не менее 10 раз, не менее 20 раз или не менее 50 раз; и/или

(b) который дополнительно включает повторное использование сетки (15) или массива после стадии (b), необязательно не менее 10 раз, не менее 20 раз или не менее 50 раз.

429. Способ по варианту осуществления 427 или варианту осуществления 428, в котором анализируемым веществом является нуклеиновая кислота, необязательно в котором нуклеиновая кислота представляет собой флуоресцентно меченый ампликон полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Хотя проиллюстрированы и описаны различные конкретные варианты осуществления, следует понимать, что без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения в него можно внести различные изменения.

10. УКАЗАНИЕ О ССЫЛКАХ

Все публикации, патенты, заявки на патенты и другие документы, указанные в описании, во всей их полноте включены в настоящее изобретение в качестве ссылки для всех объектов в такой степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент и другой документ были по отдельности указаны, как включенные в настоящее изобретение в качестве ссылки для всех объектов. В случае, если имеются расхождения между положениями одной или большей количества ссылок, включенных в настоящее изобретение, и настоящим изобретением, действуют положения настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая трехмерную сетку для определения наличия анализируемого вещества и/или количества анализируемого вещества, массив, содержащий вышеуказанную трехмерную сетку, способ получения трехмерной сетки, способ получения массива и способ определения, содержится ли анализируемое вещество в образце. В одном из вариантов реализации трехмерная сетка состоит из набухающего в воде полимера, полученного сшиванием цепей растворимого в воде полимера, сшита с поверхностью жесткого субстрата и включает молекулы-зонды, ковалентно связанные с цепями полимера, а также указанная сетка включает не менее 5 каналов, которые сходятся в точке во внутренней части сетки, так что боковое расстояние между каналами уменьшается при переходе от поверхности к точке во внутренней части. Изобретение расширяет арсенал средств для определения наличия анализируемого вещества в образце. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 16 ил., 3 пр.

1. Трехмерная сетка для определения наличия анализируемого вещества и/или количества анализируемого вещества, обладающая поверхностью и внутренней частью, указанная трехмерная сетка:

(a) состоит из набухающего в воде полимера, полученного сшиванием цепей растворимого в воде полимера;

(b) сшита с поверхностью жесткого субстрата; и

(c) включает молекулы-зонды, ковалентно связанные с цепями полимера,

характеризующаяся тем, что:

(i) указанная сетка включает не менее 5 каналов, которые сходятся в точке во внутренней части сетки, так что боковое расстояние между каналами уменьшается при переходе от поверхности к точке во внутренней части, и

(ii) большинство молекул-зондов иммобилизовано во внутренней части сетки и по меньшей мере часть молекул-зондов соприкасается с каналом.

2. Трехмерная сетка по п. 1, в которой по меньшей мере один из каналов обладает одной, двумя или тремя из следующих характеристик:

(a) канал простирается во внутреннюю часть от точки, которая находится на расстоянии менее 5 мкм от поверхности сетки или простирается во внутреннюю часть от точки на поверхности сетки;

(b) канал обладает длиной, которая составляет не менее 10% от наибольшего размера сетки; и

(c) канал обладает минимальным сечением, которое по меньшей мере в 5 раз больше размера отверстий сетки.

3. Трехмерная сетка по п. 1 или 2, в которой по меньшей мере большинство каналов в сетке обладают длинной, которая составляет не менее 10% от наибольшего размера сетки.

4. Трехмерная сетка по любому из пп. 1-3, в которой большинство каналов в сетке простирается от точки, которая находится на расстоянии менее чем 10 мкм от поверхности сетки или простирается во внутреннюю часть от точки на поверхности сетки.

5. Трехмерная сетка по любому из пп. 1-4, где сетка в своем гидратированном состоянии обладает отверстиями размером от 5 до 75 нм.

6. Трехмерная сетка по любому из пп. 1-5, в которой большинство молекул-зондов соприкасается с каналом.

7. Трехмерная сетка по любому из пп. 1-6, в которой полимер включает сополимер, полученный сополимеризацией диметилакриламида (ДМАА), метакрилоилоксибензофенона (МАБФ) и 4-винилбензолсульфоната натрия (SSNa).

8. Массив для определения наличия анализируемого вещества и/или количества анализируемого вещества, включающий множество трехмерных сеток по любому из пп. 1-7 на жестком субстрате, в котором каждая из трехмерных сеток находится в отдельном пятне на субстрате.

9. Массив по п. 8, который можно использовать повторно не менее 10 раз.

10. Способ получения трехмерной сетки по любому из пп. 1-7,

включающий стадии:

(a) обработку смеси, находящейся на поверхности жесткого субстрата при условиях, обеспечивающих образование игольчатых кристаллов, указанная смесь включает (i) водный раствор соли, (ii) растворимый в воде полимер, (iii) сшивающий реагент и (iv) молекулы-зонды, тем самым образование смеси, содержащей один или большее количество игольчатых кристаллов соли;

(b) обработку смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли, при условиях, обеспечивающих сшивку, тем самым образование сшитой полимерной сетки, имеющей молекулы-зонды, сшитые с ней и, содержащей игольчатые кристаллы соли; и

(c) взаимодействие сшитой полимерной сетки, содержащей кристаллы соли, с растворителем, в котором растворимы кристаллы соли, за счет чего происходит растворение игольчатых кристаллов соли и образование каналов вместо кристаллов соли.

11. Способ по п. 10, в котором водный раствор соли представляет собой раствор соли одновалентного катиона.

12. Способ по п. 10 или 11, в котором:

(a) условия, обеспечивающие образование игольчатых кристаллов соли, включают:

(i) дегидратацию смеси; или

(ii) охлаждение смеси; и/или

(b) растворителем является буфер на водной основе.

13. Способ получения массива, включающий (a) образование множества трехмерных сеток способом по любому из пп. 10-12 на отдельных пятнах на поверхности одного и того же субстрата и (b) сшивку множества трехмерных сеток с поверхностью.

14. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце, включающий:

(a) взаимодействие трехмерной сетки по любому из пп. 1-7 или массива по п. 8 или 9, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом, с образцом; и

(b) обнаружение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в трехмерной сетке, за счет чего происходит определение того, содержится ли анализируемое вещество в образце, и необязательно количества анализируемого вещества.

15. Способ по п. 14, в котором сетку или массив использовали и промывали не менее 10 раз до стадии (a) или который дополнительно включает повторное использование сетки или массива не менее 10 раз после стадии (b).

16. Способ по п. 15, который дополнительно включает количественное определение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в трехмерной сетке.