ТРЕХМЕРНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ НА ПРОТОЧНЫХ КЮВЕТАХ Российский патент 2025 года по МПК B01J19/00 C12Q1/6806 C08F2/48 

1. РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/941,197, озаглавленной «Трехмерные полимерные структуры в проточных кюветах», поданной 27 ноября 2019 г., описание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0002] Настоящая заявка также испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/941,215, озаглавленной «Трехмерные матрицы секвенирования в проточных кюветах», поданной 27 ноября 2019 г., описание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0003] Настоящая заявка также испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/941,242, озаглавленной «Трехмерные полимерные структуры в проточных кюветах, имеющие функционализированные поверхности», поданной 27 ноября 2019 г., описание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0004] Настоящая заявка также испрашивает приоритет по заявке на патент Нидерландов № N2024527, озаглавленной «Трехмерные полимерные структуры в проточных кюветах», поданной 20 декабря 2019 г., описание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0005] Настоящая заявка также испрашивает приоритет по заявке на патент Нидерландов № N2024596, озаглавленной «Трехмерные матрицы секвенирования в проточных кюветах», поданной 31 декабря 2019 г., описание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

[0006] Настоящая заявка также испрашивает приоритет по заявке на патент Нидерландов № N2024528, озаглавленной «Трехмерные полимерные структуры в проточных кюветах, имеющие функционализированные поверхности», поданной 20 декабря 2019 г., описание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

2. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ФОРМАТЕ

[0007] Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей предоставлен в виде файла размером в один килобайт с названием «llumina0737385SequenceListing_ST25.txt», созданного и сохраненного в последний раз 20 ноября 2020 г. Информация, содержащаяся в электронном файле перечня последовательностей, полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

3. ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Секвенирование следующего поколения (Next-generation sequencing, NGS) представляет собой высокопроизводительную технологию секвенирования, способную к быстрому и экономичному секвенированию полных геномов. По меньшей мере в одном варианте реализации NGS начинают с создания библиотеки секвенирования, которая включает в себя геномную ДНК, которая была случайным образом фрагментирована, экстрагирована и очищена. Затем для массового параллельного секвенирования всей геномной библиотеки можно использовать способы NGS, такие как секвенирование путем синтеза. Секвенирование одиночных клеток декодирует вариации геномов и транскриптомов одиночных клеток, помогая разгадать механизмы, лежащие в основе как здоровья, так и заболевания. Многие вопросы, связанные с различиями между клетками, требуют секвенирования от сотен до тысяч клеток. Однако высокопроизводительное секвенирование одиночных клеток может быть ограничено сложностью обработки от сотен до тысяч одиночных клеток при условии достижения (i) эффективной подготовки библиотек, (ii) индексации библиотечных молекул и (iii) минимальных потерь. Стратегии компартментализации могут решить эти проблемы путем разделения одиночных кювет в отдельных компартментах, которые выполняют обе из приведенных ниже функций: (I) отделяют кюветы друг от друга и (ii) обеспечивают эффективный обмен реагентами таким образом, что подготовка библиотеки может происходить параллельно с использованием от сотен до тысяч образцов без перекрестного загрязнения.

[0009] Некоторые платформы NGS могут основываться на оптическом запросе связанных с поверхностью кластеров нуклеиновых кислот и производить данные с достаточно постоянной скоростью и довольно значительными затратами на геном. Повышение производительности способов секвенирования нуклеиновых кислот может быть важным для снижения стоимости секвенирования и повышения общей точности секвенирования. Такого желаемого результата можно достичь путем секвенирования большего числа нуклеотидных кластеров. Таким образом, в некоторых случаях для увеличения количества кластеров, которые можно секвенировать, может использоваться либо большая площадь поверхности проточной кюветы, либо большая плотность кластеров. Однако в той степени, в которой проточные кюветы для секвенирования приближаются к предельному размеру и плотности кластеров, значительное улучшение производительности может становиться все более труднодостижимым при использовании традиционных способов поверхностно-связанного секвенирования. Соответственно, было бы полезно преодолеть эти ограничения.

[0010] В некоторых случаях большой объем данных, полученных при секвенировании всего генома, может усложнять обработку и анализ данных. Таким образом, в процессе работы участки геномов могут быть обогащены с использованием различных методов фокусировки на генах или других конкретных целях, представляющих интерес. Однако для некоторых современных способов подготовки и обогащения библиотеки может потребоваться множество ручных операций и переноса реагентов, что приводит к потерям в целевой библиотеке. Соответственно, могут быть полезны автоматические системы и процессы для снижения потерь, связанных с существующими способами подготовки и обогащения библиотеки секвенирования; таковые описаны в настоящем документе.

4. ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Ниже представлено изложение сущности некоторых примеров. Данное изложение сущности изобретения не является широким обзором и не предназначено для определения ключевых или критически важных аспектов или элементов описанных системы, устройств и способов и ограничения область их применения. Следует понимать, что любые признаки/примеры, соответствующие каждому из аспектов описания, приведенные в настоящем документе, могут быть реализованы совместно в любом сочетании для достижения результатов, описанных здесь. При этом любые признаки/примеры по любому одному или нескольким этим аспектам могут быть реализованы совместно с любыми признаками другого(-их) аспекта(-ов), как описано в настоящем документе, в любой комбинации для достижения полезных свойств, описанных в настоящем документе.

[0012] Вариант реализации относится к способу получения трехмерных полимерных структур в проточных кюветах, содержащему: загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, причем раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, причем проточная кювета включает по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; и облучение раствора предшественника полимера светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, через фотошаблон с заданным рисунком, причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне с заданным рисунком и образуются трехмерные полимерные структуры, которые проходят от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала.

[0013] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает вымывание неполимеризованного раствора предшественника полимера из проточной кюветы.

[0014] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает отщепление по меньшей мере некоторых трехмерных полимерных структур от проточной кюветы с использованием тепла, расщепляющих химических веществ или комбинации тепла и расщепляющих химических веществ.

[0015] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проточная кювета имеет олигонуклеотиды заданной длины как на верхней, так и на нижней поверхностях по меньшей мере одного канала, причем олигонуклеотиды включают праймеры.

[0016] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми полимер представляет собой гидрогель.

[0017] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0018] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми поперечносшивающий агент представляет собой соединение с формулой II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил;

[0019] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации.

[0020] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой акриламид, поперечносшивающий агент представляет собой N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP).

[0021] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат, этоксилированный пентаэритритолтетракрилат или их комбинации.

[0022] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО) или их комбинации.

[0023] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон содержит полиэтилентерефталат, графитовый краситель, химически вытравленную металлическую пленку или их комбинации.

[0024] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон наслаивают на верхнюю внешнюю поверхность проточной кюветы.

[0025] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми облучение предшественника полимера включает применение источника ультрафиолетового излучения для испускания света.

[0026] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют цилиндрическую форму.

[0027] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют обращенную С-образную форму.

[0028] Другой вариант реализации относится к способу получения трехмерных полимерных структур в проточной кювете, включающему: загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, причем раствор предшественника полимера включает в себя биологические клетки или колонии биологических клеток, содержащих генетический материал, мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, причем проточная кювета включает по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность, причем праймеры связаны как с верхней, так и с нижней поверхностями по меньшей мере одного канала; и облучение раствора предшественника полимера с применением источника света, который излучает свет с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, через фотошаблон с заданным рисунком, причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, которые проходят от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала, причем биологические клетки или колонии биологических клеток компартментализированы в трехмерных полимерных структурах.

[0029] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает вымывание неполимеризованного раствора предшественника полимера из проточной кюветы.

[0030] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает диффузию реагентов в трехмерные полимерные структуры, причем реагенты включают лизирующие реагенты, которые лизируют биологические клетки и высвобождают из них генетический материал, причем генетический материал включает нуклеиновую кислоту.

[0031] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает фрагментирование высвобожденной нуклеиновой кислоты и лигирование адаптеров с концами фрагментов нуклеиновой кислоты.

[0032] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает посев фрагментов нуклеиновых кислот на верхнюю и нижнюю поверхности по меньшей мере одного канала секвенирования путем: введения диффузионного барьера по меньшей мере в один канал, нагревания проточной кюветы до температуры, которая расщепляет полимерные структуры и высвобождает из них фрагменты нуклеиновых кислот, гибридизации фрагментов нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами на верхней и нижней поверхностях по меньшей мере одного канала и вымывания расщепленных полимерных структур из проточной кюветы.

[0033] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает клональную амплификацию гибридизированной нуклеиновой кислоты с использованием мостиковой амплификации для создания кластеров нуклеиновой кислоты.

[0034] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми полимер представляет собой гидрогель, а диффузионный барьер включает гидрофобную жидкость или вязкий водный раствор, причем гидрофобная жидкость включает минеральное масло, силиконовое масло или перфторированное масло, или их комбинации, а вязкий водный раствор включает полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпирролидон, плюрондекстран, сахарозу, поли(N-изопропилакриламид) или полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксид, ПЭО-ППО-ПЭО-иапонит или их комбинации.

[0035] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0036] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми поперечносшивающий агент представляет собой соединение с формулой II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0037] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации.

[0038] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой акриламид, поперечносшивающий агент представляет собой N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP).

[0039] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, или их комбинации.

[0040] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО); или их комбинации.

[0041] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон представляет собой полиэтилентерефталат, графитовый краситель, химически вытравленную металлическую пленку.

[0042] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон наслаивают на верхнюю внешнюю поверхность проточной кюветы.

[0043] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми источник света представляет собой источник ультрафиолетового света.

[0044] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют цилиндрическую форму.

[0045] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют обращенную С-образную форму.

[0046] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми биологические клетки представляют собой клетки млекопитающих.

[0047] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми биологические клетки представляют собой клетки бактерий.

[0048] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми нуклеиновая кислота представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту.

[0049] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми нуклеиновая кислота представляет собой рибонуклеиновую кислоту.

[0050] Другой вариант реализации относится к способу получения трехмерных полимерных структур на проточной кювете, включающему: загрузку раствора предшественника гидрогеля в проточную кювету, причем раствор предшественника гидрогеля включает в себя биологические клетки или колонии биологических клеток, содержащих генетический материал, мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, причем проточная кювета включает по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность, причем праймеры связаны как с верхней внутренней поверхностью, так и с нижней внутренней поверхностью по меньшей мере одного канала; облучение раствора предшественника гидрогеля с применением источника света, который излучает свет с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, через фотошаблон с заданным рисунком, причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника гидрогеля под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные гидрогелевые структуры, которые проходят от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала, причем биологические клетки или колонии биологических клеток компартментализированы в трехмерных гидрогелевых структурах; диффузию лизирующего реагента в трехмерные гидрогелевые структуры, причем лизирующий реагент лизирует биологические клетки и высвобождает из них генетический материал, причем генетический материал включает нуклеиновую кислоту; фрагментирование высвобожденной нуклеиновой кислоты и лигирование адаптеров с концами фрагментов; и посев фрагментов нуклеиновых кислот на верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность по меньшей мере одного канала путем: введения диффузионного барьера по меньшей мере в один канал, причем диффузионный барьер предотвращает перекрестное загрязнение между гидрогелевыми структурами, нагревания проточной кюветы до температуры, при которой происходит расщепление гидрогелевых структур и высвобождение фрагментов нуклеиновых кислот, гибридизации фрагментов нуклеиновых кислот с праймерами на верхней и нижней внутренних поверхностях по меньшей мере одного канала и вымывания расщепленных гидрогелевых структур из проточной кюветы; и клональную амплификацию гибридизированных фрагментов нуклеиновых кислот для создания кластеров для секвенирования.

[0051] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0052] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми поперечносшивающий агент представляет собой соединение с формулой II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0053] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации.

[0054] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой акриламид, поперечносшивающий агент представляет собой N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP).

[0055] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника гидрогеля включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, или их комбинации.

[0056] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника гидрогеля включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат;акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО); или их комбинации.

[0057] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми диффузионный барьер включает гидрофобную жидкость или вязкий водный раствор, причем гидрофобная жидкость включает минеральное масло, силиконовое масло или перфторированное масло, или их комбинации, а вязкий водный раствор включает полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпирролидон, плюрондекстран, сахарозу, поли(N-изопропилакриламид) или полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксид, ПЭО-ППО-ПЭО-иапонит или их комбинации.

[0058] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон представляет собой полиэтилентерефталат, графитовый краситель или химически вытравленную металлическую пленку, причем фотошаблон наслаивают на верхнюю внешнюю поверхность проточной кюветы.

[0059] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми источник света представляет собой источник ультрафиолетового света.

[0060] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми гидрогелевые структуры имеют цилиндрическую форму.

[0061] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми гидрогелевые структуры имеют обращенную С-образную форму.

[0062] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми биологические клетки представляют собой клетки млекопитающих.

[0063] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми биологические клетки представляют собой клетки бактерий.

[0064] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми нуклеиновая кислота представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту.

[0065] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми нуклеиновая кислота представляет собой рибонуклеиновую кислоту.

[0066] Другой вариант реализации относится к проточной кювете, содержащей: канал, причем канал включает верхнюю внутреннюю поверхность с нанесенными на нее праймерами и нижнюю внутреннюю поверхность с нанесенными на нее праймерами; и обратимые проницаемые трехмерные полимерные структуры в канале из раствора предшественника полимера, причем трехмерные полимерные структуры проходят от верхней внутренней поверхности канала к нижней внутренней поверхности канала.

[0067] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проточная кювета дополнительно содержит фотошаблон, размещенный на внешней поверхности канала.

[0068] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют цилиндрическую форму, обращенную C-образную форму, трубчатую форму или их комбинации.

[0069] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры включают гидрогели.

[0070] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проточная кювета, растворы предшественников полимеров и фотошаблон представлены в наборе.

[0071] Другой вариант реализации относится к способу получения трехмерной матрицы секвенирования на проточной кювете, включающему: встраивание олигонуклеотидов внутрь проницаемой трехмерной матрицы, причем олигонуклеотиды облегчают клональную амплификацию фрагмента нуклеиновой кислоты внутри матрицы; введение содержащей олигонуклеотид проницаемой трехмерной матрицы в проточную кювету, причем проточная кювета включает в себя по меньшей мере один канал для приема содержащей олигонуклеотид проницаемой трехмерной матрицы; и иммобилизацию содержащей олигонуклеотид проницаемой трехмерной матрицы по меньшей мере в одном канале.

[0072] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя полимер.

[0073] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица представляет собой гидрогель.

[0074] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя гидрогелевые сети заданного размера.

[0075] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя матрицу из частиц одного размера или частиц разных размеров.

[0076] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает столбчатые штыри.

[0077] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя среднепористые кристаллические материалы.

[0078] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает формирование рисунка проницаемой трехмерной матрицы на проточной кювете с помощью фотолитографии.

[0079] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми олигонуклеотиды адаптированы для секвенирования путем синтеза.

[0080] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проточная кювета имеет внутренний объем, причем содержащая олигонуклеотид проницаемая трехмерная матрица занимает весь внутренний объем проточной кюветы.

[0081] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает визуализацию проницаемой трехмерной матрицы в дискретных двухмерных слоях.

[0082] Другой вариант реализации относится к способу секвенирования в трех измерениях с использованием трехмерной матрицы секвенирования на проточной кювете, включающему: загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, причем раствор предшественника полимера включает мономеры и олигонуклеотиды; полимеризацию раствора предшественника полимера для создания проницаемой трехмерной матрицы в проточной кювете; диффузию библиотеки секвенирования в проницаемую трехмерную полимерную матрицу, причем библиотека секвенирования включает фрагменты нуклеиновых кислот; диффузию ферментов и реагентов в проницаемую трехмерную полимерную матрицу; гибридизацию фрагментов нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами в проницаемой трехмерной полимерной матрице; клональную амплификацию гибридизированных фрагментов нуклеиновых кислот для создания кластеров для секвенирования в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы; секвенирование кластеров в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы; и оптическую визуализацию секвенированных кластеров в пределах трехмерной матрицы во множестве дискретных двухмерных срезов для описания характеристик библиотеки секвенирования, причем множество дискретных двухмерных срезов представляют весь трехмерный внутренний объем проточной кюветы.

[0083] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0084] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономеры включают в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, или их комбинации.

[0085] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономеры включают в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО); или их комбинации.

[0086] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера дополнительно включает сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламида и акриламида (PAZAM), содержащий азидные фрагменты.

[0087] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми олигонуклеотиды представляют собой связанные с алкином олигонуклеотиды, выполненные с возможностью связывания с азидными фрагментами в PAZAM.

[0088] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми олигонуклеотиды адаптированы для секвенирования путем синтеза.

[0089] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя гидрогель.

[0090] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя гидрогелевые сети заданных размеров.

[0091] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя матрицу из частиц одного размера или частиц разных размеров.

[0092] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает столбчатые штыри.

[0093] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми столбчатые штыри изготовлены с включением чередующихся материалов в направлении Z.

[0094] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми оптическая визуализация включает в себя применение конфокального микроскопа, многофотонного микроскопа или микроскопа плоскостного освещения.

[0095] Другой вариант реализации относится к способу секвенирования в трех измерениях с использованием трехмерной матрицы секвенирования на проточной кювете, включающему: загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, причем раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и олигонуклеотиды; полимеризацию раствора предшественника полимера с использованием ультрафиолетового света для создания проницаемой трехмерной матрицы на проточной кювете; диффузию библиотеки секвенирования в проницаемую трехмерную полимерную матрицу, причем библиотека секвенирования включает фрагменты нуклеиновых кислот, к которым добавлены адаптеры; диффузию ферментов и реагентов в проницаемую трехмерную полимерную матрицу; гибридизацию фрагментов нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами в проницаемой трехмерной полимерной матрице; клональную амплификацию гибридизированных фрагментов нуклеиновых кислот для создания кластеров для секвенирования в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы; секвенирование кластеров в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы; и применение конфокального микроскопа, многофотонного микроскопа или микроскопа плоскостного освещения для визуализации секвенированных кластеров в пределах трехмерной матрицы во множестве дискретных двухмерных срезов для описания характеристик библиотеки секвенирования, причем множество дискретных двухмерных срезов представляют весь трехмерный внутренний объем проточной кюветы.

[0096] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0097] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми поперечносшивающий агент представляет собой соединение с формулой II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил;

[0098] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации.

[0099] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, или их комбинации.

[0100] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО); или их комбинации.

[0101] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP), диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO) или соль бисацилфосфиноксида (BAPO).

[0102] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера дополнительно включает сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламида и акриламида (PAZAM), с которым были связаны азидные фрагменты.

[0103] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми олигонуклеотиды представляют собой связанные с алкином олигонуклеотиды, выполненные с возможностью связывания с азидными фрагментами в PAZAM.

[0104] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми олигонуклеотиды адаптированы для секвенирования путем синтеза.

[0105] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя гидрогель.

[0106] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя гидрогелевые сети заданного размера.

[0107] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает в себя матрицу из частиц одного размера или частиц разных размеров.

[0108] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проницаемая трехмерная матрица включает столбчатые штыри, причем столбчатые штыри изготовлены с включением чередующихся материалов в направлении Z.

[0109] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фрагменты нуклеиновых кислот, к которым добавлены адаптеры, циркуляризируют после добавления адаптеров для создания наношариков.

[0110] Другой вариант реализации относится к набору, содержащему: проточную кювету, причем проточная кювета содержит по меньшей мере один канал; и содержащую олигонуклеотид проницаемую трехмерную матрицу, причем содержащая олигонуклетид проницаемая трехмерная матрица выполнена с возможностью введения по меньшей мере в один канал и последующей иммобилизации в нем.

[0111] Другой вариант реализации относится к способу изготовления трехмерных полимерных структур на проточной кювете, имеющих функционализированные поверхности, содержащему: загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, причем раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и функционализированный полимер, и причем проточная кювета включает по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, и причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; и облучение раствора предшественника полимера с помощью фотошаблона светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, причем фотошаблон включает ряд образованных в нем отверстий, причем фотошаблон размещен на внешней поверхности канала, и причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, проходящие от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала.

[0112] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает взаимодействие двухфункционального линкера, имеющего первый конец и второй конец, с функционализированным полимером, причем первый конец двухфункционального линкера химически или ферментативно присоединен к функционализированному полимеру, и причем второй конец двухфункционального линкера избирательно связывается с заданными типами молекул.

[0113] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми функционализированный полимер представляет собой сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламида и акриламида (PAZAM), содержащий азидные фрагменты, причем двухфункциональный линкер представляет собой комплекс биотин-ПЭГ-алкин, а способ дополнительно включает реакцию комплекса биотин-ПЭГ-алкин с азидными фрагментами в PAZAM с применением клик-реакции азид-алкин.

[0114] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает связывание стрептавидина с биотином в комплексе биотин-ПЭГ-алкин.

[0115] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает связывание биотинилированных захватных олигонуклеотидов со стрептавидином, причем биотинилированные захватные олигонуклеотиды специфичны к представляющим интерес целям в библиотеке секвенирования.

[0116] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает вымывание неполимеризованного раствора предшественника полимера из проточной кюветы.

[0117] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми способ дополнительно включает расщепление по меньшей мере некоторых трехмерных полимерных структур от проточной кюветы с использованием тепла, расщепляющих химических веществ или комбинации тепла и расщепляющих химических веществ.

[0118] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проточная кювета имеет олигонуклеотиды предварительно заданной длины и последовательности, связанные как с верхней, так и с нижней внутренними поверхностями по меньшей мере одного канала, и причем олигонуклеотиды включают праймеры, выполненные с возможностью амплификации нуклеиновых кислот.

[0119] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми полимер представляет собой гидрогель.

[0120] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0121] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми поперечносшивающий агент представляет собой соединение с формулой II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0122] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации.

[0123] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой акриламид, поперечносшивающий агент представляет собой N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP).

[0124] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, либо их комбинации или смеси.

[0125] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО); или их комбинации.

[0126] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон представляет собой полиэтилен терефталат.

[0127] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон наслаивают на верхнюю поверхность проточной кюветы.

[0128] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми облучение раствора предшественника полимера содержит применение источника ультрафиолетового излучения.

[0129] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют цилиндрическую форму.

[0130] Другой вариант реализации относится к способу изготовления трехмерных полимерных структур на проточной кювете, имеющих функционализированные поверхности, включающему: загрузку раствора предшественника гидрогеля в проточную кювету, причем раствор предшественника гидрогеля включает в себя мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и PAZAM, содержащий азидные фрагменты, причем проточная кювета включает в себя по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника гидрогеля, и причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; и облучение раствора предшественника гидрогеля через фотошаблон светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, и причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника гидрогеля под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные гидрогелевые структуры, проходящие от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала; взаимодействие комплекса биотин-ПЭГ-алкин с азидными фрагментами в PAZAM в трехмерных полимерных структурах с помощью клик-реакции азид-алкин; связывание стрептавидина с биотином в комплексе биотин-ПЭГ-алкин; и связывание биотинилированных захватных олигонуклеотидов со стрептавидином, причем биотинилированные захватные олигонуклеотиды специфичны к представляющим интерес целевым молекулам в библиотеке секвенирования.

[0131] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0132] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми поперечносшивающий агент представляет собой соединение с формулой II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил;

[0133] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации или смеси.

[0134] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой акриламид, поперечносшивающий агент представляет собой N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP).

[0135] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, либо их комбинации или смеси.

[0136] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО); или их комбинации.

[0137] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон включает полиэфирную пленку.

[0138] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон наслаивают на верхнюю поверхность проточной кюветы.

[0139] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми источник света представляет собой источник ультрафиолетового света.

[0140] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют цилиндрическую форму.

[0141] Другой вариант реализации относится к способу получения трехмерных полимерных структур на проточной кювете, имеющих функционализированные поверхности, содержащему: загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, причем раствор предшественника полимера включает в себя мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и меченный стрептавидином акриламидный мономер, и причем проточная кювета включает в себя по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, и причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность, и причем олигонуклеотиды заданной длины связаны как с верхней, так и с нижней поверхностями по меньшей мере одного канала; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; облучение раствора предшественника полимера через фотошаблон светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, и причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, проходящие от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала; селективное связывание биотинилированных захватных олигонуклеотидов со стрептавидином в трехмерных полимерных структурах, причем биотинилированные захватные олигонуклеотиды специфичны к представляющим интерес целевым молекулам в библиотеке и связываются с ними; и элюирование связанных целевых молекул и посев элюированных целевых молекул на поверхности проточной кюветы, имеющей связанные с ней олигонуклеотиды.

[0142] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой соединение с формулой I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0143] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми поперечносшивающий агент представляет собой соединение с формулой II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил;

[0144] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации или смеси.

[0145] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми мономер представляет собой акриламид, поперечносшивающий агент представляет собой N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP).

[0146] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, либо их комбинации или смеси.

[0147] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми раствор предшественника полимера включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО); или их комбинации.

[0148] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон представляет собой полиэтилен терефталат.

[0149] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми фотошаблон наслаивают на верхнюю поверхность проточной кюветы.

[0150] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми источник света представляет собой источник ультрафиолетового света.

[0151] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры имеют цилиндрическую форму.

[0152] Другой вариант реализации относится к проточной кювете, содержащей: канал, причем канал включает верхнюю внутреннюю поверхность с нанесенными на нее праймерами и нижнюю внутреннюю поверхность с нанесенными на нее праймерами; и обратимые проницаемые трехмерные полимерные структуры в канале из раствора предшественника полимера, причем трехмерные полимерные структуры проходят от верхней внутренней поверхности канала к нижней внутренней поверхности канала.

[0153] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проточная кювета дополнительно содержит фотошаблон, размещенный на внешней поверхности канала.

[0154] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми трехмерные полимерные структуры включают гидрогели.

[0155] Возможны изменения любого одного или более из вышеуказанных вариантов реализации, в соответствии с которыми проточная кювета, растворы предшественников полимеров и фотошаблон представлены в наборе.

[0156] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что указанные концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть обладающего признаками изобретения объекта изобретения, описанного в настоящем документе, и могут быть реализованы для достижения полезных свойств, описанных в настоящем документе. Дополнительные признаки и аспекты описываемой системы, устройств и способов будут очевидны обычным специалистам в данной области после прочтения и понимания представленного ниже подробного описания примеров вариантов осуществления. Как будет понятно специалисту в данной области, возможны дополнительные варианты реализации без отступления от объема и сущности того, что описывается в настоящем документе. Соответственно, графические материалы и связанные с ними описания следует рассматривать как иллюстративные и не имеющие ограничительного характера.

5. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0157] Подробное описание одного или более вариантов реализации представлено в приведенных ниже сопроводительных графических материалах и описании. Прочие признаки, аспекты и преимущества станут очевидными из описания, рисунков и формулы изобретения, в которых:

[0158] на ФИГ. 1A показан вид в перспективе проточной кюветы в соответствии с одним из вариантов реализации описываемых систем и способов;

[0159] на ФИГ. 1B показан вид сверху и крупный план сверху проточной кюветы, изображенной на ФИГ. 1A, причем на проточной кювете образованы массивы гидрогелевых структур;

[0160] на ФИГ. 1C показана проточная кювета, изображенная на ФИГ. 1A, правильно вставленная в картридж, используемый в процессах секвенирования путем синтеза;

[0161] на ФИГ. 2A показан пример описанных систем и способов образования полимерных (например, гидрогелевых) структур на проточной кювете, такой как проточная кювета, показанная на ФИГ. 1A, в соответствии с которым раствор предшественника полимера вводили в канал для текучей среды проточной кюветы, а поверх канала размещали фотошаблон с заданным рисунком;

[0162] на ФИГ. 2B показан пример описанных систем и способов образования полимерных (например, гидрогелевых) структур на проточной кювете, в соответствии с которыми ультрафиолетовый свет направляют в канал проточной кюветы через отверстия в фотошаблоне для полимеризации содержимого раствора предшественника полимера;

[0163] на ФИГ. 2C показан массив гидрогелевых структур, образованных внутри канала проточной кюветы, причем гидрогелевые структуры имеют цилиндрическую форму и прикреплены к верхней и нижней внутренним поверхностям канала;

[0164] на ФИГ. 2D показан пример способа расщепления гидрогелевых структур, образованных в канале проточной кюветы, путем введения масла, содержащего расщепляющий агент, в канал проточной кюветы;

[0165] на ФИГ. 2E показан пример способа удаления расщепленных структур гидрогеля из канала проточной кюветы путем промывки канала;

[0166] на ФИГ. 3A показан первый этап другого примера описанных систем и способов образования полимерных (например, гидрогелевых) структур на проточной кювете для секвенирования, в соответствии с которым фотошаблон с заданным рисунком размещают на проточной кювете или прикрепляют к ней, затем проточную кювету вставляют в картридж;

[0167] на ФИГ. 3B показан второй этап другого примера описанных систем и способов образования полимерных (например, гидрогелевых) структур на проточной кювете для секвенирования, с соответствии с которыми раствор предшественника полимера, содержащий биологические клетки, загружают в проточную кювету, изображенную на ФИГ. 3A, а затем проточную кювету загружают в устройство или инструмент с помощью раздвижного лотка;

[0168] на ФИГ. 3C показан третий этап другого примера описанных систем и способов образования полимера (например, гидрогеля) на проточной кювете для секвенирования, в соответствии с которыми проточную кювету подвергают воздействию ультрафиолетового излучения для образования на проточной кювете массива гидрогелевых структур (которые показаны на снимках светлопольной микроскопии), после чего проточную кювету промывают для удаления неполимеризованного материала и выгружают из инструмента;

[0169] на ФИГ. 4A показан пример описанных систем и способов инкапсуляции клеток и подготовки in situ библиотек секвенирования, в соответствии с которыми одиночные клетки или колонии клеток смешивают с раствором предшественника полимера, загружают в проточную кювету и облучают ультрафиолетовым светом через фотошаблон для создания массива гидрогелевых структур (например, столбиков) с заключенными в них клетками на проточной кювете, который показан на снимке светлопольной микроскопии;

[0170] на ФИГ. 4B показан пример описанных систем и способов инкапсуляции клеток и подготовки in situ библиотек секвенирования, в соответствии с которыми лизирующие реагенты и реагенты для мечения диффундируют в гидрогелевые структуры, показанные на ФИГ. 4A, причем клетки затем лизируются и помечаются внутри гидрогелевых структур;

[0171] на ФИГ. 4C показан пример описанных систем и способов инкапсуляции клеток и подготовки in situ библиотек секвенирования, в соответствии с которыми библиотеки, показанные на ФИГ. 4B высевают на верхнюю и нижнюю поверхности проточной кюветы путем введения масла в проточную кювету и повышения температуры для высвобождения фрагментов библиотеки, содержащихся в гидрогелевых структурах, которые затем гибридизируются с поверхностными праймерами, закрепленными на поверхностях проточной кюветы;

[0172] на ФИГ. 4D показан пример описанных систем и способов инкапсуляции клеток и подготовки in situ библиотек секвенирования, в соответствии с которыми гибридизированные фрагменты библиотеки, показанные на ФИГ. 4C, затем клонально амплифицируют с использованием процесса мостиковой амплификации для генерации кластеров;

[0173] на ФИГ. 5A показан вид сбоку группы гидрогелевых структур, образованных на проточной кювете с использованием альтернативного варианта описанных систем и способов захвата клеток на проточной кювете для подготовки in situ библиотеки, причем гидрогелевые структуры имеют обращенную С-образную геометрическую форму;

[0174] на ФИГ. 5B показаны несколько видов сверху элементов гидрогеля, захватывающих клетки, показанных на ФИГ. 5A, на которых представлена его обращенная С-образная геометрическая форма;

[0175] на ФИГ. 5C показан вид сбоку гидрогелевых структур, показанных на ФИГ. 5A, на котором представлена отдельная клетка, захваченная в каждую гидрогелевую структуру;

[0176] на ФИГ. 5D показан вид сбоку одной из гидрогелевых структур, показанных на ФИГ. 5C, на котором представлена отдельная клетка, захваченная в гидрогелевую структуру, и направление содержащей клетки текучей среды, направляемой в проточную кювету и через нее;

[0177] на ФИГ. 6 показана блок-схема, изображающая пример реализации способа получения обратимых проницаемых трехмерных полимерных структур на проточной кювете;

[0178] на ФИГ. 7 показана блок-схема, изображающая пример реализации способа получения библиотеки секвенирования с использованием обратимых проницаемых трехмерных полимерных структур, образованных на проточной кювете;

[0179] на ФИГ. 8 показана блок-схема, иллюстрирующая пример реализации способа получения библиотеки секвенирования с использованием обратимых проницаемых трехмерных структур гидрогеля, образованных на проточной кювете;

[0180] на ФИГ. 9A-9B показана проточная кювета, имеющая массив отдельных гидрогелевых столбиков, расположенных внутри проточной кюветы, созданных фотолитографическим способом, причем столбики содержат праймеры P5/P7 и поддерживают рост кластеров внутри матрицы гидрогеля;

[0181] на ФИГ. 10A показаны гидрогелевые столбики, изготовленные внутри проточной кюветы MiSeq™, а на ФИГ. 10B-10K показаны изображения временного ряда, демонстрирующие введение флуоресцентного красителя в проточную кювету, диффузию красителя в гидрогелевые столбики и вымывание красителя из гидрогелевых столбиков;

[0182] на ФИГ. 11A-11B показаны гидрогелевые гранулы, легированные с сополимером поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламида и акриламида) (PAZAM), содержащими праймеры P5/P7, причем гранулы первоначально замачивают в библиотеке секвенирования, а затем замачивают в рамках процесса ExAmp для генерации кластеров по всему трехмерному объему каждой гранулы;

[0183] на ФИГ. 12A-12B показано секвенирование без индексации, при котором каждая гидрогелевая гранула содержит кластеры из образца, в котором ее инкубировали, причем гидрогелевые гранулы, содержащие подобные кластеры, загружают в проточную кювету и секвенируют, и причем гранулы каждого типа образца можно отличить друг от друга различными способами, такими как, например, флуорофоры, встроенные в гранулы, которые удаляются перед секвенированием;

[0184] на ФИГ. 13A показана проточная кювета для секвенирования, в которой секвенирование происходит в двухмерной сети кластеров на верхней поверхности и на нижней поверхности, и в которой верхняя поверхность и нижняя поверхность разделены известным расстоянием (например, 100 мкм) вдоль оси Z;

[0185] на ФИГ. 13B показана проточная кювета для секвенирования, в которой секвенирование происходит в трехмерной сети кластеров на верхней поверхности и нижней поверхности, а также в дискретных областях, которые расположены между верхней поверхностью и нижней поверхностью, причем верхняя поверхность и нижняя поверхность отделены расстоянием 100 мкм вдоль оси Z;

[0186] на ФИГ. 14 показан пример установки SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy, селективная микроскопия плоскостного освещения), в которой возбуждение передают образцу посредством объектива с низкой числовой апертурой (numerical aperture, NA), причем флуоресцентное излучение получают посредством эмиссионного объектива с высокой NA;

[0187] на ФИГ. 15 показана большая гидрогелевая сеть внутри проточной кюветы для секвенирования;

[0188] на ФИГ. 16 показана матрица из крупных частиц, мелких частиц или комбинации крупных и мелких частиц внутри проточной кюветы для секвенирования;

[0189] на ФИГ. 17 показаны регулярно расположенные столбчатые штыри внутри проточной кюветы для секвенирования;

[0190] на ФИГ. 18 показаны среднепористые кристаллические материалы внутри проточной кюветы для секвенирования;

[0191] на ФИГ. 19A-19D показан пример реализации способа образования гидрогеля на проточной кювете путем полимеризации PAZAM+ди-DBCO-ПЭГ;

[0192] на ФИГ. 20 показана сополимеризация акриламида и модифицированных акрилатами олигонуклеотидов с образованием крупных полиакриламидных гранул;

[0193] на ФИГ. 21A показано изображение светлопольной микроскопии, на котором представлены гидрогелевые гранулы на предметном стекле;

[0194] на ФИГ. 21B показано изображение светлопольной микроскопии, на котором показаны гидрогелевые гранулы, помещенные внутрь проточной кюветы HiSeq™;

[0195] на ФИГ. 22A показано изображение флуоресцентной микроскопии стандартных акриламидных гранул после инкубации с меченой красителем комплементарной нитью;

[0196] на ФИГ. 22B показано полученное с помощью флуоресцентного микроскопа изображение олигомодифицированных акриламидных гранул после инкубации с меченой красителем комплементарной нитью;

[0197] на ФИГ. 23A показаны гидрогелевые гранулы, в которых длинные фрагменты ДНК инкапсулированы внутри проточной кюветы;

[0198] на ФИГ. 23B показаны ферментативные процессы получения библиотеки, происходящие внутри захваченных гидрогелевых гранул, изображенных на ФИГ. 23A;

[0199] на ФИГ. 23C показана амплифицированная библиотека, генерирующая кластеры соединенных прочтений, распределенных в трех измерениях внутри каждой гидрогелевой гранулы;

[0200] на ФИГ. 24A показаны захват матрицы и удлинение, происходящие на гидрогелевых гранулах, несущих олигонуклеотиды;

[0201] на ФИГ. 24B показана клональная амплификация библиотечных вставок на гидрогелевых гранулах для создания кластеров;

[0202] на ФИГ. 25A показаны кластеризованные гранулы, доставляемые в проточную кювету к раствору предшественника гидрогеля;

[0203] на ФИГ. 25B показана иммобилизация кластеризованных гранул в матрице поперечносшитого гидрогеля для сохранения пространственных местоположений гранул в трех измерениях в процессе секвенирования и последующей визуализации;

[0204] на ФИГ. 26 показаны частицы димера, имеющие различные ортогональные химические соединения для линеаризации;

[0205] на ФИГ. 27 показан пример системы для синтеза аналогичных частиц димера;

[0206] на ФИГ. 28A и 28B показано пространственное управление кластерами в трех измерениях с использованием трехмерной матрицы столбчатых штырей, имеющих переменный состав материала в направлении Z;

[0207] на ФИГ. 29A-29D показан упрощенный пример способа создания полимерного каркаса, в соответствии с которым в неполимеризованный мономерный раствор внедрены частицы соли, имеющие предварительно заданное распределение по размерам; причем частицы соли замещают мономер, таким образом создавая трехмерную сеть в растворе; причем мономерный раствор полимеризуют с образованием трехмерного полимерного каркаса вокруг частиц соли; и причем частицы соли растворяются, что приводит к случайно расположенному трехмерному массиву пор, которые образуют каркас;

[0208] на ФИГ. 30 показана блок-схема, иллюстрирующая пример способа изготовления проницаемой трехмерной матрицы на проточной кювете для секвенирования;

[0209] на ФИГ. 31 показана блок-схема, иллюстрирующая первый пример способа секвенирования библиотеки нуклеиновых кислот в трех измерениях;

[0210] на ФИГ. 32 показана блок-схема, иллюстрирующая второй пример способа секвенирования библиотеки нуклеиновых кислот в трех измерениях;

[0211] на ФИГ. 33 показано образование гидрогелевых микростолбиков на канале внутри проточной кюветы, причем отдельные гидрогелевые микростолбики видны на снимке светлопольной микроскопии;

[0212] на ФИГ. 34A показан пример способа изготовления на проточной кювете гидрогелевых микростолбиков, в соответствии с которым раствор предшественника гидрогеля, содержащий мономеры и фотоинициатор, вводят в проточную кювету;

[0213] на ФИГ. 34B показан пример способа изготовления гидрогелевых микростолбиков на проточной кювете, в соответствии с которым на проточной кювете, показанной на ФИГ. 34A, размещают фотошаблон с заданным рисунком, и конструкцию облучают ультрафиолетовым излучением;

[0214] на ФИГ. 34C показан пример способа изготовления гидрогелевых микростолбиков на проточной кювете, в соответствии с которым гидрогелевые микростолбики образуются на проточной кювете, изображенной на ФИГ. 34A, причем гидрогелевые микростолбики присоединяются к верхней и нижней поверхностям одного из каналов в проточной кювете;

[0215] на ФИГ. 35A показан пример способа изготовления на проточной кювете функционализированных гидрогелевых структур, в соответствии с которым раствор предшественника гидрогеля, содержащий 10% полиакриламида (PA), поперечносшивающего агента и 0,25% PAZAM, в которую встроены азидные фрагменты, загружен в проточную кювету;

[0216] на ФИГ. 35B показан пример способа изготовления на проточной кювете функционализированных гидрогелевых структур, в соответствии с которым фотошаблон, включающий в себя множество образованных в нем отверстий, помещают поверх проточной кюветы, показанной на ФИГ. 35A, а затем подвергают воздействию УФ-излучения в течение 10 секунд для сополимеризации акриламида и PAZAM и образования массива функционализированных азидом гидрогелевых микростолбиков в узком канале проточной кюветы;

[0217] на ФИГ. 35C показан пример способа изготовления функционализированных гидрогелевых структур на проточной кювете, в соответствии с которым комплекс биотин-ПЭГ-алкин прикрепляют к азидным фрагментам гидрогелевых микростолбиков, изображенных на ФИГ. 35B;

[0218] на ФИГ. 35D показан пример способа изготовления на проточной кювете функционализированных гидрогелевых структур, в соответствии с которым стрептавидин, меченный флуоресцеином, связывает биотин в гидрогелевых микростолбиках, изображенных на ФИГ. 35C;

[0219] на ФИГ. 35E показан пример способа изготовления функционализированных гидрогелевых структур на проточной кювете, где стрептавидин связывает биотинилированные захватные олигонуклеотиды для обеспечения иммобилизации целевых молекул библиотеки секвенирования;

[0220] на ФИГ. 36A показано 4-кратное увеличение снимка светлопольной микроскопии контроля PA/PAZAM (без биотина);

[0221] на ФИГ. 36B показано 4-кратное увеличение снимка светлопольной микроскопии PA/PAZAM плюс Blackpool;

[0222] на ФИГ. 36C показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии контроля PA/PAZAM (без биотина) после реакции в течение пяти минут;

[0223] на ФИГ. 36D показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии PA/PAZAM плюс Blackpool после реакции в течение пяти минут;

[0224] на ФИГ. 36E показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии контроля PA/PAZAM (без биотина) после реакции в течение десяти минут при 40°C;

[0225] на ФИГ. 36F показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии PA/PAZAM плюс Blackpool после реакции в течение десяти минут при 40°C;

[0226] на ФИГ. 37A показан другой пример способа изготовления на проточной кювете функционализированных гидрогелевых структур, в соответствии с которым раствор предшественника гидрогеля, содержащий 10% полиакриламида (PA) и 0,25% меченного стрептавидином акриламидного мономера, загружают в проточную кювету;

[0227] на ФИГ. 37B показан другой пример способа изготовления на проточной кювете функционализированных гидрогелевых структур, в соответствии с которым фотошаблон, включающий в себя множество образованных в нем отверстий, помещают поверх проточной кюветы, изображенной на ФИГ. 37A, а затем подвергают воздействию УФ-излучения в течение 10 секунд для сополимеризации меченных стрептавидином акриламидных мономеров и образования массива функционализированных стрептавидином гидрогелевых микростолбиков в узком канале проточной кюветы;

[0228] на ФИГ. 37C показан другой пример способа изготовления функционализированных гидрогелевых структур на проточной кювете, где биотинилированные захватные олигонуклеотиды связываются со стрептавидиновыми фрагментами в гидрогелевых микростолбиках, изображенных на ФИГ. 37B, и где целевые молекулы гибридизируются с биотинилированными захватными олигонуклеотидами и иммобилизуются на гидрогелевых микростолбиках, изображенных на ФИГ. 37B;

[0229] на ФИГ. 37D показан другой пример способа изготовления функционализированных гидрогелевых структур на проточной кювете, в соответствии с которым иммобилизованные целевые молекулы элюируют из захватных олигонуклеотидов, изображенных на ФИГ. 37C, и высевают на широкий канал проточной кюветы;

[0230] на ФИГ. 38A показаны биотинилированные праймеры Р5 и Р7, связывающиеся с гидрогелевыми микростолбиками, функционализированные стрептавидином;

[0231] на ФИГ. 38B показаны биотинилированные праймеры Р5 и Р7, изображенные на ФИГ. 38A, инкубированные с меченными ТЭТ комплементарными олигонуклеотидами P5' и P7';

[0232] на ФИГ. 38C показаны меченные ТЭТ комплементарные олигонуклеотиды P5' и P7', показанные на ФИГ. 38B, гибридизированные с биотинилированными праймерами P5 и P7;

[0233] на ФИГ. 39A показан снимок светлопольной микроскопии, на котором показаны гидрогелевые микростолбики, инкубированные с TET-P5' и TET-P7' при отсутствии биотинилированных олигонуклеотидов P5 и P7;

[0234] на ФИГ. 39B показан снимок флуоресцентной микроскопии (возбуждение 488 нм), демонстрирующий гидрогелевые микростолбики, инкубированные с TET-P5' и TET-P7' при отсутствии биотинилированных олигонуклеотидов P5 и P7, причем наблюдали равномерное окрашивание поверхностных праймеров Р5 и Р7 проточной кюветы;

[0235] на ФИГ. 39C показан снимок светлопольной микроскопии, на котором показаны гидрогелевые микростолбики, инкубированные с TET-P5' и TET-P7' после инкубации с биотинилированными олигонуклеотидами P5 и P7;

[0236] на ФИГ. 39D показан снимок флуоресцентной микроскопии (возбуждение 488 нм), иллюстрирующий гидрогелевые микростолбики, инкубированные с TET-P5' и TET-P7' после инкубации с биотинилированными олигонуклеотидами P5 и P7, причем наблюдали локализацию окрашивания ТЭТ по краю гидрогелевых микростолбиков, что указывает на то, что меченные ТЭТ олигонуклеотиды гибридизировались со связанными со стрептавидином биотинилированными праймерами P5 и P7;

[0237] на ФИГ. 40A показан снимок флуоресцентной микроскопии, иллюстрирующий уровень олигонуклеотидов TET-P5'/TET-P7' в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками после инкубации в течение одной минуты;

[0238] на ФИГ. 40B показан график, на котором представлен уровень олигонуклеотидов TET-P5'/TET-P7' в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками после инкубации в течение одной минуты;

[0239] на ФИГ. 40C показан снимок флуоресцентной микроскопии, иллюстрирующий уровень олигонуклеотидов TET-P5'/TET-P7' в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками после инкубации в течение пяти минут;

[0240] на ФИГ. 40D показан график, на котором представлен уровень олигонуклеотидов TET-P5'/TET-P7' в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками после инкубации в течение пяти минут;

[0241] на ФИГ. 40E показан снимок флуоресцентной микроскопии, иллюстрирующий уровень олигонуклеотидов TET-P5'/TET-P7' в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками после инкубации в течение десяти минут;

[0242] на ФИГ. 40F показан график, на котором представлен уровень олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками после инкубации в течение десяти минут;

[0243] на ФИГ. 41A показаны гибридизирующиеся области Р7'- и Р5'-участков библиотек секвенирования с биотинилированными олигонуклеотидами Р5 и Р7;

[0244] на ФИГ. 41B показан захват молекул библиотек секвенирования функционализированными стрептавидином гидрогелевыми столбиками, которые прикреплены к поверхности проточной кюветы;

[0245] на ФИГ. 41C показан посев связанных молекул библиотек секвенирования путем инкубации при 85°C для денатурации гибридизированных биотинилированных праймеров и последующего линейного изменения температуры до 20°C для обеспечения гибридизации молекул библиотек секвенирования с поверхностными праймерами;

[0246] на ФИГ. 42A показан снимок светлопольной микроскопии необработанной проточной кюветы (контроль);

[0247] на ФИГ. 42B показан снимок флуоресцентной микроскопии (488 нм) окрашенной красителем SYTOX необработанной проточной кюветы (контроль), не содержащей кластеров;

[0248] на ФИГ. 42C показан снимок светлопольной микроскопии проточной кюветы, имеющей стрептавидиновые микростолбики;

[0249] на ФИГ. 42D показан снимок флуоресцентной микроскопии (488 нм) окрашенной красителем SYTOX проточной кюветы, имеющей стрептавидиновые микростолбики;

[0250] на ФИГ. 42E показан снимок светлопольной микроскопии гидрогелевого микростолбика, показанного на ФИГ. 42C;

[0251] на ФИГ. 42F показан снимок флуоресцентной микроскопии (488 нм) окрашенного красителем SYTOX микростолбика, показанного на ФИГ. 42D;

[0252] на ФИГ. 43A показана проточная кювета в картридже, в которой в узком канале образованы стрептавидиновые микростолбики, но не в широком канале проточной кюветы;

[0253] на ФИГ. 43B показан микроскопический снимок широкого канала проточной кюветы, изображенной на ФИГ. 43A, окрашенной красителем SYTOX, после 24 циклов мостиковой амплификации;

[0254] на ФИГ. 43C показан микроскопический снимок узкого канала проточной кюветы, показанной на ФИГ. 43A, окрашенной красителем SYTOX, после 24 циклов мостиковой амплификации;

[0255] на ФИГ. 44 показана блок-схема, иллюстрирующая первый способ изготовления функционализированных трехмерных полимерных структур на проточной кювете;

[0256] на ФИГ. 45 показана блок-схема, иллюстрирующая второй способ изготовления функционализированных трехмерных полимерных структур на проточной кювете; и

[0257] на ФИГ. 46 показана блок-схема, иллюстрирующая третий способ изготовления функционализированных трехмерных полимерных структур на проточной кювете.

6. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0258] I. Общее описание

[0259] Реализации описанных систем и способов могут быть полезны для создания обратимых полимерных гидрогелевых структур на применяемых проточных кюветах, которые могут быть использованы в рамках рабочего процесса при секвенировании путем синтеза и других методах секвенирования. Рабочий процесс может включать в себя подготовку библиотеки и секвенирование. Эти гидрогелевые структуры могут быть особенно полезны для решения проблем высокопроизводительного секвенирования одиночных клеток или одиночных колоний на проточных кюветах, связанных с низким исходным количеством нуклеиновых кислот в одной клетке и неспособностью компартментализировать библиотеки секвенирования на проточных кюветах. Описанные системы и способы обеспечивают высокопроизводительное секвенирование одиночных клеток или одиночных колоний, обеспечивая захват или инкапсуляцию клеток и генетического материала в обратимых гидрогелевых структурах. Данные гидрогелевые структуры захватывают или корпартментализуют отдельные клетки или отдельные колонии, обеспечивая при этом эффективную замену реагентов для лизиса клеток и, в конечном итоге, подготовку библиотек секвенирования in situ.

[0260] Для создания обратимых проницаемых трехмерных полимерных (например, гидрогелевых) структур внутри каналов для текучих сред на проточных кюветах для секвенирования можно использовать различные реализации описанных систем, устройств и способов. Данные временные полимерные структуры расширяют доступные для секвенирования поверхности от двух до трех измерений, таким образом обеспечивая значительное повышение производительности проточной кюветы для секвенирования.

[0261] Для создания обратимых трехмерных полимерных (например, гидрогелевых) структур в каналах для текучих сред на проточных кюветах могут использоваться различные реализации описанных систем, устройств и способов. Эти структуры можно использовать для введения временных функциональных поверхностей в проточную кювету в дополнение к уже существующим поверхностям секвенирования для множества сфер применения, включая, например, (i) обогащение целевой ДНК; (ii) скрининг коротких палиндромных повторов, разделенных регулярными промежутками (CRISPR); и (iii) сферы применения высокоуплотненного скрининга с использованием ДНК-конъюгированных антигенов.

[0262] Используемый в настоящем документе термин «гидрогель» относится к веществу, получающемуся при образовании поперечной сшивки органического полимера (природного или синтетического) посредством ковалентной, ионной или водородной связей, создающей трехмерную структуру открытой решетки, которая захватывает молекулы воды с образованием геля. В некоторых вариантах гидрогель относится к полимеру, образующему гель, который не является токсичным для живых клеток и обеспечивает достаточную диффузию кислорода и питательных веществ в захваченные клетки для поддержания их жизнеспособности. В некоторых вариантах полимер гидрогеля содержит приблизительно 60-90% текучей среды, такой как вода, и приблизительно 10-30% полимера, причем в других вариантах содержание воды в гидрогеле составляет приблизительно 70-80%.

[0263] При использовании в настоящем документе термин «адаптер» относится к линейному олигонуклеотиду, который может быть гибридизирован с молекулой нуклеиновой кислоты, например, путем лигирования или мечения. В некоторых вариантах реализации адаптер по существу не комплементарен 3'-концу или 5'-концу любой целевой последовательности, присутствующей в образце. В некоторых примерах подходящие значения длины адаптеров находятся в диапазоне приблизительно 10-100 нуклеотидов, приблизительно 12-60 нуклеотидов или приблизительно 15-50 нуклеотидов. Как правило, адаптер может включать в себя любую комбинацию нуклеотидов и (или) нуклеиновых кислот. Адаптер также может включать одну или более расщепляемых групп в одном или более положениях. Адаптер также может включать последовательность, комплементарную по меньшей мере части праймера, например праймера, включающего универсальную нуклеотидную последовательность. Адаптер также может включать в себя штрихкод (также называемый в настоящем документе меткой или индексом) для помощи в идентификации или секвенировании, а также в коррекции ошибок в оперонах по ходу транскрипции. При использовании в настоящем документе термин «индекс» относится к последовательности нуклеотидов, которую можно использовать в качестве молекулярного идентификатора и/или штрихкода для мечения нуклеиновой кислоты и/или для идентификации источника нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации индекс можно использовать для идентификации одиночной нуклеиновой кислоты или субпопуляции нуклеиновых кислот.

[0264] В настоящем документе термин «проточная кювета» может относиться к проточной кювете, используемой в ходе выполнения рабочего процесса секвенирования. Например, проточную кювету можно использовать для подготовки и/или секвенирования библиотеки. В одном варианте реализации как для подготовки, так и для секвенирования библиотеки можно использовать одну и ту же проточную кювету. Пример проточной кюветы включает канал, содержащий поверхность, по которой могут перетекать один или более текучих реагентов, с которыми могут транспортироваться и связываться адаптированные фрагменты библиотек секвенирования. Проточная кювета включает твердую подложку, имеющую поверхность, с которой связываются библиотеки секвенирования. В некоторых примерах твердая поверхность покрыта слоем гидрогеля. В некоторых примерах поверхность содержит выступ захватных нуклеотидов, которые могут связываться с адаптированными фрагментами библиотеки секвенирования. В некоторых примерах поверхность представляет собой поверхность с заданным рисунком. Термин «с заданным рисунком» в отношении поверхности может относиться к конфигурации (такой как массив) различных областей (таких как сайты амплификации) на открытой поверхности твердой подложки или внутри нее. Например, одна или более областей могут быть элементами, в которых присутствуют один или более праймеров для амплификации и (или) захвата. Элементы могут быть разделены промежуточными областями, в которых отсутствуют праймеры. В некоторых примерах проточная кювета имеет высоту канала приблизительно 50 мкм, приблизительно 60 мкм, приблизительно 70 мкм, приблизительно 80 мкм, приблизительно 90 мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 110 мкм, приблизительно 120 мкм, приблизительно 130 мкм, приблизительно 140 мкм или приблизительно 150 мкм или величину в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений.

[0265] Как показано на ФИГ. 1A, пример проточной кюветы для секвенирования 100 включает в себя верхний слой стекла 110, имеющий образованные в нем отверстия 112 для текучей среды; канал, образующий разделитель 120, который включает в себя множество образованных в нем каналов 122 для текучей среды/секвенирования; и нижний слой стекла 130, на котором образован массив 150. Массив 150 включает в себя множество отдельных структур 152, образованных на ней описанными способами. Отдельная структура 152 может представлять собой трехмерную структуру. Структура может содержать полимер. В одном варианте реализации полимер представляет собой гидрогель. Следует отметить, что, хотя в некоторых случаях в настоящем документе гидрогель используется в качестве эталонной структуры 152, термин «гидрогель» используется только в качестве репрезентативного материала в данном варианте реализации, и структура не обязательно должна содержать гидрогель и вместо этого может содержать любой приемлемый полимерный материал. На ФИГ. 1B показана собранная проточная кювета 100, на которой в одном из каналов для секвенирования 122 был изготовлен массив 150 отдельных трехмерных гидрогелевых структур 152, а на ФИГ. 1C показана проточная кювета 100, имеющая множество образованных на ней трехмерных гидрогелевых структур 152, вставленных в картридж для секвенирования 160, который используется в аппарате для секвенирования путем синтеза. На проточной кювете трехмерные гидрогелевые структуры, имеющие определенную геометрическую форму, могут быть образованы путем: (i) введения раствора предшественника гидрогеля в канал секвенирования проточной кюветы; (ii) помещения фотошаблона с определенным рисунком поверх канала секвенирования на проточную кювету либо до, либо после введения в нее раствора предшественника гидрогеля; и (iii) воздействия на раствор предшественника гидрогеля света с заданной длиной волны через фотошаблон, причем при облучении содержимое раствора предшественника гидрогеля полимеризуется и на проточной кювете образуются трехмерные структуры, которые соответствуют рисунку фотошаблона. После того как гидрогелевые структуры выполнили свои функции, их можно отделить от проточной кюветы и смыть, не оказывая влияния на общую функциональность проточной кюветы.

[0266] Раствор предшественника гидрогеля может включать в себя мономерные растворы, которые могут быть фотополимеризованы путем активации фотоинициатора. Пример одной такой системы включает в себя по меньшей мере один тип мономера, обратимый или расщепляемый поперечносшивающий агент и фотоинициатор. В одном варианте мономер представляет собой акриламид, обратимый поперчносшивающий агент представляет собой N,N′-бис(акрилоил)цистамин (BAC), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP), который активируется ультрафиолетовым (УФ) светом с заданной длиной волны.

[0267] В других вариантах раствор-предшественник может включать в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин, ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат, или их комбинации. В других вариантах мономер может включать в себя ПЭГ-тиол/ПЭГ-акрилат, акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy) или ПЭГ/ППО.

[0268] В некоторых вариантах реализации описанных способов мономер может представлять собой соединение формулы I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0269] В некоторых вариантах реализации описанных способов, которые включают в себя поперечносшивающий агент, поперечносшивающий агент может представлять собой соединение формулы II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

[0270] Поперечносшивающий агент способен к поперечному сшиванию полимерных цепей внутри полимера. В одном варианте реализации полимер представляет собой гидрогель. В некоторых вариантах поперечносшивающий агент может расщепляться, тем самым размыкая полимерные цепи за счет присутствия восстановителя; за счет повышения температуры; под воздействием электрического поля; или при воздействии на гидрогелевые структуры света с длиной волны, обеспечивающей расщепление фоторасщепляемого поперечносшивающего агента, который поперечно сшивает полимер гидрогеля. В некоторых вариантах реализации к восстановителям относятся соединения фосфина, водорастворимые фосфины, азотсодержащие фосфины и соли и их производные, дитиоэритритол (DTE), дитиотреитол (DTT) (цис- и транс-изомеры 2,3-дигидрокси-1,4-дитиолбутана соответственно), 2-меркаптоэтанол или β-меркаптоэтанол (BME), 2-меркаптоэтанол или аминоэтантиол, глутатион, тиогликолят или тиогликолевая кислота, 2,3-димеркаптопропанол, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), трис(гидроксиметил)фосфин (THP) или P-[трис(гидроксиметил)фосфин]пропионовая кислота (THPP). В некоторых вариантах поперечносшивающий агент расщепляют путем повышения температуры до более чем приблизительно 50°C, приблизительно 55°C, приблизительно 60°C, приблизительно 65°C, приблизительно 70°C, приблизительно 75°C, приблизительно 80°C, приблизительно 85°C, приблизительно 90°C, приблизительно 95°C или приблизительно 100°C. В некоторых вариантах восстановитель активируют ультрафиолетовым излучением.

[0271] Другие подходящие фотоинициаторы включают биосовместимые фотоинициаторы для радикальной полимеризации, которые не повреждают нуклеиновые кислоты, такие как, например, диазосульфонатный инициатор; соли моноацилфосфиноксида (MAPO), такие как, например, Na-TPO и Li-TPO; и соли бисацилфосфиноксида (BAPO), такие как, например, BAPO-ONa и BAPO-OLi.

[0272] В некоторых примерах сшивание полимерных цепей гидрогелевой структуры образует матрицу гидрогеля, имеющую поры (то есть пористую матрицу гидрогеля). В некоторых вариантах размер пор в гидрогелевых структурах является регулируемым или настраиваемым и выбирается таким образом, чтобы инкапсулировать достаточно крупный генетический материал, такие как клетки или нуклеиновые кислоты (например, размером более чем приблизительно 300 пар нуклеотидов), но позволять материалам меньшего размера, таким как реагенты, или меньшим по размерам нуклеиновым кислотам (например, размером менее чем приблизительно 50 пар нуклеотидов), например праймерам, проходить через поры, тем самым входя в гидрогелевые структуры и выходя из них. Гидрогели могут иметь любой размер пор, имеющий диаметр, достаточный для обеспечения диффузии реагентов через структуру, сохраняя при этом инкапсулированные молекулы нуклеиновой кислоты. Термин «размер пор» также может относиться к среднему диаметру или среднему эффективному диаметру поперечного сечения пор по результатам измерений множества пор. Эффективный диаметр некруглого поперечного сечения равен диаметру круглого поперечного сечения с такой же площадью поперечного сечения, что и у некруглого поперечного сечения. В некоторых примерах гидрогель может набухать при гидратации гидрогеля. В результате размеры пор могут меняться в зависимости от содержания воды в гидрогеле гидрогелевой структуры. В некоторых примерах диаметр пор может составлять от приблизительно 10 нм до приблизительно 100 нм.

[0273] В некоторых примерах размер пор гидрогелевых структур точно регулируют, меняя соотношения концентрации полимера и концентрации поперечносшивающего агента. В некоторых примерах соотношение полимера и поперечносшивающего агента составляет приблизительно 30:1, приблизительно 25:1, приблизительно 20:1, приблизительно 19:1, приблизительно 18:1, приблизительно 171, приблизительно 16:1, приблизительно 15:1, приблизительно 14:1, приблизительно 13:1, приблизительно 12:1, приблизительно 11:1, приблизительно 10:1, приблизительно 9:1, приблизительно 8:1, приблизительно 7:1, приблизительно 6:1, приблизительно 5:1, приблизительно 4:1, приблизительно 3:1, приблизительно 2:1, приблизительно 1:1, приблизительно 12, приблизительно 1:3, приблизительно 1:4, приблизительно 1:5, приблизительно 1:6, приблизительно 1:7, приблизительно 1:8, приблизительно 1:9, приблизительно 1:10, приблизительно 1:15, приблизительно 1:20 или приблизительно 1:30 или приблизительно любого одного из этих соотношений или соотношения в пределах диапазона, образованного любыми двумя из вышеупомянутых соотношений.

[0274] На ФИГ. 2A-2E показан пример способа 200 изготовления и последующего удаления трехмерных гидрогелевых структур на проточной кювете 210. Проточная кювета 210 имеет верхнюю внутреннюю поверхность 212 и нижнюю внутреннюю поверхность 214, которые вместе образуют канал проточной кюветы 216. Фотошаблон с заданным рисунком 218 наслаивают или иным образом прикрепляют к верхней поверхности проточной кюветы 210. На ФИГ. 2A показано введение раствора предшественника гидрогеля 230, содержащего: (i) мономер (например, акриламид), (ii) поперечносшивающий агент (например, BAC) и (iii) фотоинициатор (например, LAP) в проточной кювете 210. На ФИГ. 2B показано воздействие на раствор предшественника гидрогеля 230 УФ-излучения с заданной длиной волны через фотошаблон с заданным рисунком 218, который имеет множество образованных в ней отверстий 200. Воздействие на раствор предшественника гидрогеля 230 УФ-излучения активирует фотоинициатор (LAP) с образованием таким образом радикалов, которые приводят к контролируемой полимеризации мономера (акриламида) с образованием гидрогелевых структур 232, содержащих дисульфидные связи. На ФИГ. 2C показано образование гидрогелевых элементов 232, которые закреплены на верхней и нижней поверхностях 212 и 214 канала(-ов) секвенирования 216 проточной кюветы 210, которые адаптированы для вставки в картридж 260. На ФИГ. 2C показан снимок светлопольной микроскопии 250, иллюстрирующий цилиндрическую гидрогелевую структуру 232 (диаметром 100-150 мкм), имеющую плотные стенки геля с менее плотной сердцевиной. На ФИГ. 2D показано отделение гидрогелевых элементов 232 от проточной кюветы 210 под воздействием нагревания или комбинации нагревания и химического расщепления поперечносшивающего агента. Например, при инкубации гидрогелевых структур 232 с восстановителем, таким как масло, содержащее DTT, структуры расщепляются путем восстановления дисульфидных связей в поперечносшивающем агенте гидрогеля до тиолов, тем самым позволяя гидрогелю вымываться из проточной кюветы 210, как показано на ФИГ. 2E. Поверхности проточной кюветы 210 остаются функциональными после вымывания расщепленных гидрогелевых структур из проточной кюветы, т. е. удаление гидрогелевых структур из проточной кюветы 210 не влияет на функциональность праймеров для секвенирования, связанных с проточной кюветой до изготовления и последующего удаления гидрогелевых элементов.

[0275] Изготовление гидрогелевых структур, таких как описанные ранее, может осуществляться как в заводских условиях, так и в лабораторных условиях. Однако известные технологии изготовления гидрогеля обычно включают использование дорогостоящего и трудноуправляемого оборудования, такого как, например, установка фотолитографии с коллимированным источником УФ-излучения и хромовым шаблоном. Соответственно, для облегчения изготовления гидрогелевых структур на проточных кюветах непосредственно пользователями продуктов секвенирования предоставляется относительно небольшой, недорогой прибор для изготовления гидрогеля в проточной кювете. В качестве примера, реализация данного инструмента в общем виде включает: (i) коллимированный светодиодный источник УФ-излучения, такой как, например, источник модели M385LP1-C1 производства компании Thor Labs; (ii) корпус, в который вставляется проточная кювета (и картридж для проточной кюветы) и который вмещает источник света и правильно позиционирует его по отношению к проточной кювете; (iii) фотошаблон Mylar® с заданным рисунком, который выполнен с возможностью наслаивания на верхнюю поверхность конкретной проточной кюветы; и (iv) экранирующую оболочку для размещения источника света и корпуса. Отверстие в защитной оболочке позволяет вставить в корпус проточную кювету для облучения проточной кюветы УФ-излучением через фотошаблон с заданным рисунком. Корпус может включать в себя аппарат для ступенчатого перемещения или регулировки, предназначенный для воспроизведения рисунка по длине и ширине проточной кюветы, если зона облучения корпуса меньше, чем зона проточной кюветы, которую необходимо подвергнуть фотообработке. Помимо работы в качестве широкопольного осветителя, различные варианты описанного инструмента также выполняют различные замены реагентов и обеспечивают термическое управление для облегчения автоматической подготовки библиотеки. Как более подробно описано ниже, некоторые варианты реализации описанного инструмента функционируют как автономные устройства для подготовки библиотек, обеспечивающие готовность к кластеризации или готовность к секвенированию библиотеки. Фотошаблон может включать в себя (без ограничений) Mylar® (полиэтилентерефталат); светопоглощающий материал, полученный методом трафаретной печати, такой как графитовый краситель; или химически протравленную металлическую пленку; такую как алюминиевая, хромовая, золотая или платиновая, и другие светопоглощающие материалы.

[0276] На ФИГ. 3A-3C показан пример реализации описанных системы и способа изготовления гидрогелевых структур на проточной кювете, причем гидрогелевые структуры содержат образец для секвенирования или иного вида анализа. В данном варианте реализации описанный инструмент является автоматическим, а корпус включает в себя процессор, который выполняет различные установленные в нем программы, предназначенные для облучения проточной кюветы и выполнения обмена реагентами и других функций автоматическим способом. Как показано на ФИГ. 3A, заказчик (или другой пользователь) заказывает проточную кювету 310, на которую наслаивают фотошаблон 318 (имеющий участок, который включает определенный пользователем рисунок) с образованием сборки 320. Область фотошаблона с рисунком 318 размещают поверх проточной кюветы и совмещают с каналом(-ами) 312 проточной кюветы 310. Затем проточную кювету 310 вставляют в соответствующую кассету проточной кюветы 360. Как показано на ФИГ. 3B, заказчик затем смешивает интересующий образец (например, биологические клетки или геномную ДНК) с раствором предшественника гидрогеля, который включает в себя, например, мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, и загружает раствор на проточную кювету 310. Как показано на ФИГ. 3C, сборку 320 и картридж 360 затем загружают в корпус 370, на котором с помощью подвижного лотка 372 установлен источник УФ-излучения. Основываясь на схеме расположения или геометрической форме рисунка фотошаблона 318, заказчик выбирает соответствующую программу облучения и подвергает проточную кювету 310 воздействию УФ-излучения для полимеризации раствора и образования рисунка в виде необходимой гидрогелевой структуры на проточной кювете 310. На ФИГ. 3C показан снимок светлопольной микроскопии гидрогелевых столбиков 332, изготовленных на проточной кювете с использованием описываемых системы и способа. Проточную кювету 310 затем промывают для удаления неполимеризованного раствора, а избыток образца и фотошаблона 318 удаляют из проточной кюветы 310. В одном варианте реализации удаляют более половины каждого из неполимеризованного раствора, избытка образца и фотошаблона. В одном варианте реализации удаляют весь неполимеризованный раствор, избыток образка и фотошаблон. Проточную кювету 310 можно помещать в секвенатор или систему подачи текучей среды для автоматической последующей обработки, такой как лизис, мечение, мостиковая амплификация, кластеризация и т. д.

[0277] Предусматривается несколько других вариантов реализации, связанных со сборкой фотошаблона и проточной кюветы. В одном варианте реализации пользователь сначала вставляет проточную кювету в корпус, а затем вставляет фотошаблон, отделенный от проточной кюветы (например, фотошаблон не наслаивается на проточную кювету). Поскольку возможны различные рисунки и конфигурации фотошаблона, пользователь может выбирать различные фотошаблоны на основании требуемого шага рисунка, или конкретных областей применения/конкретных вариантов применения проточной кюветы. В этом и других вариантах реализации корпус инструмента выполнен с возможностью приема множества различных проточных кювет, включая проточные кюветы Hiq™, NextSeq™, NovaSeq™, MiniSeq™, iSeq™ и Miq™, или других подходящих проточных кювет производства компании Illumina, Inc. В другом варианте реализации проточная кювета предоставляется предварительно собранной таким образом, что фотошаблон уже размещен на внешней поверхности проточной кюветы. В зависимости от разрешения, фотошаблон можно либо напечатать на проточной кювете с помощью трафаретной печати, либо наслоить на поверхность проточной кюветы с помощью непрозрачной клейкой пленки, образующей рисунок, для создания структур на проточной кювете. При необходимости фотошаблон можно снять с проточной кюветы после его использования. В другом варианте реализации фотошаблон может быть изготовлен из алюминия или другого металла, осажденного внутрь канала для текучей среды, в ходе микротехнологического процесса изготовления, применяемого для создания проточной кюветы. Затем, после завершения создания гидрогелевых структур на проточной кювете, фотошаблон можно вытравить буферным раствором с высоким pH.

[0278] II. Компартментализация клеток и приготовление библиотеки секвенирования in situ

[0279] Описанные системы и способы могут обладать преимуществом высокопроизводительного секвенирования одиночных клеток или одиночных колоний за счет обеспечения компартментализации биологических клеток (и генетического материала, содержащегося в них) в проточных кюветах, что достигается путем инкапсуляции одиночных клеток или одиночных колоний клеток в обратимые гидрогелевые структуры, которые обеспечивают эффективную замену реагентов для лизиса клеток и подготовки библиотеки секвенирования. Подготовка библиотеки in situ и пространственное индексирование кластеров осуществляются с использованием следующего примера реализации, который включает в себя инкапсуляцию биологических клеток на проточной кювете, подготовку библиотеки, посев библиотеки и мостиковую амплификацию. Проточная кювета снабжена двумя типами олигонуклеотидов (например, P5 и P7), которые называются поверхностными праймерами или праймерами для секвенирования, связанными с верхней и нижней поверхностями проточной кюветы. Последовательности этих поверхностных праймеров комплементарны библиотечным адаптерам, и эти олигонуклеотиды захватывают фрагменты библиотеки ДНК. При использовании в настоящем документе термины «P5» и «P7» относятся к универсальной последовательности P5 или P7 или праймеру P5 или P7 для захвата и (или) амплификации. Последовательность Р5 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1 (AATGATACGGCGACCACCGA), а последовательность P7 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

[0280] В контексте настоящего документа термин «генетический материал» относится к клеткам, микробиомам или нуклеиновым кислотам. В некоторых вариантах клетка представляет собой одиночную клетку, в том числе прокариотическую или эукариотическую клетку. В некоторых вариантах клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах клетка представляет собой бактериальную клетку. В некоторых вариантах генетический материал представляет собой вирусную частицу. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота представляет собой длинную молекулу ДНК, включающую вирусные нуклеиновые кислоты, бактериальные нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты млекопитающих. Любые интересующие генетические материалы могут быть инкапсулированы в описанные гидрогелевые структуры.

[0281] Генетический материал, инкапсулированный в описанную гидрогелевую структуру, имеет достаточный размер, чтобы он не мог проходить через поры гидрогелевой структуры. В некоторых примерах целевая молекула нуклеиновой кислоты, инкапсулированная внутри гидрогелевой структуры, имеет длину по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 200 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 300 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 500 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 1000 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 5000 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 10 000 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 20 000 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 50 000 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 100 000 нуклеотидов, или более нуклеотидов. В некоторых примерах молекулы нуклеиновой кислоты, инкапсулированные внутри гидрогелевых структур, представляют собой фрагменты геномной ДНК длиной от приблизительно 1000 до приблизительно 10 000 нуклеотидов, от приблизительно 10 000 до приблизительно 20 000 нуклеотидов, от приблизительно 10 000 до приблизительно 50 000 нуклеотидов, от приблизительно 50 000 до приблизительно 100 000 нуклеотидов, или длиной приблизительно 300, приблизительно 500, приблизительно 1000, приблизительно 10 000, приблизительно 20 000, приблизительно 50 000 или приблизительно 100 000 нуклеотидов, или длиной в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных размеров, или длиной, превышающей вышеуказанные размеры. В некоторых примерах инкапсулированные молекулы нуклеиновой кислоты имеют длину до приблизительно 3 млн. оснований.

[0282] Некоторые варианты описанных систем и способов относятся к обработке генетического материала внутри гидрогелевой структуры для создания библиотеки секвенирования, которую можно определить как набор фрагментов одной или более целевых молекул нуклеиновых кислот или ампликонов фрагментов. В некоторых вариантах генетический материал, инкапсулированный в гидрогелевую структуру, приводят в контакт с одним или более реагентами для обработки нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах генетический материал удерживается внутри гидрогелевых структур, и реагенты проходят через поры гидрогелевых структур. Реагенты могут включать в себя лизирующие реагенты, реагенты для очистки нуклеиновых кислот, реагенты для амплификации ДНК, реагенты для мечения, ПЦР-агенты или другие реагенты, используемые при обработке генетических материалов (например, лизоцим, протеиназу K, случайные гексамеры), полимеразу (например, ДНК-полимеразу Φ 29, Taq-полимеразу, Bsu-полимеразу), транспозазу (например, Tn5), праймеры (адаптерные последовательности P5 и P7), лигазу, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы. Таким образом, гидрогелевые структуры формируют микросреду для контролируемых реакций генетических материалов внутри гидрогелевых структур, обеспечивая барьер для прохождения реагентов внутрь и наружу гидрогелевых структур, одновременно удерживая сам генетический материал внутри структур. Это обеспечивает преимущество обработки одиночной клетки для быстрой и эффективной обработки целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах инкапсулированные нуклеиновые кислоты полностью или частично секвенируют внутри гидрогелевых структур. Инкапсулированные нуклеиновые кислоты можно секвенировать в соответствии с любой подходящей методикой секвенирования, такой как прямое секвенирование, включая секвенирование путем синтеза, секвенирование путем лигирования, секвенирование путем гибридизации, секвенирование через нанопоры и т. п.

[0283] Для инкапсуляции клеток, как показано на ФИГ. 4A, отдельные клетки или колонии смешивают с раствором предшественника полимера, который включает мономер, расщепляемый поперечносшивающий агент и фотоинициатор. Затем содержащий клетки раствор загружают в проточную кювету и освещают УФ-излучением через фотошаблон способом, описанным ранее, чтобы создать на проточной кювете массив гидрогелевых структур с внедренными клетками (например, столбиков). Избыток раствора предшественника вымывают для получения прозрачного свободного пространства между гидрогелевыми структурами. Объединенный снимок светлопольной микроскопии и флуоресцентной микроскопии, иллюстрирующий гидрогелевую структуру с инкапсулированными в нее клетками E. coli, и снимок светлопольной микроскопии гидрогелевых столбиков, образованных на проточной кювете, представлен в нижней части ФИГ. 4A. В качестве альтернативы, как показано на ФИГ. 5A-5D, сначала можно создать на проточной кювете 510 массив гидрогелевых структур 532, имеющих образованные в них элементы захвата клеток, а затем отдельные клетки или колонии могут протекать через элементы гидрогеля 532, захватывающие клетки, так что отдельные клетки или колонии оказываются захваченными гидрогелевыми элементами. На ФИГ. 5A показан вид сбоку примера захватывающих клетки гидрогелевых элементов 532, которые прикреплены к верхней поверхности 512 и нижней поверхности 514 канала 516. На ФИГ. 5B представлен вид сверху гидрогелевого элемента, захватывающего клетки, показанного на ФИГ. 5A. На ФИГ. 5C представлен вид сбоку примера захватывающего клетки гидрогелевого массива, в котором происходит захват клеток 550, а на ФИГ. 5D представлен вид сверху одного из захватывающих клетки гидрогелевых элементов, показанных на ФИГ. 5C, на котором представлена захваченная в них клетка 550. Как показано на ФИГ. 5D, гидрогелевые элементы 532 могут включать в себя скошенные края и различные образованные в них каналы и проходы для облегчения прохождения текучей среды через элементы и вокруг них.

[0284] В одном варианте реализации для подготовки библиотеки, как показано на ФИГ. 4B, лизирующие и реагенты для мечения диффундируют в гидрогелевые структуры. Регулировка или иное изменение размера пор гидрогеля позволяет оптимизировать буферные замены и эффективную диффузию реагентов в гидрогелевые структуры и из них. Клетки, захваченные в гидрогелевые структуры, лизируют ферментативным или химическим лизирующим буфером. Затем ДНК, высвобожденную путем лизиса клеток, метят. Мечение включает в себя модификацию молекулы нуклеиновой кислоты с помощью транспосомного комплекса для фрагментации молекулы нуклеиновой кислоты и лигирования адаптеров с 5'- и 3’-концами фрагментов за одну стадию. В реакциях мечения за одну стадию выполняют случайную фрагментацию ДНК и лигирование адаптера для повышения эффективности процесса подготовки библиотеки секвенирования. После лигирования адаптеров с фрагментами можно добавлять дополнительные мотивы, такие как индексы, штрих-коды и другие виды молекулярных модификаций, которые действуют как опорные точки при амплификации, секвенировании и анализе. Индексы и штрих-коды представляют собой уникальные последовательности ДНК, лигированные с фрагментами в библиотеке секвенирования для последующей сортировки и идентификации с помощью компьютерного моделирования. Снимок светлопольной микроскопии, иллюстрирующий массив гидрогелевых структур, представлен в нижней части ФИГ. 4B.

[0285] Как было указано ранее, адаптеры могут включать в себя сайты праймеров для секвенирования, сайты праймеров для амплификации и индексы. Например, адаптер может включать себя последовательность P5, последовательность P7 или комплемент любой из них. Как было указано ранее, термин «индекс» может включать в себя последовательность нуклеотидов, которую можно использовать в качестве молекулярного идентификатора и (или) штрихкода для метки нуклеиновой кислоты и (или) для идентификации источника нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах индекс можно использовать для идентификации одиночной нуклеиновой кислоты или субпопуляции нуклеиновых кислот.

[0286] Что касается посева библиотек, как показано на ФИГ. 4C, для посева библиотек, полученных в результате подготовки библиотеки, на верхнюю и нижнюю поверхности проточной кюветы при сохранении пространственной компартментализации в проточную кювету вводят барьер для диффузии жидкости. Барьер для диффузии жидкости может содержать расщепляющий агент, такой как DTT, который разлагает гидрогелевые структуры. Температуру проточной кюветы повышают, а гидрогелевые структуры расщепляют, высвобождая содержащиеся в ней фрагменты библиотеки, которые затем гибридизируются с поверхностными праймерами, закрепленными на поверхностях проточной кюветы в областях 250. В этом варианте реализации для удаления расщепленных гидрогелей из проточной кюветы используется этап промывки водным буфером. На ФИГ. 4C показан снимок светлопольной микроскопии расплавленных гидрогелевых структур в минеральном масле.

[0287] Гидрогелевые структуры разлагаются, будучи окруженными жидкостным диффузионным барьером, для высвобождения библиотек секвенирования из структур и посева библиотек секвенирования на проточной кювете. Жидкостный диффузионный барьер загружают в проточную кювету для заполнения пустот между гидрогелевыми структурами и окружения гидрогелевых структур. Окружение захваченных гидрогелевых структур жидкостным диффузионным барьером ингибирует диффузию библиотек секвенирования за пределы объема структуры при разложении структуры, тем самым снижая и в некоторых случаях даже предотвращая перекрестное загрязнение между гидрогелевыми структурами. После разложения структуры инкапсулированные библиотеки секвенирования переносятся к поверхности проточной кюветы, где они захватываются. Таким образом, при наличии жидкостного диффузионного барьера посев в проточную кювету происходит в непосредственной близости от площади, занимаемой каждой гидрогелевой структурой. Следует отметить, что диффузионный барьер используется в некоторых вариантах реализации, в которых требуется дискретная компартментализация фрагментов библиотеки, созданных в пределах гидрогелевых структур. Однако в вариантах реализации, в которых компартментализация нежелательна, диффузионный барьер может не использоваться. Соответственно, диффузионный барьер можно назвать «необязательным».

[0288] В некоторых примерах жидкостный диффузионный барьер может представлять собой гидрофобную жидкость, такую как масло, примеры которой включают минеральное масло, силиконовое масло или перфторированное масло, или комбинацию двух или более из них. В некоторых примерах жидкостный диффузионный барьер представляет собой вязкий водный раствор, например, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпирролидон, плуроновый декстран, сахарозу, поли(N-изопропилакриламид) или полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксид (ПЭО-ППО-ПЭО)-иапонит или комбинацию двух или более из них. В некоторых примерах в качестве жидкостного диффузионного барьера можно использовать чувствительный к температуре материал. Термочувствительным материалом является невязкая жидкость с температурой, не пригодной для посева, которая может быть легко загружена в проточную кювету, занимая промежуточное пространство между гидрогелевыми структурами. При нагревании до температуры посева материал затвердевает с образованием физического барьера и предотвращает диффузию библиотеки. В некоторых примерах чувствительный к температуре материал может представлять собой композитный материал на основе поли(N-изопропилакриламида) или полиэтиленоксида-полипропиленоксида-полиэтиленоксида (ПЭО-ППО-ПЭО)/лапонита в виде наночастиц. В некоторых примерах жидкостный диффузионный барьер, используемый в описанных вариантах реализации, состоит из комбинации любых двух или более жидкостных диффузионных барьеров, описанных выше.

[0289] Гидрогелевые структуры могут разлагаться любым подходящим способом, который существенно не снижает эффективность жидкостного диффузионного барьера для ингибирования диффузии библиотек секвенирования за пределы диаметра гидрогелевых структур. Для высвобождения библиотек секвенирования из гидрогелевых структур и посева библиотек секвенирования на проточной кювете гидрогелевые структуры не обязательно должны быть полностью расщеплены. Условия достаточной деградации включают увеличение пористости гидрогелевых структур для обеспечения диффузии инкапсулированных библиотек секвенирования и перенос библиотек секвенирования на поверхность проточной кюветы.

[0290] При мостиковой амплификации, как показано на ФИГ. 4D, гибридизированные библиотечные фрагменты затем клонально амплифицируют с использованием процесса мостиковой амплификации для создания кластеров. В процессе мостиковой амплификации полимеразы перемещаются вдоль одноцепочечного фрагмента ДНК (полинуклеотида), связанного с проточной кюветой, создавая комплементарный ему полинуклеотид. Исходный полинуклеотид смывают, оставляя только обратный полинуклеотид. В верхней части обратного полинуклеотида находится последовательность адаптера (например, P5 или P7). Фрагмент ДНК изгибается и присоединяется к олигонуклеотиду на поверхности проточной кюветы, который является комплементарным верхней последовательности адаптера. Полимеразы присоединяются к обратному полинуклеотиду, и образуется комплементарный ему полинуклеотид (идентичный исходному). Полученная двухцепочечная ДНК денатурируется таким образом, что каждый полинуклеотид может по отдельности присоединяться к олигонуклеотидной последовательности, закрепленной на проточной кювете. Один из них будет обратной нитью; другой - прямой. Затем процесс повторяет некоторое количество раз; данный процесс может происходить одновременно с участием миллионов кластеров, что приводит к клональной амплификации всех фрагментов в библиотеке ДНК. После мостиковой амплификации полученные кластеры 260 локализуются на верхней и нижней поверхностях проточной кюветы, в которой ранее были зафиксированы гидрогелевые структуры. Снимок флуоресцентной микроскопии в нижней части ФИГ. 4D иллюстрирует наличие кластеров секвенирования 260 после окрашивания интеркалирующим красителем SYTOX™, который доступен в продаже от компании ThermoFisher Scientific.

[0291] На ФИГ. 6 показана блок-схема, иллюстрирующая пример реализации способа изготовления трехмерных полимерных структур на проточной кювете. Способ 600 включает загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету в блоке 602, причем раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, причем проточная кювета включает по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, и причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом в блоке 604, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; и облучение раствора предшественника полимера через фотошаблон светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора в блоке 606. При активации фотоинициатора происходит полимеризация по меньшей мере части раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, которые проходят от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала. В других вариантах реализации фотошаблон встраивают в проточную кювету, а не размещают на ней или прикрепляют к ней.

[0292] На ФИГ. 7 показана блок-схема, иллюстрирующая другой пример реализации способа изготовления трехмерных полимерных структур на проточной кювете. Способ 700 включает загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету в блоке 702, причем раствор предшественника полимера включает в себя биологические клетки или колонии биологических клеток, содержащих генетический материал, мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, причем проточная кювета включает по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, и причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность, причем праймеры связаны как с верхней, так и с нижней поверхностями по меньшей мере одного канала; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом в блоке 704, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; и облучение раствора предшественника полимера через фотошаблон светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора в блоке 706, причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, проходящие от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала; и причем биологические клетки или колонии биологических клеток компартментированы в трехмерных полимерных структурах. В других вариантах реализации фотошаблон встраивают в проточную кювету, а не размещают на ней или прикрепляют к ней.

[0293] На ФИГ. 8 показана блок-схема еще одного примера реализации способа изготовления трехмерных гидрогелевых структур на проточной кювете. Способ 800 включает в себя загрузку раствора предшественника гидрогеля в проточную кювету на этапе 802, причем раствор предшественника гидрогеля включает в себя биологические клетки или колонии биологических клеток, содержащие генетический материал, мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, причем проточная кювета включает по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность, причем праймеры связаны как с верхней, так и с нижней внутренними поверхностями по меньшей мере одного канала; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом в блоке 804, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; облучение раствора предшественника гидрогеля через фотошаблон светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора в блоке 806, причем при активации фотоинициатора раствор предшественника гидрогеля полимеризуется под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные гидрогелевые структуры, которые проходят от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала, причем биологические клетки или колонии биологических клеток компартментализированы в трехмерных гидрогелевых структурах; диффузию лизирующего реагента в трехмерные гидрогелевые структуры в блоке 808, причем лизирующий реагент лизирует биологические клетки и высвобождает из них генетический материал, причем генетический материал содержит нуклеиновую кислоту; фрагментирование высвобожденной нуклеиновой кислоты и лигирование адаптеров с концами фрагментов нуклеиновой кислоты в блоке 810; посев фрагментов нуклеиновых кислот на верхнюю и нижнюю поверхности канала в блоке 812 путем введения диффузионного барьера по меньшей мере в один канал для предотвращения перекрестного загрязнения между гидрогелевыми структурами в блоке 814, нагревание проточной кюветы до температуры, при которой происходит расщепление гидрогелевых структур и высвобождение фрагментов нуклеиновых кислот на этапе 816, гибридизацию фрагментов нуклеиновых кислот с праймерами на верхней и нижней внутренних поверхностях по меньшей мере одного канала на этапе 818 и вымывание расщепленных гидрогелевых структур с проточной кюветы на этапе 820; и клональную амплификацию гибридизированной нуклеиновой кислоты для создания кластеров для секвенирования в блоке 822. В других вариантах реализации фотошаблон встраивают в проточную кювету, а не размещают на ней или прикрепляют к ней.

[0294] Способы и системы, описанные в настоящем документе, обеспечивают определенные преимущества. Варианты способов и методик «пространственного индексирования», описанных в настоящем документе, сокращают анализ данных и упрощают процесс получения библиотеки из одиночных клеток и молекул длинной ДНК. Существующие протоколы секвенирования одиночных клеток требуют эффективного физического разделения клеток и уникального штрихкодирования каждой выделенной клетки с последующим группированием клеток для проведения секвенирования. Современные протоколы синтетических длинных прочтений также требуют трудоемкого штрихкодирования, группирования вместе штрихкодированных фрагментов для секвенирования с последующим проведением анализа данных для разграничения генетической информации, поступающей от каждой штрихкодированной клетки. В таких длительных процессах присутствует потеря генетического материала, что приводит к выпадениям в нуклеотидных последовательностях. Варианты, описанные в настоящем документе, не только сокращают весь процесс секвенирования, но и увеличивают разрешение данных для одиночных клеток.

[0295] Следующие не имеющие ограничительного характера рабочие примеры приведены для иллюстрации конкретных признаков определенных примеров, но объем формулы изобретения не должен ограничиваться этими признаками, приведенными в качестве примера.

[0296] ПРИМЕР 1. Интеграция в проточную кювету при подготовке библиотеки из геномной ДНК

[0297] Этот пример иллюстрирует секвенирование геномной ДНК, захваченной в гидрогелевые структуры, причем процессы подготовки библиотеки и секвенирования объединены и выполняются непосредственно на проточной кювете.

[0298] Раствор предшественника гидрогеля с общей концентрацией мономеров 10%T получали из маточного раствора мономера с концентрацией 40% (масс./об.) акриламида/N, N'бис(акрилоил)цистамина (BACy) (19:1) (3,8 г акриламида, 0,2 г BACy и 6 мл дистиллированной H2O двойной очистки (dd)) с 1 мг/мл фотоинициатора LAP и геномной ДНК E. coli (0,008 нг/мкл). Раствор вводили в проточную кювету MiSeq™, и проточную кювету подвергали воздействию коллимированного УФ-излучения (установка фотолитографии OAI, мощность в диапазоне ~30-40 мВт/см²) через хромовый шаблон (фотошаблоны HTA) с рисунком из круглых элементов 200 мкм для образования гидрогелевых структур.

[0299] Раствор предшественника, содержащий избыток геномной ДНК, вымывали PR-2. Проточную кювету инкубировали с раствором фермента для мечения в течение 15 минут при 55°C, после чего промывали PR-2 и инкубировали с буфером для остановки реакции мечения (10 минут при 37°C). Проточную кювету затем промывали PR-2, а фермент AMS-1 инкубировали при 50°C в течение 5 минут. Библиотеку денатурировали промывкой раствором NaOH в концентрации 0,1 М с последующей промывкой HT-2. Проточную кювету инкубировали с HT-1 в течение 5 минут, а затем в нее загружали минеральное масло с поверхностно-активными веществами и DTT (312,5 мкл минерального масла + 4,5% Span 80, 0,4% Tween 20, 0,05% Triton X-100 и 0,5 мкл от 12 мг DTT/400 мкл этанола). Посев осуществляли путем инкубации проточной кюветы при линейном изменении температуры до 60°C, 40°C и 20°C.

[0300] Проточную кювету затем промывали HT-1, а посеянную библиотеку расширяли с помощью AMS-1 (50°C в течение 5 минут). Оставшийся гидрогель затем расплавляли с помощью CLM (40°C в течение 5 минут) и проточную кювету промывали PR-2. Затем проточную кювету вставляли в секвенатор для мостиковой амплификации (24 цикла) и секвенирования. Данный способ демонстрирует возможность захвата геномной ДНК внутрь гидрогелевых структур на проточной кювете, а также возможность подготовки и секвенирования библиотеки непосредственно на проточной кювете.

[0301] ПРИМЕР 2. Интеграция в проточную кювету при подготовке библиотеки для метагеномного минисеквенирования

[0302] Следующий пример иллюстрирует прямую интеграцию секвенирования микробных клеток, от лизиса и подготовки библиотеки микроорганизмов, инкапсулированных в гидрогелевые структуры проточной кюветы, до посева, кластеризации и секвенирования библиотечных молекул.

[0303] Раствор гидрогеля с общей концентрацией мономеров 10%T получали из маточного раствора мономера акриламида/N, N'бис(акрилоил)цистамина (BACy) с концентрацией 40% (масс./об.) (19 : 1) (3,8 г акриламида, 0,2 г BACy и 6 мл дистиллированной H20 двойной очистки (dd)), 1 мг/мл фотоинициатора LAP и раствора Tris/HCl с концентрацией 0,01 M и смесью 10 микроорганизмов (ZYMOMICS Microbial Community Standard D6300), затем раствор вводили в проточную кювету MiSeq™. Проточную кювету подвергали воздействию коллимированного УФ-излучения (установка фотолитографии OAI, мощность в диапазоне ~30-40 мВт/см²) через хромовый шаблон (HTA Photomask) с рисунком из круглых элементов на 200 мкм для образования гидрогелевых структур.

[0304] Избыток раствора предшественника промывали PR-2 и лизировали микроорганизмы с применением мининабора для бактерий ChargeSwitch (Thermo Fisher CS11301); первой инкубации с лизоцимом и лизостафином с последующей второй инкубацией с протеиназой K. Проточную кювету промывали PR-2, вводили раствор фермента для мечения и инкубировали при 55°C в течение 15 минут, после чего промывали PR-2 и инкубировали с буфером для остановки реакции мечения (10 минут при 37°C). Проточную кювету затем промывали PR-2, а фермент AMS-1 инкубировали при 50°C в течение 5 минут. Затем библиотеку денатурировали промывкой раствора NaOH в концентрации 0,1 М с последующей промывкой HT-2. Проточную кювету инкубировали с HT-1 в течение 5 минут, а затем в нее загружали минеральное масло с поверхностно-активными веществами и DTT (312,5 мкл минерального масла+4,5% Span 80, 0,4% Tween 20, 0,05% Triton X-100 и 0,5 мкл от 12 мг DTT/400 мкл этанола). Посев осуществляли путем инкубации проточной кюветы при линейном изменении температуры до 60°C, 40°C и 20°C.

[0305] Проточную кювету затем промывали HT-1, а посеянную библиотеку расширяли с помощью AMS-1 (50°C в течение 5 минут). Оставшийся гидрогель затем расплавляли с помощью CLM (40°C в течение 5 минут) и проточную кювету промывали PR-2. Затем проточную кювету вставляли в секвенатор для мостиковой амплификации (24 цикла) и секвенирования. Данный способ демонстрирует, что может происходить захват микроорганизмов внутрь гидрогелевых структур на проточной кювете и что подготовка и секвенирование геномной библиотеки могут протекать непосредственно на проточной кювете.

[0306] ПРИМЕР 3. Интеграция в проточную кювету при получении библиотеки из клеток млекопитающих

[0307] Следующий пример демонстрирует инкапсуляцию, лизис, подготовку библиотеки и секвенирование геномного материала из клеток млекопитающих на проточной кювете.

[0308] Раствор гидрогеля с общей концентрацией мономеров 10%T получали из маточного раствора мономера акриламида/N, N'бис(акрилоил)цистамина (BACy) с концентрацией 40% (масс./об.) (19:1) (3,8 г акриламида, 0,2 г BACy и 6 мл PBS), 1 мг/мл фотоинициатора LAP и клеток млекопитающих (клетки GM12878). Раствор вводили в проточную кювету MiSeq™, и проточную кювету подвергали воздействию коллимированного УФ-излучения (установка фотолитографии OAI, мощность в диапазоне ~30-40 мВт/см²) через хромовый шаблон (HTA Photomask) с рисунком из круглых элементов на 200-500 мкм для образования гидрогелевых структур, инкапсулирующих клетки. Проточную кювету затем промывали с помощью PBS.

[0309] Клетки лизировали лизирующим буфером ChargeSwitch и протеиназой K (10 минут, 50°C). Проточную кювету промывали PR-2 и добавляли в проточную кювету раствор фермента для мечения (55°C в течение 15 минут) с последующей промывкой PR-2 и инкубацией с буфером для остановки реакции мечения (10 минут при 37°C). Проточную кювету промывали PR-2 и фермент AMS-1 инкубировали при 50°C в течение 5 минут. Затем библиотеку денатурировали промывкой раствором NaOH в концентрации 0,1 М с последующей промывкой HT-2 и инкубацией с HT-1 в течение 5 минут. В проточную кювету загружали минеральное масло с поверхностно-активными веществами и DTT (312,5 мкл минерального масла +4,5% Span 80, 0,4% Tween 20, 0,05% Triton X-100 и 0,5 мкл от 12 мг DTT/400 мкл этанола) и инкубировали при линейном изменении температуры до 60°C, 40°C и 20°C.

[0310] Проточную кювету промывали HT-1 с последующей инкубацией с AMS-1 (50°C в течение 5 минут). Любой оставшийся гидрогель расщепляли с помощью CLM (40°C в течение 5 минут) и проточную кювету промывали PR-2. Проточную кювету вставляли в секвенатор MiSeq™ для мостиковой амплификации (24 цикла) и последующего секвенирования. Данный способ демонстрирует, что может происходить захват клеток млекопитающих внутрь гидрогелевых структур на проточной кювете и что подготовка и секвенирование геномной библиотеки могут протекать непосредственно на проточной кювете.

[0311] ПРИМЕР 4. Интеграция секвенирования ампликона из геномной ДНК на проточных кюветах

[0312] В данном примере показана интеграция секвенирования ампликона в проточной кювете, причем геномную ДНК инкапсулировали в гидрогелевые структуры для последующей амплификации целевых областей, добавления праймеров для секвенирования, посева и секвенирования.

[0313] Геномную ДНК инкапсулировали в гидрогелевые структуры путем первоначального смешивания геномной ДНК с раствором гидрогеля с концентрацией 10%T получали из маточного раствора мономера акриламида/N, N'бис(акрилоил)цистамина (BACy) с концентрацией 40% (масс./об.) (19:1) (3,8 г акриламида, 0,2 г BACy и 6 мл PBS), 1 мг/мл фотоинициатора LAP. Этот раствор предшественника гидрогеля вносили в проточную кювету MiSeq™. Проточную кювету подвергали воздействию коллимированного УФ-излучения (установка фотолитографии OAI, мощность в диапазоне ~30-40 мВт/см²) через хромовый шаблон (HTA Photomask) с рисунком из круглых элементов на 200 мкм, что приводило к образованию гидрогелевых столбиков, содержащих геномную ДНК. Избыток раствора и ДНК вымывали PR-2.

[0314] 10 мкл пар олигомеров в концентрации 1 мкМ (пар прямых и обратных праймеров, содержащих целевую последовательность и выступающую последовательность адаптера Illumina) смешали с 25 мкл смеси KAPA HiFi 2X (Roche) и 5 мкл буфера для ресуспендирования и поместили в проточную кювету. ПЦР проводили на термоциклере с использованием следующей программы: 92°C в течение 5 минут, 25 циклов: (i) 92°C в течение 30 секунд, (ii) 55°C в течение 30 секунд и (iii) 72°C в течение 2 минут, 72°C в течение 5 минут. Проточную кювету затем промывали с помощью PR-2.

[0315] Затем проводили 8 циклов ПЦР с использованием программы термоциклера, описанной в предыдущем абзаце, в этот раз с использованием 5 мкл праймера Nextera XT 1, 5 мкл праймера Nextera XT 2, 25 мкл смеси KAPA HiFi 2X, 15 мкл воды для ПЦР. Проточную кювету затем промывали с помощью PR-2.

[0316] Библиотечные молекулы денатурировали промывкой раствором NaOH в концентрации 0,1 М с последующей промывкой HT-2 и инкубацией с HT-1 в течение 5 минут. В проточную кювету загружали минеральное масло с поверхностно-активными веществами и DTT (312,5 мкл минерального масла+4,5% Span 80, 0,4% Tween 20, 0,05% Triton X-100 и 0,5 мкл от 12 мг DTT/400 мкл этанола) и инкубировали при линейном изменении температуры до 60°C, 40°C и 20°C. Проточную кювету промывали HT-1 с последующей инкубацией с AMS-1 (50°C в течение 5 минут). Любой оставшийся гидрогель расщепляли с помощью CLM (40°C в течение 5 минут) и проточную кювету промывали PR-2. Затем проточную кювету вставляли в секвенатор MiSeq™ для мостиковой амплификации (24 цикла) и последующего секвенирования. Данный способ демонстрирует, что геномную ДНК можно инкапсулировать в гидрогелевые структуры проточной кюветы и что последующая амплификация целевых областей, добавление праймеров для секвенирования, посев и секвенирование могут протекать на проточной кювете.

[0317] В описанных в настоящем документе примерах каждая отдельная гидрогелевая структура содержит библиотеку секвенирования, полученную из генетического материала или нуклеиновой кислоты, содержащихся в гидрогелевой структуре. Соответственно, библиотека секвенирования, посеянная из одной гидрогелевой структуры, соответствует нуклеиновой кислоте, инкапсулированной в эту гидрогелевую структуру. Поскольку посев происходит в непосредственной близости от отпечатка каждой гидрогелевой структуры проточной кюветы, засеянная библиотека секвенирования каждой структуры пространственно разделяется (или «индексируется») на проточной кювете на основе местоположения структуры.

[0318] III. Секвенирование нуклеиновых кислот в трех измерениях

[0319] Как описано выше, производительность работы существующих платформ секвенирования следующего поколения (NGS) определяют по следующим показателям: (i) двухмерная плотность кластеров нуклеиновых кислот; и (ii) общий размер активной поверхности проточной кюветы, оба из которых уже достигли практических ограничений при производстве. В примерах реализации предложены системы и способы преодоления этих ограничений путем расширения поверхности, на которой может происходить секвенирование, от двух измерений до трех измерений, что обеспечивает значительное повышение производительности проточной кюветы для секвенирования и генерации данных.

[0320] Повышение производительности проточной кюветы для секвенирования и увеличение генерации данных облегчаются путем заполнения проточной кюветы (или другого предмета, такого как, например, капиллярная трубка или миниатюрная кювета) материалами или трехмерными структурами, занимающими весь объем проточной кюветы и способствующими образованию кластеров с желаемой плотностью по всему объему проточной кюветы. Затем выполняется секвенирование путем синтеза или секвенирование другим подходящим способом, при этом идентификация кластеров и распознавание оснований происходят путем оптического опроса ряда наложенных друг на друга двухмерных срезов по всей проточной кювете. Примеры способов последовательной визуализации отдельных двухмерных срезов по всей проточной кювете включают: (i) использование конфокального микроскопа, способного сфокусироваться на дискретных двухмерных срезах проточной кюветы и многократно измерять одни и те же двухмерные плоскости; и (ii) использование микроскопа плоскостного освещения, с помощью которого можно быстро визуализировать трехмерные объемы. В других вариантах реализации для визуализации трехмерной матрицы используют многофотонную флуоресценцию (такую как флуоресценция с двухфотонным возбуждением (2PEF)) или другую методику многофотонной визуализации, такую как флуоресценция с трехфотонным возбуждением (3PEF) или многогармоническая генерация (MHG). Многофотонная визуализация представляет собой технологию с применением возбуждения, подобного конфокальному возбуждению с аналогичными возможностями разделения, которая включает использование импульсных лазеров, но, как правило, на длинах волн в ближней инфракрасной области (NIR), таким образом значительно снижая потенциальное фотоповреждение матрицы и ее содержимого.

[0321] В примерах реализации трехмерные кластеры создают во всех проницаемых гидрогелевых матрицах, таких как описанные выше, присоединяя связанные с алкином праймеры для захвата (например, P5 и P7) к акриламидной гидрогелевой матрице, которая включает в себя поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламид и акриламид) (PAZAM), содержащий азидные фрагменты, с помощью клик-реакции. Клик-реакция азид-алкин включает катализируемую медью реакцию азида с алкином и с образованием 5-членного гетероатома: катализируемое Cu(I) азид-алкиновое циклоприсоединение (CuAAC). Клик-реакцию азид-алкин можно подвергнуть фотоинициации с использованием Cu (II) и фотоинициирующей системы, такой как фотоинициирующая система II типа, например камфорхинон, в которой в качестве источника возбуждения может использоваться синий свет с длиной волны 470 нм. Затем библиотека секвенирования, содержащую фрагменты нуклеиновых кислот с адаптерами, лигированными с фрагментом, диффундирует в гидрогелевую матрицу и кластеризуется с использованием кластерной амплификации, мостиковой амплификации или другого подходящего способа. В некоторых вариантах реализации фрагменты нуклеиновых кислот циркуляризируют после добавления адаптеров для создания «наношариков» нуклеиновых кислот. Проницаемость гидрогеля позволяет ферментам и другим реагентам диффундировать в гидрогель и выполнять амплификацию нуклеиновых кислот. Как более подробно описано ниже, гидрогелевая матрица может быть полимеризована с образованием различных форм и геометрических конфигураций, таких как массив столбиков, штырей или линейных бороздок, для облегчения обмена реагентами вокруг гидрогелевой матрицы и быстрой диффузии внутрь гидрогелевой матрицы и из нее.

[0322] Проточные кюветы для секвенирования содержат два типа олигонуклеотидов (например, P5 и P7), которые в качестве альтернативы называются праймерами для прививки, праймерами для захвата, поверхностными праймерами или праймерами для секвенирования, связанных с верхней и нижней поверхностями проточной кюветы с помощью слоев гидрогеля или другими способами прикрепления. Последовательности этих праймеров комплементарны адаптерам библиотеки, и эти олигонуклеотиды захватывают фрагменты библиотеки ДНК. При использовании в настоящем документе термины «P5» и «P7» относятся к универсальной последовательности P5 или P7 или праймеру P5 или P7 для захвата и (или) амплификации. Последовательность Р5 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1 (AATGATACGGCGACCACCGA), а последовательность P7 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

[0323] На ФИГ. 9A и 9B показана проточная кювета 1400, которая включает в себя массив 1402 отдельных гидрогелевых столбиков 1404, образованных внутри проточной кюветы фотолитографическим способом, таким как описанный выше. Столбики содержат праймеры P5/P7 и способствуют росту кластеров 1406 внутри гидрогелевой матрицы. На ФИГ. 10A показаны гидрогелевые столбики 1410, изготовленные внутри проточной кюветы MiSeq™, а на ФИГ. 10B-10F показаны изображения временного ряда, демонстрирующие введение флуоресцентного красителя в проточную кювету, диффузию красителя в гидрогелевые столбики и вымывание красителя из гидрогелевых столбиков. На ФИГ. 11-11B показаны гидрогелевые гранулы 1412, легированные с праймерами P5/P7, содержащими PAZAM. Гранулы изначально замачивают с библиотекой секвенирования, а затем замачивают в рамках процесса ExAmp для генерации кластеров по всему трехмерному объему каждой гранулы. На ФИГ. 12A-12B показано секвенирование без индексации, при котором каждая гидрогелевая гранула содержит кластеры (1420, 1422, 1424, 1426) из образца, в котором ее инкубировали. Гидрогелевые гранулы, содержащие такие кластеры, загружают в проточную кювету и секвенируют. Гранулы каждого типа образца можно отличить друг от друга различными способами, такими как, например, с применением флуорофоров, внедренных в гранулы, которые перед секвенированием удаляют.

[0324] На ФИГ. 13A показана проточная кювета 1430 для секвенирования, в которой секвенирование происходит в двухмерной сети кластеров на верхней внутренней поверхности 1440 и нижней внутренней поверхности 1450, и в которой верхняя внутренняя поверхность 1440 и нижняя внутренняя поверхность 1450 разделены известным расстоянием вдоль оси Z (например, 100 мкм). На ФИГ. 13B показана проточная кювета 1430, в которой секвенирование происходит в трехмерной сети кластеров на верхней внутренней поверхности 1440 и нижней внутренней поверхности 1450 и в областях 1442, 1444 и 1446, которые расположены между верхней внутренней поверхностью 1440 и нижней внутренней поверхностью 1450, причем верхняя внутренняя поверхность 1440 и нижняя внутренняя поверхность 1450 отделены известным расстоянием вдоль оси Z (например, 100 мкм). Преимущества и полезные свойства этого примера реализации по сравнению с существующими системами и способами NGS включают в себя: (i) повышение производительности отдельной проточной кюветы в > 50 раз. (ii) изготовление высокопроизводительных проточных кювет, не включающее перемещение оптической системы по осям X, Y; (iii) более эффективный расход реагентов для секвенирования благодаря использованию всего объема проточной кюветы, что сокращает количество отходов и улучшает экономические аспекты процесса секвенирования; и (iv) совместимость с большинством или со всеми существующими платформами секвенирования. В некоторых вариантах реализации местоположения кластеров идентифицируют во время первых процедур сканирования, а для последующих процедур сканирования назначают координаты X, Y, Z. Смещение по измерениям X и Y можно учесть, используя «карту эталонного кластера», которая генерируется во время первой процедуры сканирования. В настоящем документе термины «X», «Y» и «Z» или «ось X», «ось Y» и «ось Z» относятся к трехмерной декартовой системе координат.

[0325] Производительность можно рассчитать в отношении заданной платформы и размера проточной кюветы, используя количество кластеров на двухмерную плоскость и количество двухмерных срезов, которые можно визуализировать в проточной кювете. Последнее относится к системе оптического обнаружения конкретной платформы и зависит от толщины оптического сечения (dz) вдоль направления Z, которую можно рассчитать по следующей формуле:

где λ_em - длина волны возбуждения, n - показатель преломления образца, а NA - числовая апертура. Рассчитанные значения dz, полученные в отношении платформы с высоким и низким значением числовой апертуры (NA), приведены в ТАБЛИЦЕ 1 ниже. Объективы с более высоким увеличением могут иметь большее значение NA (т.е. более широкий угол для сбора информации), что также означает лучшее разрешение по оси Z (т. е. меньшие значения dz). На практике максимальное разрешение по оси Z приблизительно в 2-3 раза меньше, чем в измерениях X и Y. Более того, более короткие длины волн позволяют получить более высокое разрешение.

6.1. ТАБЛИЦА 1. Рассчитанные значения оптической толщины (dz) для платформы с низкими и высокими значениями NA Платформа нет данных n λ (нм) dz (мкм) NextSeq 0,35 1,36 550 7,7 600 8,4 675 9,4 740 10,3 HiSeq 0,75 1,36 550 1,6 600 1,7 675 1,9 740 2,1

[0326] Используя значения dz и толщину проточной кюветы, можно экстраполировать количество оптических сечений (или отдельных двухмерных срезов), достижимых в каждой проточной кювете, а также для получения потенциальных выходных данных (см. ТАБЛИЦУ 2 ниже). Например, система HiSeq™ с толщиной оптического сечения приблизительно 2 мкм может позволить получить изображение 50 отдельных 2D-срезов, тогда как система NextSeq™ с большим dz приблизительно 10 мкм может обеспечить получение 10 оптических сечений. Используя данную стратегию трехмерного секвенирования и принимая плотность кластеров в трех измерениях как постоянную, выход можно увеличить с 120 до 600 Гб в проточной кювете NextSeq™ и с 1460 до 22 500 Гб в проточной кювете HiSeq™. Еще большее увеличение плотности данных возможно за счет использования более объемных проточных кювет для максимального увеличения пространства для роста кластеров в трех измерениях.

6.2. ТАБЛИЦА 2. Рассчитанные выходные данные в отношении платформы с низкими и высокими значениями NA. Платформа dz (мкм) Интерпозер (мкм) Срезы 2D Выход/срез 2D (Гб) Общий выход (Гб) NextSeq 10 100 10 60 600 HiSeq 2 100 50 450 22500

[0327] Аналогично конфокальной микроскопии, примером способа оптической микроскопии для визуализации трехмерных структур является селективная микроскопия плоскостного освещения (SPIM), также называемая микроскопией плоскостного освещения. Существует множество вариантов реализации микроскопии плоскостного освещения, во всех из которых используется двухобъективная конфигурация. Для возбуждения используют первый объектив, как правило, недорогой и с низким значением NA; а второй объектив с более высоким значением NA используют для сбора флуоресцентного излучения образца, представляющего интерес, (см. ФИГ. 14). В данной геометрической конфигурации боковое (XY) разрешение системы определяется с помощью собирающей оптики, а осевое разрешение (Z) определяется объективом, применяемым для возбуждения, и длиной волны возбуждения. Данную технологию обычно используют для визуализации живых биологических образцов от клеток до целых организмов размером до нескольких миллиметров с разрешением в микронного масштаба со скоростью в сотни изображений в секунду. На ФИГ. 14 показан пример установки SPIM 1460, в которой возбуждение подают с использованием объектива с низким значением NA 1462 в образец 1464, причем флуоресцентное излучение собирают с помощью эмиссионного объектива с высоким значением NA 1466. Пучок можно формировать с помощью цилиндрической линзы для одновременного возбуждения полного поля флуорофоров, или однолинейный пучок можно сканировать методом скоростного сканирования через фокальную плоскость эмиссионного объектива для создания полного изображения. Последующее перемещение образца на механическом этапе обеспечивает быструю объемную визуализацию при высоком разрешении.

[0328] Как указано выше, описанные системы и способы обеспечивают материалы и структуры, занимающие весь объем проточной кюветы, способствующие образованию кластеров и обеспечивающие трехмерное секвенирование. Подходящие материалы: (i) занимают всю высоту канала проточной кюветы; (ii) обеспечивают включение олигонуклеотидов с помощью различных стратегий полимеризации или наличия подходящих функциональных групп (например, азидов); (iii) имеют регулируемую плотность функциональных групп для контроля плотности кластеров; (iv) способствуют потоку реагентов с минимальными градиентами диффузии; и (v) поддерживают конфокальную микроскопию во всей глубине проточной кюветы с минимальным рассеянием. Примеры подходящих материалов включают гидрогелевые сети заданного размера; матрицу из крупных частиц, мелких частиц или комбинации крупных и мелких частиц (например, частиц одного размера или частиц разных размеров); регулярно расположенные столбчатые штыри; и среднепористые кристаллические материалы. На ФИГ. 15 показана большая гидрогелевая сеть 1000 в проточной кювете для секвенирования. На ФИГ. 16 показана матрица из крупных частиц 1100, мелких частиц 1102 или комбинации крупных частиц 1100 и мелких частиц 1102 внутри проточной кюветы для секвенирования. На ФИГ. 17 показаны регулярно расположенные столбчатые штыри 1200 внутри проточной кюветы для секвенирования; а на ФИГ. 18 показаны среднепористые или микропористые кристаллические материалы 1300 внутри проточной кюветы для секвенирования. В некоторых примерах реализации трехмерную матрицу можно создать из фиброина шелка или полимерных волокон, таких как, например, целлюлоза/целлюлозные полимеры и их конструкции (например, бумага), на которых можно сформировать кластеры.

[0329] Крупная гидрогелевая сеть, как показано на ФИГ. 15, может быть создана путем полимеризации функционального гидрогеля внутри проточной кюветы, в результате чего образуется непрерывная полимерная сеть с равномерно распределенными функциональными группами, которые способствуют образованию кластеров. В одном варианте реализации PAZAM реагирует с ПЭГ, функционализированным DBCO. Плотностью сети можно управлять путем корректировки концентрации PAZAM и соотношения значений концентрации PAZAM:DBCO-ПЭГ для оптимизации плотности функциональных групп и диффузионных характеристик гидрогеля. В этом способе мягкая полимерная сеть используется в качестве трехмерного каркаса с точками фиксации нуклеиновых кислот, определяющими место расположения кластеров в гидрогелевой матрице. На ФИГ. 19A-14D показан пример реализации способа образования гидрогеля на проточной кювете путем полимеризации PAZAM + ди-DBCO-ПЭГ.

[0330] Трехмерная матрица из сплошных или пористых частиц, таких как показанные на ФИГ. 16, образует надежную сеть, в которой реакции секвенирования протекают на поверхности частиц или внутри частиц, а диффузия реагентов происходит в промежуточных областях между частицами. Кластеры расположены на поверхности частиц или по всему объему частиц. В этом варианте реализации частицы выполнены с возможностью обеспечения оптимальной площади поверхности, модуля упругости и оптической прозрачности. Примеры включают пористые гидрогелевые гранулы (например, акриламидные гели), сплошные полимерные частицы (например, полистирол), полимерные частицы с ядром и оболочкой и неорганические материалы (например, частицы диоксида кремния); все из них несут праймеры для прививки на их поверхности и (или) на всем протяжении их трехмерных структур.

[0331] Как показано на ФИГ. 20, в примере реализации несущие олигомеры гидрогелевые гранулы получали с использованием простой капельной генерации в комбинации с сополимеризацией акриламида и модифицированных акрилатами олигонуклеотидов (доступных в продаже от компании Integrated DNA Technologies, Inc.). На ФИГ. 20 показана сополимеризация акриламида и модифицированных акрилатами олигонуклеотидов с образованием крупных полиакриламидных гранул. Поскольку размер гидрогелевых гранул немного больше (~120 мкм), чем высота верхней и нижней поверхностей типовой проточной кюветы (например, 100 мкм), гидрогелевые гранулы могут быть плотно упакованы и захвачены внутрь проточных кювет без какого-либо химического прикрепления к ним. на ФИГ. 21A показано изображение светлопольной микроскопии, на котором представлены гидрогелевые гранулы на предметном стекле; а на ФИГ. 21B показано изображение светлопольной микроскопии, на котором показаны гидрогелевые гранулы, помещенные внутрь проточной кюветы HiSeq™. Чтобы продемонстрировать, что реагенты могут легко диффундировать в пористые гидрогелевые гранулы, изготовленные описанными способами, и из них, меченную красителем комплементарную нить\ гибридизировали с меченными олигомерами акриламидными гранулами для обнаружения флуоресценции по всей гидрогелевой матрице. Контрольные стандартные акриламидные гранулы, к которым не прививали олигонуклеотиды, не демонстрировали флуоресцентного сигнала при инкубации с меченой красителем комплементарной нитью, тем самым подтверждая, что сигнал, обнаруженный при использовании модифицированных олигомерами акриламидных гранул, был инициирован путем гибридизации и что олигонуклеотиды могли удерживаться внутри гранул без наличия связанных с гидрогелем комплементарных нитей. на ФИГ. 22A показано изображение флуоресцентной микроскопии стандартных акриламидных гранул после инкубации с меченой красителем комплементарной нитью; а на ФИГ. 17B показано полученное с помощью флуоресцентного микроскопа изображение олигомодифицированных акриламидных гранул после инкубации с меченой красителем комплементарной нитью.

[0332] Данный вариант реализации легко трансформируется в простой способ выполнения длинных прочтений, в соответствии с которым гидрогелевые гранулы, несущие праймеры для прививки, инкапсулируют длинные фрагменты библиотеки ДНК (~100 т. п. н.) и выступают в качестве реакционного сосуда для ферментативных процессов, таких как, например, мечение, лигирование и кластеризация, для создания уникальных пространственно разделенных кластеров связанных считываний. Внутренние меченые и лигированные фрагменты ДНК связываются с праймерами Р5 и Р7, распределенными внутри гидрогелевых гранул, чтобы обеспечить образование кластеров с помощью мостиковой амплификации по всей трехмерной гидрогелевой структуре, а также образование уникального пространственного штрих-кода. на ФИГ. 23A показаны гидрогелевые гранулы, в которых длинные фрагменты ДНК инкапсулированы внутри проточной кюветы; на ФИГ. 23B показаны ферментативные процессы получения библиотеки, происходящие внутри захваченных гидрогелевых гранул, изображенных на ФИГ. 23A; а на ФИГ. 23C показана амплифицированная библиотека, генерирующая кластеры связанных прочтений, распределенных в трех измерениях внутри каждой гидрогелевой гранулы.

[0333] Некоторые варианты реализации с использованием трехмерных матриц сплошных или пористых частиц включают в себя частицы, имеющие сложные физические и химические структуры, за пределами проточной кюветы, которые направлены в проточную кювету и иммобилизованы в ней путем поперечного сшивания. Клональная амплификация библиотек нуклеиновых кислот может сначала происходить на гранулах за пределами проточной кюветы, а затем гранулы направляют в проточную кювету в водном растворе, содержащем предшественники гидрогеля, такие как описанные выше. Затем предшественники гидрогеля поперечно сшивают с использованием ранее описанных способов для создания каркаса на проточной кювете. На ФИГ. 24A показаны захват матрицы и удлинение, происходящие на гидрогелевых гранулах, несущих олигонуклеотиды; а на ФИГ. 24B показана клональная амплификация библиотечных вставок на гидрогелевых гранулах для создания кластеров. На ФИГ. 25A показаны кластеризованные гранулы, доставляемые в проточную кювету к раствору предшественника гидрогеля; на ФИГ. 25B показана иммобилизация кластеризованных гранул в матрице поперечносшитого гидрогеля для сохранения пространственных местоположений гранул в трех измерениях в процессе секвенирования и последующей визуализации.

[0334] Подготовка гидрогелевых гранул вне проточной кюветы позволяет получить пространственно сгруппированные области ортогональных химических соединений для линеаризации с использованием конкретной конфигурации гранул. Затем такие гранулы могут доставлять в проточную кювету и использовать для одновременного секвенирования прямых/обратных нитей в трех измерениях. Для этого используют гидрогелевые частицы, имеющие пространственно разделенные олигонуклеотидные праймеры, имеющие уникальные химические соединения для линеаризации. С помощью непрерывных поточных реакций, в которых предшественники частиц синтезируют и функционализируют перед димеризацией, были продемонстрированы димеры частиц, имеющие разные поверхностно активные вещества. Димерные частицы можно использовать для пространственно-связанных прочтений в прямом и обратном направлениях в трех измерениях. На ФИГ. 26 показаны частицы димера, имеющие различные ортогональные химические соединения для линеаризации; а на ФИГ. 27 показана система предшествующего уровня техники для синтеза аналогичных димерных частиц.

[0335] Некоторые варианты реализации описанных систем и способов обеспечивают функциональные трехмерные каркасы с использованием столбчатых штырей, которые проходят вертикально от низа проточной кюветы до верха проточной кюветы, как показано на ФИГ. 17. Данные столбчатые штыри могут быть изготовлены с использованием методик нисходящего микропроизводства, таких как, например, фотолитография; тонкопленочное осаждение; и селективное травление. Поверхности столбиков можно функционализировать с помощью ранее описанных способов, которые включают в себя PAZAM, для создания жесткой сети химически активных столбиков, обеспечивая при этом протекание жидкости и химическую диффузию по промежуточным областям между столбиками. В некоторых вариантах реализации используют столбики, изготовленные таким образом, чтобы они имели переменный состав материала в направлении Z. Такие столбики можно подвернуть селективной функционализации на поверхности одного из двух материалов, что позволяет контролировать пространственное распределение кластеров в направлении Z с целью ограничения мультиклональности и упрощения оптической визуализации. В данном варианте реализации коллектор Z-срезов для оптического опроса имеет систематическую пространственную организацию. На ФИГ. 28A и 28B показано пространственное управление кластерами в трех измерениях с использованием трехмерной матрицы столбчатых штырей, имеющих переменный состав материала в направлении Z.

[0336] В некоторых вариантах реализации для создания каркасов проточных кювет используются микропористые кристаллические материалы, такие как показанные на ФИГ. 18. Микропористые кристаллические материалы имеют четко определенные структуры, включающие в себя поры, упорядоченные и выровненные в одном направлении. Таким образом, эти материалы по существу обеспечивают уплотненные каналы для текучей среды, причем каждая пора представляет собой один канал для текучей среды. Поверхности многих пористых материалов могут быть функционализированы; таким образом, микропористый материал с выровненными порами может функционировать в качестве матрицы для трехмерного секвенирования с химическими реакциями, происходящими на стенках пор. Как показано на ФИГ. 18, как поток текучей среды, так и оптическая визуализация протекают в направлении Z, если смотреть вниз по длинной оси поры. Микропористый кремний является одним из примеров материала, который может быть изготовлен так, чтобы иметь предварительно ориентированные поры контролируемого размера. Боковые размеры и толщина микропористых кремниевых пленок легко контролируются выбором пластины предшественника, и проточные кюветы могут быть получены путем установки микропористых кремниевых пленок на отдельную кювету для текучей среды.

[0337] В некоторых вариантах реализации для трехмерного секвенирования на проточной кювете используются полимерные каркасы. На ФИГ. 29A-29D показан упрощенный пример способа создания полимерного каркаса, в соответствии с которым в неполимеризованный мономерный раствор внедрены частицы соли, имеющие предварительно заданное распределение по размерам. Частицы соли замещают мономер, таким образом создавая трехмерную сеть в растворе. Мономерный раствор полимеризуют с образованием трехмерного полимерного каркаса вокруг частиц соли и частицы соли растворяют, в результате чего образуется разупорядоченный трехмерный массив пор, определяющий каркас. Такие каркасы можно активировать и покрыть гидрогелем, таким как PAZAM. Хотя такие каркасы необязательно представляют собой расположенные на равном расстоянии друг от друга, многослойные структуры, такие как описанные ранее, подходящая стратегия визуализации позволит визуализировать весь каркас и затем применить обработку изображения для идентификации различных кластеров. В частицы соли, используемые в данном примере реализации, могут быть добавлены пассивированные металлические частицы. После растворения частиц соли эти частицы остаются в каркасе в фиксированных местах. Во время визуализации эти частицы можно использовать для получения точек, по которым можно выровнять кластеры и которые таким образом по существу действуют как реперные знаки.

[0338] На ФИГ. 30 показана блок-схема, иллюстрирующая пример способа изготовления проницаемой трехмерной матрицы на проточной кювете. Способ 2500 включает встраивание олигонуклеотидов в проницаемую трехмерную матрицу в блоке 2502; введение содержащей олигонуклеотид проницаемой трехмерной матрицы в проточную кювету в блоке 2504, причем проточная кювета включает в себя по меньшей мере один канал для приема содержащей олигонуклеотид проницаемой трехмерной матрицы.

[0339] На ФИГ. 31 показана блок-схема, иллюстрирующая первый пример способа секвенирования библиотеки нуклеиновых кислот в трех измерениях. Способ 2600 включает загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету в блоке 2602, причем раствор предшественника полимера включает мономеры и олигонуклеотиды; полимеризацию раствора предшественника полимера для создания проницаемой трехмерной матрицы внутри проточной кюветы в блоке 2604; диффузию библиотеки секвенирования в проницаемую трехмерную полимерную матрицу в блоке 2606, причем библиотека секвенирования включает фрагменты нуклеиновых кислот; диффузию ферментов и реагентов в проницаемую трехмерную полимерную матрицу в блоке 2608; гибридизацию фрагментов нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами в проницаемой трехмерной полимерной матрице в блоке 2610; клональную амплификацию гибридизированных фрагментов нуклеиновых кислот для создания кластеров для секвенирования в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы в блоке 2612; секвенирование кластеров в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы в блоке 2614; и оптическую визуализацию секвенированных кластеров в пределах трехмерной матрицы во множестве дискретных двухмерных срезов для описания характеристик библиотеки секвенирования в блоке 2614, причем множество дискретных двухмерных срезов представляют весь трехмерный внутренний объем проточной кюветы.

[0340] На ФИГ. 32 показана блок-схема, иллюстрирующая второй пример способа секвенирования библиотеки нуклеиновых кислот в трех измерениях. Способ 2700 включает загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету в блоке 2702, причем раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и олигонуклеотиды; полимеризацию раствора предшественника полимера с использованием ультрафиолетового света для создания проницаемой трехмерной матрицы внутри проточной кюветы в блоке 2604; диффузию библиотеки секвенирования в проницаемую трехмерную полимерную матрицу в блоке 2606, причем библиотека секвенирования включает фрагменты нуклеиновых кислот; диффузию ферментов и реагентов в проницаемую трехмерную полимерную матрицу в блоке 2608; гибридизацию фрагментов нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами в проницаемой трехмерной полимерной матрице в блоке 2610; клональную амплификацию гибридизированных фрагментов нуклеиновых кислот для создания кластеров для секвенирования в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы в блоке 2612; секвенирование кластеров в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы в блоке 2614; и применение конфокального микроскопа или микроскопа плоскостного освещения для визуализации секвенированных кластеров в пределах трехмерной матрицы во множестве дискретных двухмерных срезов для описания характеристик библиотеки секвенирования в блоке 2616, причем множество дискретных двухмерных срезов представляют весь трехмерный внутренний объем проточной кюветы.

[0341] IV. Функционализация гидрогелевых структур на проточной кювете

[0342] Для создания обратимых гидрогелевых структур в каналах для текучей среды на проточных кюветах можно использовать различные варианты реализации описанных систем, устройств и способов, которые можно использовать для введения временных функциональных поверхностей в проточную кювету в дополнение к уже существующим поверхностям секвенирования. Данные временные функциональные поверхности можно использовать для множества вариантов применения, включая, например, (i) обогащение целевой ДНК; (ii) скрининг коротких палиндромных повторов, разделенных регулярными промежутками (CRISPR); и (iii) сферы применения высокоуплотненного скрининга с использованием ДНК-конъюгированных антигенов. С помощью способов, описанных в настоящем документе (включая изложенные выше), изготавливают гидрогелевые микростолбики на проточной кювете, дополненные стрептавидиновыми фрагментами. Как более подробно описано ниже, биотинилированные захватные олигонуклеотиды связываются со стрептавидином и иммобилизуют целевые молекулы библиотеки на гидрогелевых структурах для обогащения библиотеки в проточной кювете. Аналогичным образом, белки и олигонуклеотиды могут быть присоединены к гидрогелевым столбикам с помощью биотин-стрептавидиновой связи для обеспечения различных других процессов скрининга, таких как скрининг CRISPR. Описанные варианты реализации обеспечивают гораздо большую площадь поверхности реакций связывания из-за пористого характера гидрогелей и позволяют проводить скрининг всего объема проточной кюветы, а не только поверхности, на предмет событий связывания, что приводит к более высокой способности к связыванию и скорости реакции.

[0343] Пример реализации показан на ФИГ. 33, на которой показано образование гидрогелевых микростолбиков на канале в проточной кювете с использованием ранее описанного способа изготовления гидрогелевых микроструктур на проточной кювете. На ФИГ. 33 проточная кювета 400 вставлена в картридж 460. Массив 450 отдельных гидрогелевых микростолбиков 452 образован внутри канала 422 и виден на снимке светлопольной микроскопии в нижней части ФИГ. 33. В одном примере реализации гидрогелевые микростолбики 452 создают путем сополимеризации акриламидного мономера и поперечносшивающего агента N,N'-бис(акрилоил)цистамина. Контроль пространственного формирования рисунка осуществляется с помощью фотоинициатора фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфината лития (LAP) для инициирования реакции полимеризации путем направления ультрафиолетового излучения через фотошаблон, расположенный на проточной кювете 400 над каналом 422. На ФИГ. 34A-34C показано изготовление гидрогелевых микростолбиков 452 на проточной кювете, причем раствор предшественника гидрогеля, который включает акриламидные и поперечносшивающие мономеры и фотоинициатор, вводят в проточную кювету 400 (ФИГ. 34A), а затем подвергают воздействию УФ-излучения через фотошаблон 418 (ФИГ. 34B), на который предварительно нанесен рисунок с требуемыми элементами (например, отверстия имеют конкретную геометрическую форму) для образования гидрогелевых столбиков (ФИГ. 34C). На ФИГ. 34A-34C проточная кювета 400 имеет узкий канал 422, в котором образованы гидрогелевые микростолбики 452, и широкий канал 424. Гидрогелевые микростолбики 452 прикреплены как к верхней поверхности 412, так и к нижней поверхности 414 узкого канала 422.

[0344] Проточная кювета 400 снабжена двумя типами олигонуклеотидов (например, P5 и P7), которые называются поверхностными праймерами или праймерами для секвенирования, связанными с верхней и нижней поверхностями проточной кюветы. Последовательности этих поверхностных праймеров комплементарны библиотечным адаптерам, и эти олигонуклеотиды захватывают фрагменты библиотеки ДНК. При использовании в настоящем документе термины «P5» и «P7» относятся к универсальной последовательности P5 или P7 или праймеру P5 или P7 для захвата и (или) амплификации. Последовательность Р5 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1 (AATGATACGGCGACCACCGA), а последовательность P7 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

[0345] ПРИМЕР 5. Конъюгированный с PAZAM биотин

[0346] В примере реализации, показанном на ФИГ. 35A-6E, функционализированные обратимые гидрогелевые структуры формировали внутри канала в проточной кювете с использованием сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламида и акриламида (PAZAM), в который встроены азидные фрагменты; и клик-реакции азид-алкин. Клик-реакция азид-алкин включает катализируемую медью реакцию азида с алкином и с образованием 5-членного гетероатома: катализируемое Cu(I) азид-алкиновое циклоприсоединение (CuAAC). Клик-реакцию азид-алкин можно подвергнуть фотоинициации с использованием Cu (II) и фотоинициирующей системы, такой как фотоинициирующая система II типа, например камфорхинон, в которой в качестве источника возбуждения может использоваться синий свет с длиной волны 470 нм.

[0347] В этом примере реализации гидрогелевые микростолбики сначала изготавливают внутри проточной кюветы MiSeq™ (или любой другой подходящей проточной кюветы) с использованием УФ-опосредованной сополимеризации акриламида, поперечносшивающего агента и PAZAM, в которую встроены азидные фрагменты. Затем на азидные фрагменты PAZAM наносят комплекс биотин-полиэтиленгликоль (ПЭГ)-алкин и используют для связывания стрептавидина. Затем множественные сайты связывания стрептавидина позволяют иммобилизованному стрептавидину иммобилизовать захватные зонды олигонуклеотидов, которые в свою очередь гибридизируются с молекулами библиотеки секвенирования, представляющими интерес, которые вводят в проточную кювету. Все негибридизированные фрагменты библиотеки вымывают из проточной кюветы. Связанные фрагменты библиотеки секвенирования затем элюируют из гидрогелевых микростолбиков, расположенных в узком канале (зона без секвенирования) проточной кюветы, и высевают в широкий канал (зона секвенирования) проточной кюветы при подготовке к амплификации, кластеризации и секвенированию путем синтеза или секвенированию другим способом.

[0348] На ФИГ. 35A-35E показан пример реализации способа изготовления функционализированных гидрогелевых структур на проточной кювете. На ФИГ. 35A в проточную кювету 400 загружают раствор предшественника гидрогеля, содержащий 10% полиакриламида (PA), поперечносшивающего агента и 0,25% PAZAM, в которую встроены азидные фрагменты. На ФИГ. 35A проточная кювета 400 представляет собой проточную кювету MiSeq™ с узким каналом 422 и широким каналом 424. На ФИГ. 35B фотошаблон 418, включающий в себя множество образованных в нем отверстий размером 200 мкм, помещают на верхнюю часть проточной кюветы 400, которая затем подвергается воздействию УФ-излучения в течение 10 секунд для сополимеризации акриламида и PAZAM с образованием массива 450 функционализированных азидом гидрогелевых микростолбиков 452 в узком канале 422. На ФИГ. 35C биотинил-ПЭГ-алкин в концентрации 5 мкМ прикрепляют к азидным фрагментам во время инкубации Blackpool. На ФИГ. 35D стрептавидин, меченый флуоресцеином (1:500), связывает биотин в гидрогелевых микростолбиках 452. На ФИГ. 35E стрептавидин связывает биотинилированные захватные олигонуклеотиды для обеспечения иммобилизации целевых молекул библиотеки секвенирования, которые были помечены в процессе получения библиотеки последовательностями, комплементарными последовательностям захватных олигонуклеотидов.

[0349] ФИГ. 36A-36F представляют собой серию снимков светлопольной микроскопии и флуоресцентной микроскопии (возбуждение 488 нм), демонстрирующих окрашивание биотинилированных гидрогелевых микростолбиков флуоресцеином-стрептавидином. На ФИГ. 36A показано 4-кратное увеличение снимка светлопольной микроскопии контроля PA/PAZAM (без биотина). На ФИГ. 36B показано 4-кратное увеличение снимка светлопольной микроскопии комбинации PA/PAZAM плюс Blackpool. На ФИГ. 36C показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии контроля PA/PAZAM (без биотина) после реакции в течение пяти минут. На ФИГ. 36D показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии комбинации PA/PAZAM плюс Blackpool после реакции в течение пяти минут. На ФИГ. 36E показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии контроля PA/PAZAM (без биотина) после реакции в течение десяти минут при 40°C. На ФИГ. 36F показано 4-кратное увеличение снимка флуоресцентной микроскопии PA/PAZAM плюс Blackpool после реакции в течение десяти минут при 40°C. На ФИГ. 36D и 7F показано, что меченный флуоресцеином стрептавидин связывает конъюгированные с биотином гидрогелевые микростолбики. В контрольном эксперименте (ФИГ. 36C и 36E), микростолбики полиакриламида/PAZAM без биотина не связывались со стрептавидином, меченным флуоресцеином. На этих фигурах четко показано, что конъюгированные с биотином (функционализированные) гидрогелевые микростолбики эффективно связывают целевые молекулы, представляющие интерес, т. е. меченный флуоресцеином стрептавидин в данном конкретном примере.

[0350] ПРИМЕР 6. Сополимер стрептавидина и акриламида

[0351] В примере реализации, показанном на ФИГ. 37A-37D, функционализированные обратимые гидрогелевые структуры образуются внутри канала в проточной кювете путем фотополимеризации акриламидного мономера, поперечносшивающего агента и меченного стрептавидином акриламидного мономера. Стрептавидиновые функциональные группы гидрогеля связывают биотинилированные захватные олигонуклеотиды, которые, в свою очередь, гибридизируются с молекулами библиотеки секвенирования, представляющими интерес и введенными в проточную кювету. Негибридизированные фрагменты библиотеки вымывают из проточной кюветы. Связанные фрагменты библиотеки секвенирования затем элюируют из гидрогелевых микростолбиков, расположенных в узком канале (зона без секвенирования) проточной кюветы, и высевают в широкий канал (зона секвенирования) проточной кюветы при подготовке к амплификации, кластеризации и секвенированию путем синтеза или секвенированию другим способом.

[0352] На ФИГ. 37A в проточную кювету 400 загружают раствор предшественника гидрогеля, содержащий 10% полиакриламида (PA) и 0,25% меченного стрептавидином акриламидного мономера. На ФИГ. 37A проточная кювета 400 представляет собой проточную кювету MiSeq™ с узким каналом 422 и широким каналом 424. На ФИГ. 37B фотошаблон 418, включающий в себя множество образованных в нем отверстий размером 200 мкм, помещают на верхнюю часть проточной кюветы 400, которую затем подвергают воздействию УФ-излучения в течение 10 секунд для сополимеризации акриламида и меченных стрептавидином акриламидных мономеров, и образуют массив 450 функционализированных стрептавидином гидрогелевых микростолбиков 452 в узком канале 422. На ФИГ. 37C биотинилированные захватные олигонуклеотиды связываются со стрептавидиновыми группами в гидрогелевых структурах, а целевые молекулы библиотеки гибридизируются с биотинилированным захватным олигонуклеотидом и иммобилизуются на гидрогелевых микростолбиках. На ФИГ. 37D иммобилизованные целевые молекулы элюируют из захватных олигонуклеотидов и высевают в широкий канал 424 проточной кюветы 400 для амплификации, кластеризации, секвенирования путем синтеза и секвенирования другим способом.

[0353] Как показано на ФИГ. 38A-38C, стрептавидин на поверхности гидрогелевых столбиков 452 можно обнаружить путем инкубации с биотинилированными праймерами P5 и P7. На ФИГ. 38A показаны биотинилированные праймеры Р5 и Р7 (908 и 906 соответственно) для связывания с функционализированным стрептавидином гидрогелевым микростолбиком 452. На ФИГ. 38B показаны биотинилированные праймеры P5 и P7 (908 и 906 соответственно), инкубируемые с меченными TET комплементарными олигонуклеотидами P5’ и P7’ (909 и 907 соответственно). На ФИГ. 38C показаны меченные TET комплементарные олигонуклеотиды P5’ и P7’ (909 и 907 соответственно), гибридизированные с биотинилированными праймерами P5 и P7 (908 и 906 соответственно). Контрольные гидрогелевые микростолбики, изготовленные без стрептавидина, не демонстрируют окрашивания праймерами, меченными TET, тогда как столбики, содержащие стрептавидин, демонстрируют окрашивание праймерами, меченными TET.

[0354] На ФИГ. 39A показан снимок светлопольной микроскопии, на котором показаны гидрогелевые микростолбики 452, инкубированные с TET-P5’ и TET-P7’ при отсутствии биотинилированных олигонуклеотидов P5 и P7. На ФИГ. 39B показан снимок флуоресцентной микроскопии (возбуждение 488 нм), демонстрирующий гидрогелевые микростолбики 452, инкубированные с TET-P5’ и TET-P7’ при отсутствии биотинилированных олигонуклеотидов P5 и P7, причем наблюдали равномерное окрашивание поверхностных праймеров Р5 и Р7 проточной кюветы. На ФИГ. 39C показан снимок светлопольной микроскопии, на котором показаны гидрогелевые микростолбики 452, инкубированные с TET-P5' и TET-P7', после инкубации с биотинилированными олигонуклеотидами P5 и P7. На ФИГ. 39D показан снимок флуоресцентной микроскопии (возбуждение 488 нм), демонстрирующий гидрогелевые микростолбики 452, инкубированные с TET-P5’ и TET-P7’ после инкубации с биотинилированными олигонуклеотидами P5 и P7, причем наблюдали локализацию окрашивания TET по краю гидрогелевых микростолбиков, что указывает на то, что меченые TET олигонуклеотиды гибридизировались со связанными со стрептавидином биотинилированными праймерами P5 и P7.

[0355] При инкубации олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ с содержащими стрептавидин микростолбиками, которые предварительно инкубировали с биотинилированными олигонуклеотидами P5 и P7, в промежуточном пространстве между микростолбиками на проточной кювете наблюдалось истощение меченых TET праймеров по мере увеличения флуоресценции на поверхности микростолбиков и проникновения в гидрогель. На ФИГ. 40A показан снимок флуоресцентной микроскопии, иллюстрирующий уровень олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками при инкубации в течение одной минуты, а на ФИГ. 40B показан график, на котором представлен уровень олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками при инкубации в течение одной минуты с указанием расстояния по оси X и уровня по оси Y. На ФИГ. 40C показан снимок флуоресцентной микроскопии, иллюстрирующий уровень олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками при инкубации в течение пяти минут, а на ФИГ. 40D показан график, на котором представлен уровень олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками при инкубации в течение пяти минут с указанием расстояния по оси X и уровня по оси Y. На ФИГ. 40E показан снимок флуоресцентной микроскопии, иллюстрирующий уровень олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками при инкубации в течение десяти минут, а на ФИГ. 40F показан график, на котором представлен уровень олигонуклеотидов TET-P5’/TET-P7’ в промежуточных пространствах между гидрогелевыми микростолбиками при инкубации в течение десяти минут с указанием расстояния по оси X и уровня по оси Y. Профили интенсивности флуоресценции, представленные на этих микроскопических снимках, показывают, что связывание меченных TET олигонуклеотидов с поверхностью гидрогеля истощает олигонуклеотиды в промежуточных областях между микростолбиками.

[0356] Как показано на ФИГ. 41A-41C, для демонстрации способности к захвату и высвобождению целевых молекул в соответствии с вышеописанным примером реализации библиотеку PhiX инкубировали с биотинилированными праймерами P5 и P7 (1:10). На ФИГ. 41A показаны гибридизирующиеся области Р7’- и Р5’-концов библиотек секвенирования (902 и 904 соответственно) с биотинилированными олигонуклеотидами Р5 и Р7 (906 и 908 соответственно). На ФИГ. 41B показаны захватывающие молекулы библиотеки секвенирования 902 и 904 с функционализированными стрептавидином гидрогелевыми столбиками 452, которые прикреплены к поверхности проточной кюветы 400. На ФИГ. 41C показан процесс посева связанных молекул библиотеки секвенирования 902 и 904 путем инкубации при 85°C для денатурации гибридизированных биотинилированных праймеров 906 и 908 и последующего линейного изменения температуры до 20°C для обеспечения гибридизации молекул 902 и 904 библиотеки с поверхностными праймерами 510 и 912 соответственно. Затем гибридизированную библиотеку PhiX (1 пМ) инкубировали либо в необработанной проточной кювете (контроль), либо в проточной кювете с рисунком из стрептавидиновых столбиков. После инкубации с молекулами библиотеки, гибридизированными с биотиновыми праймерами, проточные кюветы промывали HT-1 с последующим посевом (5 мин при 80°C, 5 мин при 60°C, 2 мин при 40°C и 2 мин при 20°C), первым удлинением (AMS-1, 50°C 5 мин) и 24 циклами мостиковой амплификации. В то время как в контрольной проточной кювете скопления отсутствуют (см. ФИГ. 42A-42B), проточные кюветы со стрептавидиновыми столбиками показали высокую плотность скоплений (см. ФИГ. 42C-42F), демонстрируя успешный захват библиотеки, гибридизированной с биотином-P5/биотином-P7.

[0357] На ФИГ. 42A показан снимок светлопольной микроскопии необработанной проточной кюветы (контроль), а на ФИГ. 42B показан снимок флуоресцентной микроскопии (488 нм) окрашенной красителем SYTOX (ThermoFisher Scientific) необработанной проточной кюветы (контроль) без кластеров. На ФИГ. 42C показан снимок светлопольной микроскопии проточной кюветы, имеющей стрептавидиновые микростолбики, а ФИГ. 42D представляет собой снимок флуоресцентной микроскопии (488 нм) окрашенной красителем SYTOX проточной кюветы, имеющей стрептавидиновые микростолбики. На ФИГ. 42E показан снимок светлопольной микроскопии гидрогелевого микростолбика, показанного на ФИГ. 42C. На ФИГ. 42F показан снимок флуоресцентной микроскопии (488 нм) окрашенного красителем SYTOX микростолбика, показанного на ФИГ. 42D. Полученные снимки флуоресцентной микроскопии окрашенных красителем SYTOX проточных кювет показывают, что, хотя необработанные проточные кюветы не содержат кластеров, проточная кювета со стрептавидиновыми и гидрогелевыми столбиками демонстрирует высокую плотность кластеров и «отпечатки» в местах, где были нанесены рисунки из гидрогелевых микростолбиков. Кроме того, при формировании рисунка только одного канала (узкого канала) проточной кюветы стрептавидиновыми столбиками кластеры демонстрируют градиент плотности в той же проточной кювете, причем плотность кластеров вблизи столбиков выше. На ФИГ. 43A изображена проточная кювета 400 в картридже 460, в которой стрептавидиновые микростолбики образованы в узком канале 422, но не в широком канале 422. Если рисунки из стрептавидиновых столбиков нанесены только в узком канале проточной кюветы MiSeq™, плотность кластеров образует градиент от высокой вблизи микростолбиков (узкий канал) до низкой в удалении от микростолбиков (широкий канал). На ФИГ. 43B показан микроскопический снимок широкого канала 424, окрашенного красителем SYTOX, после 24 циклов мостиковой амплификации, а на ФИГ. 43C показан снимок флуоресцентной микроскопии узкого канала 422, окрашенного красителем SYTOX, после 24 циклов мостиковой амплификации. В приведенных ниже описаниях представлены некоторые дополнительные примеры, относящиеся к способам, предложенным в настоящем документе. Они не обязательно являются частью не имеющих ограничительного характера рабочих примеров, представленных выше.

[0358] На ФИГ. 44 показана блок-схема, иллюстрирующая первый способ изготовления функционализированных трехмерных полимерных структур на проточной кювете. Способ 1500 включает загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету в блоке 1902, в соответствии с которым раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и функционализированный полимер, такой как, например, PAZAM, содержащий азидные фрагменты, причем проточная кювета включает в себя по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом в блоке 1904, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; и облучение раствора предшественника полимера через фотошаблон источником света в блоке 1906, причем источник света излучает свет с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, и причем при активации фотоинициатора полимеризуется раствор предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, проходящие от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала.

[0359] На ФИГ. 45 показана блок-схема, иллюстрирующая второй способ изготовления функционализированных трехмерных полимерных структур на проточной кювете. Способ 1600 включает загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету в блоке 1602, в соответствии с которым раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и PAZAM, содержащий азидные фрагменты, причем проточная кювета включает в себя по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом в блоке 1604, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; облучение раствора предшественника полимера через фотошаблон источником света в блоке 1606, причем источник света излучает свет с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, и причем при активации фотоинициатора полимеризуется раствор предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, проходящие от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала; взаимодействие комплекса биотин-ПЭГ-алкин с азидными фрагментами в PAZAM в трехмерных полимерных структурах с помощью клик-реакции азид-алкин в блоке 1608; связывание стрептавидина с биотином в комплексе биотин-ПЭГ-алкин в блоке 1610; и связывание биотинилированных захватных олигонуклеотидов со стрептавидином в блоке 1612, причем биотинилированные захватные олигонуклеотиды специфичны к представляющим интерес целевым молекулам в библиотеке секвенирования.

[0360] На ФИГ. 46 показана блок-схема, иллюстрирующая третий способ изготовления функционализированных трехмерных полимерных структур на проточной кювете. Способ 1700 включает загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету в блоке 1702, причем раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент, фотоинициатор и меченный стрептавидином акриламидный мономер, и причем проточная кювета включает в себя по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; размещение фотошаблона по меньшей мере над одним каналом в блоке 1704, причем фотошаблон включает в себя ряд образованных в нем отверстий; облучение раствора предшественника полимера через фотошаблон источником света в блоке 1706, причем источник света излучает свет с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, и причем при активации фотоинициатора полимеризуется раствор предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, проходящие от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала; связывание биотинилированных захватных олигонуклеотидов со стрептавидином в трехмерных полимерных структурах в блоке 1708, причем биотинилированные захватные олигонуклеотиды специфичны к представляющим интерес целевым молекулам в библиотеке секвенирования и связываются с ними; и элюирование связанных целевых молекул и посев элюированных целевых молекул на поверхности проточной кюветы, имеющей связанные с ней олигонуклеотиды, в блоке 1710.

[0361] Вышеприведенное описание предоставлено для того, чтобы специалист в данной области мог реализовать на практике различные конфигурации, описанные в настоящем документе. Хотя технология, являющаяся объектом изобретения, описана, в частности, со ссылкой на различные фигуры и конфигурации, следует понимать, что она приведена только в качестве иллюстрации и не должна рассматриваться как ограничивающая объем технологии, являющейся объектом изобретения.

[0362] Вся литература и аналогичные материалы, цитируемые в настоящей заявке, включая, без ограничений, патенты, заявки на патенты, статьи, книги, научные трактаты и веб-страницы, независимо от формата такой литературы и аналогичных материалов, включены в настоящий документ посредством ссылки. В случае если один или более из включенной в настоящий документ литературы и аналогичных материалов отличаются от настоящей заявки или противоречит ей, включая, без ограничений, определенные термины, использование терминов, описанные методы и т. п., данная заявка имеет преобладающую силу.

[0363] Используемые в настоящем документе формы единственного числа подразумевают как единственные, так и множественные формы, если из контекста явно не следует иное. Используемый в настоящем документе термин «содержащий» представляет собой синоним терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и является включающим или не имеющим ограничительного характера, и он не исключает дополнительных неуказанных элементов или стадий способа. Несмотря на то, что можно использовать многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, в настоящем документе приводятся примеры приемлемых способов и материалов. Если контекст не указывает иное, указания числовых диапазонов по конечным точкам включают в себя все числа, входящие в этот диапазон. Более того, ссылки на «один вариант реализации» не следует интерпретировать как исключающие существование дополнительных вариантов реализации, которые также включают в себя указанные элементы. Более того, если явно не указано иное, варианты реализации «содержащие» или «имеющие» элемент или множество элементов, имеющих конкретное свойство, могут включать в себя дополнительные элементы, независимо от того, имеют ли они это свойство или нет.

[0364] Термины «по существу» и «приблизительно», используемые в данном описании, используются для описания и учета небольших колебаний, например, из-за вариаций при обработке. Например, они могут относиться к колебаниям, меньшим или равным ±5%, например, меньшим или равным ±2%, например, меньшим или равным ±1%, например, меньшим или равным ±0,5%, например, меньшим или равным ±0,2%, например, меньшим или равным ±0,1%, например, меньшим или равным ±0,05% и (или) 0%.

[0365] Существует множество других способов реализации технологии, являющейся объектом изобретения. Различные функции и элементы, описанные в настоящем документе, можно разделять отличным от показанных образом без отступления от объема технологии, являющейся объектом изобретения. Для специалистов в данной области могут быть очевидны различные модификации этих вариантов реализации, и общие принципы, определенные в настоящем документе, могут применяться к другим вариантам реализации. Таким образом, специалист в данной области может вносить множество изменений и модификаций в технологию, являющуюся объектом изобретения, без отступления от объема технологии, являющейся объектом изобретения. Например, может быть использовано разное количество данных модулей или блоков, может быть использован другой тип или типы данных модулей или блоков, может быть добавлен данный модуль или блок или может быть опущен данный модуль или блок.

[0366] Подчеркнутые и (или) выделенные курсивом заголовки и подзаголовки используются только для удобства, не ограничивают технологию, являющуюся объектом изобретения, и не упоминаются в связи с интерпретацией описания технологии, являющейся объектом изобретения. Все структурные и функциональные эквиваленты элементов различных вариантов реализации, описанных в настоящем описании, которые известны или станут позднее известными специалистам в данной области, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки и считаются охваченными технологией, являющейся объектом изобретения. Более того, ничто из описанного в настоящем документе не предназначено для общественности, независимо от того, указано ли такое описание в приведенном выше изложении в явном виде.

[0367] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть объекта изобретения, описанного в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью объекта изобретения, описанного в данном документе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ILLUMINA, INC.

<120> ТРЕХМЕРНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ НА ПРОТОЧНЫХ КЮВЕТАХ

<130> 0737385

<150> 62/941,197

<151> 2019-11-27

<150> 62/941,215

<151> 2019-11-27

<150> 62/941,242

<151> 2019-11-27

<150> N2024527

<151> 2019-12-20

<150> N2024528

<151> 2019-12-20

<150> N2024596

<151> 2019-12-31

<160> 2

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P5

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> P7

<400> 2

caagcagaag acggcatacg a 21

<---

Изобретение относится к области методов секвенирования, а именно к способу проведения секвенирования на трехмерных полимерных структурах в кювете и способу получения такой кюветы. Способ изготовления трехмерных полимерных структур на проточных кюветах включает несколько этапов. В начале загружают раствор предшественника полимера в проточную кювету, подходящую для использования в секвенировании. Раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор. Причем раствор предшественника полимера включает полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат, этоксилированный пентаэритритолтетракрилат или их комбинации. При этом в проточной кювете имеется по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, и по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность. Затем проводят облучение раствора предшественника полимера светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, через фотошаблон с заданным рисунком, причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, которые проходят от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала. Предложенный подход позволяет автоматизировать процесс секвенирования и снизить потери данных, связанные с обогащением библиотеки секвенирования. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 46 ил., 2 табл., 6 пр.

1. Способ изготовления трехмерных полимерных структур на проточных кюветах, включающий:

загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, подходящую для использования в секвенировании,

причем раствор предшественника полимера включает мономер, поперечносшивающий агент и фотоинициатор, причем раствор предшественника полимера включает полиэтиленгликоль (ПЭГ)-тиол, ПЭГ-акрилат, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), ПЭГ, полипропиленоксид (ППО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную кислоту) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат, этоксилированный пентаэритритолтетракрилат или их комбинации,

причем в проточной кювете имеется по меньшей мере один канал для приема раствора предшественника полимера, и

причем по меньшей мере один канал имеет верхнюю внутреннюю поверхность и нижнюю внутреннюю поверхность; и

облучение раствора предшественника полимера светом с длиной волны, достаточной для активации фотоинициатора, через фотошаблон с заданным рисунком, причем при активации фотоинициатора полимеризуется по меньшей мере часть раствора предшественника полимера под отверстиями в фотошаблоне и образуются трехмерные полимерные структуры, которые проходят от верхней внутренней поверхности к нижней внутренней поверхности по меньшей мере одного канала.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий источник света, причем источник света представляет собой источник ультрафиолетового света.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, дополнительно содержащий отделение по меньшей мере некоторых из трехмерных полимерных структур от проточной кюветы с использованием нагрева, расщепляющих химических веществ или комбинации нагрева и расщепляющих химических веществ.

4. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым мономер представляет собой соединение формулы I:

где каждая из групп R² независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил.

5. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым поперечносшивающий агент представляет собой соединение формулы II:

причем:

каждая переменная n независимо представляет собой целое число от 1 до 6, и

каждая группа R¹ независимо представляет собой водород или (C_1-6)-алкил;

6. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым фотоинициатор представляет собой диазосульфонатный инициатор; соль моноацилфосфиноксида (MAPO); соль бисацилфосфиноксида (BAPO); или их комбинации.

7. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым мономер представляет собой акриламид, поперечносшивающий агент представляет собой N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy), а фотоинициатор представляет собой фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития (LAP).

8. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым раствор предшественника полимера включает полиэтиленгликоль-(ПЭГ)-тиол/ПЭГ-акрилат; акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (BACy); ПЭГ/полипропиленоксид (ППО) или их комбинации.

9. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым фотошаблон включает в себя полиэтилентерефталат, графитовый краситель, химически вытравленную металлическую пленку или их комбинации.

10. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым трехмерные полимерные структуры являются цилиндрическими.

11. Способ по любому из пп. 1, 2, в соответствии с которым трехмерные полимерные структуры имеют обращенную С-образную форму.

12. Способ по любому из пп. 1, 2, дополнительно включающий взаимодействие двухфункционального линкера, имеющего первый конец и второй конец, с функционализированным полимером, причем первый конец двухфункционального линкера химически или ферментативно присоединяется к функционализированному полимеру, и причем второй конец двухфункционального линкера избирательно связывается с заранее заданными типами молекул.

13. Способ по п. 12, в соответствии с которым функционализированный полимер представляет собой сополимер поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламида и акриламида) (PAZAM), и причем бифункциональный линкер представляет собой комплекс биотин-ПЭГ-алкин, и причем способ дополнительно включает в себя реакцию комплекса биотин-ПЭТ-алкин с азидными фрагментами в PAZAM с помощью клик-реакции азид-алкин.

14. Способ по п. 13, дополнительно включающий связывание стрептавидина с биотином в комплексе биотин-ПЭГ-алкин.

15. Способ по п. 14, дополнительно включающий связывание биотинилированного захватного олигонуклеотида со стрептавидином, причем биотинилированный захватный олигонуклеотид является специфичным к цели, представляющей интерес, в библиотеке секвенирования.

16. Способ секвенирования в трех измерениях с использованием трехмерной матрицы секвенирования на проточной кювете, полученной способом по любому из пп. 1-15, включающий:

загрузку раствора предшественника полимера в проточную кювету, причем раствор предшественника полимера включает мономеры и олигонуклеотиды;

полимеризацию раствора предшественника полимера для создания проницаемой трехмерной матрицы в проточной кювете;

диффузию библиотеки секвенирования в проницаемую трехмерную полимерную матрицу, причем библиотека секвенирования включает фрагменты нуклеиновых кислот;

диффузию ферментов и реагентов в проницаемую трехмерную полимерную матрицу;

гибридизацию фрагментов нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами в проницаемой трехмерной полимерной матрице с получением гибридизированных фрагментов нуклеиновых кислот;

клональную амплификацию гибридизированных фрагментов нуклеиновых кислот для создания кластеров для секвенирования в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы;

секвенирование кластеров в пределах проницаемой трехмерной полимерной матрицы; и

оптическую визуализацию секвенированных кластеров в пределах трехмерной матрицы во множестве дискретных двухмерных срезов для описания характеристик библиотеки секвенирования, причем множество дискретных двухмерных срезов представляют весь трехмерный внутренний объем проточной кюветы.

17. Способ по п. 16, дополнительно включающий фрагментирование высвобожденной нуклеиновой кислоты и лигирование адаптеров с концами фрагментов нуклеиновой кислоты.

18. Способ по п. 17, дополнительно включающий посев фрагментов нуклеиновых кислот на верхнюю и нижнюю поверхности по меньшей мере одного канала секвенирования путем:

введения диффузионного барьера по меньшей мере в один канал,

нагревания проточной кюветы до температуры, при которой происходит расщепление полимерных структур и высвобождение из нее фрагментов нуклеиновых кислот,

гибридизации фрагментов нуклеиновых кислот с олигонуклеотидами на верхней и нижней поверхностях по меньшей мере одного канала, и

вымывания расщепленных полимерных структур из проточной кюветы.

19. Проточная кювета, включающая трехмерные полимерные структуры на проточных кюветах, полученных способом по любому из пп. 1-15, содержащая:

канал, причем канал включает верхнюю внутреннюю поверхность с нанесенными на нее праймерами и нижнюю внутреннюю поверхность с нанесенными на нее праймерами; и

обратимые проницаемые трехмерные полимерные структуры в канале из раствора предшественника полимера, причем трехмерные полимерные структуры проходят от верхней внутренней поверхности канала к нижней внутренней поверхности канала.