СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИГАНДОВ НА МАТРИЦАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНДЕКСОВ И ШТРИХКОДОВ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6816 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке WIPO 62/909,014, поданной 1 октября 2019 г., озаглавленной «METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE NUCLEIC ACID ON AN ARRAY»; и предварит, заявке США WIPO 62/903,108, поданной 20 сентября 2019 г., озаглавленной «METHODS AND COMPOSITIONS FOR HIGH-THROUGHPUT GENOTYPING ON ARRAYS USING INDEXES AND BARCODES», каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают способы и композиции для обнаружения лигандов-мишеней на матрице. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата специфически связывается с лигандом-мишенью из образца, определяют положение содержащих зонд захвата гранул в матрице и декодируют гранулу для определения зонда захвата и образца. В некоторых вариантах осуществления штрихкод указывает на наличие зонда захвата, прикрепленного к грануле; а индекс указывает на субпопуляцию гранул. Некоторые варианты осуществления относятся к секвенированию полинуклеотидов-мишеней из нескольких различных образцов нуклеиновых кислот на матрице гранул.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей, присутствующих в биологическом образце, используют, например, в качестве способа идентификации и классификации микроорганизмов, диагностики инфекционных заболеваний, обнаружения и описания генетических аномалий, выявления генетических изменений, связанных с раком, изучения генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию и оценки ответа на различные формы лечения. Распространенной методикой обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей в биологическом образце является секвенирование нуклеиновых кислот.

[0004] Методика секвенирования нуклеиновых кислот в значительной степени развилась от способов химического разложения, используемых Максамом и Гилбертом, и способов удлинения цепи, используемых Сэнгером. В настоящее время используют несколько методик секвенирования, которые позволяют проводить параллельную обработку тысяч нуклеиновых кислот, все на одном чипе. Некоторые платформы включают конфигурации на основе гранул и микрочипов, в которых гранулы диоксида кремния функционализированы зондами в зависимости от использования таких конфигураций в областях применения, включающих секвенирование, генотипирование, профилирование экспрессии генов.

[0005] Способы генотипирования различных образцов на существующих матрицах на основе гранул требуют, чтобы прокладки физически подразделяли различные области микрочипов гранул на множество секторов. Затем отдельные образцы загружают в каждую отдельную секцию, созданную прокладкой. Однако такие способы можно применять с относительно малым числом введенных образцов, но они оказываются трудоемкими или трудноконтролируемыми при увеличении плотности образцов на чип гранулы увеличивается с 24 до 96, 384, 1536 или более образцов на чип гранулы.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Некоторые варианты осуществления включают способ секвенирования нуклеиновых кислот-мишеней на матрице, включающий: (а) получение первой и второй популяций гранул, причем: первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, а вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами; (b) получение первого и второго множества полинуклеотидов, причем: первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом множество первых полинуклеотидов находится в растворе, а второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, причем множество вторых полинуклеотидов находится в растворе; (с) гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с первыми зондами захвата с получением гибридизованных первых гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней со вторыми зондами захвата с получением гибридизованных вторых гранул; (d) случайное распределение гибридизованных первых гранул и гибридизованных вторых гранул на матрице; (е) декодирование положений первой и второй гранул на матрице путем секвенирования первого и второго штрихкодов; и (f) удлинение первого и второго зондов захвата для получения данных нуклеотидной последовательности для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней.

[0007] В некоторых вариантах осуществления первое множество полинуклеотидов содержит первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами; а второе множество полинуклеотидов содержит вторые целевые нуклеиновые кислоты, вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами.

[0008] В некоторых вариантах осуществления первое или второе множество полинуклеотидов получают посредством мечения образца нуклеиновой кислоты множеством транспосом. В некоторых вариантах осуществления множество транспосом содержат первый или второй индексы. Некоторые варианты осуществления также включают в себя добавление адаптеров к меченому образцу нуклеиновой кислоты, причем адаптеры содержат первый или второй индексы. Некоторые варианты осуществления также включают амплификацию меченого образца нуклеиновой кислоты с праймерами, содержащими первый или второй индексы.

[0009] В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата встраивает последовательности, комплементарные первому и второму индексам и первому и второму сайтам связывания индексного праймера, в удлиненные зонды захвата.

[0010] В некоторых вариантах осуществления первая популяция гранул содержит первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами, а вторая популяция гранул содержит вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды первой популяции гранул содержат первые индексы; а олигонуклеотиды второй популяции гранул содержат вторые индексы. В некоторых вариантах осуществления первые индексы указывают на источник первых нуклеиновых кислот-мишеней, а вторые индексы указывают на источник вторых нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления первые индексы совпадают друг с другом и вторые индексы совпадают друг с другом.

[0011] Некоторые варианты осуществления также включают секвенирование первого и второго индексов. В некоторых вариантах осуществления секвенирование первого и второго индексов включает удлиняющие праймеры, гибридизованные с сайтами связывания индексного праймера. В некоторых вариантах осуществления сайты индексного связывающего праймера являются одинаковыми.

[0012] В некоторых вариантах осуществления первую и вторую нуклеиновые кислоты-мишени получают от разных образцов нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления первую и вторую нуклеиновые кислоты-мишени получают от разных геномных ДНК.

[0013] В некоторых вариантах осуществления первый и второй штрихкоды указывают на нуклеотидную последовательность первого или второго зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления первые штрихкоды отличаются друг от друга и вторые штрихкоды отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления секвенирование первого и второго штрихкодов включает удлиняющие праймеры, гибридизованные с сайтами связывания штрихкодового праймера. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера одинаковы.

[0014] В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает полимеразное удлинение. В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает добавление одного нуклеотида к зонду захвата. Некоторые варианты осуществления также включают лигирование специфичных для локуса олигонуклеотидов с удлиненными зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает лигирование специфичных для локуса олигонуклеотидов с зондами захвата.

[0015] В некоторых вариантах осуществления стадию (с) выполняют в растворе.

[0016] В некоторых вариантах осуществления матрица размещена на поверхности проточной кюветы. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы выполнены с возможностью прикрепления к матрице. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы содержат биотин, стрептавидин или их производное; и матрица содержит биотин, стрептавидин или их производное. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы являются магнитными.

[0017] Некоторые варианты осуществления включают способ секвенирования нуклеиновых кислот-мишеней на матрице, включающий: (а) получение первой и второй популяций гранул, причем: первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, а вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами; (b) получение первого и второго множества полинуклеотидов, причем: первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами, при этом множество первых полинуклеотидов находится в растворе, а второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, вторые индексы и вторые сайты связывания праймера, смежные со вторыми индексами, причем множество вторых полинуклеотидов находится в растворе; (с) гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с первыми зондами захвата с получением гибридизованных первых гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней со вторыми зондами захвата с получением гибридизованных вторых гранул; (d) случайное распределение гибридизованных первых гранул и гибридизованных вторых гранул на матрице; (е) декодирование положений первой и второй гранул на матрице путем секвенирования первого и второго штрихкодов; (f) удлинение первого и второго зондов захвата для получения данных нуклеотидной последовательности для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней; и (g) определение источника данных нуклеотидной последовательности первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней путем секвенирования первого и второго индексов.

[0018] В некоторых вариантах осуществления первое множество полинуклеотидов содержит первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами; а второе множество полинуклеотидов содержит вторые целевые нуклеиновые кислоты, вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами.

[0019] В некоторых вариантах осуществления первое или второе множество полинуклеотидов получают посредством мечения образца нуклеиновой кислоты множеством транспосом. В некоторых вариантах осуществления множество транспосом содержат первый или второй индексы. Некоторые варианты осуществления также включают в себя добавление адаптеров к меченому образцу нуклеиновой кислоты, причем адаптеры содержат первый или второй индексы. Некоторые варианты осуществления также включают амплификацию меченого образца нуклеиновой кислоты с праймерами, содержащими первый или второй индексы.

[0020] В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата встраивает последовательности, комплементарные первому и второму индексам и первому и второму сайтам связывания индексного праймера, в удлиненные зонды захвата.

[0021] Некоторые варианты осуществления также включают способ секвенирования нуклеиновых кислот-мишеней на матрице, включающий: (а) получение первой и второй популяций гранул, причем: первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, а также первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами, а вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами, и вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами; (b) получение первого и второго множества полинуклеотидов, причем: первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом множество первых полинуклеотидов находится в растворе, а второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, причем множество вторых полинуклеотидов находится в растворе; (с) гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с первыми зондами захвата с получением гибридизованных первых гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней со вторыми зондами захвата с получением гибридизованных вторых гранул; (d) случайное распределение гибридизованных первых гранул и гибридизованных вторых гранул на матрице; (е) декодирование положений первой и второй гранул на матрице путем секвенирования первого и второго штрихкодов; и (f) удлинение первого и второго зондов захвата для получения данных нуклеотидной последовательности для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней.

[0022] В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды первой популяции гранул содержат первые индексы; а олигонуклеотиды второй популяции гранул содержат вторые индексы. В некоторых вариантах осуществления первые индексы указывают на источник первых нуклеиновых кислот-мишеней, а вторые индексы указывают на источник вторых нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления первые индексы совпадают друг с другом и вторые индексы совпадают друг с другом.

[0023] Некоторые варианты осуществления также включают секвенирование первого и второго индексов. В некоторых вариантах осуществления секвенирование первого и второго индексов включает удлиняющие праймеры, гибридизованные с сайтами связывания индексного праймера. В некоторых вариантах осуществления сайты индексного связывающего праймера являются одинаковыми.

[0024] В некоторых вариантах осуществления первую и вторую нуклеиновые кислоты-мишени получают от разных образцов нуклеиновых кислот.В некоторых вариантах осуществления первую и вторую нуклеиновые кислоты-мишени получают от разных геномных ДНК.

[0025] В некоторых вариантах осуществления первый и второй штрихкоды указывают на нуклеотидную последовательность первого или второго зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления первые штрихкоды отличаются друг от друга и вторые штрихкоды отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления секвенирование первого и второго штрихкодов включает удлиняющие праймеры, гибридизованные с сайтами связывания штрихкодового праймера. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера одинаковы.

[0026] В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает полимеразное удлинение. В некоторых вариантах осуществления первый и второй зонды захвата включают добавление одного нуклеотида к зонду захвата. Некоторые варианты осуществления также включают лигирование специфичных для локуса олигонуклеотидов с удлиненными зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает лигирование специфичных для локуса олигонуклеотидов с зондами захвата.

[0027] В некоторых вариантах осуществления стадию (с) выполняют в растворе.

[0028] В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит матрицу. В некоторых вариантах осуществления матрица содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы выполнены с возможностью прикрепления к матрице. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы содержат биотин, стрептавидин или их производное; и матрица содержит биотин, стрептавидин или их производное. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы являются магнитными.

[0029] Некоторые варианты осуществления включают набор, содержащий: множество популяций гранул, содержащих олигонуклеотиды, присоединенные к гранулам, причем олигонуклеотиды содержат индексы, сайты связывания индексного праймера, смежные с индексами, зонды захвата, штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со штрихкодами, при этом индексы между популяциями гранул отличаются. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания индексного праймера одинаковы во множестве популяций. В некоторых вариантах осуществления штрихкоды указывают на нуклеотидную последовательность зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления штрихкоды отличаются в популяции гранул. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера одинаковы во множестве популяций. Некоторые варианты осуществления также включают реагент, выбранный из: локус-специфичного олигонуклеотида; транспосома для мечения образца нуклеиновой кислоты; транспосома, содержащего индекс и сайт связывания индексного праймера; адаптера, содержащего индекс и сайт связывания индексного праймера; праймера, способного гибридизоваться с сайтом связывания индексного праймера или его комплементом; и праймера, способного гибридизоваться с сайтом связывания штрихкодового праймера или его комплементом. Некоторые варианты осуществления также включают в себя проточную кювету.

[0030] Некоторые варианты осуществления включают способ получения индексированной популяции гранул, включающий: (а) получение популяции гранул, в которой каждая гранула содержит адаптер, зонд захвата и первый полинуклеотид, содержащий штрихкод и сайт связывания штрихкодового праймера; (b) получение множества индексных полинуклеотидов, в котором каждый индексный полинуклеотид содержит индекс и сайт связывания индексного праймера; и (с) присоединение множества индексных полинуклеотидов к популяции гранул посредством адаптеров с получением таким образом индексированной популяции гранул.

[0031] В некоторых вариантах осуществления (с) включает удлинение адаптеров за счет полимеразного удлинения.

[0032] В некоторых вариантах осуществления каждый индексный полинуклеотид содержит сайт связывания адаптера, а прикрепление включает гибридизацию сайтов связывания адаптера с адаптерами.

[0033] В некоторых вариантах осуществления (с) включает лигирование индексных полинуклеотидов с адаптерами.

[0034] В некоторых вариантах осуществления прикрепление включает гибридизацию шунтового полинуклеотида с адаптером и индексным полинуклеотидом.

[0035] В некоторых вариантах осуществления (с) включает присоединение множества индексных полинуклеотидов к адаптерам популяции гранул посредством химически реакционноспособной функциональной группы. В некоторых вариантах осуществления прикрепление включает реакцию клик-химии.

[0036] В некоторых вариантах осуществления первые полинуклеотиды популяции гранул содержат отличающиеся друг от друга зонды захвата.

[0037] В некоторых вариантах осуществления индекс каждого индексного полинуклеотида является одинаковым.

[0038] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата.

[0039] Некоторые варианты осуществления также включают приведение индексированной популяции гранул в контакт со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую кислоту-мишень.

[0040] Некоторые варианты осуществления также включают смешивание индексированной популяции гранул, контактирующих со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую мишень, с дополнительной индексированной популяцией гранул, причем дополнительная индексированная популяция гранул содержит индексный полинуклеотид, содержащий индекс, отличный от индекса индексированной популяции гранул, контактирующих со множеством нуклеиновых кислот.

[0041] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок.

[0042] В некоторых вариантах осуществления способ выполняют на проточной кювете.

[0043] Некоторые варианты осуществления включают способ обнаружения лиганда-мишени, включающий: (а) получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит зонд захвата, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, и сайт связывания штрихкодового праймера; (b) получение индексного полинуклеотида, содержащего индекс, сайт связывания индексного праймера и адаптер, способный связываться с сайтом связывания штрихкодового праймера; (с) специфическое связывание лиганда-мишени с зондом захвата; (d) гибридизацию индексного полинуклеотида с первым полинуклеотидом посредством адаптера; (е) обнаружение лиганда-мишени на матрице; и (f) определение индекса и штрихкода первого полинуклеотида.

[0044] В некоторых вариантах осуществления (е) включает распределение популяции гранул на матрице.

[0045] В некоторых вариантах осуществления (f) включает гибридизацию индексного праймера с сайтом связывания индексного праймера и определение последовательности индекса.

[0046] В некоторых вариантах осуществления дегибридизацию индексного полинуклеотида из первого полинуклеотида; гибридизацию штрихкодового праймера с сайтом связывания штрихкодового праймера; и удлинение штрихкодового праймера для определения последовательности штрихкода.

[0047] В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид дополнительно содержит расщепляемый линкер, расположенный между адаптером и индексом, и (i) включает: (i) расщепление расщепляемого линкера; и (ii) удлинение адаптера для определения последовательности штрихкода.

[0048] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок.

[0049] В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления (е) включает удлинение первого полинуклеотида, гибридизованного с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает добавление обнаруживаемого дидезоксинуклеотида.

[0050] В некоторых вариантах осуществления способ выполняют на проточной кювете.

[0051] Некоторые варианты осуществления включают способ обнаружения лиганда-мишени, включающий: (а) получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит зонд захвата, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и второй полинуклеотид; (b) получение индексного полинуклеотида, содержащего индекс, сайт связывания индексного праймера и адаптер; (с) специфическое связывание лиганда-мишени с зондом захвата; (d) прикрепление индексного полинуклеотида ко второму полинуклеотиду посредством адаптера; (е) обнаружение лиганда-мишени на матрице; и (f) определение индекса и штрихкода первого полинуклеотида.

[0052] В некоторых вариантах осуществления второй полинуклеотид содержит штрихкод и сайт связывания штрихкодового праймера.

[0053] В некоторых вариантах осуществления (d) включает добавление реакционноспособной функциональной группы ко второму полинуклеотиду, причем адаптер способен прикрепляться к реакционноспособной функциональной группе. В некоторых вариантах осуществления добавление реакционноспособной функциональной группы включает реакцию клик-химии.

[0054] В некоторых вариантах осуществления (е) включает распределение популяции гранул на матрице.

[0055] В некоторых вариантах осуществления (f) включает гибридизацию индексного праймера с сайтом связывания индексного праймера и определение последовательности индекса.

[0056] В некоторых вариантах осуществления (f) включает гибридизацию штрихкодового праймера с сайтом связывания штрихкодового праймера и определение последовательности штрихкода.

[0057] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок.

[0058] В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления (е) включает удлинение первого полинуклеотида, гибридизованного с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает добавление обнаруживаемого дидезоксинуклеотида.

[0059] В некоторых вариантах осуществления способ выполняют на проточной кювете.

[0060] Некоторые варианты осуществления включают способ обнаружения лиганда-мишени на матрице, включающий: (а) получение первой и второй популяций гранул, причем каждая гранула содержит: зонд захвата, причем зонд захвата способен специфически связываться с лигандом-мишенью, нуклеиновую кислоту, кодирующую штрихкод, и сайт связывания штрихкодового праймера, причем штрихкод указывает на зонд захвата, и нуклеиновую кислоту, кодирующую индекс и сайт связывания индексного праймера, причем индекс указывает на источник гранулы из первой популяции или второй популяции; (b) приведение первой популяции гранул в контакт с первым образцом, содержащим первый лиганд-мишень, причем первый лиганд-мишень специфически связывается с зондом захвата первой популяции гранул, и получение таким образом связанной с мишенью первой популяции гранул; (с) приведение второй популяции гранул в контакт со вторым образцом, содержащим второй лиганд-мишень, причем второй лиганд-мишень специфически связывается с зондом захвата второй популяции гранул, и получение таким образом связанной с мишенью второй популяции гранул; (d) случайное распределение связанной с мишенью первой популяции гранул и связанной с мишенью второй популяции гранул на матрице; (е) обнаружение положения гранул, содержащих первый лиганд-мишень и второй лиганд-мишень, на матрице; и (f) определение последовательности индекса и штрихкода гранул, содержащих первый лиганд-мишень и второй лиганд-мишень, на матрице.

[0061] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления обнаружение положения гранул, содержащих первый лиганд-мишень и второй лиганд-мишень, на матрице включает удлинение зонда захвата путем полимеразного удлинения или лигирования.

[0062] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок.

[0063] В некоторых вариантах осуществления стадию (е) выполняют после стадии (f).

[0064] В некоторых вариантах осуществления штрихкоды первой популяции гранул содержат отличные друг от друга штрихкоды, и штрихкоды второй популяции гранул содержат отличные друг от друга штрихкоды.

[0065] В некоторых вариантах осуществления индексы первой популяции гранул идентичны друг другу, а индексы второй популяции гранул идентичны друг другу.

[0066] В некоторых вариантах осуществления матрица размещена на поверхности проточной кюветы. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая популяции гранул адаптированы для прикрепления к матрице. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая популяции гранул содержат биотин, стрептавидин или их производное; и матрица содержит биотин, стрептавидин или их производное. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая популяции гранул являются магнитными.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0067] На ФИГ. 1 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего штрихкод, сайт связывания праймера и зонд захвата, присоединенный к грануле посредством 5'-линкера.

[0068] На ФИГ. 2 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего зонд захвата, штрихкод и сайт связывания праймера, присоединенный к грануле посредством 5'-линкера, с присутствием расщепляемого линкера между зондом захвата и штрихкодом.

[0069] На ФИГ. 3 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего штрихкод, сайт связывания праймера и зонд захвата, присоединенный к грануле посредством 3'-линкера.

[0070] На ФИГ. 4 показан пример осуществления полинуклеотида, содержащего спейсер, штрихкод, сайт связывания праймера и зонд захвата, присоединенный к грануле посредством 5'-линкера.

[0071] На ФИГ. 5А показан пример осуществления гранулы с прикрепленным первым полинуклеотидом, содержащим штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и зонд захвата, и с прикрепленным вторым полинуклеотидом, содержащим индекс и сайт связывания индексного праймера.

[0072] На ФИГ. 5В показан пример осуществления нуклеиновой кислоты-мишени, содержащей однонуклеотидный полиморфизм (SNP), гибридизованный к прикрепленному к грануле зонду захвата.

[0073] На ФИГ. 5С показан пример осуществления зонда захвата, удлиненного обнаруживаемым маркером.

[0074] На ФИГ. 5D показан пример осуществления штрихкодового праймера, гибридизованного с сайтом связывания штрихкодового праймера, и удлинение штрихкодового праймера.

[0075] На ФИГ. 5Е показан пример осуществления индексного праймера, гибридизованного с сайтом связывания индексного праймера, и удлинение индексного праймера.

[0076] На ФИГ. 6А показан пример осуществления: гранулы, содержащей один полинуклеотид, содержащий зонд захвата (слева); гранулы, содержащей зонд захвата нуклеиновой кислоты, полинуклеотида, содержащего штрихкод, указывающий на зонд захвата, и полинуклеотида, содержащего индекс для отличия субпопуляции гранул от другой субпопуляции гранул (посередине); и гранулы, содержащей зонд захвата, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и полинуклеотид, содержащий индекс для отличия субпопуляции гранул от другой субпопуляции гранул (справа).

[0077] На ФИГ. 6В показаны примеры осуществления: гранулы, содержащей первый и второй зонды захвата, гибридизованные с нуклеиновой кислотой-мишенью, причем первый зонд захвата содержит расщепляемый линкер (слева); и гранулы, содержащий зонд захвата белка, который временно связывает субстрат для генерации сигнала, содержащего обнаруживаемую метку (справа).

[0078] На ФИГ. 6С показан пример осуществления двухзондового анализа, в котором нуклеиновая кислота-мишень гибридизована с первым и вторым зондами захвата на грануле, первый зонд захвата лигирован со вторым зондом захвата, а расщепляемый линкер расщеплен для получения гранулы, содержащей удлиненный первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку.

[0079] На ФИГ. 7А представлена фотография пула гранул, иммобилизованного на проточной кювете.

[0080] На ФИГ. 7В представлена столбчатая диаграмма некоторого количества копий для определенных типов гранул в определенных ячейках.

[0081] На ФИГ. 7С представлен график сравнения средней интенсивности С и средней интенсивности Т. Средняя интенсивность С является интенсивностью флуоресценции, поступающей от меченого цитозина в паре нуклеотидов, а средняя интенсивность Т является интенсивностью флуоресценции от меченого тимидина в паре нуклеотидов.

[0082] На ФИГ. 8 представлена гистограмма некоторого количества определенных типов гранул в определенных ячейках для репрезентативной пробы.

[0083] На ФИГ. 9 показан вариант осуществления рабочего процесса секвенирования нуклеиновых кислот-мишеней на матрице, в котором полинуклеотиды, содержащие нуклеиновые кислоты-мишени, также включают в себя индекс.

[0084] На ФИГ. 10 представлен вариант осуществления рабочего процесса секвенирования нуклеиновых кислот-мишеней на матрице, в котором гранулы включают в себя индекс.

[0085] На ФИГ. 11 показан вариант осуществления рабочего процесса получения популяции индексированных гранул и применения индексированных гранул в многолуночном планшете, причем каждая лунка содержит отдельный образец.

[0086] На ФИГ. 12А представлен схематический вид гранулы с первым и вторым полинуклеотидами, прикрепленными к грануле. Первый полинуклеотид содержит код, такой как штрихкод; праймер А, такой как сайт связывания штрихкодового праймера; и зонд, такой как зонд захвата. Второй полинуклеотид содержит индекс. Второй полинуклеотид присоединен к грануле посредством спейсера и линкера X-Y.

[0087] На ФИГ. 12А представлен схематический вид гранулы с первым и вторым полинуклеотидами, прикрепленными к грануле. Первый полинуклеотид содержит код, такой как штрихкод; праймер А, такой как сайт связывания штрихкодового праймера; и зонд, такой как зонд захвата. Второй полинуклеотид содержит индекс; и праймер В, такой как сайт связывания индексного праймера. Второй полинуклеотид присоединен к грануле посредством шунта, гибридизованного со вторым полинуклеотидом и адаптером. Второй полинуклеотид может быть лигирован с адаптером.

[0088] На ФИГ. 12С представлен схематический вид гранулы с первым и вторым полинуклеотидами, прикрепленными к грануле. Первый полинуклеотид содержит код, такой как штрихкод; праймер А, такой как сайт связывания штрихкодового праймера; и зонд, такой как зонд захвата. Второй полинуклеотид содержит индекс; праймер В, такой как сайт связывания индексного праймера; и сайт связывания адаптера. Второй полинуклеотид прикреплен к грануле посредством гибридизации с адаптером, прикрепленным к грануле. Адаптер может быть удлинен для включения комплемента индекса; праймер В.

[0089] На ФИГ. 13А представлен схематический вид гранулы с первым полинуклеотидом, прикрепленным к грануле. Первый полинуклеотид содержит код, такой как штрихкод; праймер, такой как сайт связывания штрихкодового праймера; и зонд, такой как зонд захвата. Показан второй полинуклеотид, содержащий индекс; праймер 2, такой как сайт связывания индексного праймера; спейсер, который может включать необязательный расщепляемый сайт, такой как сайт расщепления уридина; и адаптер, гибридизованный с сайтом связывания штрихкодового праймера.

[0090] На ФИГ. 13 В показан вариант осуществления рабочего процесса обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени на матрице, в которой индексный полинуклеотид гибридизован с первым полинуклеотидом, прикрепленным к грануле.

[0091] На ФИГ. 14 представлен схематический вид гранулы с первым и вторым полинуклеотидами, прикрепленными к грануле. Первый полинуклеотид содержит код, такой как штрихкод; праймер А, такой как сайт связывания штрихкодового праймера; и зонд, такой как зонд захвата. Второй полинуклеотид содержит повторы индекса и сайта связывания индексного праймера.

[0092] На ФИГ. 15А показан вариант осуществления рабочего процесса обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени на матрице, в которой индексный полинуклеотид прикреплен к грануле посредством реакционноспособной группы.

[0093] На ФИГ. 15В показан вариант осуществления рабочего процесса обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени на матрице и продолжение рабочего процесса, изображенного на ФИГ. 15А.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0094] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают способы и композиции для обнаружения лигандов-мишеней на матрице. В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень может содержать нуклеиновую кислоту, белок или другой антиген. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата специфически связывается с лигандом-мишенью из образца, определяют положение содержащих зонд захвата гранул в матрице и декодируют гранулу для определения зонда захвата и образца. В некоторых вариантах осуществления штрихкод указывает на наличие зонда захвата, прикрепленного к грануле; а индекс указывает на субпопуляцию гранул. В некоторых вариантах осуществления штрихкод и индекс определяют посредством секвенирования. Некоторые варианты осуществления также включают двухзондовый анализ, в котором первый и второй зонды захвата, прикрепленные к грануле, лигируют друг с другом в присутствии нуклеиновой кислоты-мишени, конец продукта лигирования отщепляют от гранулы, а гранулу, содержащую удлиненный зонд захвата, обнаруживают и декодируют на матрице.

[0095] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к высокопроизводительному генотипированию на матрицах. Некоторые варианты осуществления относятся к декодированию положений микроэлементов в матрице. В некоторых вариантах осуществления микроэлементы содержат полинуклеотиды, имеющие штрихкоды и индексы. Некоторые варианты осуществления включают секвенирование штрихкодов и индексов для определения положений полинуклеотидов в матрице. Некоторые аспекты, которые могут быть полезны для способов и композиций, описанных в настоящем документе, описаны в WO 2020/086746, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0096] Декодирование путем гибридизации включает определение положения зонда захвата в матрице зондов захвата, распределенной случайным образом. Способ обычно включает несколько последовательных циклов гибридизации меченых зондов гибридизации с одним или более участками зонда захвата, визуализацию событий гибридизации и удаление зондов гибридизации. Для декодирования путем гибридизации требуются специальные реагенты, специальные жидкостные устройства и специальные детекторы. В некоторых вариантах осуществления декодирование путем гибридизации может занимать до 8 часов с 7 8 последовательными циклами.

[0097] Варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают случайным образом распределенные матрицы полинуклеотидов, содержащие сайт связывания праймера и штрихкод. В некоторых вариантах осуществления штрихкод можно быстро секвенировать для декодирования матрицы с использованием высокопроизводительной системы секвенирования. Некоторые варианты осуществления могут существенно сократить время, необходимое для декодирования матрицы без дополнительных реагентов, зондов гибридизации или специализированного декодирующего оборудования.

[0098] Некоторые варианты осуществления включают применение методик секвенирования следующего поколения (NGS) и микрочипов на основе гранул. В некоторых таких вариантах осуществления предложены высокоэффективные недорогие и высокопроизводительные генотипирующие анализы, которые можно выполнять на стандартной платформе для секвенирования NGS с небольшими модификациями субстратов и реагентов.

[0099] В некоторых способах мультиплексирования множество образцов нуклеиновых кислот из разных источников можно обрабатывать параллельно с поддержанием физического разделения каждого образца. Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают способ индексирования нуклеиновой кислоты, который путем индексирования каждого образца по индексу на соответствующей грануле устраняет необходимость в физических барьерах, разделяющих отдельные образцы на всех стадиях. В некоторых вариантах осуществления демультиплексирование индексов выполняют путем секвенирования, и это можно обеспечить на объекте пользователя с использованием стандартного химического секвенирования путем синтеза (SBS). Кроме того, при принятии подхода с использованием декодирования путем секвенирования (DBS), который можно внедрить на объекте потребителя с использованием стандартной платформы и химического SBS, сокращаются ограничения по затратам, пространству и времени, связанные с внутренним декодированием матрицы гранул.

[0100] Некоторые варианты осуществления включают пул гранул с индексированным обогащением, содержащий гранулу, изображенную на ФИГ. 5А. В некоторых таких вариантах осуществления гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий зонд локус-специфичный зонд захвата, штрихкод для идентификации положения связанного зонда на матрице и сайт связывания штрихкодового праймера для считывания штрихкода с использованием SBS; и второй полинуклеотид, содержащий индекс для мультиплексирования образца и сайт связывания индексного праймера для считывания индекса с использованием SBS.

[0101] В некоторых вариантах осуществления сложность пула гранул определяется количеством зондов захвата или количеством составных (N) и количеством поддерживаемых (S) образцов. Таким образом, пул гранул, поддерживающий количество составных N и образцов S, будет состоять из S × N уникальных типов гранул. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата и/или индексные праймеры включают дополнительные 3'-ортогональные блокаторы для предотвращения интерференции во время SBS на одном из двух олигонуклеотидов.

[0102] Некоторые варианты осуществления включают проведение анализа генотипирования, в котором во многолуночный планшет, содержащий S лунок, загружают S пулов гранул, причем каждый пул гранул имеет уникальный индекс образца, при этом каждая лунка содержит N уникальных типов гранул. После генерирования библиотеки нуклеиновых кислот из образцов такая обработка образца нуклеиновой кислоты на стадиях, включающих случайную амплификацию праймера с последующей ферментативной фрагментацией и очисткой, каждую библиотеку образцов добавляют в индексированную лунку и позволяют гибридизироваться с зондами захвата. После завершения гибридизации путем добавления инкорпорационной смеси, которая включает флуоресцентные нуклеотиды и соответствующую полимеразу, выполняют анализ достройки по одному основанию для зондирования представляющего интерес SNP. В конце встраивания все образцы захвата гранул на планшете объединяют и загружают в проточную кювету. Проточная кювета может быть ровной или структурированной, а поверхность может быть надлежащим образом модифицирована для поддержания иммобилизации гранул при желаемой плотности. В некоторых вариантах осуществления после иммобилизации гранул выполняют считывание SNP, которое включает один цикл сканирования для считывания сигнала, полученного от флуоресцентной инкорпорации на сайте SNP. Этот цикл может включать цикл SBS на устройстве. Для определения зонда захвата и положения конкретной гранулы внутри проточной кюветы также проводят считывание штрихкода, которое включает 12-20 циклов SBS, в зависимости от количества составных пула гранул. В некоторых вариантах осуществления эту стадию можно заменять дополнительными циклами секвенирования после определенного SNP. Кроме того, выполняют считывание индекса образца, которое включает 6-12 циклов SBS для чтения индекса образца. В некоторых вариантах осуществления весь анализ на проточной кювете может включать менее около 30 циклов SBS и может выполняться менее чем за 4 часа.

[0103] Некоторые варианты осуществления относятся к способам и композициям секвенирования полинуклеотидов-мишеней на матрице. Некоторые варианты осуществления относятся к секвенированию полинуклеотидов-мишеней из нескольких различных образцов нуклеиновых кислот на матрице гранул. В некоторых таких вариантах осуществления индексная последовательность связана с нуклеиновыми кислотами-мишенями из образца нуклеиновой кислоты.

[0104] В одном варианте осуществления настоящего изобретения прокладки не используются для разделения различных областей генной матрицы. Вместо этого к образцам добавляют индексные последовательности для дифференцирования образцов, гибридизированных с гранулами, и поддержки объединения образцов с высоким количеством составных. В некоторых вариантах осуществления индексы можно добавлять либо к пулам гранул, либо к образцам.

[0105] Варианты осуществления относятся к получению библиотек полинуклеотидов из множества различных образцов нуклеиновых кислот и определению наличия определенных элементов, таких как однонуклеотидный полиморфизм, инсерции, делеции, в нуклеиновых кислотах-мишенях каждого образца нуклеиновой кислоты. Библиотеки полинуклеотидов параллельно исследуют на матрице на наличие определенных элементов нуклеиновых кислот-мишеней.

[0106] В некоторых вариантах осуществления каждый образец нуклеиновой кислоты связан с отличающейся индексной последовательностью так, что библиотека полинуклеотидов, полученных из образца нуклеиновой кислоты, включает в себя один и тот же индекс. Нуклеиновую кислоту-мишень идентифицируют в библиотеке полинуклеотидов путем селективной гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с зондом захвата, прикрепленным к грануле, удлинения зонда захвата и обнаружения удлинения зонда захвата на матрице. Каждый зонд захвата может включать штрихкод, и, таким образом, зонд захвата можно идентифицировать путем секвенирования штрихкода, связанного с зондом захвата на матрице. В некоторых таких вариантах осуществления олигонуклеотид, прикрепленный к грануле, включает в себя зонд захвата и штрихкод.

[0107] В некоторых вариантах осуществления индекс, связанный с полинуклеотидом, может быть секвенирован на матрице. Положение сигналов на матрице для удлинения зонда захвата, последовательности штрихкода и последовательности индекса может идентифицировать наличие определенного элемента, такого как однонуклеотидный полиморфизм, инсерция, делеция, в нуклеиновой кислоте-мишени из конкретного образца нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления множество различных образцов нуклеиновых кислот могут быть протестированы на одной матрице.

[0108] В настоящем документе термин «матрица» может относиться к популяции различных микроэлементов, таких как микроэлементы, содержащие полинуклеотиды, которые связаны или прикреплены к поверхности таким образом, что разные микроэлементы можно отличать друг от друга в соответствии с относительным местоположением. Отдельный элемент матрицы может включать в себя одну копию микроэлемента, или же может присутствовать множество копий микроэлемента в виде популяции микроэлементов в отдельном элементе матрицы. Популяция микроэлементов в каждом элементе, как правило, является гомогенной и имеет один вид микроэлементов. Таким образом, на элементе может присутствовать множество копий одной нуклеотидной последовательности, например множество молекул нуклеиновых кислот, имеющих одинаковую последовательность.

[0109] В некоторых вариантах осуществления на элементе может присутствовать гетерогенная популяция микроэлементов. Таким образом, элемент может, но не обязательно, включать только один вид микроэлемента и может вместо этого содержать множество различных видов микроэлементов, таких как смесь нуклеиновых кислот, имеющих различные последовательности. Соседние элементы матрицы могут отделяться друг от друга без перекрывания. Соответственно, элементы могут быть расположены рядом друг с другом или разделяться гэпом. В вариантах осуществления, в которых элементы разнесены друг от друга, соседние сайты могут быть разнесены, например, на расстояние менее 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм, 100 пм, 50 пм, 1 пм или любое расстояние в пределах диапазона из любых двух вышеперечисленных расстояний. Расположение элементов на матрице также можно понимать с точки зрения межцентровых расстояний между соседними элементами. Используемая в изобретении матрица может иметь соседние элементы с межцентровым расстоянием менее около 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм, 100 пм, 50 пм, 1 пм или любым расстоянием в пределах диапазона из любых двух вышеперечисленных расстояний.

[0110] В некоторых вариантах осуществления значения расстояний, описанные выше или в любом другом месте этого документа, могут представлять собой среднее расстояние между соседними элементами матрицы. Таким образом, не все соседние элементы должны находиться в указанном диапазоне, если иное не указано конкретно, например посредством конкретного утверждения о том, что расстояние представляет собой пороговое расстояние между всеми соседними элементами матрицы. Варианты осуществления могут использоваться с матрицами, имеющими элементы с различными значениями плотности. Примеры диапазонов плотностей для определенных вариантов осуществления включают в себя от около 10000000 элементов/см² до около 2000000000 элементов/см²; от около 100000000 элементов/см² до около 1000000000 элементов/см²; от около 100000 элементов/см² до около 10000000 элементов/см²; от около 1000000 элементов/см² до около 5000000 элементов/см²; от около 10000 элементов/см² до около 100000 элементов/см²; от около 20000 элементов/см² до около 50000 элементов/см²; от около 1000 элементов/см² до около 5000 элементов/см², или любую плотность в пределах диапазона любых двух из вышеуказанных плотностей.

[0111] В настоящем документе термин «поверхность» может относиться к части субстрата или структуры подложки, которая доступна для контакта с реагентами, гранулами или аналитами. Поверхность может быть по существу ровной или плоской. Альтернативно поверхность может иметь закругленную или контурную форму. Примерами контуров, которые можно использовать на поверхности, являются лунки, выемки, столбики, ребра, каналы или т.п. Примеры материалов, которые можно использовать в качестве субстрата или структуры подложки, включают в себя стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или TEFLON; полисахариды или сшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Поверхность, пригодная для использования в рамках изобретения, может быть изготовлена из одного материала или смеси нескольких различных материалов. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит лунки. В некоторых вариантах осуществления опорная конструкция может содержать один или более слоев. Примеры опорных конструкций могут включать чип, пленку, многолуночный планшет и проточную кювету.

[0112] В настоящем документе термин «гранула» может относиться к небольшому телу, изготовленному из жесткого или полужесткого материала. Тело может иметь форму, описываемую, например, как сфера, овал, микросфера, или иную принятую форму частиц с симметричными или несимметричными размерами. Примеры материалов, подходящих для гранул, включают в себя стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или TEFLON; полисахариды или сшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; или множество иных полимеров. Примеры гранул включают в себя стеклянные гранулы с контролируемыми порами, парамагнитные гранулы, золь двуокиси тория, гранулы сефарозы, нанокристаллы и другие известные в данной области гранулы. Гранулы могут быть изготовлены из биологических или небиологических материалов. Магнитные гранулы особенно подходят для использования из-за простоты манипуляций с магнитными гранулами с помощью магнитов на различных стадиях способов, описанных в настоящем документе. Гранулы, используемые в определенных вариантах осуществления, могут иметь диаметр, ширину или длину от около 0,1 мкм до около 100 мкм, от около 0,1 нм до около 500 нм. В некоторых вариантах осуществления, гранулы, используемые в определенных вариантах изобретения, могут иметь диаметр, ширину или длину менее около 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм, 100 пм, 50 пм, 1 пм или любой диаметр, ширину или длину в пределах диапазона из любых двух вышеперечисленных значений диаметра, ширины или длины. Размер гранулы можно выбрать таким образом, чтобы она имела уменьшенный размер и, следовательно, можно было обеспечить больше элементов на единицу площади с сохранением при этом достаточного сигнала (копии темплата на элемент) для анализа этих элементов.

[0113] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут быть прикреплены к гранулам. В некоторых вариантах осуществления гранулы могут быть распределены в лунки на поверхности субстрата. Пример матриц гранул, которые можно использовать в определенных вариантах осуществления, включают технологию произвольного порядка BEADARRAY (Illumina Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния). Такие массивы гранул описаны в публикациях Michael et al., Anal Chem 70, 1242-8 (1998); Walt, Science 287, 451-2 (2000); Fan et al., Cold Spring Harb Symp QuantBiol 68:69-78 (2003); Gunderson et al., Nat Genet 37:549-54 (2005); Bibikova et al. Am J Pathol 165:1799-807 (2004); Fan et al., Genome Res 14:878-85 (2004); Kuhn et al., Genome Res 14:2347-56 (2004); Yeakley et al., NatBiotechnol 20:353-8 (2002); и Bibikova et al., Genome Res 16:383-93 (2006), каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0114] В настоящем документе термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» могут использоваться взаимозаменяемо и могут относиться к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, этот термин включает одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК. Термин «полинуклеотид» также относится как к двухцепочечным, так и к одноцепочечным молекулам. Примеры полинуклеотидов включают ген или фрагмент гена, геномную ДНК, фрагмент геномной ДНК, экзон, интрон, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, некодирующую РНК (нкРНК), такую как РНК, взаимодействующую с PIWI (пиРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) и длинную некодирующую РНК (длнкРНК), малую шпилечную (мшРНК), малую ядерную РНК (мяРНК), микроРНК (мкрРНК), малую ядрышковую РНК (мяшРНК) и вирусную РНК, рибозим, кДНК, рекомбинантный полинуклеотид, разветвленный полинуклеотид, плазмиду, вектор, изолированную ДНК любой последовательности, изолированную РНК любой последовательности, полинуклеотидный зонд, праймер или амплифицированную копию любого из вышеперечисленных вариантов. Полинуклеотид может включать в себя модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, включая нуклеотиды с неприродными основаниями, нуклеотиды с модифицированными природными основаниями, такими как аза- или деазапурины. Полинуклеотид может состоять из определенной последовательности четырех нуклеотидных оснований: аденина (А); цитозина (Ц); гуанина (Г); и тимина (Т). Также может присутствовать урацил (У), например, в качестве естественной замены тимина, если полинуклеотид представляет собой РНК. Урацил также может использоваться в ДНК. Таким образом, термин «последовательность» относится к буквенному представлению полинуклеотида или любой молекулы нуклеиновой кислоты, включая природные и неприродные основания.

[0115] В настоящем документе термин «нуклеиновая кислота-мишень» или его грамматический эквивалент может относиться к молекулам или последовательностям нуклеиновой кислоты, которые необходимо секвенировать, анализировать и/или дополнительно обработать. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть присоединена к матрице. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может быть присоединен к матрице, а матрицу впоследствии можно использовать для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени в образце, который взаимодействует с зондом. В связи с этим следует понимать, что в отношении способов обнаружения нуклеиновых кислот в некоторых вариантах осуществления термины «мишень» и «зонд» могут использоваться взаимозаменяемо.

[0116] В настоящем документе термин «зонд захвата» может относиться к полинуклеотиду, имеющему достаточную комплементарность, чтобы специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Зонд захвата может функционировать как аффинная связывающая молекула для выделения нуклеиновой кислоты-мишени из других нуклеиновых кислот и/или компонентов в смеси. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть специфически связана зондом захвата через промежуточные молекулы. Примеры промежуточных молекул включают линкеры, адаптеры и другие мостиковые нуклеиновые кислоты, имеющие достаточную комплементарность, чтобы специфически гибридизироваться как с целевой последовательностью, так и с зондом захвата.

[0117] В настоящем документе термин «гибридизация», «гибридизировать» или их грамматический эквивалент может относиться к реакции, в которой один или более полинуклеотидов взаимодействуют с образованием комплекса, который по меньшей мере частично образован посредством водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Водородные связи могут возникать посредством спаривания оснований по Уотсону - Крику, связывания по Хугстину или любым другим специфичным для последовательности способом. Комплекс может иметь две цепочки, образующие дуплексную структуру, три или более цепочки, образующие многоцепочечный комплекс, одну самогибридизующуюся цепь или любую их комбинацию. Кроме водородного связывания цепочки также могут быть поперечно-сшитыми или соединены иными силами.

[0118] В настоящем документе термины «удлиняющий», «удлинение» или их любые грамматические эквиваленты могут относиться к добавлению дНТФ к праймеру, полинуклеотиду или другой молекуле нуклеиновой кислоты ферментом-удлинителем, таким как полимераза. Например, в некоторых способах, описанных в настоящем документе, полученный удлиненный праймер содержит информацию о последовательности РНК. Хотя в некоторых вариантах осуществления описано выполнение удлинения с использованием полимеразы, такой как ДНК-полимераза или обратная транскриптаза, удлинение может быть выполнено любым другим способом, хорошо известным в данной области. Например, удлинение можно выполнять путем лигирования коротких отрезков случайно выбранных олигонуклеотидов друг с другом, например, олигонуклеотидов, которые гибридизовались с представляющей интерес цепью.

[0119] В настоящем документе термины «лигирование», «лигировать» или другие их грамматические эквиваленты могут относиться к соединению двух нуклеотидных цепей фосфодиэфирной связью. Такая реакция может быть катализирована лигазой. Термин «лигаза» относится к классу ферментов, которые катализируют эту реакцию с гидролизом АТФ или аналогичного трифосфата.

Декодирование путем секвенирования

[0120] Некоторые варианты осуществления способов и композиций, предложенных в настоящем документе, включают декодирование положения микроэлементов матрицы с использованием высокопроизводительного секвенирования. В некоторых вариантах осуществления микроэлементы матрицы содержат полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды можно случайным образом распределить на поверхности субстрата. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать сайт связывания праймера и штрихкод. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать зонд захвата, сайт связывания праймера и штрихкод.

[0121] Некоторые варианты осуществления для декодирования положения полинуклеотидов в матрице могут включать (а) получение субстрата, имеющего матрицу полинуклеотидов, распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит штрихкод и сайт связывания праймера; (b) гибридизацию множества праймеров с сайтами связывания праймера; и (с) определение последовательностей штрихкодов путем удлинения гибридизированных праймеров. В некоторых таких вариантах осуществления последовательность каждого штрихкода может указывать положение полинуклеотида в матрице. Например, в некоторых вариантах осуществления матрицу можно получить с использованием полинуклеотидов, причем известно, что штрихкоды ассоциируются с определенными зондами захвата, так что определение положения штрихкода на матрице может указывать на положение соответствующего зонда захвата. В таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может быть связан с зондом захвата через общий элемент. Например, каждый полинуклеотид и зонд захвата может быть связан с одними тем же микроэлементом, таким как гранула. В дополнительных таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может содержать зонд захвата.

[0122] В некоторых вариантах осуществления штрихкод может содержать нуклеотидную последовательность, которую можно использовать для определения полинуклеотида в матрице. Штрихкод может включать в себя уникальную нуклеотидную последовательность, которая отличима от других штрихкодов. Она также может быть отличима от других нуклеотидных последовательностей в полинуклеотидах и целевых нуклеиновых кислотах по последовательности штрихкода, а также по положению штрихкода в полинуклеотиде, например по его положению на 5' сайта связывания праймера. Например, в некоторых вариантах осуществления в множестве нуклеиновых кислот последовательность штрихкода может присутствовать более одного раза, однако штрихкод, расположенный на 5' от сайта связывания праймера, может быть обнаружен. Штрихкод может иметь любую желаемую длину последовательности, достаточную для обеспечения уникальной нуклеотидной последовательности в пределах множества штрихкодов в популяции и/или в пределах множества анализируемых или исследуемых полинуклеотидов и целевых нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления штрихкод является нуклеиновой кислотой или областью внутри полинуклеотида в диапазоне около 6-30 нуклеотидов. Штрихкод может содержать, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или он может быть длиннее. Например, штрихкод может содержать 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов, или он может быть длиннее. Подходящие штрихкоды для некоторых вариантов осуществления описаны в патенте США No 8,053,192, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может отличать полинуклеотид от другого полинуклеотида в матрице, так что каждый штрихкод отличается от другого штрихкода. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может отличать популяцию полинуклеотидов от другой популяции полинуклеотидов в матрице, так что набор штрихкодов отличается от другого набора штрихкодов. Некоторые аспекты, применимые со способами и композициями, предложенными в настоящем документе, описаны в патентах США 20180334711 А1 и 20190085384 А1, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может включать в себя уникальный молекулярный идентификатор (UMI).

[0123] В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера может быть 3' штрихкода, так что праймер, гибридизованный с сайтом связывания праймера, можно удлинить с образованием комплемента штрихкода. Например, для получения последовательности штрихкода праймер можно удлинить. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера может находиться непосредственно по соседству со штрихкодом в полинуклеотиде. В некоторых вариантах осуществления каждый сайт связывания праймера в популяции полинуклеотидов может иметь одну и ту же последовательность. В некоторых вариантах осуществления субпопуляция полинуклеотидов может содержать сайты связывания праймера с первой последовательностью, а другая субпопуляция полинуклеотидов может содержать сайты связывания праймера со второй последовательностью. В некоторых вариантах осуществления гибридизация различных праймеров с множеством различных сайтов связывания праймера может быть одновременной, последовательной или итеративной.

[0124] Некоторые варианты осуществления включают полинуклеотиды, содержащие зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может содержать последовательность, которая может гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления популяция полинуклеотидов может содержать зонды захвата, которые отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления каждый зонд захвата может отличаться друг от друга. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата могут быть похожи друг на друга, например, они могут иметь похожие последовательности и/или похожие последовательности со схожей длиной. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может отличаться от одного другого зонда захвата количеством нуклеотидов менее 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2, причем количество нуклеотидов может быть представлено последовательными нуклеотидами, непоследовательными нуклеотидами, вставленными нуклеотидами или удаленными нуклеотидами в зонде захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может отличаться от одного другого зонда захвата одним нуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера и штрихкод могут быть 5' зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера и штрихкод могут представлять собой 3' зонда захвата.

[0125] Некоторые варианты осуществления включают полинуклеотиды, содержащие расщепляемые линкеры. В некоторых таких вариантах осуществления расщепляемый линкер может быть расположен так, чтобы расщепление линкера могло отделять зонд захвата от сайта связывания праймера и штрихкода. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может быть расположен в полинуклеотиде между зондом захвата и сайтом связывания праймера и штрихкодом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может удалять полинуклеотид, содержащий сайт связывания праймера и штрихкод, связанный с зондом захвата. Например, полинуклеотид и зонд захвата могут быть оба связаны с гранулой. Расщепление расщепляемого линкера может приводить к удалению с гранулы полинуклеотида, содержащего сайт связывания праймера и штрихкод.

[0126] В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может иметь длину, соответствующую по меньшей мере 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500 нуклеотидам, или длину в пределах диапазона любых двух из вышеперечисленных значений длины. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер поддается расщеплению агентами, такими как свет, основание, кислота и/или фермент, такой как специфичный к последовательности рестрикционный фермент или протеаза. Расщепляемый линкер может включать определенную последовательность нуклеотидов, такую как сайт распознавания фермента, и/или может включать определенные модифицированные нуклеотиды, поддающиеся расщеплению агентом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может содержать урацил, который может расщепляться экзогенным расщепляющим основание агентом, таким как ДНК-гликозилаза (урацил-ДНК-гликозилаза (УДГ)). В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер может содержать 8-гидроксигуанин, который может расщепляться 8-гидроксигуанин-ДНК-гликозилазой (белок формамидопиридин-ДНК-гликозилаза (FPG)). Другие примеры расщепляемых линкеров описаны в заявке на патент США 2005/0181394, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0127] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды присоединены к субстрату. В некоторых вариантах осуществления субстрат может содержать гранулу. С помощью одноточечной ковалентной связи с поверхностью субстрата на 5'-конце или 3'-конце полинуклеотида или вблизи них полинуклеотиды могут быть иммобилизованы на субстрате, таком как гранула или другая поверхность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать спейсер, который прикреплен к субстрату. В некоторых вариантах осуществления спейсер может иметь длину, соответствующую по меньшей мере 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500 нуклеотидам, или длину в пределах диапазона любых двух из вышеперечисленных значений длины. Для этой цели можно использовать любое подходящее средство ковалентного связывания, известное в данной области. Выбранная для связывания химическая реакция зависит от характера твердой подложки и любых примененных к ней производных или функционализирующих модификаций. Полинуклеотид может содержать функциональную группу, которая может представлять собой ненуклеотидную химическую модификацию, для облегчения присоединения. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать серосодержащее нуклеофильное вещество, такое как фосфоротиоат или тиофосфат, например, расположенное на 5'-конце. В случае полиакриламидных гидрогелей на твердой подложке данный нуклеофил будет связываться с бромацетамидной группой, присутствующей в гидрогеле. Примером средств присоединения полинуклеотида к твердой подложке является связь посредством 5'-фосфоротиоатного присоединения к гидрогелю, состоящему из полимеризованного акриламида и N-(5-бромацетамидилпентил)акриламида (BRAPA), который описан в патенте США №8,168,388, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0128] В некоторых вариантах осуществления положение полинуклеотидов в матрице может быть декодировано путем секвенирования штрихкодов полинуклеотидов. Например, последовательность штрихкода может быть связана с сайтом на матрице, а сайт может быть связан с конкретным зондом захвата. Некоторые варианты осуществления включают секвенирование следующего поколения (NGS), которое может относиться к способам секвенирования, позволяющим осуществлять массивное параллельное секвенирование клонально амплифицированных молекул и одиночных молекул нуклеиновых кислот. Примеры NGS включают секвенирование путем синтеза (SBS) с использованием обратимых терминаторов-красителей и секвенирование путем лигирования. В SBS выполняется мониторинг удлинения праймера нуклеиновой кислоты вдоль темплата нуклеиновой кислоты для определения последовательности нуклеиновых кислот в темплате. Основополагающим химическим процессом может быть полимеризация. В конкретном варианте осуществления SBS на основе полимеразы для удлинения к праймеру добавляют флуоресцентно-меченые нуклеотиды темплатным зависимым образом, чтобы для определения последовательности темплата можно было использовать обнаружение порядка и типа добавляемых к праймеру нуклеотидов.

[0129] Одну или более амплифицированных нуклеиновых кислот можно подвергать воздействию SBS или другой методики обнаружения, которая включает повторную доставку реагентов по циклам. Например, для запуска первого цикла SBS, может быть обеспечено протекание одного или более меченых нуклеотидов, ДНК-полимеразы и т.д. в гидрогелевую гранулу (или сквозь нее), содержащую одну или более амплифицированных молекул нуклеиновой кислоты. Можно выявлять те сайты, где удлинение праймера приводит к встраиванию меченого нуклеотида. Нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации, которое завершает дополнительное удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру. Например, в праймер можно добавлять нуклеотидный аналог, имеющий фрагмент обратимого терминатора, так чтобы последующее удлинение не могло происходить до тех пор, пока не будет доставлен блокирующий агент для удаления фрагмента. Таким образом, для вариантов осуществления, в которых применяется обратимая терминация, доставка разблокирующего реагента в проточную кювету может происходить до или после обнаружения. В промежутке между различными стадиями доставки можно проводить промывки. Затем цикл можно повторять n раз для удлинения праймера на n нуклеотидов, таким образом обнаруживая последовательность длиной п.

[0130] Некоторые варианты осуществления SBS включают обнаружение протона, высвобождаемого при встраивании нуклеотида в продукт удлинения. Например, для секвенирования на основе обнаружения высвобождаемых протонов можно использовать электрический детектор и связанные с этим имеющиеся на рынке методики. Примерами таких систем секвенирования являются пиросеквенирование, например доступная в продаже платформа производства компании 454 Life Sciences, дочерней компании Roche; секвенирование с использованием меченных γ-фосфатом нуклеотидов, например доступная в продаже платформа производства компании Pacific Biosciences; и секвенирование с использованием обнаружения протонов, например доступная в продаже платформа производства компании Ion Torrent, дочерней компании Life Technologies. Некоторые варианты осуществления включают пиросеквенирование, которое описано в заявке на патент США 2005/0130173 и 2006/0134633 и патентах США №№4,971,903; 6,258,568 и 6,210,891, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Некоторые варианты осуществления включают секвенирование путем лигирования, которое описано в патенте США №5,599,675; И патенте США №5,750,341, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0131] В некоторых вариантах осуществления могут использоваться способы, включающие мониторинг активности ДНК-полимеразы в реальном времени. Например, включение нуклеотидов может быть обнаружено за счет взаимодействий по механизму резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между содержащей флуорофор полимеразой и нуклеотидами с γ-фосфатной меткой или с помощью волноводов с нулевой модой (ZMW). Другой полезной методикой секвенирования является секвенирование через нанопоры. В некоторых вариантах осуществления с нанопорами целевая нуклеиновая кислота или отдельные нуклеотиды удаляются при прохождении целевой нуклеиновой кислоты через нанопору. По мере прохождения нуклеиновой кислоты или нуклеотида через нанопору каждый тип нуклеотида можно идентифицировать путем измерения колебаний электрической проводимости поры.

[0132] Как показано на ФИГ. 1, в некоторых вариантах осуществления микроэлемент матрицы может включать полинуклеотид, прикрепленный к грануле 10 посредством 5'-линкера 20. Полинуклеотид может содержать штрихкод 30, сайт 40 связывания праймера и зонд 50 захвата. Праймер 60 может гибридизоваться с сайтом связывания праймера и может быть удлинен с получением последовательности штрихкода для декодирования положения микроэлемента в матрице. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами-мишенями, и зонд захвата может быть удлинен, например, с помощью полимеразы или с помощью лигазы. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может участвовать в мостиковой амплификации. Способы мостиковой амплификации описаны в патентах США №№7,985,565 и 7,115,400, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0133] Как показано на ФИГ. 2, в некоторых вариантах осуществления микроэлемент матрицы может включать полинуклеотид, содержащий зонд 50 захвата, штрихкод 30 и сайт 40 связывания праймера, причем полинуклеотид присоединен к грануле 10 посредством 5'-линкера 20. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать в себе расщепляемый линкер 70 между зондом захвата и штрихкодом. В некоторых вариантах осуществления праймер 60 может быть гибридизован с сайтом связывания праймера, и может быть определена последовательность штрихкода, тем самым декодируется положение микроэлемента в матрице. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может быть расщеплен, а штрихкод и сайт связывания праймера удалены с микроэлемента, содержащего гранулу и зонд захвата. Некоторые из таких вариантов осуществления обеспечивают декодированные матрицы перед гибридизацией нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть гибридизована с зондом захвата в декодированном положении в матрице. В некоторых вариантах осуществления гибридизованный зонд захвата может быть удлинен, например, с помощью полимеразы или с помощью лигазы. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может участвовать в мостиковой амплификации.

[0134] Как показано на ФИГ. 3, в некоторых вариантах осуществления микроэлемент матрицы может включать полинуклеотид, содержащий штрихкод 30 и сайт 40 связывания праймера, а также зонд 50 захвата, присоединенный к грануле 10 посредством 3'-линкера 25. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания праймера может примыкать к линкеру, присоединенному к грануле. Некоторые варианты осуществления могут включать использование таких микроэлементов в анализах для скрининга и разработки определенных полимераз. Например, можно проводить скрининг активности полимераз относительно сайтов праймеров, присоединенных к гранулам без спейсеров, по сравнению с сайтами праймеров, присоединенными к гранулам с помощью спейсеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может быть гибридизована с зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления гибридизованные нуклеиновые кислоты-мишени могут быть удлинены, например, с помощью полимеразы или с помощью лигазы.

[0135] Как показано на ФИГ. 4, варианты осуществления микроэлемента матрицы могут включать полинуклеотид, содержащий спейсер 80, штрихкод 30, сайт 40 связывания праймера и зонд 50 захвата, присоединенный к грануле 10 посредством 5'-линкера 20.

Секвенирование множества нуклеиновых кислот-мишеней

[0136] Некоторые варианты осуществления включают секвенирование множества нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени могут быть получены из разных источников, таких как разные субъекты, например геномная ДНК от разных субъектов. В некоторых вариантах осуществления разные нуклеиновые кислоты-мишени могут быть связаны с разными индексами, так что индекс может идентифицировать конкретную популяцию нуклеиновых кислот-мишеней, например популяцию, полученную из одного источника.

[0137] Некоторые варианты осуществления включают получение по меньшей мере первой и второй субпопуляций гранул, причем каждая гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий зонд захвата, штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода, и второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции.

[0138] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0139] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и/или второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. Например, зонды захвата первой субпопуляции могут отличаться друг от друга; и/или зонды захвата первой субпопуляции могут отличаться друг от друга. В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первых субпопуляций гранул содержит зонды захвата, имеющие одни и те же нуклеотидные последовательности, что и зонды захвата вторых субпопуляций гранул. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может содержать нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0140] Некоторые варианты осуществления также включают гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата первой субпопуляции гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата второй субпопуляции гранул. В некоторых таких вариантах осуществления гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата первой субпопуляции гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней с зондами захвата второй субпопуляции гранул выполняют в разных положениях. Например, разные положения предусматривают разные реакционные объемы, такие как разные лунки, например разные лунки в многолуночном планшете. Например, в 96-луночном планшете можно гибридизовать 96 различных субпопуляций гранул с 96 различными нуклеиновыми кислотами-мишенями, в которых каждая различная субпопуляция гранул гибридизуется с различной нуклеиновой кислотой-мишенью в различной лунке.

[0141] В некоторых вариантах осуществления разные субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты, распределены на субстрате, таком как плоский субстрат.В некоторых вариантах распределенные субпопуляции гранул содержат матрицу. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.

[0142] В некоторых вариантах осуществления разные субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени, объединены до распределения на субстрате. В некоторых вариантах осуществления разные субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени, последовательно распределяют на субстрате. Например, первую субпопуляцию гранул, содержащую гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени, распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени.

[0143] В некоторых вариантах осуществления гибридизованные зонды захвата удлинены. В некоторых вариантах осуществления гибридизованные зонды захвата удлиняют перед распределением на субстрате различных субпопуляций гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления гибридизованные зонды захвата удлиняют после распределения на субстрате гранул, содержащих гибридизованные зонды захвата и нуклеиновые кислоты-мишени. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных зондов захвата может предусматривать полимеразное удлинение. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных зондов захвата может предусматривать удлинение на основе лигазы, например, лигирование зонда удлинения с зондом захвата в присутствии лигазы. В некоторых вариантах осуществления на стадии удлинения к удлиненному зонду захвата можно добавлять обнаруживаемый маркер. В некоторых вариантах осуществления обнаруживаемый маркер может содержать флуоресцентный маркер.

[0144] Некоторые варианты осуществления включают декодирование гранул на субстрате. Некоторые варианты осуществления включают декодирование гранул путем определения положений удлиненных зондов захвата, штрихкодов и индексов на субстрате. В некоторых вариантах осуществления присутствие специфического штрихкода в определенном положении на субстрате указывает на специфический зонд захвата в этом положении. В некоторых вариантах осуществления присутствие определенного индекса в положении на субстрате указывает на то, что нуклеиновая кислота-мишень определенной субпопуляции нуклеиновых кислот-мишеней связана с положением на субстрате. В некоторых вариантах осуществления присутствие удлиненного зонда захвата в положении на субстрате указывает на присутствие определенной нуклеиновой кислоты-мишени в субпопуляциях нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления идентичность штрихкода, идентичность индекса и присутствие удлиненного зонда захвата в одном положении на поверхности указывает на присутствие определенной нуклеиновой кислоты-мишени в определенной субпопуляции нуклеиновых кислот-мишеней.

[0145] В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает обнаружение положений гибридизованных зондов захвата или удлиненных зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления обнаружение положения гибридизованных зондов захвата или удлиненных зондов захвата включает удлинение гибридизованных зондов захвата с обнаруживаемым маркером. В некоторых вариантах осуществления определение положения гибридизованных зондов захвата или удлиненных зондов захвата включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза.

[0146] В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает декодирование положения индексов гранул, содержащих удлиненный зонд захвата. Некоторые варианты осуществления включают гибридизацию множества индексных праймеров с сайтами индексных праймеров и удлинение гибридизованных индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных индексных праймеров включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения индексов гранул включает секвенирование индексов на субстрате.

[0147] В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает декодирование положения штрихкодов гранул, содержащих удлиненный зонд захвата. Некоторые варианты осуществления включают гибридизацию множества штрихкодовых праймеров с сайтами штрихкодовых праймеров и удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров. В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров, включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование гранул на субстрате включает декодирование положения штрихкодов гранул, включает секвенирование штрихкодов на субстрате.

[0148] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 100, 200, 300, 400 или 500 или более зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 5000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности.

[0149] Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 100 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.

[0150] Аспекты некоторых вариантов осуществления показаны на ФИГ. 5А - ФИГ. 5Е. Как показано на ФИГ. 5А, субпопуляция гранул содержит гранулу с прикрепленным первым полинуклеотидом, содержащим штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и зонд захвата, и с прикрепленным вторым полинуклеотидом, содержащим индекс и сайт связывания индексного праймера. Различные субпопуляции гранул могут включать различные индексы. Различные субпопуляции гранул, причем каждая субпопуляция имеет определенный индекс, может быть распределена по лункам 96-луночного планшета таким образом, чтобы каждая лунка содержала одну субпопуляцию гранул.

[0151] Как показано на ФИГ. 5В, нуклеиновая кислота-мишень из популяции нуклеиновых кислот-мишеней гибридизирована с зондом захвата, причем нуклеиновая кислота-мишень содержит SNP. В некоторых вариантах осуществления в каждую лунку, содержащую субпопуляцию гранул, добавляют субпопуляцию нуклеиновых кислот-мишеней. Каждая субпопуляция нуклеиновых кислот-мишеней может быть получена из другого источника, такого как другой субъект. Например, субпопуляцию нуклеиновых кислот-мишеней можно получить путем подготовки библиотеки нуклеиновых кислот из одного источника нуклеиновых кислот, например из одного образца нуклеиновых кислот от субъекта. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени не требуют секвенирования адаптера.

[0152] Как показано на ФИГ. 5С, зонд захвата, который гибридизирован с содержащей SNP нуклеиновой кислотой-мишенью, может быть удлинен. В некоторых вариантах осуществления удлинение можно выполнять добавлением инкорпорационной смеси, которая содержит флуоресцентные нуклеотиды и соответствующую полимеразу. В некоторых вариантах осуществления удлинение является достройкой по одному основанию.

[0153] В некоторых вариантах осуществления все гранулы объединены и распределены по поверхности проточной кюветы. Проточная кювета может иметь структурированную поверхность, и поверхность можно модифицировать для поддержания иммобилизации гранул при желаемой плотности.

[0154] В некоторых вариантах осуществления проводят считывание SNP. В некоторых вариантах осуществления для считывания сигнала от инкорпорирования зонда захвата на сайте SNP выполняют цикл сканирования. В некоторых вариантах осуществления этот цикл может включать по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления 3'-концы удлиненных зондов захвата отщеплены и заблокированы.

[0155] Как показано на ФИГ. 5D, штрихкодовый праймер гибридизирован с сайтом связывания штрихкодового праймера, и штрихкодовый праймер удлинен. В некоторых вариантах осуществления удлинение штрихкодового праймера включает считывание штрихкода. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления количество циклов секвенирования путем синтеза может зависеть от количества различных штрихкодов в субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать 12-20 циклов секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления удлинение позволяет идентифицировать зонд захвата и положение определенной гранулы внутри проточной кюветы.

[0156] Как показано на ФИГ. 5Е, индексный праймер гибридизирован с сайтом связывания индексного праймера, и индексный праймер удлинен. В некоторых вариантах осуществления удлинение индексного праймера включает считывание индекса. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления количество циклов секвенирования путем синтеза может зависеть от количества различных индексов в множестве субпопуляций гранул. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать 6-12 циклов секвенирования путем синтеза.

Определенные способы обнаружения лигандов-мишеней

[0157] Некоторые варианты осуществления включают способы обнаружения лигандов-мишеней. В некоторых вариантах осуществления лиганды-мишени могут содержать нуклеиновые кислоты, белки или другие антигены. В некоторых вариантах осуществления лиганды-мишени получают из разных источников, например из разных образцов, разных отдельных субъектов или разных популяций субъектов.

[0158] В некоторых вариантах осуществления способы обнаружения лигандов-мишеней могут включать получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью. Например, зонд захвата может содержать нуклеиновую кислоту, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула также содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса. В некоторых вариантах осуществления популяция гранул содержит первую и вторую субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления индексы первой субпопуляции гранул отличаются от индексов второй субпопуляции гранул. Например, индексы первой субпопуляции гранул можно использовать для определения первой субпопуляции гранул по индексам второй субпопуляции гранул.

[0159] Некоторые варианты осуществления включают приведение первых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул. Например, первые лиганды-мишени можно получить из первого образца лигандов, а вторые лиганды-мишени можно получить из второго образца лигандов. Некоторые варианты осуществления также предусматривают распределение на субстрате первой и второй субпопуляций гранул, содержащих специфически связанные первый и второй лиганды-мишени. Некоторые варианты осуществления также включают обнаружение зондов захвата, специфически связанных с первым и вторым лигандами-мишенями, распределенными на субстрате. Некоторые варианты осуществления также включают декодирование положений гранул, содержащих обнаруженные зонды захвата, на субстрате.

[0160] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту, а лиганды-мишени содержат нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В других вариантах осуществления зонд захвата отличается от первого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата субпопуляции гранул содержат отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления различные субпопуляции гранул могут содержать одни и те же или различные зонды захвата. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

[0161] В некоторых таких вариантах осуществления обнаружение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, включает удлинение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления удлинение может включать полимеразное удлинение и/или лигазное удлинение. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает обнаруживаемый нуклеотид, такой как флуоресцентно-меченный нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает однонуклеотидное удлинение зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает удлинение зондов захвата множеством нуклеотидов.

[0162] В некоторых таких вариантах осуществления зонд захвата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата субпопуляции гранул специфически связываются с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления различные субпопуляции гранул могут содержать одни и те же или различные зонды захвата. В некоторых таких вариантах осуществления различные зонды захвата субпопуляции гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями.

[0163] В некоторых вариантах осуществления обнаружение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, включает иммунологический анализ. Например, лиганды-мишени, специфически связанные с зондами захвата, приводят в контакт со вторичным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит обнаруживаемую метку, например флуоресцентную метку.

[0164] В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0165] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность и позволяют отличать одну субпопуляцию гранул от другой субпопуляции гранул. Например, нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0166] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0167] В некоторых вариантах осуществления приведение первого лиганда-мишени в контакт с зондами захвата первой субпопуляции гранул и приведение вторых лигандов-мишеней в контакт с зондами захвата второй субпопуляции гранул осуществляется в разных положениях. Например, разные положения могут предусматривать разные реакционные объемы, например разные объемы в разных лунках в микротитрационном планшете.

[0168] Некоторые варианты осуществления также предусматривают объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения первой и второй субпопуляций гранул на субстрате. В других вариантах осуществления первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления субпопуляции гранул распределяют на субстрате до обнаружения зонда захвата, специфически связанного с лигандом.

[0169] В некоторых таких вариантах осуществления обнаружение зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, также может включать определение положения зондов захвата, специфически связанных с лигандами-мишенями, на субстрате.

[0170] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения обнаруженных зондов захвата включает декодирование положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата. Некоторые варианты осуществления также включают гибридизацию множества индексных праймеров с сайтами индексных праймеров и удлинение гибридизованных индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных индексных праймеров содержит по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения индексов гранул включает секвенирование индексов на субстрате.

[0171] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения обнаруженных зондов захвата включает декодирование положения штрихкодов гранул, содержащих обнаруженный зонд захвата. Некоторые такие варианты осуществления включают гибридизацию множества штрихкодовых праймеров с сайтами штрихкодовых праймеров и удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных штрихкодовых праймеров включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения штрихкодов гранул включает секвенирование штрихкодов на субстрате.

[0172] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.В некоторых вариантах осуществления распределенные первая и вторая субпопуляции гранул содержат матрицу.

[0173] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50, 100, 500, 1000 или 5000 отличающихся друг от друга зондов захвата или любое количество зондов захвата в диапазоне между любыми двумя вышеуказанными количествами. Некоторые варианты осуществления также содержат по меньшей мере 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции, или любое количество разных субпопуляций гранул между любыми двумя вышеуказанными количествами.

[0174] На ФИГ. 6А слева изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200, имеющую полинуклеотид 210, прикрепленный к грануле. Полинуклеотид содержит зонд захвата, который гибридизован с нуклеиновой кислотой-мишенью 220. Зонд захвата удлинен нуклеотидом, содержащим обнаруживаемую метку 230. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может содержать штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и идентификации штрихкода. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид также может включать индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул, и сайт связывания индексного праймера, подходящий для секвенирования и определения индекса. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0175] На ФИГ. 6А посередине изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200 с зондом 240 захвата, прикрепленным к грануле. Зонд захвата гибридизован с нуклеиновой кислотой-мишенью 220. К грануле также прикреплен первый полинуклеотид 260, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и определения штрихкода. К грануле также прикреплен второй полинуклеотид 250, содержащий индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул. Зонд захвата удлинен нуклеотидом, содержащим обнаруживаемую метку 230. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0176] На ФИГ. 6А справа изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200 с зондом 270 захвата, прикрепленным к грануле, причем зонд захвата является антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела. Зонд захвата специфически связан с лигандом 280. Лиганд также связан со вторичным антителом 290, которое содержит обнаруживаемую метку 230. К грануле также прикреплен первый полинуклеотид 260, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и определения штрихкода. К грануле также прикреплен второй полинуклеотид 250, содержащий индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0177] На ФИГ. 6В справа изображен вариант осуществления, который содержит гранулу 200 с зондом 330 захвата, содержащим белок, прикрепленный к грануле. В некоторых вариантах осуществления гранулу можно распределить в матрице на субстрате. Субстрат 340 для белка используют для контакта с белком, чтобы генерировать сигнал, содержащий обнаруживаемую метку 230. Возможно определение положения сигнала на матрице. В некоторых вариантах осуществления гранула может содержать первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и сайт связывания штрихкодового праймера, подходящий для секвенирования и определения штрихкода, также прикрепленный к грануле. В некоторых вариантах осуществления гранула может содержать второй полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на субпопуляцию гранул из другой субпопуляции гранул, также прикрепленный к грануле. В некоторых вариантах осуществления гранулу декодируют на матрице. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0178] Некоторые варианты осуществления включают способы обнаружения лигандов-мишеней на матрице, включающие: (а) получение первой и второй популяций гранул, причем каждая гранула содержит: зонд захвата, причем зонд захвата способен специфически связываться с лигандом-мишенью, нуклеиновую кислоту, кодирующую штрихкод, и сайт связывания штрихкодового праймера, причем штрихкод указывает на зонд захвата, и нуклеиновую кислоту, кодирующую индекс и сайт связывания индексного праймера, причем индекс указывает на источник гранулы из первой популяции или второй популяции и (b) приведение первой популяции гранул в контакт с первым образцом, содержащим первый лиганд-мишень, причем первый лиганд-мишень специфически связывается с зондом захвата первой популяции гранул и, таким образом, получение связанной с мишенью первой популяции гранул; (с) приведение второй популяции гранул в контакт со вторым образцом, содержащим второй лиганд-мишень, причем второй лиганд-мишень специфически связывается с зондом захвата второй популяции гранул, и получение таким образом связанной с мишенью второй популяции гранул; (d) случайное распределение связанной с мишенью первой популяции гранул и связанной с мишенью второй популяции гранул на матрице; (е) обнаружение положения гранул, содержащих первый лиганд-мишень и второй лиганд-мишень, на матрице; и (f) определение последовательности индекса и штрихкода гранул, содержащих первый лиганд-мишень и второй лиганд-мишень, на матрице. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления обнаружение положения гранул, содержащих первый лиганд-мишень и второй лиганд-мишень, на матрице включает удлинение зонда захвата путем полимеразного удлинения или лигирования. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок. В некоторых вариантах осуществления стадию (е) выполняют после стадии (f). В некоторых вариантах осуществления штрихкоды первой популяции гранул содержат отличные друг от друга штрихкоды, и штрихкоды второй популяции гранул содержат отличные друг от друга штрихкоды. В некоторых вариантах осуществления индексы первой популяции гранул идентичны друг другу, а индексы второй популяции гранул идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления матрица размещена на поверхности проточной кюветы. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая популяции гранул адаптированы для прикрепления к матрице. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая популяции гранул содержат биотин, стрептавидин или их производное; и матрица содержит биотин, стрептавидин или их производное. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая популяции гранул являются магнитными.

Секвенирование и анализ нуклеиновых кислот-мишеней

[0179] Некоторые варианты осуществления включают секвенирование и/или анализ нуклеиновых кислот-мишеней. Некоторые варианты осуществления включают декодирование положений полинуклеотидов в матрице в соответствии со способами, предложенными в настоящем документе; гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата; удлинение зондов захвата; и обнаружение удлинения зондов захвата, гибридизированных с нуклеиновой кислотой-мишенью, в некотором положении на матрице. В некоторых вариантах осуществления положения полинуклеотидов на матрице можно декодировать перед гибридизацией нуклеиновой кислоты-мишени с полинуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления положения полинуклеотидов на матрице можно декодировать после обнаружения удлинения зондов захвата, гибридизованных с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид может быть связан с зондом захвата через общий элемент. Например, каждый полинуклеотид и зонд захвата может быть связан с одним и тем же микроэлементом, таким как гранула. В дополнительных таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может содержать зонд захвата.

[0180] Некоторые варианты осуществления включают достройку зондов захвата по одному основанию (SBE). В некоторых вариантах осуществления SBE можно использовать для обнаружения аллели, мутаций или других элементов нуклеиновых кислот-мишеней. Вкратце, в SBE используется зонд захвата, который гибридизуется с геномным фрагментом-мишенью в положении, которое является проксимальном или соседним к положению обнаружения, причем положение обнаружения указывает на конкретный локус. Полимеразу можно использовать для удлинения 3'-конца зонда захвата нуклеотидным аналогом, меченым детекторной меткой. На основании точности фермента нуклеотид встраивается в зонд захвата только в том случае, если он комплементарен положению обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени. При необходимости нуклеотид можно дериватизировать таким образом, что применение блокирующей группы, включая обратимые блокирующие группы, не может приводить к дополнительным удлинениям и, таким образом, происходит добавление только одного нуклеотида. Присутствие в удлиненном зонде захвата меченого нуклеотида может быть обнаружено, например, в конкретном месте матрицы, а добавленный нуклеотид определен для установления идентичности локуса или аллели. SBE можно проводить в известных условиях, таких как описанные в патентах США №9,441,267 и US 9,045,796, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0181] Некоторые варианты осуществления включают аллель-специфическое удлинение праймера (ASPE). В некоторых вариантах осуществления ASPE может включать удлинение зондов захвата, которые различаются по нуклеотидной композиции на их 3'-конце. Способ ASPE можно осуществлять с применением нуклеозида или нуклеотида, содержащего расщепляемый линкер, чтобы после обнаружения зонда можно было удалить метку. Это делает возможным дополнительное использование зондов или подтверждение, что обнаруженный сигнал обусловлен меткой, которая теперь удалена. Вкратце, ASPE можно выполнять путем гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с зондом захвата, имеющим участок последовательности 3', который комплементарен положению обнаружения, и участок последовательности 5', который комплементарен последовательности, которая находится по соседству с положением обнаружения. Направляемая темплатом модификация части 3' зонда захвата, например, путем добавления меченого нуклеотида с помощью полимеразы, позволяет получить меченый продукт удлинения, но только в том случае, если темплат включает целевую последовательность. Тогда может быть обнаружено присутствие такого меченого продукта удлинения праймера, например, на основании его положения в матрице, с обозначением присутствия специфической аллели. В некоторых вариантах осуществления ASPE можно выполнять с множеством зондов захвата, которые имеют аналогичные 5'-концы, так что они ренатурируются по соседству с одним и тем же положением обнаружения в нуклеиновой кислоте-мишени, но различные 3'-концы, так что полимеразой модифицируются только зонды захвата, имеющие 3'-конец, который комплементирует положение обнаружения. Зонд захвата, имеющий 3'-концевое основание, которое комплементарно конкретному положению обнаружения, называют зондом идеального соответствия (РМ) для положения, тогда как зонды захвата, которые имеют 3'-концевое несоответствующее основание и не выполнены с возможностью удлинения в ходе реакции ASPE, представляют собой зонды несоответствия (ММ) для положения. Можно обнаружить присутствие меченого нуклеотида в зонде РМ и определить последовательность 3' зонда захвата, определенного для идентификации конкретной аллели в положении обнаружения.

[0182] Некоторые варианты осуществления включают способы для декодирования положений полинуклеотидов в матрице, (а) получение субстрата, имеющего матрицу полинуклеотидов, распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода, при этом каждый полинуклеотид связан с зондом захвата; (b) гибридизацию множества праймеров с сайтами связывания праймера; (с) определение последовательностей штрихкодов путем удлинения гибридизованных праймеров, причем последовательность каждого штрихкода указывает на положение полинуклеотида в матрице. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид связан с зондом захвата посредством гранулы. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата является 3' сайта связывания праймера. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата является 5' штрихкода. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит последовательность, отличную от последовательности другого зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата отличается от другого зонда захвата менее чем на 5 различных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления каждый зонд захвата содержит различную последовательность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды случайным образом распределены на поверхности субстрата. В некоторых вариантах осуществления штрихкод содержит последовательность, отличную от другого штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждый штрихкод содержит различную последовательность. В некоторых вариантах осуществления каждый сайт связывания праймера содержит одну и ту же последовательность. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды присоединены к гранулам. В некоторых вариантах осуществления гранулы распределены в лунках. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер выполнен с возможностью удаления зонда захвата из сайта связывания праймера и штрихкода. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит лунки. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер прикреплен к субстрату. В некоторых вариантах осуществления спейсер прикреплен к грануле. Некоторые варианты осуществления также включают гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата выполняют после определения последовательностей штрихкодов. В некоторых вариантах осуществления гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата выполняют перед определением последовательностей штрихкодов. Некоторые варианты осуществления также включают удлинение гибридизованной нуклеиновой кислоты-мишени или полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления удлинение предусматривает лигирование. Некоторые варианты осуществления также включают амплифицирование нуклеиновой кислоты-мишени.

[0183] Некоторые варианты осуществления включают способы секвенирования нуклеиновой кислоты-мишени. Некоторые такие способы (а) декодируют положения полинуклеотидов в матрице в соответствии с любым из вышеуказанных способов; (b) гибридизируют нуклеиновую кислоту-мишень с зондами захвата; (с) удлиняют зонды захвата, гибридизированные с нуклеиновой кислотой-мишенью; и (d) обнаруживают положение удлиненных зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления (d) обнаружение положения удлиненных зондов захвата выполняют до (а) декодирования положений полинуклеотидов в матрице. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата удлиняют с помощью лигазы. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата удлиняют с помощью полимеразы. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата удлиняют добавлением одного нуклеотида. Некоторые варианты осуществления также включают отщепление сайтов связывания праймера и штрихкодов от зондов захвата перед гибридизацией нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата. Некоторые варианты осуществления также включают отщепление сайтов связывания праймера и штрихкодов от зондов захвата после гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с зондами захвата.

[0184] Некоторые варианты осуществления включают секвенирование полинуклеотидов-мишеней, полученных из различных биологических источников, на матрице. В некоторых таких вариантах осуществления полинуклеотиды, содержащие нуклеиновые кислоты-мишени, можно получить из образца нуклеиновой кислоты. Примеры образцов полинуклеотидов включают образцы геномной ДНК, образцы кДНК, образцы РНК и ампликоны индивидуумов. Полинуклеотид может включать в себя нуклеиновую кислоту-мишень, индекс и сайт связывания индексного праймера, смежный с индексом. Индекс можно использовать для указания источника нуклеиновой кислоты-мишени в качестве определенного образца нуклеиновой кислоты. Например, полинуклеотиды, полученные из разных образцов нуклеиновых кислот, могут включать в себя разные индексы. Каждый индекс может иметь положение, предназначенное для связывания с конкретным праймером для амплификации. Данный сайт связывания индексного праймера можно использовать для секвенирования индекса путем удлинения праймера, гибридизированного с сайтом связывания индексного праймера. В некоторых вариантах осуществления индекс представляет собой нуклеиновую кислоту или область внутри полинуклеотида в диапазоне от около 3 до 30 последовательных нуклеотидов. Штрихкод может содержать, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или он может быть длиннее. Некоторые аспекты, применимые со способами и композициями, предложенными в настоящем документе, описаны в патентах США 20180334711 А1 и 20190085384 А1, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления штрихкод или индекс могут включать в себя уникальный молекулярный идентификатор (UMI).

[0185] Полинуклеотиды можно получать различными способами. В некоторых вариантах осуществления образец нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновые кислоты-мишени, можно метить транспосомами для получения фрагментов нуклеиновых кислот с концами, содержащими последовательности из транспосом. В некоторых вариантах осуществления транспосомы могут включать в себя индексы и сайты связывания индексного праймера, так что мечение добавляет индексы и сайты связывания индексного праймера к фрагментам нуклеиновых кислот.Например, входную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеиновую кислоту-мишень, можно приводить в контакт со множеством транспосом. Транспосомы могут фрагментировать входную нуклеиновую кислоту и присоединять адаптеры к концам фрагментов нуклеиновой кислоты. Примеры таких реакций мечения описаны в патенте США №9,040,256, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0186] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, содержащие индексы, можно получить путем добавления адаптеров к концам фрагментов нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты-мишени, причем адаптеры могут включать индексы и сайты связывания индексного праймера. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, содержащие индексы, можно получить путем амплификации фрагментов нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты-мишени, с праймерами, содержащими индексы и сайты связывания индексного праймера, так чтобы продукты амплификации включали индексы и сайты связывания индексного праймера.

[0187] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени полинуклеотидов гибридизируются с зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата присоединены к гранулам. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат зонды захвата. Олигонуклеотид может включать в себя зонд захвата, штрихкод и сайт связывания штрихкодового праймера. В некоторых вариантах осуществления штрихкод можно секвенировать путем удлинения праймера, гибридизированного с сайтом связывания праймера. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может включать в себя нуклеотидную последовательность, которую можно использовать для определения полинуклеотида, такого как зонд захвата, в матрице. Штрихкод может включать в себя уникальную нуклеотидную последовательность, которая отличима от других штрихкодов. Она также может быть отличима от других нуклеотидных последовательностей в полинуклеотидах и нуклеиновых кислотах-мишенях по последовательности штрихкода, а также по положению штрихкода в полинуклеотиде, например по его положению, смежному с сайтом связывания штрихкодового праймера. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность штрихкода может присутствовать более одного раза во множестве нуклеиновых кислот, однако штрихкод, смежный с сайтом связываний штрихкодового праймера, может быть обнаружен. Штрихкод может иметь любую желаемую длину последовательности, достаточную для обеспечения уникальной нуклеотидной последовательности в пределах множества штрихкодов в популяции и/или в пределах множества анализируемых или исследуемых полинуклеотидов и целевых нуклеиновых кислот.В некоторых вариантах осуществления штрихкод представляет собой нуклеиновую кислоту или область внутри полинуклеотида в диапазоне от около 6 до 30 нуклеотидов. Штрихкод может содержать, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или он может быть длиннее. Подходящие штрихкоды для некоторых вариантов осуществления описаны в патенте США No 8,053,192, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может отличать полинуклеотид от другого полинуклеотида в матрице, так что каждый штрихкод отличается от другого штрихкода. В некоторых вариантах осуществления штрихкод можно использовать для идентификации положения гранулы в матрице. В некоторых вариантах осуществления штрихкод можно использовать для идентификации зонда захвата.

[0188] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени полинуклеотидов гибридизируют с зондами захвата для получения гибридизированных гранул. В некоторых вариантах осуществления гибридизированные гранулы могут включать в себя олигонуклеотид, содержащий штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и зонд захвата, причем зонд захвата может быть гибридизирован с нуклеиновой кислотой-мишенью полинуклеотида, а полинуклеотид может включать в себя индекс и сайт связывания индексного праймера. Гибридизованные гранулы могут быть случайным образом распределены по матрице.

[0189] В некоторых вариантах осуществления информацию о последовательности нуклеиновой кислоты-мишени можно получить путем удлинения зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может быть удлинен для включения последовательностей, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых таких вариантах осуществления удлинение может включать полимеразное удлинение. В некоторых вариантах осуществления удлинение является достройкой по одному основанию (SBE). В некоторых вариантах осуществления SBE можно использовать для обнаружения аллели, мутаций или других элементов нуклеиновых кислот-мишеней.

[0190] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может быть удлинен с помощью лигирования. Например, локус-специфичный олигонуклеотид может гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью в положении, смежном с сайтом, в котором зонд захвата гибридизируется с нуклеиновой кислотой-мишенью, а затем локус-специфичный олигонуклеотид может быть лигирован с зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может быть удлинен, так чтобы удлиненный зонд захвата включал последовательности, комплементарные индексу и сайту связывания индексного праймера полинуклеотида.

[0191] В некоторых вариантах осуществления индекс секвенируют для определения источника нуклеиновой кислоты-мишени, присоединенной к грануле на матрице. В некоторых вариантах осуществления штрихкод секвенируют для декодирования положения гранулы на матрице. В некоторых вариантах осуществления штрихкод секвенируют для идентификации зонда захвата, прикрепленного к грануле на матрице.

[0192] В некоторых вариантах осуществления матрица размещена на поверхности проточной кюветы. В некоторых вариантах осуществления гранулы выполнены с возможностью прикрепления к матрице. Например, гранулы могут включать в себя такие агенты, как биотин, стрептавидин или их производное; и матрица содержит биотин, стрептавидин или их производное. В некоторых вариантах осуществления гранулы и матрица являются магнитными.

[0193] Некоторые варианты осуществления включают получение множества полинуклеотидов из разных образцов нуклеиновых кислот, гибридизацию каждого множества полинуклеотидов с популяцией гранул, содержащих зонды захвата для получения гибридизированных гранул, и случайное распределение гибридизированных гранул на матрице. Пример осуществления включает получение первой и второй популяций гранул, причем первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды, и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, а вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами. Получают первое и второе множество полинуклеотидов, причем первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом множество первых полинуклеотидов находится в растворе, а второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, причем множество вторых полинуклеотидов находится в растворе. Первые нуклеиновые кислоты-мишени гибридизируют с первыми зондами захвата для получения гибридизированных первых гранул, а вторые нуклеиновые кислоты-мишени гибридизируют со вторыми зондами захвата для получения гибридизированных вторых гранул. Гибридизованные первые гранулы и гибридизованные вторые гранулы на матрице случайным образом распределяют по матрице. Положения первой и второй гранул на матрице декодируют путем секвенирования первого и второго штрихкодов для определения того, какие гранулы были связаны каждым набором нуклеиновых кислот-мишеней. Данные нуклеотидной последовательности получают для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней путем удлинения первого и второго зондов захвата.

[0194] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды индексируют, как описано в настоящем документе. Например, получают первую и вторую популяции гранул, причем первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды, и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, а вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами. Получают первое и второе множество полинуклеотидов, причем первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами, при этом множество первых полинуклеотидов находится в растворе, а второе множество полинуклеотидов содержит вторые целевые нуклеиновые кислоты, вторые индексы и вторые сайты связывания праймера, смежные со вторыми индексами, причем множество вторых полинуклеотидов находится в растворе. Первые нуклеиновые кислоты-мишени гибридизируют с первыми зондами захвата для получения гибридизированных первых гранул, а вторые нуклеиновые кислоты-мишени гибридизируют со вторыми зондами захвата для получения гибридизированных вторых гранул. Гибридизованные первые гранулы и гибридизованные вторые гранулы случайным образом распределяют по матрице. Положения первой и второй гранул на матрице декодируют путем секвенирования первого и второго штрихкодов. Первый и второй зонды захвата удлиняют для получения данных нуклеотидной последовательности для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней. Источник данных нуклеотидной последовательности первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней определяют посредством секвенирования первого и второго индексов.

[0195] В некоторых вариантах осуществления первое множество полинуклеотидов содержит первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами; а второе множество полинуклеотидов содержит вторые целевые нуклеиновые кислоты, вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами. В некоторых вариантах осуществления первое или второе множество полинуклеотидов получают посредством мечения образца нуклеиновой кислоты множеством транспосом. В некоторых вариантах осуществления множество транспосом содержат первый или второй индексы. Некоторые варианты осуществления также включают в себя добавление адаптеров к меченому образцу нуклеиновой кислоты, причем адаптеры содержат первый или второй индексы. Некоторые варианты осуществления также включают амплификацию меченого образца нуклеиновой кислоты с праймерами, содержащими первый или второй индексы. В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата встраивает последовательности, комплементарные первому и второму индексам и первому и второму сайтам связывания индексного праймера, в удлиненные зонды захвата.

[0196] В некоторых вариантах осуществления гранулы могут быть индексированы. Например, гранула может включать в себя нуклеиновую кислоту, содержащую индекс и сайт связывания индексного праймера. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид, прикрепленный к грануле, может включать в себя штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера, индекс, сайт связывания индексного праймера. Например, первая популяция гранул может содержать первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами, а вторая популяция гранул может содержать вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды первой популяции гранул содержат первые индексы; а олигонуклеотиды второй популяции гранул содержат вторые индексы.

[0197] В некоторых вариантах осуществления получают первую и вторую популяции гранул, в которых первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, а также первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами, а вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами, а также вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами. Получают первое и второе множество полинуклеотидов, причем первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом множество первых полинуклеотидов находится в растворе, а второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, причем множество вторых полинуклеотидов находится в растворе. Первые нуклеиновые кислоты-мишени гибридизируют с первыми зондами захвата для получения гибридизированных первых гранул, а вторые нуклеиновые кислоты-мишени гибридизируют со вторыми зондами захвата для получения гибридизированных вторых гранул. Гибридизованные первые гранулы и гибридизованные вторые гранулы случайным образом распределяют по матрице. Положения первой и второй гранул на матрице декодируют путем секвенирования первого и второго штрихкодов. Первый и второй зонды захвата удлиняют для получения данных нуклеотидной последовательности для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды первой популяции гранул содержат первые индексы; а олигонуклеотиды второй популяции гранул содержат вторые индексы.

[0198] В некоторых вариантах осуществления первые индексы указывают на источник первых нуклеиновых кислот-мишеней, а вторые индексы указывают на источник вторых нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления первые индексы совпадают друг с другом и вторые индексы совпадают друг с другом. Некоторые варианты осуществления также включают секвенирование первого и второго индексов. В некоторых вариантах осуществления первый и второй индексы содержат удлиняющие праймеры, гибридизованные с сайтами связывания индексного праймера. В некоторых вариантах осуществления сайты индексного связывающего праймера являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления первую и вторую нуклеиновые кислоты-мишени получают от разных образцов нуклеиновых кислот.В некоторых вариантах осуществления первую и вторую нуклеиновые кислоты-мишени получают от разных геномных ДНК.

[0199] В некоторых вариантах осуществления первый и второй штрихкоды указывают на нуклеотидную последовательность первого или второго зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления первые штрихкоды отличаются друг от друга и вторые штрихкоды отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления секвенирование первого и второго штрихкодов включает удлиняющие праймеры, гибридизованные с сайтами связывания штрихкодового праймера. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера одинаковы.

[0200] В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает полимеразное удлинение. В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает добавление одного нуклеотида к зонду захвата. Некоторые варианты осуществления также включают лигирование специфичных для локуса олигонуклеотидов с удлиненными зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления удлинение первого и второго зондов захвата включает лигирование специфичных для локуса олигонуклеотидов с зондами захвата.

[0201] В некоторых вариантах осуществления гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с первыми зондами захвата для получения гибридизованных первых гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней со вторыми зондами захвата для получения гибридизованных вторых гранул выполняют в растворе.

[0202] В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит матрицу. В некоторых вариантах осуществления матрица содержит множество лунок, причем каждая лунка содержит одну или более гранул. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы выполнены с возможностью прикрепления к матрице. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая гранулы содержат биотин, стрептавидин или их производное; и матрица содержит биотин, стрептавидин или их производное. В некоторых вариантах осуществления гранулы и матрица являются магнитными.

[0203] Пример осуществления секвенирования нуклеиновых кислот-мишеней на матрице, в котором полинуклеотиды, содержащие нуклеиновую кислоту-мишень, также включают индекс, показан на ФИГ. 9. Образец ДНК, содержащий целевую нуклеиновую кислоту, содержащую однонуклеотидный полиморфизм (star), подвергают мечению, при котором образец ДНК фрагментируют, и к каждому концу фрагментов добавляют сайты связывания праймера для амплификации. Фрагменты амплифицируют посредством ПЦР с праймерами, которые связываются с сайтами связывания праймера для амплификации и включают индекс образца и сайт связывания индексного праймера прочтения. Последовательности индекса образца и индексного праймера прочтения встраивают в амплифицированные продукты. Гранулы получают путем присоединения олигонуклеотидов к гранулам. Олигонуклеотиды содержат линкер, декодирующую последовательность (также известную как последовательность штрихкода), сайт связывания декодирующего праймера прочтения и зонд захвата. Амплифицированные продукты и гранулы объединяют. Нуклеиновые кислоты-мишени гибридизуются с зондами захвата. Гибридизация может происходить в растворе или на матрице. Гибридизованные гранулы случайным образом распределяют на матрице. Зонд захвата удлиняют полностью функциональными нуклеотидами (FFN) и обнаруживают удлинение. Удлиненный зонд захвата дополнительно удлиняют для встраивания последовательностей, комплементарных индексу образца и сайту связывания индексного праймера прочтения. Цепь, содержащую нуклеиновую кислоту-мишень, диссоциируют от удлиненного захвата. Индекс образца удлиненного зонда захвата секвенируют путем удлинения праймера, гибридизованного с сайтом связывания праймера прочтения индекса. Декодирующую последовательность удлиненного зонда захвата секвенируют путем удлинения праймера, гибридизированного с сайтом связывания декодирующего праймера прочтения. Источник нуклеиновой кислоты-мишени идентифицируют из последовательности индекса образца. Гранулу декодируют и из декодирующей последовательности идентифицируют зонд захвата.

[0204] Другой пример осуществления секвенирования нуклеиновых кислот-мишеней на матрице, в котором гранулы включают индекс, показан на ФИГ. 10. Гранулы получают путем присоединения олигонуклеотидов зонда захвата и олигонуклеотидов зонда индекса образца. Олигонуклеотиды зонда захвата включают в себя линкер, декодирующую последовательность, сайт связывания декодирующего праймера чтения и зонд захвата. Олигонуклеотид с индексным зондом образца включает в себя линкер, индекс образца и сайт связывания индексного праймера чтения. Гранулы комбинируют с фрагментированными нуклеиновыми кислотами, содержащими нуклеиновые кислоты-мишени, такие как нуклеиновые кислоты, содержащие интересующий однонуклеотидный полиморфизм (star). Нуклеиновая кислота-мишень гибридизуется с зондом захвата либо в растворе, либо на матрице. Зонд захвата удлиняют с помощью FFN. Детектируют удлинение. Нуклеиновую кислоту-мишень диссоциируют от удлиненного зонда захвата. Индекс образца секвенируют путем удлинения праймера, гибридизованного с сайтом связывания индексного праймера прочтения. Декодирующую последовательность удлиненного зонда захвата секвенируют путем удлинения праймера, гибридизированного с сайтом связывания декодирующего праймера прочтения. Источник нуклеиновой кислоты-мишени идентифицируют из последовательности индекса образца. Гранулу декодируют и из декодирующей последовательности идентифицируют зонд захвата.

Некоторые двухзондовые способы

[0205] Некоторые варианты осуществления включают обнаружение нуклеиновой кислоты-мишени с помощью первого и второго зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень содержит первый участок, способный гибридизоваться с первым зондом захвата, и второй участок, способный гибридизоваться со вторым зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления получают популяцию гранул, в которой каждая гранула содержит первый зонд захвата и второй зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления один из двух зондов захвата присоединен к грануле посредством расщепляемого линкера. В некоторых вариантах осуществления один из зондов захвата содержит обнаруживаемую метку, такую как флуоресцентная метка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень гибридизуется с зондами захвата с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей одноцепочечный гэп. Гэп заполняют и расщепляемый линкер отщепляют. Обнаруживают удлиненный зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления один из зондов захвата содержит обнаруживаемую метку, такую как флуоресцентная метка. В некоторых вариантах осуществления обнаруживаемую метку встраивают в удлиненный зонд захвата во время заполнения гэпа.

[0206] В некоторых вариантах осуществления второй зонд захвата присоединен к грануле посредством расщепляемого линкера, и второй зонд захвата содержит обнаруживаемую метку, такую как флуоресцентная метка. Примеры расщепляемых линкеров включают линкеры, которые можно расщеплять химическим путем, ферментами, такими как эндонуклеазы, и определенными частотами света. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула также содержит первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонд захвата, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода. В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата содержит первый полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата отличается от первого полинуклеотида.

[0207] В некоторых вариантах осуществления конец первого зонда захвата лигирован с концом второго зонда захвата. В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата лигируют со вторым зондом захвата путем гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с первым и вторым зондами захвата гранулы популяции гранул с получением двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей одноцепочечный гэп между первым и вторым зондами захвата, и заполнение гэпа между первым и вторым зондами захвата. В некоторых вариантах осуществления заполнение гэпа можно выполнять с помощью полимеразы и/или лигазы. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер расщепляют с получением гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку. В некоторых вариантах осуществления популяция гранул распределена на субстрате. В некоторых вариантах осуществления популяцию гранул распределяют на субстрате после расщепления расщепляемого линкера. В некоторых вариантах осуществления популяцию гранул распределяют на субстрате до расщепления расщепляемого линкера или до лигирования первого зонда захвата со вторым зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления определяют положение гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате.

[0208] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате включает декодирование положения штрихкода гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате. Некоторые такие варианты осуществления могут включать гибридизацию штрихкодового праймера с сайтом штрихкодового праймера и удлинение гибридизованного штрихкодового праймера. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованного штрихкодового праймера включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения штрихкода гранулы включает секвенирование штрихкода на субстрате.

[0209] В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на источник нуклеиновой кислоты-мишени, и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса.

[0210] В некоторых вариантах осуществления популяция гранул содержит первую и вторую субпопуляции гранул, каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность.

[0211] В некоторых вариантах осуществления стадию лигирования или расщепления с первой субпопуляцией гранул выполняют в положениях, отличающихся от стадии лигирования или расщепления со второй субпопуляцией гранул. В некоторых вариантах осуществления разные положения предусматривают разные реакционные объемы. В некоторых вариантах осуществления разные положения предусматривают разные лунки.

[0212] Некоторые варианты осуществления также предусматривают объединение первой и второй субпопуляций гранул до распределения субпопуляции гранул на субстрате. В других вариантах осуществления первую субпопуляцию гранул распределяют на субстрате до распределения на субстрате второй субпопуляции гранул.

[0213] В некоторых вариантах осуществления декодирование положения гранулы, содержащей первый зонд захвата, содержащий обнаруживаемую метку, на субстрате включает определение положения индексов гранул, содержащих обнаруженный зонт захвата. Некоторые такие варианты осуществления включают гибридизацию множества индексных праймеров с сайтами индексных праймеров и удлинение гибридизованных индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления удлинение гибридизованных индексных праймеров включает по меньшей мере один цикл секвенирования путем синтеза. В некоторых вариантах осуществления декодирование положения индексов гранул включает секвенирование индексов на субстрате.

[0214] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат. В некоторых вариантах осуществления распределенная популяция гранул содержит матрицу.

[0215] На ФИГ. 6В слева изображен вариант осуществления, в котором гранула 200 содержит первый зонд 300 захвата, прикрепленный к грануле посредством расщепляемого линкера 310. Второй зонд 320 захвата прикреплен к грануле. Нуклеиновая кислота-мишень 220 из определенного образца гибридизована с первым и вторым зондами захвата, и первый зонд захвата удлинен для заполнения гэпа между первым и вторым зондами захвата нуклеотидами, которые содержат обнаруживаемые метки 230. После заполнения гэпа нуклеиновую кислоту-мишень удаляют, а расщепляемый линкер расщепляют с получением удлиненного второго зонда захвата, содержащего обнаруживаемые метки, прикрепленные к грануле. Гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на присоединенный к грануле образец, и полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонды захвата, не показаны. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице.

[0216] На ФИГ. 6С изображен вариант осуществления, в котором первый зонд захвата присоединен к грануле 200 посредством его 5'-конца. Второй зонд 360 захвата присоединен к грануле посредством его 3'-конца и расщепляемого линкера 310. Второй зонд захвата содержит обнаруживаемые метки 230. Нуклеиновую кислоту-мишень 220 гибридизована с первым и вторым зондами захвата, первый зонд захвата удлинен и лигирован со вторым зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота-мишень может содержать структурные варианты (SV). Расщепляемый линкер расщепляют с получением удлиненного первого зонда захвата, содержащего обнаруживаемую метку и присоединенного к грануле. Гранулу можно распределить в матрице на субстрате и декодировать. Полинуклеотид, содержащий индекс, указывающий на присоединенный к грануле образец, и полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на первый или второй зонды захвата, не показаны. Декодирование может включать определение положения обнаруживаемой метки на матрице; определение штрихкода, прикрепленного к грануле на матрице; и/или определение индекса, прикрепленного к грануле на матрице. При отсутствии нуклеиновой кислоты-мишени второй зонд захвата и обнаруживаемая метка отщеплены от гранулы.

Некоторые способы получения и применения индексированных гранул

[0217] Некоторые варианты осуществления включают получение индексированных гранул. Некоторые такие варианты осуществления могут включать обеспечение популяции индексных полинуклеотидов, причем каждый индексный полинуклеотид содержит индекс, сайт связывания индексного праймера и якорь/адаптер. В некоторых вариантах осуществления якорь/адаптер способен связываться или гибридизоваться с сайтом связывания адаптера, прикрепленным к грануле.

[0218] Некоторые варианты осуществления включают способ получения индексированной популяции гранул, включающий (а) получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит адаптер, зонд захвата и первый полинуклеотид, содержащий штрихкод и сайт связывания штрихкодового праймера; (b) получение множества индексных полинуклеотидов, в котором каждый индексный полинуклеотид содержит индекс и сайт связывания индексного праймера; и (с) присоединение множества индексных полинуклеотидов к популяции гранул посредством адаптеров с получением таким образом индексированной популяции гранул. В некоторых вариантах осуществления (с) включает удлинение адаптеров за счет полимеразного удлинения. В некоторых вариантах осуществления каждый индексный полинуклеотид содержит сайт связывания адаптера, а прикрепление включает гибридизацию сайтов связывания адаптера с адаптерами. В некоторых вариантах осуществления (с) включает лигирование индексных полинуклеотидов с адаптерами. В некоторых вариантах осуществления прикрепление включает гибридизацию шунтового полинуклеотида с адаптером и индексным полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления (с) включает присоединение множества индексных полинуклеотидов к адаптерам популяции гранул посредством химически реакционноспособной функциональной группы. В некоторых вариантах осуществления первые полинуклеотиды популяции гранул содержат отличающиеся друг от друга зонды захвата. В некоторых вариантах осуществления индекс каждого индексного полинуклеотида является одинаковым. Аспекты, подходящие для способов и композиций, используемых для соединения полинуклеотидов друг с другом путем химического лигирования, описаны в патенте США №20180127816, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0219] Некоторые варианты осуществления также включают приведение индексированной популяции гранул в контакт со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую кислоту-мишень. Некоторые варианты осуществления также включают смешивание индексированной популяции гранул, контактирующих со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую мишень, с дополнительной индексированной популяцией гранул, причем дополнительная индексированная популяция гранул содержит индексный полинуклеотид, содержащий индекс, отличный от индекса индексированной популяции гранул, контактирующих со множеством нуклеиновых кислот.

[0220] В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. Некоторые варианты осуществления также включают приведение индексированной популяции гранул в контакт со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую кислоту-мишень. Некоторые варианты осуществления также включают смешивание индексированной популяции гранул, контактирующих со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую мишень, с дополнительной индексированной популяцией гранул, причем дополнительная индексированная популяция гранул содержит индексный полинуклеотид, содержащий индекс, отличный от индекса индексированной популяции гранул, контактирующих со множеством нуклеиновых кислот.

[0221] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок.

[0222] В некоторых вариантах осуществления способ выполняют на проточной кювете.

[0223] Пример осуществления получения индексированных гранул показан на ФИГ. 11. Индексный полинуклеотид содержит якорь или адаптер, индекс и сайт связывания индексного праймера. Получают и распределяют в лунках многолуночного планшета множество популяций индексных полинуклеотидов. Каждая лунка может содержать популяцию индексного полинуклеотида, содержащего одинаковый индекс. Например, первая лунка может содержать популяцию индексных полинуклеотидов, содержащих первый индекс, а вторая лунка может содержать популяцию индексных полинуклеотидов, содержащих второй индекс.В лунки может быть распределено множество гранул. Каждая гранула может включать в себя первый полинуклеотид, содержащий зонд захвата, и второй полинуклеотид, содержащий индексирующий якорь, такой как сайт связывания, способный связываться с якорем или адаптером индексного полинуклеотида. В каждую лунку добавляют по одному пулу гранул. Один пул гранул может включать в себя популяцию гранул, в которых зонды захвата отличаются друг от друга. Один пул гранул, содержащий одинаковый индекс, можно использовать с одним образцом, так чтобы можно было идентифицировать, что источник последующих продуктов обработанных нуклеиновых кислот в образце был получен из одного образца посредством идентификации связанного индекса. Как показано на ФИГ. 11, один индексированный пул гранул можно добавлять в одну лунку в многолуночном планшете, в котором каждая лунка содержит один образец.

[0224] Индекс индексного полинуклеотида может быть встроен в гранулу несколькими различными способами. В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид гибридизуют с гранулой посредством якоря и второго полинуклеотида, а второй полинуклеотид удлиняют, таким образом встраивая комплемент индекса индексного полинуклеотида в удлиненный второй полинуклеотид, присоединенный к грануле. В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид и второй полинуклеотид лигированы вместе. В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид присоединяют к полинуклеотиду, присоединенному к грануле посредством химического или ферментативного способа. В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид гибридизуют с полинуклеотидом, присоединенным к грануле, а индекс гибридизованного индексного полинуклеотида определяют на матрице.

[0225] Некоторые варианты осуществления включают добавление индекса к грануле химическим или ферментативным способом. Пример осуществления добавления индекса к грануле химическим или ферментативным способом показан на ФИГ. 12А, на которой изображена гранула, содержащая первый и второй полинуклеотиды. Первый полинуклеотид содержит зонд, такой как зонд захвата; код, такой как штрихкод; и праймер А, такой как сайт связывания штрихкодового праймера, который можно использовать для определения последовательности штрихкода. Второй полинуклеотид содержит индекс; и праймер В, такой как сайт связывания индексного праймера, который можно использовать для определения последовательности индекса. Второй полинуклеотид может быть прикреплен к грануле посредством спейсера и функциональных групп X-Y, которые связывают второй полинуклеотид со спейсером. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может включать в себя сайт связывания праймера последовательности. В некоторых вариантах осуществления к индексному полинуклеотиду можно добавить блокирующую группу. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания индексного праймера также может представлять собой шпильку с обратимо блокированным З'-концом.

[0226] Некоторые варианты осуществления включают добавление индекса к грануле путем удлинения адаптера, прикрепленного к грануле. В некоторых вариантах осуществления адаптер, прикрепленный к грануле, может быть удлинен путем лигирования или посредством полимеразного удлинения. Пример осуществления удлинения путем лигирования показан на ФИГ. 12В, на которой изображена гранула, содержащая первый и второй полинуклеотиды. Первый полинуклеотид содержит зонд, такой как зонд захвата; код, такой как штрихкод; и праймер А, такой как сайт связывания штрихкодового праймера, который можно использовать для определения последовательности штрихкода. Второй полинуклеотид содержит адаптер, который может быть удлинен путем лигирования с третьим полинуклеотидом, содержащим индекс и праймер В, с применением четвертого полинуклеотида, содержащего шунт, который способен гибридизоваться как со вторым, так и с третьим полинуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может включать в себя сайт связывания праймера последовательности. В некоторых вариантах осуществления к индексному полинуклеотиду можно добавить блокирующую группу. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания индексного праймера также может представлять собой шпильку с обратимо блокированным 3'-концом.

[0227] Пример осуществления удлинения путем полимеразного удлинения показан на ФИГ. 12С, на которой изображена гранула, содержащая первый и второй полинуклеотиды. Первый полинуклеотид содержит зонд, праймер А и код. Второй полинуклеотид содержит адаптер. Третий полинуклеотид, такой как индексный полинуклеотид, содержит сайт связывания адаптера, способный связываться с адаптером, индекс и праймер В. Третий полинуклеотид гибридизуется со вторым полинуклеотидом, так чтобы второй полинуклеотид удлинялся посредством полимеразного удлинения для встраивания индекса в удлиненный адаптер. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата может включать в себя сайт связывания праймера последовательности. В некоторых вариантах осуществления к индексному полинуклеотиду можно добавить блокирующую группу. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания индексного праймера также может представлять собой шпильку с обратимо блокированным 3'-концом.

[0228] Некоторые варианты осуществления включают применение индексного полинуклеотида, гибридизованного с первым нуклеотидом, прикрепленным к грануле. Некоторые варианты осуществления включают способы обнаружения лиганда-мишени, включающие: (а) получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит зонд захвата, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, и сайт связывания штрихкодового праймера; (b) получение индексного полинуклеотида, содержащего индекс, сайт связывания индексного праймера и адаптер, способный связываться с сайтом связывания штрихкодового праймера; (с) специфическое связывание лиганда-мишени с зондом захвата; (d) гибридизацию индексного полинуклеотида с первым полинуклеотидом посредством адаптера; (е) обнаружение лиганда-мишени на матрице; и (f) определение индекса и штрихкода первого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления (е) включает распределение популяции гранул на матрице. В некоторых вариантах осуществления (f) включает гибридизацию индексного праймера с сайтом связывания индексного праймера и определение последовательности индекса. В некоторых вариантах осуществления дегибридизацию индексного полинуклеотида из первого полинуклеотида; гибридизацию штрихкодового праймера с сайтом связывания штрихкодового праймера; и удлинение штрихкодового праймера для определения последовательности штрихкода. В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид дополнительно содержит расщепляемый линкер, расположенный между адаптером и индексом, и (f) включает: (i) расщепление расщепляемого линкера; и (ii) удлинение адаптера для определения последовательности штрихкода. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок. В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления (е) включает удлинение первого полинуклеотида, гибридизованного с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает добавление обнаруживаемого дидезоксинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления способ выполняют на проточной кювете.

[0229] Пример осуществления для применения индексного полинуклеотида, гибридизованного с первым нуклеотидом, присоединенным к грануле, показан на ФИГ. 13А и ФИГ. 13В. На ФИГ. 13А изображена гранула, содержащая первый полинуклеотид. Первый полинуклеотид содержит зонд, такой как зонд захвата; праймер, такой как сайт связывания праймера; и код, такой как штрихкод. Индексный полинуклеотид содержит индекс; праймер 2, такой как сайт связывания индексного праймера; спейсер, такой как расщепляемый спейсер; и адаптер, способный гибридизоваться с сайтом связывания праймера первого полинуклеотида. Пул гранул может быть получен с использованием индексного полинуклеотида, как показано на ФИГ. 11. На ФИГ. 13В (первая панель) показана гранула, содержащая первый полинуклеотид, в котором нуклеиновая кислота-мишень гибридизована с первым полинуклеотидом посредством зонда захвата, а индексный полинуклеотид гибридизован с первым полинуклеотидом посредством сайта связывания праймера. На ФИГ. 13В (вторая панель) показан удлиненный первый полинуклеотид с одним флуоресцентным дидезоксинуклеотидом (star), который может быть обнаружен на матрице гранул. Можно определить индекс и штрихкод. На ФИГ. 13В (третья панель) показано, что флуоресцентный дидезоксинуклеотид был удален из удлиненного первого полинуклеотида. Индексный праймер можно гибридизовать с сайтом связывания индексного праймера и удлинять, а также определять последовательность индекса. На ФИГ. 13В (четвертая панель) показано, что нуклеиновая кислота-мишень была дегибридизована из первого полинуклеотида. Индексный полинуклеотид расщепляют на расщепляемом линкере, и теперь адаптер соответствует штрихкодовому праймеру, гибридизованному с сайтом связывания праймера, который можно удлинить, и определяют последовательность штрихкода.

[0230] Некоторые варианты осуществления включают применение индексного полинуклеотида, содержащего множество индексной последовательности и сайта связывания индексного праймера. В некоторых таких вариантах осуществления множество индексных последовательностей может приводить к увеличению сигнала в позиции на матрице при секвенировании индекса. Пример варианта осуществления показан на ФИГ. 14. На ФИГ. 14 показана гранула, содержащая первый полинуклеотид и второй полинуклеотид. Первый полинуклеотид содержит: код, такой как штрихкод; праймер А, такой как сайт связывания штрихкодового праймера; и зонд, такой как зонд захвата. Второй полинуклеотид содержит повторы индекса и сайтов связывания индексного праймера. В некоторых вариантах осуществления повторы улучшают интенсивность сигнала на гранулах с низким количеством иммобилизованных индексов. В некоторых вариантах осуществления повторы могут ограничивать величину площади поверхности, занятой праймерами, без уменьшения сигнала.

[0231] Некоторые варианты осуществления включают ферментативное добавление индексного полинуклеотида к грануле. В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид может быть присоединен к грануле путем удлинения полинуклеотида, прикрепленного к грануле посредством реакционноспособной группы. В некоторых вариантах осуществления индексный полинуклеотид может быть прикреплен к грануле перед смешиванием пула гранул с другими пулами гранул, например, перед загрузкой смеси в матрицу. Некоторые варианты осуществления включают способ обнаружения лиганда-мишени, включающий: (а) получение популяции гранул, причем каждая гранула содержит зонд захвата, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и второй полинуклеотид; (b) получение индексного полинуклеотида, содержащего индекс, сайт связывания индексного праймера и адаптер; (с) специфическое связывание лиганда-мишени с зондом захвата; (d) прикрепление индексного полинуклеотида ко второму полинуклеотиду посредством адаптера; (е) обнаружение лиганда-мишени на матрице; и (f) определение индекса и штрихкода первого полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления второй полинуклеотид содержит штрихкод и сайт связывания штрихкодового праймера. В некоторых вариантах осуществления (d) включает добавление реакционноспособной функциональной группы ко второму полинуклеотиду, причем адаптер способен прикрепляться к реакционноспособной функциональной группе. Аспекты, подходящие для способов и композиций, используемых для добавления реакционноспособной функциональной группы к полинуклеотиду, описаны в патенте США №20180127816, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления (е) включает распределение популяции гранул на матрице. В некоторых вариантах осуществления (f) включает гибридизацию индексного праймера с сайтом связывания индексного праймера и определение последовательности индекса. В некоторых вариантах осуществления (i) включает гибридизацию штрихкодового праймера с сайтом связывания штрихкодового праймера и определение последовательности штрихкода. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит белок. В некоторых вариантах осуществления лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления (е) включает удлинение первого полинуклеотида, гибридизованного с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления удлинение включает добавление обнаруживаемого дидезоксинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления способ выполняют на проточной кювете.

[0232] Пример осуществления ферментативного добавления индексного полинуклеотида к грануле показан на ФИГ. 15А и ФИГ. 15В. На ФИГ. 15А и ФИГ. 15В показана гибридизация нуклеиновой кислоты-мишени с гранулой посредством зонда захвата первого полинуклеотида, добавление индексного полинуклеотида к грануле посредством второго полинуклеотида и определение штрихкода и индекса, прикрепленного к грануле. На ФИГ. 15А (первая панель) представлена гранула, содержащая первый и второй полинуклеотиды. Первый полинуклеотид содержит: код, такой как штрихкод; праймер, такой как сайт связывания штрихкодового праймера; и зонд, такой как зонд захвата. На ФИГ. 15А (вторая панель) показана гибридизация нуклеиновой кислоты-мишени с зондом захвата. На ФИГ. 15А (третья панель) показана достройка по одному основанию (SBE) первого полинуклеотида флуоресцентным дидезоксинуклеотидом (star). На ФИГ. 15А (четвертая панель) показано добавление реакционноспособной группы (треугольника) ко второму полинуклеотиду, такому как реакционноспособный дидезоксинуклеотид. Добавление может включать в себя применение концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT). На ФИГ. 15В (первая панель) показано добавление индексного полинуклеотида, содержащего индекс, сайт связывания индексного праймера и адаптер, ко второму полинуклеотиду посредством реакционноспособной группы и адаптера. Гранула может быть загружена в матрицу, положение гранулы может быть определено из флуоресцентного дидезоксинуклеотида, и флуоресцентный дидезоксинуклеотид может быть удален. На ФИГ. 15В (вторая панель) показана гибридизация индексного праймера с сайтом связывания индексного праймера для определения последовательности индекса. Индексный праймер и нуклеиновая кислота-мишень могут быть дегибридизованы. На ФИГ. 15В (третья панель) показана гибридизация штрихкодовых праймеров с сайтами связывания штрихкодового праймера для определения последовательности штрихкодов.

Спейсеры

[0233] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, включают в себя применение спейсеров. Спейсер может включать полинуклеотид, имеющий длину, которая больше или равна 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500 последовательным нуклеотидам, или длину в диапазоне любых двух из вышеуказанных чисел. В некоторых вариантах осуществления спейсер может быть расположен между двумя полинуклеотидными элементами для повышения эффективности определенных процессов путем снижения стерического несоответствия. Например, спейсер можно использовать для повышения эффективности ферментативных процессов, таких как применение полимераз, лигаз и/или концевых трансфераз для субстрата, такого как полинуклеотиды, прикрепленные к грануле. В некоторых вариантах осуществления спейсер может быть размещен между любыми двумя элементами, включая: гранулу, такую как прикрепленный конец полинуклеотида к грануле, индекс, сайт связывания индексного праймера, штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и зонд захвата.

Наборы и системы

[0234] Некоторые варианты осуществления включают наборы и системы для декодирования микроэлементов, таких как полинуклеотиды на матрице. Некоторые такие наборы и системы могут включать субстрат, такой как чип или жидкостная ячейка, с матрицей полинуклеотидов, случайным образом распределенных на поверхности субстрата. Полинуклеотиды могут содержать 3' сайта связывания праймера штрихкода. В некоторых таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может содержать зонд захвата. В дополнительных таких вариантах осуществления каждый полинуклеотид может быть связан с зондом захвата посредством общего элемента. Например, каждый полинуклеотид и зонд захвата может быть связан с одним и тем же микроэлементом, таким как гранула. Некоторые варианты осуществления включают детектор, выполненный с возможностью обнаружения сигналов от реагентов, гибридизованных с полинуклеотидами в матрице; такие реагенты могут включать в себя реагенты для секвенирования, такие как нуклеотиды, содержащие обнаруживаемые метки. Некоторые варианты осуществления включают детектор, выполненный с возможностью обнаружения сигналов, которые могут возникать в результате встраивания нуклеотида в полинуклеотид, например пирофосфат, или изменений в ионах водорода.

[0235] Некоторые варианты осуществления включают наборы или системы, содержащие по меньшей мере первую и вторую субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула субпопуляции может содержать первый полинуклеотид, содержащий зонд захвата, штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула субпопуляции может также содержать второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса. В некоторых вариантах осуществления индекс субпопуляции гранул может указывать на эту конкретную субпопуляцию гранул. В некоторых вариантах осуществления индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции. В некоторых вариантах осуществления наборов и систем, представленных в настоящем документе, первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул.

[0236] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул содержат одни и те же нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

[0237] В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество штрихкодовых праймеров, способных гибридизоваться с сайтами штрихкодовых праймеров.

[0238] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество индексных праймеров, способных гибридизоваться с сайтами индексных праймеров.

[0239] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.В некоторых вариантах осуществления субстрат выполнен с возможностью образования комбинации первой и второй субпопуляций гранул матрицы гранул на поверхности субстрата и возможностью секвенирования этой матрицы в множестве циклов секвенирования посредством циклов синтеза.

[0240] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 500 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 5000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50000 зондов захвата, содержащих различные нуклеотидные последовательности.

[0241] Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 100 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции. Некоторые варианты осуществления включают по меньшей мере 10000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.

[0242] Некоторые варианты осуществления включают набор, содержащий: матрицу полинуклеотидов, случайным образом распределенных на поверхности субстрата, причем каждый полинуклеотид содержит 3' сайта связывания праймера штрихкода и связан с зондом захвата, при этом каждый полинуклеотид содержит другой штрихкод и связан с другим зондом захвата. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид связан с зондом захвата посредством гранулы. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления субстрат является плоским. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит лунки. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды присоединены к гранулам. В некоторых вариантах осуществления гранулы распределены в лунках. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит матрицу.

[0243] Некоторые варианты осуществления включают наборы или системы, содержащие первую и вторую субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью. Примеры лигандов-мишеней включают нуклеиновые кислоты, белки или другие антигены. Примеры зондов захвата включают нуклеиновые кислоты, антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата одной и той же гранулы, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода. В некоторых вариантах осуществления каждая гранула содержит второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса. В некоторых таких вариантах осуществления индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции. Например, индексы первой субпопуляции гранул можно использовать, чтобы отличить первую субпопуляцию гранул от второй субпопуляции гранул. В некоторых вариантах осуществления первая субпопуляция гранул отделена от второй субпопуляции гранул. Например, первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул.

[0244] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту, а лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых таких вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления зонды захвата содержат нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) или его комплементом.

[0245] В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела.

[0246] В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. Например, каждый зонд захвата первой субпопуляции гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями; а каждый зонд захвата второй субпопуляции гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями. Например, набор различных зондов захвата первой субпопуляции гранул специфически связывается с теми же лигандами-мишенями, что и набор различных зондов захвата первой субпопуляции гранул.

[0247] В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество штрихкодовых праймеров, способных гибридизоваться с сайтами штрихкодовых праймеров.

[0248] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и/или нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество индексных праймеров, способных гибридизоваться с сайтами индексных праймеров.

[0249] В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество раздельных сайтов. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество лунок. В некоторых вариантах осуществления субстрат содержит множество каналов. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.В некоторых вариантах осуществления субстрат выполнен с возможностью образования комбинации первой и второй субпопуляций гранул матрицы гранул на поверхности субстрата и возможностью секвенирования этой матрицы в множестве циклов секвенирования посредством циклов синтеза.

[0250] В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50, 100, 500, 1000 или 5000 отличающихся друг от друга зондов захвата или любое количество зондов захвата в диапазоне между любыми двумя вышеуказанными количествами. Некоторые варианты осуществления также содержат по меньшей мере 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции, или любое количество разных субпопуляций гранул между любыми двумя вышеуказанными количествами.

[0251] Некоторые варианты осуществления включают набор, содержащий первую и вторую субпопуляции гранул, причем каждая гранула содержит: зонд захвата, который специфически связывается с лигандом-мишенью, первый полинуклеотид, содержащий штрихкод, указывающий на зонд захвата, и 3'-конец штрихкода для связывания с праймером штрихкода, и второй полинуклеотид, содержащий индекс и 3'-конец индекса для связывания с праймером индекса, причем индексы первой субпопуляции отличаются от индексов второй субпопуляции, при этом первый объем содержит первую субпопуляцию гранул, а второй объем содержит вторую субпопуляцию гранул. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит нуклеиновую кислоту, а лиганд-мишень содержит нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах осуществления первый полинуклеотид содержит зонд захвата. В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул содержит отличающиеся друг от друга нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул содержат одни и те же нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления зонд захвата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления каждый из зондов захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связывается с отличающимися друг от друга лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления разные зонды захвата первой и второй субпопуляций гранул специфически связываются с одними и теми же лигандами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество штрихкодовых праймеров, способных гибридизоваться с сайтами штрихкодовых праймеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности индексов первой субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность, и нуклеотидные последовательности индексов второй субпопуляции гранул содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности сайтов связывания индексного праймера содержат одну и ту же нуклеотидную последовательность. Некоторые варианты осуществления также включают множество индексных праймеров, способных гибридизоваться с сайтами индексных праймеров. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит субстрат.В некоторых вариантах осуществления субстрат выполнен с возможностью образования комбинации первой и второй субпопуляций гранул матрицы гранул на поверхности субстрата и возможностью секвенирования этой матрицы в множестве циклов секвенирования посредством циклов синтеза. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 50 отличающихся друг от друга зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления каждая из первой и второй субпопуляций гранул содержит по меньшей мере 500 отличающихся друг от друга зондов захвата. Некоторые варианты осуществления также включают по меньшей мере 10 разных субпопуляций гранул, причем каждая субпопуляция содержит индекс, отличающийся от другой субпопуляции.

[0252] Дополнительные варианты осуществления наборов и систем, предложенных в настоящем документе, могут включать в себя множество популяций гранул, содержащих олигонуклеотиды, присоединенные к гранулам, причем олигонуклеотиды содержат индексы, сайты связывания индексного праймера, смежные с индексами, зонды захвата, штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со штрихкодами, при этом индексы у разных популяций гранул различаются. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания индексного праймера одинаковы во множестве популяций. В некоторых вариантах осуществления штрихкоды указывают на нуклеотидную последовательность зондов захвата. В некоторых вариантах осуществления штрихкоды отличаются в популяции гранул. В некоторых вариантах осуществления сайты связывания штрихкодового праймера одинаковы во множестве популяций. В некоторых вариантах осуществления гранулы содержат биотин, стрептавидин или их производное. В некоторых вариантах осуществления гранулы являются магнитными.

[0253] Некоторые варианты осуществления также включают реагент, выбранный из: локус-специфичного олигонуклеотида; транспосома для мечения образца нуклеиновой кислоты; транспосома, содержащего индекс и сайт связывания индексного праймера; адаптера, содержащего индекс и сайт связывания индексного праймера; праймера, способного гибридизоваться с сайтом связывания индексного праймера или его комплементом; и/или праймера, способного гибридизоваться с сайтом связывания штрихкодового праймера или его комплементом. Некоторые варианты осуществления также включают в себя матрицу, такую как матрица на поверхности проточной кюветы. Некоторые варианты осуществления включают детектор, выполненный с возможностью обнаружения сигналов от реагентов, гибридизованных с полинуклеотидами в матрице; такие реагенты могут включать в себя реагенты для секвенирования, такие как нуклеотиды, содержащие обнаруживаемые метки. Некоторые варианты осуществления включают детектор, выполненный с возможностью обнаружения сигналов, которые могут возникать в результате встраивания нуклеотида в полинуклеотид, например пирофосфат, или изменений в ионах водорода.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Декодирование матрицы путем секвенирования

[0254] Синтезируют множество полинуклеотидов, причем каждый полинуклеотид содержит от 5' до 3': спейсер, уникальный штрихкод, сайт связывания праймера и уникальный зонд захвата. Известны последовательности штрихкода и зонда захвата; последовательность сайта связывания праймера одинакова для каждого полинуклеотида. Каждый полинуклеотид прикреплен к грануле. Гранулы случайным образом распределяют в лунки чипа. Матрицу гранул декодируют путем гибридизации праймера с сайтом связывания праймера, удлинения праймера и обнаружения последовательности штрихкода. Положение штрихкода определяет положение соответствующего зонда захвата.

Пример 2. Декодирование штрихкодов на матрице путем секвенирования

[0255] Была подготовлена библиотека нуклеиновых кислот, полученная из человеческой геномной ДНК. Была подготовлена субпопуляция гранул. К каждой грануле был прикреплен первый и второй полинуклеотиды. Первый полинуклеотид содержал зонд захвата, сайт связывания штрихкодового праймера и штрихкод, указывающий на зонд захвата. Второй полинуклеотид содержал индекс и сайт связывания индексного праймера.

[0256] Пул гранул, содержащий 18 816 различных типов кодов/зондов, загружали в проточную кювету HiSeq (ФИГ. 7А). После иммобилизации коды длиной 20 нуклеотидов секвенировали с помощью химической реакции SBS, а идентичность каждой гранулы определяли путем выравнивания кодовых последовательностей со списком типов гранул. На ФИГ. 7В представлена гистограмма количества копий для определенных типов гранул в определенных столбцах, и продемонстрировано, что 97,5% от ожидаемого состава идентифицировано с помощью процесса декодирования на основе секвенирования и что подавляющее большинство типов гранул присутствуют на уровне, достаточном для исследований генотипирования.

Пример 3. Производительность генотипирования на HiSeq с использованием обнаружения FFN

[0257] Для демонстрации характеристик генотипирования на HiSeq с использованием обнаружения FFN олигонуклеотидную ДНК-мишень гибридизовали с суспензией гранул с олигонуклеотидами, конъюгированными с зондом. Гранулы загружали в проточную кювету HiSeq. Зонды, связанные с ДНК-мишенью, достраивали по одному основанию с использованием флуоресцентных нуклеотидов. Проточную кювету с загруженными гранулами визуализировали для получения значений интенсивности генотипирования гранул. Флуоресцентные нуклеотиды расщепляли и гранулы декодировали с использованием химической реакции SBS. Для измерения производительности анализа выравнивали считывание декодирования и генотипирования. Отдельные точки окрашивали в соответствии с ожидаемым генотипом. На ФИГ. 7С представлен график интенсивности С по сравнению с интенсивностью Т, где каждая точка представляет собой среднее значение всех копий для данного типа гранул и окрашена в соответствии с ожидаемым генотипом, а также продемонстрировано, что достройка зонда по одному основанию флуоресцентными нуклеотидами обеспечивает точное генотипирование.

Пример 4. Мультиплексирование 12 образцов с 10 368-плексным пулом гранул

[0258] Этот пример демонстрирует демультиплексирование множества образцов на одной проточной кювете и, в частности, способность к мультиплексированию 12 образцов с 10 368-плексным пулом гранул. Один пул гранул отдельно гибридизовали с 12 различными индексными последовательностями. После гибридизации образцы объединяли и загружали на проточную кювету HiSeq. Затем проводили два отдельных считывания, одно для идентификации образца на основе гибридизованного индекса и отдельное считывание для идентификации типа гранул на основе считывания-декодирования. На ФИГ. 8 представлена гистограмма для репрезентативного образца ряда определенных типов гранул в определенных связях, а также продемонстрировано, что большинство типов гранул присутствуют на уровне, достаточном для экспериментов по генотипированию для данного образца. В таблице на ФИГ. 7 представлена сводная информация по согласованности демультиплексирования и декодирования гранул для 12 объединенных и загруженных одновременно индексированных образцов, свидетельствующая о том, что представление образцов является равномерным и что большинство зондов присутствуют во всех образцах.

Пример 5. Большое параллельное генотипирование SNP

[0259] Это пример рабочего процесса генотипирования 384 образцов за один прогон секвенирования. Полинуклеотиды, содержащие нуклеиновые кислоты-мишени, которые включают в себя интересующий однонуклеотидный полиморфизм (SNP), получают в 384-луночном планшете. Каждая лунка содержит ДНК от другого субъекта. ДНК метят транспосомами, которые фрагментируют ДНК, и добавляют к каждому концу фрагментов сайты связывания праймера для амплификации. Фрагменты амплифицируют с праймерами, которые включают в себя индекс и сайт связывания индексного праймера, для получения амплифицированных фрагментов, в которых по меньшей мере один конец каждого амплифицированного фрагмента включает в себя индекс и сайт связывания индексного праймера. Индекс отличается для каждой лунки таким образом, что полинуклеотиды, полученные из определенной лунки, можно идентифицировать по определенному индексу. Полученные полинуклеотиды включают индекс, сайт связывания индексного праймера и целевую нуклеиновую кислоту.

[0260] В каждую лунку добавляют популяцию гранул. Популяция гранул включает олигонуклеотид, присоединенный к грануле. Олигонуклеотид включает в себя штрихкод, сайт связывания штрихкодового праймера и зонд захвата. Зонд захвата имеет длину 50 нуклеотидов и специфичен к конкретной нуклеиновой кислоте-мишени. Штрихкод можно использовать для идентификации зонда захвата. Популяция гранул включает в себя различные зонды захвата. Нуклеиновые кислоты-мишени гибридизуются с зондами захвата в растворе в каждой лунке с получением гибридизованных гранул. Гибридизованные гранулы из каждой лунки объединяют и загружают в матрицу гранул на проточной кювете. Гибридизованные гранулы случайным образом распределяют на матрице.

[0261] На матрице зонды захвата удлиняют на один нуклеотид для идентификации SNP. Индексы секвенируют путем удлинения праймера, гибридизованного с сайтами связывания индексного праймера, для идентификации источника нуклеиновой кислоты-мишени. Штрихкоды секвенируют путем удлинения праймера, гибридизованного с сайтами связывания индексного праймера, для декодирования положения гранулы на матрице. Конкретные SNP идентифицируют и связывают с конкретным образцом ДНК, полученным от конкретного субъекта.

[0262] Используемый в настоящем документе термин «содержащий» представляет собой синоним терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и является включающим или не имеющим ограничительного характера, и он не исключает дополнительных неуказанных элементов или стадий способа.

[0263] В описании выше приведены несколько способов и материалов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться модификациям в части способов и материалов, а также изменениям в части способов изготовления и оборудования. Такие модификации будут очевидны специалистам в данной области после изучения настоящего описания или реализации изобретения, описанного в настоящем документе, на практике. Следовательно, не предполагается, что настоящее изобретение ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, но предполагается, что оно охватывает все модификации и альтернативные варианты в пределах истинного объема и сущности изобретения.

[0264] Все источники, процитированные в настоящем документе, включая, без ограничений, опубликованные и неопубликованные заявки, патенты и ссылки на литературу, полностью включены в настоящий документ путем ссылки и, следовательно, являются частью настоящего описания. В тех случаях, когда публикации, патенты или заявки на патенты, включенные путем ссылки, противоречат изложению, приведенному в настоящем описании, предполагается, что настоящее описание заменяет и/или имеет приоритет над любым таким противоречащим материалом.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ секвенирования нуклеиновой кислоты-мишени на матрице, включающий: (a) получение первой и второй популяций гранул, причем: первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, и вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами; (b) получение первого и второго множества полинуклеотидов, причем: первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом первое множество полинуклеотидов находится в растворе, и второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом второе множество полинуклеотидов находится в растворе; (c) гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с первыми зондами захвата с получением гибридизованных первых гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней со вторыми зондами захвата с получением гибридизованных вторых гранул; (d) случайное распределение гибридизованных первых гранул и гибридизованных вторых гранул на матрице; (e) декодирование положений первой и второй гранул на матрице путем секвенирования на матрице первого и второго штрихкодов; и (f) удлинение первого и второго зондов захвата для получения данных нуклеотидной последовательности для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней. Изобретение обеспечивает точное генотипирование. 42 з.п. ф-лы, 15 ил., 5 пр.

1. Способ секвенирования нуклеиновой кислоты-мишени на матрице, включающий:

(a) получение первой и второй популяций гранул, причем:

первая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие первые зонды захвата, первые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные с первыми штрихкодами, и

вторая популяция гранул содержит олигонуклеотиды, содержащие вторые зонды захвата, вторые штрихкоды и сайты связывания штрихкодового праймера, смежные со вторыми штрихкодами;

(b) получение первого и второго множества полинуклеотидов, причем:

первое множество полинуклеотидов содержит первые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом первое множество полинуклеотидов находится в растворе, и

второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, при этом второе множество полинуклеотидов находится в растворе;

(c) гибридизацию первых нуклеиновых кислот-мишеней с первыми зондами захвата с получением гибридизованных первых гранул и гибридизацию вторых нуклеиновых кислот-мишеней со вторыми зондами захвата с получением гибридизованных вторых гранул;

(d) случайное распределение гибридизованных первых гранул и гибридизованных вторых гранул на матрице;

(e) декодирование положений первой и второй гранул на матрице путем секвенирования на матрице первого и второго штрихкодов; и

(f) удлинение первого и второго зондов захвата для получения данных нуклеотидной последовательности для первой и второй нуклеиновых кислот-мишеней.

2. Способ по п. 1, в котором:

первое множество полинуклеотидов содержит первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами; и

второе множество полинуклеотидов содержит вторые нуклеиновые кислоты-мишени, вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами.

3. Способ по п. 2, в котором первое или второе множество полинуклеотидов получают посредством мечения образца нуклеиновой кислоты множеством транспосом.

4. Способ по п. 3, в котором множество транспосом содержат первый или второй индексы.

5. Способ по п. 4, дополнительно включающий добавление адаптеров к меченому образцу нуклеиновой кислоты, причем адаптеры содержат первый или второй индексы.

6. Способ по п. 5, дополнительно включающий амплификацию меченного образца нуклеиновой кислоты, праймерами, содержащими первый или второй индексы.

7. Способ по любому из пп. 2-6, в котором удлинение первого и второго зондов захвата встраивает последовательности, комплементарные первому и второму индексам и первому и второму сайтам связывания индексного праймера, в удлиненные зонды захвата.

8. Способ по п. 1, в котором:

первая популяция гранул содержит первые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные с первыми индексами, и

вторая популяция гранул содержит вторые индексы и сайты связывания индексного праймера, смежные со вторыми индексами.

9. Способ по п. 8, в котором олигонуклеотиды первой популяции гранул содержат первые индексы; а олигонуклеотиды второй популяции гранул содержат вторые индексы.

10. Способ по любому из пп. 2-9, в котором первые индексы указывают на источник первых нуклеиновых кислот-мишеней, а вторые индексы указывают на источник вторых нуклеиновых кислот-мишеней.

11. Способ по любому из пп. 2-10, в котором первые индексы совпадают друг с другом, и вторые индексы совпадают друг с другом.

12. Способ по любому из пп. 2-11, дополнительно включающий секвенирование первого и второго индексов.

13. Способ по п. 12, в котором секвенирование первого и второго индексов включает удлинение праймеров, гибридизованных с сайтами связывания индексного праймера.

14. Способ по любому из пп. 2-13, в котором сайты связывания индексного праймера являются одинаковыми.

15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором первая и вторая нуклеиновые кислоты-мишени получены из разных образцов нуклеиновой кислоты.

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором первая и вторая нуклеиновые кислоты-мишени получены от геномной ДНК.

17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором первый и второй штрихкоды указывают на нуклеотидную последовательность первого или второго зонда захвата.

18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором первые штрихкоды отличаются друг от друга, и вторые штрихкоды отличаются друг от друга.

19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором секвенирование первого и второго штрихкодов включает удлинение праймеров, гибридизованных с сайтами связывания штрихкодового праймера.

20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором сайты связывания штрихкодового праймера являются одинаковыми.

21. Способ по любому из пп. 1-20, в котором удлинение первого и второго зондов захвата включает полимеразное удлинение.

22. Способ по п. 21, в котором удлинение первого и второго зондов захвата включает добавление одного нуклеотида к зонду захвата.

23. Способ по п. 21 или 22, дополнительно включающий лигирование локус-специфичных олигонуклеотидов с удлиненными зондами захвата.

24. Способ по любому из пп. 21-23, в котором удлинение первого и второго зондов захвата включает лигирование локус-специфичных олигонуклеотидов с зондами захвата.

25. Способ по любому из пп. 1-24, в котором стадию (c) выполняют в растворе.

26. Способ по любому из пп. 1-25, в котором матрица размещена на поверхности проточной кюветы.

27. Способ по любому из пп. 1-26, в котором первая и вторая гранулы выполнены с возможностью прикрепления к матрице.

28. Способ по п. 27, в котором первая и вторая гранулы содержат биотин, стрептавидин или их производное; и матрица содержит биотин, стрептавидин или их производное.

29. Способ по п. 27, в котором первая и вторая гранулы являются магнитными.

30. Способ по п. 1, где стадия (a) дополнительно включает:

(i) получение множества индексных полинуклеотидов, в котором каждый индексный полинуклеотид содержит первый индекс или второй индекс и сайт связывания указанного индексного праймера; и

(ii) присоединение множества индексных полинуклеотидов к первой или второй популяции гранул посредством адаптера.

31. Способ по п. 30, который (ii) включает удлинение адаптеров путем полимеразного удлинения.

32. Способ по п. 30, в котором каждый индексный полинуклеотид содержит сайт связывания адаптера, а прикрепление включает гибридизацию сайтов связывания адаптера с адаптерами.

33. Способ по п. 30, в котором (ii) включает лигирование индексных полинуклеотидов с адаптерами.

34. Способ по п. 33, в котором прикрепление включает гибридизацию шунтового полинуклеотида с адаптером и индексным полинуклеотидом.

35. Способ по п. 30, который (ii) включает прикрепление множества индексных полинуклеотидов к адаптерам популяции гранул посредством химически реакционноспособной функциональной группы.

36. Способ по п. 35, в котором прикрепление включает реакцию клик-химии.

37. Способ по любому из пп. 30-36, в котором первые полинуклеотиды популяции гранул содержат зонды захвата, отличающиеся друг от друга.

38. Способ по любому из пп. 30-37, в котором индекс каждого индексного полинуклеотида является одинаковым.

39. Способ по п. 30-38, в котором первый полинуклеотид содержит зонд захвата.

40. Способ по любому из пп. 30-39, дополнительно включающий приведение индексированной популяции гранул в контакт со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую кислоту-мишень.

41. Способ по п. 40, дополнительно включающий смешивание индексированной популяции гранул, приведенных в контакт со множеством нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую кислоту-мишень, с дополнительной индексированной популяцией гранул, причем дополнительная индексированная популяция гранул содержит индексный полинуклеотид, содержащий индекс, отличный от индекса индексированной популяции гранул, приведенных в контакт со множеством нуклеиновых кислот.

42. Способ по любому из пп. 30-38, в котором зонд захвата содержит белок.

43. Способ по любому из пп. 30-42, выполняемый на проточной кювете.