СПОСОБ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ С КОМБИНИРОВАННОЙ СХЕМОЙ СВЯЗЫВАНИЯ АНТИТЕЛ Российский патент 2021 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологии и аналитической биохимии и представляет способ иммунохроматографического (ИХ) анализа для высокочувствительного определения специфических иммуноглобулинов в пробах.

На сегодняшний день в практике иммунохроматографической серодиагностики используются три основные схемы анализа:

1. При реализации классической схемы ИХ-серодиагностики в ходе анализа формируются детектируемые комплексы из: иммобилизованных в аналитической зоне молекул антигена (iAg); специфических антител из пробы (Ab) и конъюгата маркера с иммуноглобулин-связывающим белком (P*). Данный комплекс состава P*-Ab-iAg визуализуется благодаря концентрированию молекул маркера в аналитической зоне (схема 1). Подавляющее большинство описываемых в литературе и коммерческих тест-систем для иммунохроматографической серодиагностики основаны на использовании данной схемы анализа [1-6]. Проблема использования данной схемы для серодиагностики заключается в том, что на первой стадии P* связывается со всеми иммуноглобулинами в пробе, среди которых специфические иммуноглобулины не превышают 10%. Таким образом, наличие в пробе посторонних иммуноглобулинов снижает достоверность диагностики.

2. В альтернативной схеме один и тот же антиген сорбирован на поверхность маркера (Ag*) и в аналитической зоне (iAg), а детектируемые комплексы формируются благодаря наличию у антител (Ab) нескольких валентностей, что приводит к образованию комплекса состава Ag*-Ab-iAg (схема 2). В данной схеме и с маркерным конъюгатом, и в аналитической зоне теста связываются только специфические иммуноголобулины, поэтому общие иммуноглобулины не оказывают влияния на результаты теста. Однако в данной схеме анализа также присутствует процесс, который мешает выявлению специфических иммуноглобулинов – это связывание разных валентностей антитела с антигенами, иммобилизованными на разных маркерных частицах с образованием комплексов состава Ag*-Ab-Ag*. Такие комплексы не могут связываться с антигеном в аналитической зоне из-за отсутствия свободных валентностей антител. Данная схема анализа встречается реже, однако в научной литературе описан ряд разработок на её основе [7-10]

3. В третьей схеме ИХ-серодиагностики порядок формирования детектируемого комплекса инвертирован относительно классической схемы: маркер конъюгирован с антигеном (Ag*), а в аналитической зоне сорбирован иммуноглобулин-связывающий белок (iP). Соответственно, детектируемым комплексом в этом случае будет комплекс состава Ag*-Ab-iP (схема 3). В данной схеме, как и в схеме 1, общие иммуноглобулины будут связываться с iP, мешая связыванию специфических иммуноглобулинов. Однако данная схема предпочтительней, чем схема 1, поскольку рабочая мембрана теста имеет сорбционную емкость, которая на порядок превышает сорбционную емкость маркерных частиц, что позволяет связывать большее количество иммуноглобулинов. Схема 3 анализа также часто встречается в ИХ-серодиагностике [11-16]

Предлагаемая нами новая схема серодиагностики представляет собой комбинацию схем 2 и 3. Благодаря использованию конъюгата маркера с антигеном и иммобилизации в аналитической зоне смеси антигена и иммуноглобулин-связывающего белка возможно образование детектируемых комплексов как состава Ag*-Ab-iAg (как в схеме 2), так и состава Ag*-Ab-iP (как в схеме 3). При этом в случае образования комплексов Ag*-Ab-Ag*, в отличие от схемы 2, сохраняется возможность связывания данных комплексов в аналитической зоне с образованием комплексов Ag*-Ab-Ag*-iP, которые генерируют в два раза больший сигнал из-за наличия в составе сразу двух маркерных частиц. Таким образом, данная схема позволяет совместить преимущества схем 2 и 3 анализа и улучшить достоверность серодиагностики.

Пример. Иммунохроматографическое определение антител против ЛПС Brucella abortus .

Для формирования тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), мембрану под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану AP 045, для нанесения БСА использовалась мембрана PT-R5.

На мембраны были нанесены следующие реагенты:

1. Белок А из Staphylococcus aureus, производства ООО «Имтек» (Россия).

2. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и ЛПС Brucella abortus. производства РГП «Национальный центр биотехнологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан.

Конъюгат коллоидного золота с антигеном наносили на мембрану под конъюгат в разведении, соответствующем D₅₂₀=5, в объеме 10 мкл на 1 см полосы.

Аналитические зоны тестов формировали в трех вариантах:

1. Для формирования аналитической зоны использовали белок А. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора белка А (10,0 мг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4).

2. Для формирования аналитической зоны использовали ЛПС Brucella abortus в концентрации 0,5 мкг/мл в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,4), 2 мкл на 1 см полосы.

3. Для формирования аналитической зоны использовали смесь белка А (10,0 мг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4) и ЛПС Brucella abortus (0,5 мкг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4), 2 мкл на 1 см полосы.

Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). После нанесения реагентов мембраны высушивали не менее 24 ч в помещении с контролируемыми температурой и влажностью.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу (сыворотку крови, полученной от коровы с подтвержденным диагнозом бруцеллез) на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально. Результаты анализа, представленные на Фиг. 1 демонстрируют преимущество предложенной схемы анализа со смесью антигена и иммуноглобулин-связывающего белка над схемами анализа с использованием только антигена или только иммуноглобулин-связывающего белка.

Источники литературы:

1. Abdoel, T., Dias, I.T., Cardoso, R. and Smits, H.L., 2008. Simple and rapid field tests for brucellosis in livestock. Veterinary Microbiology, 130(3), pp.312-319.

2. Sotnikov, D.V., Byzova, N.A., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Baltin, K.K., Mukanov, K.K., Ramankulov, E.M., Sadykhov, E.G. and Dzantiev, B.B., 2015. Express immunochromatographic detection of antibodies against Brucella abortus in cattle sera based on quantitative photometric registration and modulated cut-off level. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 36(1), pp.80-90.

3. Nakano, S., Tsukimura, T., Togawa, T., Ohashi, T., Kobayashi, M., Takayama, K., Kobayashi, Y., Abiko, H., Satou, M., Nakahata, T. and Warnock, D.G., 2015. Rapid Immunochromatographic Detection of Serum Anti-α-Galactosidase A Antibodies in Fabry Patients after Enzyme Replacement Therapy. PloS one, 10(6), p.e0128351.

4. Janwan, P., Intapan, P.M., Yamasaki, H., Rodpai, R., Laummaunwai, P., Thanchomnang, T., Sanpool, O., Kobayashi, K., Takayama, K., Kobayashi, Y. and Maleewong, W., 2016. Development and usefulness of an immunochromatographic device to detect antibodies for rapid diagnosis of human gnathostomiasis. Parasites & Vectors, 9(1):14.

5. Struyf, F., Lemmens, A., Valadas, E., Verhaegen, J. and Van Ranst, M., 1999. Usefulness of immunochromatographic detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis as an adjunct to auramine staining for rapid diagnosis of tuberculosis in a low-prevalence setting. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 18(10), pp.740-742.

6. Schrier, W.H., Schoengold, R.J., Baker, J.T., Norell, J.L., Jaseph, C.L., Okin, Y., Doe, J.Y. and Chandler, H., 1998. Development of FlexSure® HP—an immunochromatographic method to detect antibodies against Helicobacter pylori. Clinical Chemistry, 44(2), pp.293-298.

7. Wu, H. S., Chiu, S. C., Tseng, T. C., Lin, S. F., Lin, J. H., Hsu, Y. F., ... & Huang, K. H. (2004). Serologic and molecular biologic methods for SARS-associated coronavirus infection, Taiwan. Emerging Infectious Diseases, 10(2), 305.

8. Sato, N. S., Melo, C. S. D., Zerbini, L. C., Silveira, E. P., Fagundes, L. J., & Ueda, M. (2003). Assessment of the rapid test based on an immunochromatography technique for detecting anti-Treponema pallidum antibodies. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 45(6), 319-322.

9. Karakus, C., & Salih, B. A. (2013). Comparison of the lateral flow immunoassays (LFIA) for the diagnosis of Helicobacter pylori infection. Journal of Immunological Methods, 396 (1-2), 8-14.

10. Vrublevskaya VV, Afanasyev VN, Grinevich AA, Skarga YY, Gladyshev PP, Ibragimova SA, Krylsky DV, Dezhurov SV, Morenkov OS: A sensitive and specific lateral flow assay for rapid detection of antibodies against glycoprotein B of Aujeszky's disease virus. Journal of Virological Methods 2017, 249:175-180.

11. Rajerison, M., Dartevelle, S., Ralafiarisoa, L. A., Bitam, I., Tuyet, D. T. N., Andrianaivoarimanana, V., ... & Rahalison, L. (2009). Development and evaluation of two simple, rapid immunochromatographic tests for the detection of Yersinia pestis antibodies in humans and reservoirs. PLoS Neglected Tropical Diseases, 3(4), e421.

12. Karakus, C., & Salih, B. A. (2013). Comparison of the lateral flow immunoassays (LFIA) for the diagnosis of Helicobacter pylori infection. Journal of Immunological Methods, 396(1-2), 8-14.

13. Martinez-Sernandez V, Muino L, Perteguer MJ, Garate T, Mezo M, Gonzalez-Warleta M, Muro A, Correia da Costa JM, Romaris F, Ubeira FM: Development and evaluation of a new lateral flow immunoassay for serodiagnosis of human fasciolosis. PLoS neglected tropical diseases 2011, 5(11):e1376.

14. Ben-Selma W, Harizi H, Boukadida J: Immunochromatographic IgG/IgM test for rapid diagnosis of active tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology : CVI 2011, 18(12):2090-2094.

15. Sotnikov, D. V., Zherdev, A. V., & Dzantiev, B. B. (2017). Theoretical and experimental comparison of different formats of immunochromatographic serodiagnostics. Sensors, 18(1), 36.

16. Sotnikov, D. V., Zherdev, A. V., Avdienko, V. G., & Dzantiev, B. B. (2015). Immunochromatographic assay for serodiagnosis of tuberculosis using an antigen–colloidal gold conjugate. Applied Biochemistry and Microbiology, 51(8), 834-839.

Изобретение относится к иммунологии и аналитической биохимии и представляет собой способ иммунохроматографической серодиагностики для определения специфических иммуноглобулинов в пробах. Способ иммунохроматографического анализа для определения специфических антител в целях серодиагностики, в котором маркерные частицы конъюгируются с молекулами антигена, заключается в том, что на рабочей мембране иммунохроматографической системы иммобилизуют смесь антигена с иммуноглобулин-связывающим белком А бактерии Staphylococcus aureus. Изобретение обеспечивает улучшение достоверности серодиагностики. 1 пр., 1 ил.

Способ иммунохроматографического анализа для определения специфических антител в целях серодиагностики, в котором маркерные частицы конъюгируются с молекулами антигена, отличающийся тем, что на рабочей мембране иммунохроматографической системы иммобилизуют смесь антигена с иммуноглобулин-связывающим белком А бактерии Staphylococcus aureus.