Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии Российский патент 2021 года по МПК C12N1/21 C12N15/63 C12N15/77 C12P13/08 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, получению L-аминокислот с разветвленной боковой цепью (ВСАА от англ. branched-chain amino acids), преимущественно, L-валина, с помощью модифицированной бактерии Corynebacterium glutamicum, содержащей мутацию в регуляторной области оперона генов биосинтеза аминокислот ilvBNC.

ВСАА (L-валин, L-лейцин, L-изолейцин, далее - валин, лейцин, изолейцин) относят к группе незаменимых аминокислот, которые не синтезируются в организме человека и животных, а поступают в организм с пищей. Получение ВСАА, широко используемых в качестве кормовых добавок в животноводстве и птицеводстве, обычно осуществляют путем ферментации Сахаров при помощи кишечной палочки Escherichia coli (US 5658766А) или коринеформных бактерий, таких как Corynebacterium или Brevibacterium (US 5521074А, US 7632663 В1, US 9290770 B2, US 10457919 B2). Пути биосинтеза изолейцина, валина и лейцина тесно связаны. Четыре фермента -ацетолактатсинтаза, изомероредуктаза, дегидратаза дигидроксикислот и трансаминаза В (кодируемые генами ilvBN, ilvC, ilvD и ilvE, соответственно) катализируют стадии превращения двух молекул пирувата в валин и, параллельно, этапы превращения 2-кетобутирата и пирувата в изолейцин.

2-кетобутират образуется из треонина в реакции, катализируемой треониндегидратазой (кодируемой геном ilvA), специфичной для пути изолейцина. Лейцин-специфический путь начинается с 2-кетоизовалерата, который также является прямым предшественником валина. Участие одних и тех же ферментов в синтезе различных ВСАА затрудняет создание штаммов, продуцирующих одну из этих аминокислот без дополнительного образования в качестве побочного продукта других ВСАА.

Современные штаммы-продуценты, используемые для промышленного производства ВСАА, содержат комплекс изменений в геноме, обеспечивающих сверхпродукцию ВСАА при росте на средах с сахарами. Для получения штаммов-продуцентов используют различные селекционные и генетические подходы, включая мутагенез (US 5521074 А, ЕР 0477000 А2), амплификацию отдельных или нескольких генов (US 7632663 B1), усиление активности отдельных генов или их инактивацию (Wada М. et al.) (7).

Известно, что гены биосинтеза ВСАА (ilB, ilvN и ilvC) в клетках Corynebacterium составляют единый оперон, активность которого подавляется валином, лейцином или изолейцином. Экспрессия генов оперона ilvBNC контролируется с участием регуляторной области - 292 нуклеотида, расположенной перед первым геном оперона. Она кодирует лидерный пептид из 15 аминокислот и район, где возможно формирование вторичных структур - терминатора и антитерминатора. Замена 3 валиновых остатков на аланиновые в лидерном пептиде ведет к потери зависимой от концентрации валина экспрессии оперона (S. Morbach). Удаление, частичное удаление или мутации, приводящие к инактивации лидерного пептида, ведут к повышенной продукции валина (US 20160108444 A1). Внесение делеции 211 п.о. в аттенюаторный район промоторной области гена ilvB, находящийся в составе автономной векторной плазмиды pECKAilvBNC, также ведет к увеличению продукции валина (ЕР 1860193А1).

Значительное число известных штаммов-продуцентов аминокислот на основе бактерий Corynebacterium glutamicum, не снижает потребности в разработке новых подходов к созданию таких продуцентов и усовершенствованию существующих способов синтеза ВСАА.

Задачами настоящего изобретения являются:

- повышение продуктивности штаммов-продуцентов ВСАА, принадлежащих к Corynebacterium glutamicum,

- разработка способа получения валина с использованием этих штаммов.

Поставленные задачи решены путем:

- получения бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC - продуцента аминокислоты с разветвленной боковой цепью: L-валина или L-лейцина.

- разработки способа получения L-валина путем культивирования бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC в подходящих условиях с последующим выделением целевой аминокислоты из культуральной жидкости.

В основу заявляемого изобретения положен обнаруженный факт, что штаммы Corynebacterium glutamicum, имеющие специфическую мутацию в регуляторной области перед старт-кодоном структурного гена ilvB, обладают повышенной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной боковой цепью. Эта мутация является заменой гуанина на аденин в положении -183 п. о. (G183A) в нуклеотидной последовательности перед первым структурным геном ilvB оперона ilvBNC (в последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 это нуклеотид номер 110) и не затрагивает последовательности, кодирующей лидерный пептид.

В соответствии с описанием изобретения в качестве продуцента ВСАА используют бактерию Corynebacterium glutamicum, содержащую мутацию P_ilvB (G183A), приводящую к замене нуклеотида гуанин на нуклеотид аденин в регуляторной области оперона ilvBNC в положении -183 п.о. перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона.

В качестве исходной бактерии Corynebacterium glutamicum используют, в частности, штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 (депонированы в коллекции типовых культур USA).

Термин «бактерия, способная продуцировать аминокислоты с разветвленной боковой цепью» означает бактерию, способную накапливать валин или лейцин в больших количествах, чем родительские штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.

Термин «бактерия с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что нуклеотидная последовательность регуляторной области оперона ilvBNC из Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или из Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 (SEQ ID NO: 1) содержит замену нуклеотида гуанин на нуклеотид аденин (мутация G183A) в положении -183 перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона с образованием последовательности SEQ ID NO: 2.

Направленное введение мутации P_ilvB (G183A) в хромосому родительского штамма Corynebacterium glutamicum осуществляют с помощью известных методов генной инженерии, в частности, метода замещения, основанного на гомологичной рекомбинации (Schafer A. et al, 1994) (12).

ДНК-фрагмент регуляторной области оперона ilvBNC, содержащий мутацию P_ilvB(G183A), получают с помощью метода ПЦР (Sambrook et al.) (13). Затем исходную последовательность в хромосоме родительского штамма замещают на мутантную последовательность с помощью гомологичной рекомбинации, которую проводят, в частности, с использованием плазмиды, не способной к автономному поддержанию в клетке хозяина.

Способ получения валина в общем виде

Способ получения аминокислоты валина включает культивирование валин-продуцирующей бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC в подходящих условиях с последующим выделением синтезированного валина из культуральной жидкости традиционными способами с кристаллизацией из раствора соляной кислоты (14).

В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа, и содержащую в качестве источника углерода глюкозу или глюкозные сиропы, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт или гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°С, преимущественно при 30-32°С и рН среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.

Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.

Заявляемый способ позволяет обеспечить уровень продукции валина до 15-25 г/л, что в превосходит исходный уровень родительского штамма на 50-400% (в зависимости от штамма).

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC.

Штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675, являющегося производным штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, у которого гены ponA и ilvA делегированы, путем замены нативной последовательности регуляторной области оперона ilvBNC (SEQ ID NO: 1) мутантной копией (SEQ ID NO: 2). Для этого с помощью ПЦР получена мутантная копия регуляторной области оперона ilvBNC с заменой нуклеотида гуанин на аденин в позиции -183 перед старт-кодоном структурного гена ilvB, которая затем вставлена в плазмиду pIKA-sac13, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermoscientific") гена sacB из Bacillus subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена Km^R (Tarutina) (15). С учетом того, что плазмида pIKA-sac13 не способна автономно поддерживаться в клетках Corynebacterium glutamicum после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки Corynebacterium glutamicum VC2 В-13675, отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации произошло замещение нативной последовательности регуляторной области оперона ilvBNC на мутантную копию. Наличие замены в регуляторной области подтверждено с помощью анализа методом ПЦР и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum VC3 с заменой нуклеотида гуанин на аденин в позиции -183 перед старт-кодоном структурного гена ilvB депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676.

Пример 2. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 (VB3) с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC.

Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 (VB3) сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13674 (VB2), имеющего делеции в генах ponA и ilvA в хромосоме штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13869, путем замены нативной последовательности регуляторной области гена ilvB (SEQ ID NO: 1) на их мутантную копию (SEQ ID NO: 2). Конструирование мутантной копии регуляторной области оперона ilvBNC и замена нативной последовательности на мутантную копию проведены как описано в Примере 1. Наличие замены в регуляторной области подтверждено с помощью анализа методом ПЦР и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum VB3 с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677.

Пример 3. Оценка влияния мутации P_ilvB (G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC у штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676 или штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 на активность ацетолактатсинтазы -ключевого фермента биосинтеза аминокислот с разветвленной боковой цепью

Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676 или штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 выращивают в колбах на питательной среде, содержащей (г/л): фосфат калия однозамещенный - 2,5, фосфат калия двузамещенный трехводный - 19,7, сульфат магния семиводный - 1,0, глюкоза - 20,0, биотин - 0,0001, тиамин - 0,0002, кукурузный экстракт - 5,0, сульфат аммония - 15,0, изолейцин - 0,25, вода до 1 л, рН 7,0-7,2 в течение 7 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С, используя в качестве посевного материала ночные культуры штаммов, выращенные при тех же условиях. Затем клетки собирают с помощью центрифугирования, осадок промывают фосфатным буфером (0,2 М, рН7,4), клетки суспендируют в том же буфере с добавлением MgCl₂ (5 мМ) и β-меркаптоэтанола (1 мкл/мл) и разрушают ультразвуком в течение 15 минут. По окончании обработки ультразвуком образцы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. В качестве контроля используют родительские штаммы Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13675 и Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13674, выращенные при тех же условиях, что и мутантные штаммы.

Активность ацетолактатсинтазы в полученных бесклеточных экстрактах штаммов определяют при 30°С согласно методике, описанной Guo et al. 2015 (16) с некоторыми модификациями.

Удельную активность ацетолактатсинтазы рассчитывают как нмоль α-ацетолактата, образующегося в минуту в расчете на 1 мг общего белка. Количество общего белка в экстрактах определяют по методу Лоури (17).

Из результатов, представленных в таблице 1, следует, что введение мутации PilvB(G183A), локализованной в регуляторной области оперона ilvBNC, в геном штамма Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674 или Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675 приводит к увеличению активности ацетолактатсинтазы - ключевого фермента биосинтеза аминокислот с разветвленной боковой цепью в 6,5 раз по сравнению с родительскими штаммами.

Пример 4. Оценка влияния мутации P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC на продуктивность по валину или лейцину у штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677

Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677, предварительно выращенной в течение 22 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 10,0 хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002 с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена 50,0 мл/л, вода - остальное. Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (18). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. В качестве контрольного штамма используют родительский штамм Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674.

Пробирки с культурами инкубируют в течение 36 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С и затем в культуральной жидкости определяют содержание валина или лейцина методом тонкослойной хроматографии.

Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 с мутацией P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC продуцирует на 50% больше валина и в 2 раза больше лейцина по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674.

Пример 5. Оценка влияния мутации P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC на продуктивность по валину у штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676

Оценку продуктивности проводят в пробирочных тестах также как описано в примере 4. В качестве штамма сравнения используют родительский штамм Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675.

Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 с мутацией P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC, продуцирует в 4 раза больше валина, чем родительский штамм Corynebacterium glutamicum VC2 В-13675.

Из результатов, представленных в таблицах 1, 2 и 3, следует, что потенциал штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и АТСС13869 по удельной активности ацетолактатсинтазы и по уровню продукции валина существенно различается. Штамм VB2, производный от Corynebacterium glutamicum АТСС13869, продуцирует в 5 раз больше валина по сравнению со штаммом VC2, производным от Corynebacterium glutamicum АТСС13032.

Штаммы, содержащие мутацию P_ilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC - Corynebacterium glutamicum VC3, Corynebacterium glutamicum VB3, обеспечивают увеличение продукции валина от 50 до 400% по сравнению с контрольными штаммами. При этом эффект, который оказывает мутация P_ilvB(G183A) в регуляторной области ilvBNC, зависит от родительского штамма.

Пример 6. Получение валина с использованием штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 или штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676

Для выделения валина из культуральной жидкости штамм Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 или штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 выращивают в колбах в условиях и на среде как описано в примере 4. После выращивания твердые остатки, такие как клетки, удаляют из культуральной жидкости методом центрифугирования и фильтрацией через мембрану с последующим вакуум-выпариванием образовавшегося пермеата. Из водного раствора валин выделяют кристаллизацией с последующей перекристаллизацией из раствора соляной кислоты (14). Выход валина из КЖ составляет 50,7%, содержание валина в полученном продукте -99,6%.

Таким образом, наличие мутации P_ilvB(G183A), локализованной в регуляторной области оперона ilvBNC, в штамме бактерий Corynebacterium glutamicum - продуценте аминокислоты с разветвленной боковой цепью позволяет значительно повысить выход целевой аминокислоты по сравнению с родительским штаммом, что представляет интерес для получения и усовершенствования продуцентов аминокислот из группы ВСАА.

Разработанный на основе заявляемой бактерии способ получения валина расширяет арсенал известных способов получения этой наиболее востребованной из группы ВСАА аминокислоты и позволяет повысить уровень продукции валина на 50-400% по сравнению с родительским штаммом.

Список источников информации

1. US 5521074 А

2. US 7632663 В1

3. US 9290770 В2

4. US 10457919 В2

5. US 5658766А

6. ЕР 0477000 А2

7. Wada М., Hijikata N.. Aoki R., Takesue N., and Yokota A. Enhanced valine production in Corynebacterium glutamicum with defective H+-ATPase and C-terminal truncated acetohydroxyacid synthase. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2008). V. 72 (11). P. 2959-2965.

8. US 20160108444 A1

9. Morbach S., Junger C., Sahmand H., Eggeling L. Attenuation Control of ilvBNC in Corynebacterium glutamicum: Evidence of Leader Peptide Formation without the Presence of a Ribosome Binding Site. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2000. V.90. - №5. - P. 501-507

10. ЕР 1860193 A1

11. Liebl W., Ehrmann M., Ludwig W., Schleifer K.H. Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns Int. J. Syst. Bacteriol. - Vol. 41(2). - P. 255-260.

12. Schäfer A., Tauch A., Jäger W., Kalinowski J., Thierbach G., and Pühler. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. -(1994). V. 145. P. 69-73.

13. Sambrook I., Russell D. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001

14. A.E. Агаджанян, Г.Ж. Оганесян и Е.А. Агаджанян Выделение и очистка валина из культуральной жидкости Химический журнал Армении, 2002, №4, 55, стр. 121-129

15. Taratina M.G., Raevskaya N.M., Shustikova Т.Е., et al. Assessment of effectiveness of Corynebacterium glutamicum promoters and their application to enhancement of gene activity in lysine-producing bacteria. Biotekhnologiya (Biotechnology), 2015, 6, 16-24. doi: 10.21519/0234-2758-2015-6-16-24

16. Guo Y., Han M., Xu J., Zhang W. Analysis of acetohydroxyacid synthase variants from branched-chain amino acids-producing strains and their effects on the synthesis of branched-chain amino acids in Corynebacterium glutamicum. Protein Expression and Purification. -(2015). - V. 109. P. 106-112

17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 193(1) 265-275.

18. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный

научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных

микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский

институт»» (НИЦ «Курчатовский институт»- ГосНИИгенетика)

<120> Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать

L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии

<160> 2

<210> 1

<211> 292

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> CDS

<222> (1)…(-292)

<223> ilvBNC regulator region

<400> 1

catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60

gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgag ggctttcttg 120

ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180

atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240

ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292

<210> 2

<211> 292

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> CDS

<222> (1)…(-292)

<223> ilvBNC regulator region с заменой гуанина на аденин в позиции -183 п.н.

перед старт кодоном структурного гена ilvB

<400> 2

catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60

gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgaa ggctttcttg 120

ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180

atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240

ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена бактерия Corynebacterium glutamicum, являющаяся продуцентом аминокислоты с разветвленной боковой цепью - L-валина. Батекрия содержит мутацию, представляющую собой замену гуанина на аденин в положении -183 в нуклеотидной последовательности перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона ilvBNC. Также предложен способ получения L-валина, предусматривающий культивирование указанной бактерии в подходящих условиях до оптимального накопления целевого продукта и выделение целевой аминокислоты из культуральной жидкости. Группа изобретений позволяет повысить выход L-валина по сравнению с родительским штаммом. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 6 пр.

1. Бактерия Corynebacterium glutamicum с мутацией, представляющей собой замену гуанина на аденин в положении -183 в нуклеотидной последовательности перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона ilvBNC, - продуцент аминокислоты с разветвленной боковой цепью - L-валина.

2. Способ получения L-валина, включающий культивирование бактерии по п. 1 в подходящих условиях до оптимального накопления целевого продукта и выделение целевой аминокислоты из культуральной жидкости.