Родственные заявки

Данная заявка испрашивает преимущество приоритета предварительной патентной заявки США №: 62/264013, поданной 7 декабря 2015 года, предварительной патентной заявки США №: 62/315228, поданной 30 марта 2016 года, предварительной патентной заявки США №: 62/366304, поданной 25 июля 2016 года и предварительной патентной заявки США №: 62/429241, поданной 2 декабря 2016 года. Полное содержание каждой из вышеприведенных патентных заявок включено в данный документ посредством ссылки.

Данная заявка связана с предварительной патентной заявкой США №: 61/992057, поданной 12 мая 2014 года, предварительной патентной заявкой США №: 62/089018, поданной 8 декабря 2014 года, предварительной патентной заявкой США №: 62/102281, поданной 12 января 2015 года, и PCT Патентной заявкой PCT/US2015/030337, поданной 12 мая 2015 года. Полное содержание каждой из вышеприведенных патентных заявок включено в данный документ посредством ссылки.

Кроме того, данная заявка связана с предварительной патентной заявкой США №: 61/638952, поданной 26 апреля 2012 года, предварительной патентной заявкой США №: 61/669249, поданной 9 июля 2012 года, предварительной патентной заявкой США №: 61/734573, поданной 7 декабря 2012 года, патентной заявкой США №: 13/837129, поданной 15 марта 2013 года, теперь патентом США №: 9127274, патентной заявкой США №: 14/806084, поданной 22 июля 2015 года, теперь патентом США №: 9376680, патентной заявкой США №: 15/070358, поданной 15 марта 2016 года, и PCT патентной заявкой № PCT/US2013/038218, поданной 25 апреля 2013 года. Данная заявка также связана с PCT патентной заявкой № PCT/US2012/065601, поданной 16 ноября 2012 года. Полное содержание каждой из вышеприведенных патентных заявок включено в данный документ посредством ссылки.

Список последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 6 декабря 2016 года, называется 121301-05220_SL.TXT и имеет размер 21140 байт.

Уровень техники настоящего изобретения

Serpinc1 является членом суперсемейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов). Serpinc1 является ингибитором плазменных протеаз, который ингибирует тромбин, а также другие активированные сериновые протеазы свертывающей системы, такие как факторы X, IX, XI, XII и VII и, таким образом, регулирует каскад свертывания крови. Противосвертывающая активность Serpinc1 усиливается в присутствии гепарина и других родственных гликозаминогликанов, которые катализируют образование комплексов тромбин:антитромбин (ТАТ).

Расстройства, сопровождающиеся кровоточивостью, как наследственные, так и приобретенные, являются условиями, при которых происходит неадекватное свертывание крови. Например, гемофилия представляет собой группу наследственных генетических нарушений, сопровождающихся кровоточивостью, которые нарушают способность организма контролировать образование кровяного сгустка или свертываемость. Гемофилия А является рецессивным X-сцепленным генетическим расстройством, связанным с отсутствием функционального фактора свертывания VIII и составляет 80% случаев гемофилии. Гемофилия B является рецессивным X-сцепленным генетическим расстройством, связанным с отсутствием функционального фактора свертывания IX. Она включает приблизительно 20% случаев гемофилии. Гемофилия C является аутосомным генетическим расстройством, связанным с отсутствием функционального фактора свертывания XI. Гемофилия C не является полностью рецессивной, так как гетерозиготные особи также демонстрируют повышенную кровоточивость.

Хотя в настоящее время нет лечения для гемофилии, ее можно контролировать с помощью регулярных инфузий дефицитного фактора свертывания крови, например, фактора VIII при гемофилии А. Однако у некоторых больных гемофилией вырабатываются антитела (ингибиторы) против вводимых им заместительных факторов и, таким образом, становятся невосприимчивыми к заместительным факторам свертывания. Соответственно, кровотечения у таких субъектов невозможно надлежащим образом контролировать.

Развитие высоких титров ингибиторов, например, к фактору VIII и другим факторам свертывания является наиболее серьезным осложнением терапии гемофилии и делает лечение кровотечений весьма сложным. В настоящее время единственными стратегиями прекращения кровотечений у таких субъектов являются использование «средств обходного действия», таких как функция обхода ингибиторов к фактору VIII (FEIBA) и рекомбинантный активированный фактор VII (rFVIIa), плазмаферез, непрерывное замещение фактора и терапия иммунной толерантности, ни один из которых не является полностью эффективным. Соответственно, в данной области существует потребность в альтернативных методах лечения субъектов, страдающих расстройством, сопровождающимся кровоточивостью, таким как гемофилия.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предоставлены способы лечения субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь ингибирование или уменьшение экспрессии гена Serpinc1, например, расстройства, сопровождающегося кровоточивостью, такого как гемофилия, с использованием композиций иРНК, которые воздействуют на опосредованное индуцируемым РНК комплексом сайленсинга (RISC) расщепление транскриптов РНК гена Serpinc1 для подавления экспрессии гена Serpinc1.

Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на неожиданном открытии, что очень низкие дозы (например, дозы, по меньшей мере примерно в 30 раз ниже, чем дозы, практикуемые в данной области) связанного с GalNAc средства двухцепочечной RNAi, включая конкретные химические модификации, показывают исключительную эффективность для подавления экспрессии Serpinc1, а также исключительную продолжительность подавления экспрессии Serpinc1. Конкретно, низкие дозы средств RNAi, содержащих лиганд GalNAc и смысловую нить и антисмысловую нить, в которых по существу все нуклеотиды являются модифицированными, такие как средства RNAi, содержащие один или более мотивов трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов, включая один такой мотив на участке расщепления средств или около него, шесть тиофосфатных связей, и лиганд GalNAc, показаны в данном изобретении исключительно эффективными и продолжительными по подавлении активности гена Serpinc1.

Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту дозы от приблизительно 0,200 мг/кг до приблизительно 1,825 мг/кг средства двухцепочечной RNAi, которая содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухцепочечную область, при этом смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, а антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, например, лиганд присоединен на 3'-конце смысловой нити.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы лечения субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту дозы от приблизительно 0,200 мг/кг до приблизительно 1,825 мг/кг средства двухцепочечной RNAi, при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухцепочечную область, при этом смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, а антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, прикрепленным к 3'-концу смысловой нити.

В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой нити и все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами.

В другом варианте осуществления смысловая нить и антисмысловая нить содержат область комплементарности, которая содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от любой одной из последовательностей, перечисленных в любой одной из таблиц 2 и 3.

В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды независимо выбирают из группы, состоящей из 2'-O-метил модифицированного нуклеотида, 2'-фтор модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-тиофосфатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с производным холестерила или бисдециламидной группы додекановой кислоты. В дополнительных вариантах осуществления модифицированный нуклеотид выбирают из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтор модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотида, неблокированного нуклеотида, конформационно ограниченного нуклеотида, ограниченного этилом нуклеотида, нуклеотида с удаленным азотистым основанием, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, 2'-O-аллил модифицированного нуклеотида, 2'-C-аллил модифицированного нуклеотида, 2'-гидроксил модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего искусственное основание.

В другом варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi, по меньшей мере одна нить содержит 3' «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3' «липкий» конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов, например, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов. В других вариантах осуществления по меньшей мере одна нить средства RNAi содержит 5' «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна нить содержит 5' «липкий» конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов, например, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов. В других вариантах осуществления и 3'-, и 5'-конец одной нити средства RNAi содержит «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления лигандом является N-ацетилгалактозамин (GalNAc). Лиганд может представлять собой один или более GalNAc, прикрепленный к средству RNAi через моновалентный, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер. Лиганд можно конъюгировать с 3'-концом смысловой нити средства двухцепочечной RNAi, 5'-концом смысловой нити средства двухцепочечной RNAi, 3'-концом антисмысловой нити средства двухцепочечной RNAi или 5'-концом антисмысловой нити средства двухцепочечной RNAi.

В некоторых вариантах осуществления средства двухцепочечной RNAi изобретения содержат множество, например, 2, 3, 4, 5 или 6, GalNAc, каждый из которых независимо прикреплен к множеству нуклеотидов средства двухцепочечной RNAi через множество моновалентных линкеров.

В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой

.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту дозы от приблизительно 0,200 мг/кг до приблизительно 1,825 мг/кг средства двухцепочечной RNAi, при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, при этом антисмысловая нить содержит область комплементарности части мРНК, кодирующей Serpinc1, при этом каждая нить составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, при этом средство двухцепочечной RNAi представлено формулой (IIIe):

смысловая: 5' -N_a -Y Y Y-N_a-3'

антисмысловая: 3' n_p'-N_a'-Y'Y'Y'-N_a'-5' (IIIe)

при этом:

n_p' представляет собой «липкий» конец из 2 нуклеотидов, а каждый нуклеотид внутри n_p' связан с соседним нуклеотидом посредством тиофосфатной связи;

каждый N_a и N_a' независимо представляет олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, или их комбинациями, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два разных модифицированных нуклеотида;

YYY и Y'Y'Y' каждый независимо представляют один мотив трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов, и при этом модификации представляют собой 2'-O-метил или 2'-фтор модификации;

при этом смысловая нить и антисмысловая нить каждая независимо содержат две тиофосфатные связи на 5'-конце; и

при этом смысловую нить конъюгируют по меньшей мере с одним лигандом, при этом лиганд представляет собой одно или более производное GalNAc, присоединенное через моновалентный, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер,

тем самым предотвращая по меньшей мере один симптом у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы лечения субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту дозы от приблизительно 0,200 мг/кг до приблизительно 1,825 мг/кг средства двухцепочечной RNAi, при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, при этом антисмысловая нить содержит область комплементарности части мРНК, кодирующей Serpinc1, при этом каждая нить составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, при этом средство двухцепочечной RNAi представлено формулой (IIIe):

смысловая: 5' -N_a -Y Y Y-N_a-3'

антисмысловая: 3' n_p'-N_a'-Y'Y'Y'-N_a'-5' (IIIe)

при этом:

n_p' представляет собой «липкий» конец из 2 нуклеотидов, а каждый нуклеотид внутри n_p' связан с соседним нуклеотидом посредством тиофосфатной связи;

каждый N_a и N_a' независимо представляет олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, или их комбинациями, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два разных модифицированных нуклеотида;

YYY и Y'Y'Y' каждый независимо представляют один мотив трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов, и при этом модификации представляют собой 2'-O-метил или 2'-фтор модификации;

при этом смысловая нить и антисмысловая нить каждая независимо содержат две тиофосфатные связи на 5'-конце; и

при этом смысловую нить конъюгируют по меньшей мере с одним лигандом, при этом лиганд представляет собой одно или более производное GalNAc, прикрепленное через моновалентный, бивалентный и трехвалентный разветвленный линкер,

тем самым предотвращая по меньшей мере один симптом у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту в разовой дозе или в двух или более дозах, например, в 3, 4, 5 или 6 дозах.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту один раз в месяц, каждые шесть недель, каждые 2 месяца, каждые три месяца или при необходимости.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить субъекту в виде, например, месячной дозы от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,825 мг/кг, от 0,200 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,400 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,400 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,400 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,100 мг/кг, или приблизительно 0,925 до приблизительно 1,000 мг/кг, в виде, например, месячной дозы в течение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми месяцев или более.

Субъектом может быть человек, такой как человек, имеющий расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, такое как приобретенное расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, или врожденное расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, например, гемофилия, например, гемофилия A, гемофилия B или гемофилия C.

В одном варианте осуществления субъект страдает гемофилией A и является субъектом с ингибиторами. В другом варианте осуществления, субъект страдает гемофилией B и является субъектом с ингибиторами. В другом варианте осуществления субъект страдает гемофилией C и является субъектом с ингибиторами.

В одном варианте осуществления введение субъекту средства двухцепочечной RNAi вызывает увеличение свертываемости крови и/или снижение накопления белка Serpinc1.

В одном варианте осуществления способы дополнительно предусматривают измерение уровней тромбина у субъекта.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить подкожно или внутривенно.

В одном варианте осуществления по существу все нуклеотиды антисмысловой нити и по существу все нуклеотиды смысловой нити средства RNAi содержат модификацию, выбираемую из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации и 2'-фтор модификации. В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой нити и все нуклеотиды антисмысловой цепи средства RNAi являются модифицированными нуклеотидами.

В одном варианте осуществления мотив YYY возникает на участке расщепления смысловой нити или около него.

В одном варианте осуществления мотив Y'Y'Y' возникает в позициях 11, 12 и 13 антисмысловой нити от 5'-конца.

Двухцепочечная область может составлять 15-30 нуклеотидных пар в длину, 17-23 нуклеотидных пар в длину, 17-25 нуклеотидных пар в длину, 23-27 нуклеотидных пар в длину,19-21 нуклеотидных пар в длину или 21-23 нуклеотидных пар в длину.

Каждая нить может иметь 15-30 нуклеотидов или 19-30 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления смысловая нить имеет всего 21 нуклеотида, а антисмысловая нить имеет всего 23 нуклеотида.

В одном варианте осуществления лиганд представляет собой

.

В одном варианте осуществления лиганд прикреплен к 3-концу смысловой нити.

В одном варианте осуществления средство RNAi конъюгируют с лигандом, как показано в следующей схеме

при этом X представляет собой O или S.

В одном варианте осуществления пара оснований в 1 позиции 5-конца антисмысловой нити дуплекса представляет собой пару оснований AU.

В одном варианте осуществления средство RNAi представляет собой AD-57213 ((Смысловой (от 5' к 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf (SEQ ID NO:13); Антисмысловой (от 5' к 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14), при этом A, c, g и u представляют собой A, C, G или U рибозы; a, c, g и u представляют собой A, C, G или U 2'-O-метил (2'-OMe) рибозы; Af, Cf, Gf или Uf представляют собой 2'-фтор A, C, G или U; и s представляет собой тиофосфатную связь)).

В одном варианте осуществления средство вводят в виде фармацевтической композиции. В одном варианте осуществления средство RNAi вводят в незабуференном растворе, таком как физиологический солевой раствор или вода.

В другом варианте осуществления миРНК вводят с буферным раствором, таким как буферный раствор, содержащий ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).

В одном аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту дозы от приблизительно 0,200 мг/кг до приблизительно 1,825 мг/кг средства двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (RNAi), при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем антисмысловая нить содержит область комплементарности, которая содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, прикрепленным к 3'-концу смысловой нити.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы лечения субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту дозы от приблизительно 0,200 мг/кг до приблизительно 1,825 мг/кг средства двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (RNAi), при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем антисмысловая нить содержит область комплементарности, которая содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, прикрепленным к 3'-концу смысловой нити.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить субъекту в двух или более дозах.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту один раз в месяц. В другом варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту каждые шесть недель. В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту каждые 2 месяца. В другом варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту каждые три месяца.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить субъекту в виде, например, месячной дозы от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,825 мг/кг, от 0,200 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,200 до приблизительно 0,400 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,225 до приблизительно 0,400 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,250 до приблизительно 0,400 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,425 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,450 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,800 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,700 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,600 мг/кг, от приблизительно 0,475 до приблизительно 0,500 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,875 до приблизительно 0,900 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,100 мг/кг, от приблизительно 0,900 до приблизительно 1,000 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,825 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,800 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,700 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,600 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,500 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,400 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,200 мг/кг, от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,100 мг/кг или от приблизительно 0,925 до приблизительно 1,000 мг/кг.

В некоторых вариантах осуществления дозу средства двухцепочечной RNAi вводят субъекту в виде месячной дозы от приблизительно 0,200 мг/кг до приблизительно 0,250 мг/кг; или в виде месячной дозы от приблизительно 0,425 мг/кг до приблизительно 0,475 мг/кг; или в виде месячной дозы от приблизительно 0,875 мг/кг до приблизительно 0.925 мг/кг; или в виде месячной дозы от приблизительно 1,775 мг/кг до приблизительно 1,825 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту в виде месячной дозы, составляющей 0,225 мг/кг.

В другом варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту в виде месячной дозы, составляющей 0,450 мг/кг.

В другом варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту в виде месячной дозы, составляющей 0,900 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту в виде месячной дозы, составляющей 1,800 мг/кг.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту подкожно.

В одном варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту снижает у субъекта активность Serpinc1 на от приблизительно 70% до приблизительно 95%.

В другом варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту повышает пиковые уровни тромбина у субъекта до диапазона пиковых уровней тромбина у субъекта, у которого нет расстройства, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1.

В одном варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту достаточно для доведения пиковых уровней выработки тромбина у субъекта до приблизительно такого же уровня, который достигается посредством введения субъекту фактора VIII.

В другом варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту достаточно для достижения пиковых уровней выработки тромбина у субъекта выше, чем приблизительно 40%.

В другом варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту уменьшает частоту кровотечений в год (ABR) у субъекта на от приблизительно 80 до приблизительно 95% по сравнению со средней анамнестической зарегистрированной ABR у субъектов, имеющих расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1, которым не вводили средство двухцепочечной RNAi.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят с буферным раствором, таким как буферный раствор, содержащий ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).

В одном варианте осуществления субъектом является человек.

Расстройство может представлять собой расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, такое как приобретенное расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, или врожденное расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, например, гемофилия, например, гемофилия A, гемофилия B или гемофилия C.

В одном варианте осуществления субъект страдает гемофилией A и является субъектом с ингибиторами. В другом варианте осуществления субъект страдает гемофилией B и является субъектом с ингибиторами. В другом варианте осуществления субъект страдает гемофилией C и является субъектом с ингибиторами.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту подкожно.

В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой нити и все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами.

В одном варианте осуществления модифицированные нуклеотиды независимо выбирают из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтор модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотида, нуклеотида с удаленным азотистым основанием, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего искусственное основание.

Область комплементарности может составлять по меньшей мере 17 нуклеотидов в длину или 19 нуклеотидов в длину.

В одном варианте осуществления область комплементарности составляет между 19 и 21 нуклеотидом в длину. В другом варианте осуществления область комплементарности составляет между 21 и 23 нуклеотидами в длину.

В одном варианте осуществления каждая нить составляет не более чем 30 нуклеотидов в длину.

По меньшей мере одна нить средства двухцепочечной RNAi может содержать 3' «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида или 3' «липкий» конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов, например, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов. В других вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь средства RNAi содержит 5' «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь содержит 5' «липкий» конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов, например, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов. В других вариантах осуществления и 3'-, и 5'-конец одной нити средства RNAi содержат «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления лигандом является N-ацетилгалактозамин (GalNAc). Лиганд может представлять собой один или более GalNAc, прикрепленный к средству RNAi через моновалентный, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер. Лиганд можно конъюгировать с 3'-концом смысловой нити средства двухцепочечной RNAi, 5'-концом смысловой нити средства двухцепочечной RNAi, 3'-концом антисмысловой нити средства двухцепочечной RNAi или 5'-концом антисмысловой нити средства двухцепочечной RNAi.

В некоторых вариантах осуществления средства двухцепочечной RNAi изобретения содержат множество, например, 2, 3, 4, 5 или 6 GalNAc, каждый из которых независимо прикреплен к множеству нуклеотидов средства двухцепочечной RNAi через множество моновалентных линкеров.

В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой

.

В одном варианте осуществления средство RNAi конъюгируют с лигандом, как показано в следующей схеме

и при этом X представляет собой O или S.

В одном варианте осуществления X представляет собой O.

В одном варианте осуществления область комплементарности состоит из нуклеотидной последовательности 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить, содержащую нуклеотидную последовательность 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3'(SEQ ID NO: 16), а антисмысловая нить содержит нуклеотидную последовательность 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).

В одном варианте осуществления смысловая нить содержит 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13), а антисмысловая нить содержит 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), при этом A, c, g и u представляют собой A, C, G или U рибозы; a, c, g и u представляют собой A, C, G или U 2'-O-метил (2'-OMe) рибозы; Af, Cf, Gf или Uf представляют собой 2'-фтор A, C, G или U; и s представляет собой тиофосфатную связь.

В одном аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту фиксированной дозы от приблизительно 25 мг до приблизительно 100 мг средства двухцепочечной RNAi, которая содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухцепочечную область, при этом смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, прикрепленным к 3'-концу смысловой нити.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы лечения субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту фиксированной дозы от приблизительно 25 мг до приблизительно 100 мг средства двухцепочечной RNAi, при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухцепочечную область, при этом смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, прикрепленным к 3'-концу смысловой нити.

В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой нити и все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами.

В другом варианте осуществления смысловая нить и антисмысловая нить содержат область комплементарности, которая содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от любой одной из последовательностей, перечисленных в любой одной из таблиц 2 и 3.

В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды независимо выбирают из группы, состоящей из 2'-O-метил модифицированного нуклеотида, 2'-фтор модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-тиофосфатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с производным холестерила или бисдециламидной группы додекановой кислоты. В дополнительных вариантах осуществления модифицированный нуклеотид выбирают из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтор модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотид, неблокированного нуклеотида, конформационно ограниченного нуклеотида, ограниченного этилом нуклеотида, нуклеотида с удаленным азотистым основанием, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, 2'-O-аллил модифицированного нуклеотида, 2'-C-аллил модифицированного нуклеотида, 2'-гидроксил модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего искусственное основание.

В другом варианте осуществления средства двухцепочечной RNAi, по меньшей мере одна цепь содержит 3' «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна цепь содержит 3' «липкий» конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов, например, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов. В других вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь средства RNAi содержит 5' «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна цепь содержит 5' «липкий» конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов, например, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов. В других вариантах осуществления и 3'-, и 5'-конец одной нити средства RNAi содержит «липкий» конец по меньшей мере из 1 нуклеотида.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту фиксированной дозы от приблизительно 25 мг до приблизительно 100 мг средства двухцепочечной RNAi, при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, при этом антисмысловая нить содержит область комплементарности части мРНК, кодирующей Serpinc1, при этом каждая нить составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, при этом средство двухцепочечной RNAi представлено формулой (IIIe):

смысловая: 5' -N_a -Y Y Y-N_a-3'

антисмысловая: 3' n_p'-N_a'-Y'Y'Y'-N_a'-5' (IIIe)

при этом:

n_p' представляет собой «липкий» конец из 2 нуклеотидов, а каждый нуклеотид внутри n_p' связан с соседним нуклеотидом через тиофосфатную связь;

каждый N_a и N_a' независимо представляет олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, или их комбинации, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два разных модифицированных нуклеотида;

YYY и Y'Y'Y' каждый независимо представляет один мотив трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов, и при этом модификации представляют собой 2'-O-метил или 2'-фтор модификации;

при этом смысловая нить и антисмысловая нить каждая независимо содержат две тиофосфатные связи на 5'-конце; и

при этом смысловую нить конъюгируют по меньшей мере с одним лигандом, при этом лиганд представляет собой одно или более производное GalNAc, прикрепленное через моновалентный, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер,

тем самым предотвращая по меньшей мере один симптом у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы лечения субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту фиксированной дозы от приблизительно 25 мг до приблизительно 100 мг средства двухцепочечной RNAi, при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, при этом антисмысловая нить содержит область комплементарности части мРНК, кодирующей Serpinc1, при этом каждая нить составляет в длину от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, при этом средство двухцепочечной RNAi представлено формулой (IIIe):

смысловая: 5' -N_a -Y Y Y-N_a-3'

антисмысловая: 3' n_p'-N_a'-Y'Y'Y'-N_a'-5' (IIIe)

при этом:

n_p' представляет собой «липкий» конец из 2 нуклеотидов, а каждый нуклеотид внутри n_p' связан с соседним нуклеотидом через тиофосфатную связь;

каждый N_a и N_a' независимо представляет олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными или их комбинациями, причем каждая последовательность содержит по меньшей мере два разных модифицированных нуклеотида;

YYY и Y'Y'Y' каждый независимо представляют один мотив трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов, и при этом модификации представляют собой 2'-O-метил или 2'-фтор модификации;

при этом смысловая нить и антисмысловая нить каждая независимо содержат две тиофосфатные связи на 5'-конце; и

при этом смысловую нить конъюгируют по меньшей мере с одним лигандом, при этом лиганд представляет собой одно или более производное GalNAc, прикрепленное через моновалентный, бивалентный и трехвалентный разветвленный линкер,

тем самым предотвращая по меньшей мере один симптом у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту в разовой дозе или в двух или более дозах, например, в 3, 4, 5 или 6 дозах.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту один раз в месяц, однократно каждые пять недель, каждые шесть недель, однократно каждые семь недель, каждые 2 месяца, каждые три месяца или при необходимости.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить субъекту в виде, например, фиксированной дозы, составляющей между приблизительно 25 мг и приблизительно 100 мг, например, между приблизительно 25 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 75 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 70 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 60 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 50 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 60 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 60 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 55 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 75 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 55 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 75 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 55 мг, или между приблизительно 45 мг и приблизительно 95 мг as например, фиксированной дозы в течение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми месяцев или более.

В некоторых вариантах осуществления средство двухцепочечной RNAi можно вводить субъекту в виде фиксированной дозы, составляющей приблизительно 25 мг, приблизительно 30 мг, приблизительно 35 мг, приблизительно 40 мг, приблизительно 45 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно 55 мг, приблизительно 60 мг, приблизительно 65 мг, приблизительно 70 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 80 мг, приблизительно 85 мг, приблизительно 90 мг, приблизительно 95 мг или приблизительно 100 мг.

Субъектом может быть человек, такой как человек, имеющий расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, такое как приобретенное расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, или врожденное расстройство, сопровождающееся кровоточивостью, например, гемофилия, например, гемофилия A, гемофилия B или гемофилия C.

В одном варианте осуществления субъект страдает гемофилией A и является субъектом с ингибиторами. В другом варианте осуществления субъект страдает гемофилией B и является субъектом с ингибиторами. В другом варианте осуществления субъект страдает гемофилией C и является субъектом с ингибиторами.

В одном варианте осуществления введение субъекту средства двухцепочечной RNAi вызывает увеличение свертываемости крови и/или уменьшает накопление белка Serpinc1.

В одном варианте осуществления способы дополнительно предусматривают измерение уровней тромбина у субъекта.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить подкожно или внутривенно.

В одном варианте осуществления по существу все нуклеотиды антисмысловой нити и по существу все нуклеотиды смысловой нити средства RNAi содержат модификацию, выбираемую из группы, состоящей из 2'-O-метил модификации и 2'-фтор модификации. В одном варианте осуществления все нуклеотиды смысловой нити и все нуклеотиды антисмысловой цепи средства RNAi являются модифицированными нуклеотидами.

В одном варианте осуществления мотив YYY возникает на участке расщепления смысловой нити или около него.

В одном варианте осуществления мотив Y'Y'Y' возникает в позициях 11, 12 и 13 антисмысловой нити от 5'-конца.

Двухцепочечная область может составлять 15-30 нуклеотидных пар в длину, 17-23 нуклеотидных пар в длину, 17-25 нуклеотидных пар в длину, 23-27 нуклеотидных пар в длину,19-21 нуклеотидных пар в длину или 21-23 нуклеотидных пар в длину.

Каждая нить может иметь 15-30 нуклеотидов или 19-30 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления смысловая нить имеет всего 21 нуклеотид, и антисмысловая нить имеет всего 23 нуклеотида.

В одном варианте осуществления лиганд представляет собой

.

В одном варианте осуществления лиганд прикреплен к 3'-концу смысловой нити.

В одном варианте осуществления средство RNAi конъюгируют с лигандом, как показано в следующей схеме

при этом X представляет собой O или S.

В одном варианте осуществления пара оснований в 1 позиции 5'-конца антисмысловой нити дуплекса представляет собой пару оснований AU.

В одном варианте осуществления средство RNAi представляет собой AD-57213 ((Смысловой (от 5' к 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf (SEQ ID NO:13); Антисмысловой (от 5' к 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14), при этом A, c, g и u представляют собой A, C, G или U рибозы; a, c, g и u представляют собой 2'-O-метил (2'-OMe) A, C, G или U; Af, Cf, Gf или Uf представляют собой 2'-фтор A, C, G или U; и s представляет собой тиофосфатную связь)).

В одном варианте осуществления средство вводят в виде фармацевтической композиции. В одном варианте осуществления средство RNAi вводят в незабуференном растворе, таком как солевой раствор или вода.

В другом варианте осуществления миРНК вводят с буферным раствором, таким как буферный раствор, содержащий ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).

В одном аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту фиксированной дозы от приблизительно 25 мг до приблизительно 100 мг средства двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (RNAi), при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем антисмысловая нить содержит область комплементарности, которая содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO: 15), при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, прикрепленным к 3'-концу смысловой нити.

В другом аспекте в настоящем изобретении предоставлены способы лечения субъекта, имеющего расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1. Способы предусматривают введение субъекту фиксированной дозы от приблизительно 25 мг до приблизительно 100 мг средства двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (RNAi), при этом средство двухцепочечной RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем антисмысловая нить содержит область комплементарности, которая содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличаясь не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO: 15), при этом по существу все нуклеотиды смысловой нити и по существу все нуклеотиды антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, и при этом средство двухцепочечной RNAi содержит лиганд, например, смысловую нить средства двухцепочечной RNAi конъюгируют с лигандом, прикрепленным к 3'-концу смысловой нити.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить субъекту в двух или более дозах.

В некоторых вариантах осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту один раз в месяц, однократно каждые пять недель, каждые шесть недель, однократно каждые семь недель, каждые 2 месяца, каждые три месяца или при необходимости.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту один раз в месяц. В другом варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту каждые шесть недель. В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту каждые 2 месяца. В другом варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту каждые три месяца.

Средство двухцепочечной RNAi можно вводить субъекту в виде, например, фиксированной дозы, составляющей между приблизительно 25 мг и приблизительно 100 мг, например, между приблизительно 25 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 75 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 70 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 60 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 50 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 50 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 80 мг, между приблизительно 60 мг и приблизительно 100 мг, между приблизительно 60 мг и приблизительно 90 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 55 мг, между приблизительно 25 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 75 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 30 мг и приблизительно 55 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 95 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 85 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 75 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 65 мг, между приблизительно 40 мг и приблизительно 55 мг, или между приблизительно 45 мг и приблизительно 95 мг.

В некоторых вариантах осуществления средство двухцепочечной RNAi можно вводить в виде фиксированной дозы, составляющей приблизительно 25 мг, приблизительно 30 мг, приблизительно 35 мг, приблизительно 40 мг, приблизительно 45 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно 55 мг, приблизительно 60 мг, приблизительно 65 мг, приблизительно 70 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 80 мг, приблизительно 85 мг, приблизительно 90 мг, приблизительно 95 мг или приблизительно 100 мг.

В некоторых вариантах осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту в виде фиксированной дозы, составляющей приблизительно 25 мг; или в виде фиксированной дозы, составляющей приблизительно 50 мг; или в виде фиксированной дозы, составляющей приблизительно 80 мг; или в виде фиксированной дозы, составляющей приблизительно 100 мг.

В одном варианте осуществления средство двухцепочечной RNAi вводят субъекту подкожно.

В одном варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту снижает у субъекта активность Serpinc1 на от приблизительно 70% до приблизительно 95%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 90%, от приблизительно 90% до приблизительно 95% или более чем на 95%.

В другом варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту повышает пиковые уровни тромбина у субъекта до диапазона пиковых уровней тромбина у субъекта, у которого нет расстройства, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1.

В одном варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту достаточно для доведения пиковых уровней выработки тромбина у субъекта до приблизительно такого же уровня, который достигается посредством введения субъекту фактора VIII.

В другом варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту достаточно для достижения пиковых уровней выработки тромбина выше, чем приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, или выше, чем приблизительно 60% у субъекта.

В другом варианте осуществления введение дозы средства двухцепочечной RNAi субъекту уменьшает частоту кровотечений в год (ABR) у субъекта на от приблизительно 80% до приблизительно 95%, от приблизительно 80% до приблизительно 85%, от приблизительно 85% до приблизительно 90% или от приблизительно 90% до приблизительно 95% по сравнению со средней анамнестической зарегистрированной ABR у субъектов, имеющих расстройство, которому могло бы помочь снижение экспрессии Serpinc1, которым не вводили средство двухцепочечной RNAi.