СПОСОБ МИКРОРАЗБАВЛЕНИЯ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНОЙ ИНГИБИРУЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ Российский патент 2021 года по МПК A61K38/12 C12Q1/18 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к компонентам, способам анализа и способам оценки антибактериальной эффективности и определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) полипептидов, в том числе полипептидов-лизинов, уничтожающих бактерии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Развитие бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, является одной из значительных проблемой в медицине ввиду возрастания количества антибиотиков, применяемых при широком спектре заболеваний и других состояний. Новые подходы к антимикробной терапии включают антибиотики на основе ферментов («энзибиотики»), например, лизины бактериофагов. Фаги используют эти лизины для гидролиза клеточной стенки бактерий-хозяев, приводящего к высвобождению потомства вируса за счет гипотонического лизиса. Высокая летальная активность лизинов против грамположительных патогенных организмов делает их привлекательными кандидатами для разработки терапевтических средств (Fischetti, V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400; Nelson, D.L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112). Лизины бактериофагов исходно были предложены для устранения носительства патогенных стрептококков в носоглотке (Loeffler, J.М. et al. (2001) Science 294: 2170-2172; Nelson, D. et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112).

[0003] Установлено, что литические ферменты бактериофагов можно применять в оценке и специфическом лечении различных видов инфекций у субъектов с использованием различных путей введения. Например, патент США 5604109 (Fischetti et al.) относится к быстрому обнаружению стрептококков группы А в клинических образцах посредством ферментативного гидролиза полуочищенным ферментом-лизином, ассоциированным с фагом стрептококков группы С. Действие этого фермента легло в основу дополнительных исследований, приведших к разработке способов лечения заболеваний. В патентах Fischetti и Loomis (патентах США 5985271, 6017528 и 6056955) описано применение фермента-лизина, продуцируемого бактериями-стрептококками группы С, инфицированными бактериофагом С1. В патенте США 6248324 (Fischetti and Loomis) описана композиция для лечения дерматологических инфекций за счет применения литического фермента в носителе, подходящем для наружного нанесения на кожные ткани. В патенте 6254866 (Fischetti, Loomis) описан способ лечения бактериальных инфекций пищеварительного тракта, включающий введение литического фермента, специфического по отношению к бактерии, вызвавшей инфекцию. В патенте США 6264945 (Fischetti, Loomis) описаны способ и композиция для лечения бактериальных инфекций путем парентерального введения (внутримышечно, подкожно или внутривенно) по меньшей мере одного литического фермента, продуцируемого бактерией, инфицированной бактериофагом, специфичным по отношению к указанной бактерии, и соответствующего носителя для доставки литического фермента в организм пациента.

[0004] В патенте США 7402309, 7638600 и опубликованной заявке РСТ WO 2008/018854 предложены отдельные фаг-ассоциированные литические ферменты, используемые в качестве антибактериальных агентов для лечения или ослабления инфекции Bacillus anthracis. В патенте США 7569223 описаны литические ферменты для Streptococcus pneumoniae. Лизин, подходящий для Enterococcus (Е. faecalis и Е. faecium, в том числе ванкомицин-резистентных штаммов), описан в патенте США 7582291. В US 2008/0221035 описаны мутантные лизины Ply GBS, характеризующиеся высокой эффективностью в уничтожении стрептококков группы В. Химерный лизин, обозначенный как ClyS, обладающий активностью против бактерий-стафилококков, в том числе Staphylococcus aureus, подробно описан в WO 2010/002959. Лизин PlySs2, выделенный из Streptococcus suis и эффективно уничтожающий штаммы Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus и Listeria, описан в WO 2012/145630 и патенте США 9034322.

[0005] Лизин PlySs2 (CF-301) представляет собой первый лизин, для которого были начаты и завершены клинические исследования I фазы, разрешенные FDA (Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США). Лизины можно комбинировать с антибиотиками (например, ванкомицином или даптомицином), стандартно применяемыми для лечения инфекций кровотока, в том числе эндокардита, вызываемых метициллин-чувствительным и резистентным Staphylococcus aureus. Для поддержки клинических исследований в целях оценки и стандартизации бактериальных агентов используют анализ чувствительности к антибиотикам (AST) in vitro.

[0006] Для анализа активности лизина, например, PlySs2/CF-301, против изолятов S. aureus можно применять микроразбавление в жидкой среде (бульоне) (BMD), хотя стандартный способ (методология CLSI) не является надежным анализом и демонстрирует различные проблемы при использовании для анализа такого литического полипептида, как PlySs2 (CF-301). Эти проблемы включают эффект переноса, несовпадение или отклонение от результатов анализа чувствительности в крови, сыворотке или плазме человека и потерю активности фермента в панелях разбавленных замороженных препаратов.

[0007] Ввиду недостатков и проблем, ассоциированных со стандартными способами микроразбавления в жидкой среде для оценки антибактериальных агентов, например, полипептидов-лизинов, в данной области техники существует потребность в достоверном, надежном и воспроизводимом способе оценки чувствительности бактерий в анализе in vitro, которые можно применять для клинического тестирования и оценки, надлежащим образом имитирующих активность и эффекты in vivo.

[0008] Источники, цитируемые в настоящем документе, не следует интерпретировать в качестве признания того, что они являются предшествующим уровнем техники по отношению к настоящему изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящая заявка относится к модифицированным способам и анализам (тест-системам), в которых применяются уникальные компоненты для определения минимальной ингибирующей концентрации и оценки эффективности пептидов в уничтожении бактерий, в частности, пептидов, эффективно действующих против бактерий, в частности, литических пептидов.

[00010] Настоящее изобретение относится к предложенным системе или анализу для определения МИК антибактериального пептида, в частности, литического пептида, причем указанный анализ выполняют с применением среды или жидкой среды с добавлением сыворотки млекопитающего и восстановителя. В одном аспекте настоящего изобретения предложен анализ для определения эффективности антибактериального пептида в уничтожении бактерий, точно отражающего эффективность антибактериального пептида, например, литического пептида или лизина, в уничтожении бактерий в организме млекопитающего или пациента, в частности, человека.

[00011] В соответствии с настоящим изобретением предложен способ определения активности антибактериального пептида, например, литического пептида или лизина, в уничтожении бактерий, причем активность, связанная с уничтожением, точно имитирует уничтожение бактерий указанным антибактериальным пептидом в организме человека, включающий оценку антибактериального пептида в жидкой среде с добавлением сыворотки животного и восстановителя. В одном аспекте настоящего изобретения антибактериальный пептид, такой как, литический полипептид или лизин, оценивают по отношению к чувствительной бактерии в жидкой среде с добавлением сыворотки крови лошади, сыворотки крови собаки, сыворотки крови кролика или сыворотки крови мыши и восстановителя. В одном аспекте настоящего изобретения антибактериальный пептид, такой как, литический полипептид или лизин, оценивают по отношению к чувствительной бактерии в жидкой среде с добавлением сыворотки крови лошади и восстановителя.

[00012] В соответствии с настоящим изобретением предложен модифицированный и улучшенный способ и анализ с микроразбавлением в жидкой среде (BMD) для тестирования пептидов, в частности, пептидов с антибактериальным действием, в частности, литических пептидов или пептидов-лизинов. В одном аспекте настоящего изобретения предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлены сыворотка крови млекопитающего и восстановители.

[00013] В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови животного. В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови позвоночного. В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови млекопитающего. В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка животного, выбранная из сыворотки крови лошади, сыворотки крови человека, сыворотки крови собаки, сыворотки крови кролика, сыворотки крови мыши, сыворотки крови крупного рогатого скота. В одном аспекте предложен способ микроразбавления в жидкой среде (BMD) с применением среды или жидкой среды, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови животного, выбранная из сыворотки крови лошади, сыворотки крови собаки, сыворотки крови кролика, сыворотки мыши, сыворотки крупного рогатого скота. В одном аспекте предложен способ микроразбавления в жидкой среде (BMD) с применением в среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови лошади.

[00014] В одном аспекте способа BMD согласно настоящему изобретению в среду или жидкую среду добавлены сыворотка крови млекопитающего и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавлены сыворотка крови лошади и восстановитель. В одном аспекте восстановитель представляет собой DL-дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте восстановитель представляет собой гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР).

[00015] В одном аспекте в среду или жидкую среду, подходящую для роста бактерий, добавлены сыворотка крови млекопитающего и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду с откорректированным катионным составом добавлены крови млекопитающего и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду с откорректированным катионным составом добавлены сыворотка крови лошади и восстановитель. В одном аспекте восстановитель представляет собой DL-дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте восстановитель представляет собой гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР).

[00016] Количество добавляемой сыворотки можно определить путем сравнения с сывороткой крови человека. Количество добавляемой сыворотки может составлять от 10% сыворотки до 80% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 10% сыворотки до 60% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 10% сыворотки до 50% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 15% сыворотки до 40% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 15% сыворотки до 30% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 20% сыворотки до 30% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять приблизительно 25% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет от 20% сыворотки до 30% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет приблизительно 25% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет 25% сыворотки животного. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет приблизительно 25% сыворотки крови лошади.

[00017] В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют сыворотку лошади и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют приблизительно от 20% до 30% сыворотки крови лошади и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют приблизительно 25% сыворотки крови лошади и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют 25% сыворотку лошади и восстановитель. В одном аспекте в жидкую среду с откорректированным катионным составом добавляют сыворотку лошади и восстановитель. В одном аспекте в жидкую среду с откорректированным катионным составом добавляют приблизительно от 20% до 30% сыворотки крови лошади и восстановитель. В одном аспекте в жидкую среду с откорректированным катионным составом добавляют 25% сыворотку лошади и восстановитель.

[00018] В одном аспекте в среду или жидкую среду, подходящую для роста (выращивания) бактерий, добавляют 25% сыворотку млекопитающего и дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте в жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) добавляют 25% сыворотку лошади и дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте в жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) добавляют 25% сыворотку лошади и гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР). В одном аспекте в жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) добавляют 25% сыворотку лошади и 0,5 мМ DL-дитиотрейтола (ДТТ).

[00019] В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 10 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 5 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 2 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 1 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 0,9 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,2 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,3 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,4 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет приблизительно 0,5 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,25 мМ до 1 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет менее 1 мМ.

[00020] В одном варианте реализации анализ и способ согласно настоящему изобретению применяют при оценке и анализе литического полипептида. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для определения эффективности уничтожения бактерий литическим полипептидом, активным против бактерий Streptococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для определения эффективности уничтожения бактерий литическим полипептидом, активным против бактерий Streptococcus и Staphylococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида, активного против бактерий Streptococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида, активного против бактерий Staphylococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида, активного против бактерий Streptococcus и Staphylococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида против грамположительных бактерий. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида против более чем одного вида грамположительных бактерий. Грамположительные бактерии можно выбирать из бактерий Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus и Listeria.

[00021] В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, например, в том числе, полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против грамположительных бактерий. В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, в том числе полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против бактерий, устойчивых к антибиотикам. В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, в том числе полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против бактерий Streptococcus и Staphylococcus. В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, в том числе полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против бактерий Streptococcus и/или Staphylococcus, устойчивых к антибиотикам. В одном аспекте литический полипептид представляет собой PlySs2 или его производное или вариант. В одном аспекте полипептид содержит последовательность, представленную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1).

[00022] Добавление сыворотки млекопитающего, например, сыворотки крови лошади, соответствует результатам, описанным в настоящем документе и указывающим, что пептид, в частности, литический полипептид, в частности, типичный литический полипептид PlySs2, более активен в сыворотке/крови человека (а также некоторых других видов млекопитающих, в том числе лошади), чем просто в среде или жидкой среде, применяемой в анализе. Обнаружено, что полипептид, в частности, литический полипептид, в частности, типичный литический полипептид PlySs2, значительно более активен в сыворотке/крови человека (а также некоторых других видов млекопитающих, в том числе лошади), чем в жидкой среде с откорректированным катионным составом без добавления сыворотки. Антибактериальный полипептид, в частности, типичный литический полипептид PlySs2, более активен (в частности, в 32-64 раза более активен) в сыворотке/крови человека (а также некоторых других видов млекопитающих в том числе, лошади), чем в жидкой среде, например, жидкой среде с откорректированным катионным составом без добавления сыворотки. При добавлении в СА-МНВ в 25% концентрации сыворотка лошади предотвращает эффект переноса и позволяет получить значения МИК, практически идентичные значениям, полученным в 100% сыворотке человека. Добавление ДТТ применяется для стабилизации полипептида-лизина и позволяет использовать замороженные панели для микроразбавления в жидкой среде для определения МИК. ДТТ представляет собой распространенный восстановитель, используемый для предотвращения окисления и инактивации ферментов при хранении или в условиях анализов in vitro.

[00023] В одном аспекте настоящего изобретения лизин бактериофага, полученный из бактерий Streptococcus или Staphylococcus, применяют в способах и композициях согласно настоящему изобретению. Типичный(е) полипептид(ы)-лизин(ы) для применения в настоящем изобретении, в частности, лизин PlySs2, предложенный в настоящем документе и на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1), демонстрируют уникальную широкую активность, позволяющую уничтожать различные бактерии, в частности, грамположительные бактерии, в том числе штаммы бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus и Listeria. В одном из аспектов лизин PlySs2 может уничтожать штаммы Staphylococcus aureus и бактерий, как показано в настоящем документе. В одном из аспектов лизин PlySs2 может уничтожать штаммы бактерий Staphylococcus и Streptococcus. PlySs2 эффективен против устойчивого к антибиотикам Staphylococcus aureus, например, устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), устойчивого к ванкомицину Staphylococcus aureus (VRSA), устойчивого к даптомицину Staphylococcus aureus (DRSA) и устойчивого к линезолиду Staphylococcus aureus (LRSA). PlySs2 эффективен против умеренно чувствительного к ванкомицину Staphylococcus aureus (VISA).

[00024] Выделенный полипептид-лизин PlySs2 может содержать аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 1, или ее варианты, обладающие по меньшей мере 80% идентичностью, 85% идентичностью, 90% идентичностью, 95% идентичностью или 99% идентичностью по отношению к полипептиду, изображенному на фигуре 1, и эффективно уничтожает грамположительные бактерии. Выделенный полипептид-лизин PlySs2 может содержать аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 1, или ее варианты, обладающие по меньшей мере 80% идентичностью, 85% идентичностью, 90% идентичностью, 95% идентичностью или 99% идентичностью по отношению к полипептиду, изображенному на фигуре 1, и эффективно уничтожает бактерии Staphylococcus и Streptococcus.

[00025] В любом из таких способов или в любых способах бактерии можно выбирать из Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus simulans, Streptococcus suis, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus equi, Streptococcus equi zoo, Streptococcus agalactiae (GBS), Streptococcus pyogenes (GAS), Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus группы G, Streptococcus группы E, Enterococcus faecalis и Streptococcus pneumonia.

[00026] В соответствии с любым из способов согласно настоящему изобретению бактерии могут являться бактериями, устойчивыми к антибиотикам. Бактерия может представлять собой устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), умеренно чувствительный к ванкомицину Staphylococcus aureus (VISA), устойчивый к ванкомицину Staphylococcus aureus (VRSA), устойчивый к даптомицину Staphylococcus aureus (DRSA) или устойчивый к линезолиду Staphylococcus aureus (LRSA). Чувствительные бактерии могут представлять собой клинически значимые или патогенные, в частности, для людей, бактерии. В одном аспекте способа(ов) полипептид(ы)-лизин(ы) эффективно уничтожает(ют) штаммы бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus и Listeria.

[00027] В дополнительном аспекте или варианте реализации способов и композиций, предложенных в настоящем документе, применяют другой отличающийся лизин, специфичный по отношению к стафилококкам, отдельно или в комбинации с лизином PlySs2, предложенным и описанным в настоящем документе. В одном из таких аспектов или вариантов реализации способов и композиций, предложенных в настоящем документе, применяют лизин ClyS, специфичный по отношению к стафилококкам, отдельно или в комбинации с лизином PlySs2, предложенным и описанным в настоящем документе.

[00028] Для специалистов в данной области техники после ознакомления со следующим описанием, снабженным ссылками на следующие иллюстративные изображения, станут очевидны другие объекты и преимущества.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[00029] На фигуре 1 показаны (А) аминокислотная последовательность полипептида-лизина PlySs2 (CF-301) с обозначенными остатками активного центра и структурой доменов, включая каталитический домен семейства CHAP и домен семейства SH3, связывающийся с клеточной стенкой; и (В) предсказанная 3-мерная структура (представление по I-TASSER).

[00030] На фигуре 2 показаны (А) мишень в клеточной стенке S. aureus; (В) расщепление связи D-Ala-L-Gly в пептидогликановой сетчатой структуре клеточной стенки стафилококков, необходимой для стабильности структуры (по материалам Capot-Chartier, Front Microbiol 22:2104); и (С) гидролиз клеточной стенки и осмотический лизис. На фигуре (С) показано, что гидролиз пептидогликана приводит к осмотическому лизису бактерий. На фигуре (С) приведены необработанная бактерия, бактерия через 15 секунд (15 с) после добавления CF-301 и через 15 минут обработки CF-301.

[00031] На фигуре 3 представлены примеры влияния переноса и крови при анализе BMD. (А) эффект переноса, или эффект Игла снижает точность определения МИК у MHBII. (В) Изображено влияние крови на штамм S. aureus. Сыворотку (HuS) и плазму крови (HuP) применяют следующим образом: HuS¹ = объединенная сыворотка мужчин с АВ, Innovative Research, Inc; HuS² = объединенная сыворотка здоровых людей, Innovative Research, Inc; HuS³ = сыворотка отдельного здорового человека, BioreclamationIVT; HuS⁴ = объединенная сыворотка мужчин с АВ, Sigma-Aldrich.

[00032] На фигуре 4 представлены результаты анализа чувствительности набора 30 штаммов S. aureus. Описаны проблемы, связанные с некоторыми способами анализа.

[00033] На фигуре 5 представлена таблица с результатами BMD-анализа PlySs2/CF301 с применением нового способа и 25% сыворотки крови лошади из 14 различных источников для оценки S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212.

[00034] На фигуре 6 представлена динамика определения МИК в замороженных образцах CF-301 с применением новой BMD-методологии.

[00035] На фигуре 7 представлен анализ МИК для штамма MRSA АТСС 29213 в различных условиях. (А) только MHBII (МИК=16 мкг/мл с легким эффектом переноса); (В) 100% сыворотка человека (МИК=1 мг/мл); и (С) MHBII, 25% сыворотка лошади, 0,5 мм ДТТ (МИК=0,5 мкг/мл).

[00036] На фигуре 8 представлен анализ МИК шиамма S. aureus АТСС 700699 в СА-МНВ с 25% сывороткой лошади и 0,5 мМ ДТТ (МИК=1 мкг/мл).

[00037] На фигуре 9 представлена оценка активности МИК CF-301 с применением BMD-методологии с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ по отношению к различным чувствительным грамположительным бактериям, в том числе MRSA, MSSA, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae и Enterococcus faecalis.

[00038] На фигуре 10 представлена активность ванкомицина согласно оценке с применением модифицированного способа BMD по сравнению со стандартной жидкой средой САМНВ без добавок. Выполнена оценка различных штаммов Staphylococcus aureus, в том числ штаммов MSSA и MRSA.

[00039] На фигуре 11 представлен анализ контроля качества определения МИК на основе анализа BMD с использованием МНВ II с 25% сывороткой лошади и 0,5 мМ ДТТ в течение 5 дней по отношению к (A) S. aureus АТСС 29213 и (В) Е. faecalis АТСС 29212. За несколько дней подряд проанализировали пять повторностей на штамм. Показано сравнение оценки в двух различных лабораториях - лаборатории 1 и лаборатории 2. Ванкомицин и оксациллин использовали в качестве контрольных агентов в СА-МНВ и СА-МНВ=2% физиологическом растворе, соответственно.

[00040] На фигуре 12 представлены исследования по поиску диапазона, в которых оценивали (А) различное количества добавляемой сыворотки крови лошади (от 12,5% до 30%) и (В) различные количества добавляемого восстановителя ДТТ (0-1 мМ). Количество обозначено либо более темным, либо светлым оттенком. Темный оттенок означает, что способ забракован из-за эффекта переноса, высоких значений МИК (в сравнении с сывороткой (HuS) или невозможности замораживания. Более светлый оттенок означает, что способ обеспечивает уровень активности, аналогичный активности в HuS.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[00041] В соответствии с настоящим изобретением можно применять стандартные методики молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинантных ДНК в пределах данной области техники. Такие методики описаны в литературе в полном объеме. См., например, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R.M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J.E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J.E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

[00042] Соответственно, в настоящем документе следующие термины должны соответствовать определениям, приведенным ниже.

[00043] Термины "лизин(ы) PlySs", "лизин PlySs2", "PlySs2", "CF-301", "CF301" и любые варианты, не перечисленные явным образом, могут использоваться в настоящем документе на равных основаниях, и на протяжении настоящей заявки и формулы изобретения относятся к белковому материалу, включая одиночные и множественные белки, и распространяется на белки с аминокислотной последовательностью, описанной в настоящем документе и представленной на фигуре 1 и в SEQ ID NO: 1, и профилями активности, представленными в настоящем документе и формуле изобретения. Соответственно, аналогичным образом рассматриваются белки с практически эквивалентной или модифицированной активностью. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, модификации, внесенные за счет сайт-специфического мутагенеза, или случайными, например, модификации, полученные за счет мутаций у организмов-хозяев, являющихся продуцентами комплекса или его указанных субъединиц. Кроме того, предполагается, что термины "лизин(ы) PlySs", "лизин PlySs2", "PlySs2", "CF-301", "CF301" охватывают белки, явным образом указанные в настоящем документе, а также их практически гомологичные аналоги, фрагменты и укороченные и аллельные модификации. Лизин PlySs2 описан в патенте США 9034322 и заявке РСТ PCT/US2012/34456. Gilmer et al также описали лизин PlySs2 (Gilmer DB et al (2013) Antimicrob Agents Chemother Epub 2013 April 9 [PMID 23571534]).

[00044] Термин "ClyS", "лизин ClyS" относится к химерному лизину ClyS, обладающему активностью против бактерий-стафилококков, в том числе Staphylococcus aureus, подробно описанному в WO 2010/002959, а также в статье Daniel et al (Daniel, A et al (2010) Antimicrobial Agents and Chemother 54(4):1603-1612). Типичная аминокислотная последовательность ClyS представлена в SEQ ID NO: 2.

[00045] Термин "литический фермент" или "литический полипептид» включает фермент, обладающий литической активностью по отношению к клеточной стенке бактерий, уничтожающий одну или более из бактерий в подходящих условиях и за соответствующее время. Примеры литических ферментов включают, без ограничения, различные амидазные ферменты, вызывающие лизис клеточной стенки. В частном аспекте литический фермент относится к литическому ферменту бактериофага. Термин "литический фермент бактериофага" относится к литическому ферменту, выделенному из бактериофага, или синтезированному литическому ферменту с аналогичной структурой, поддерживающему функционал литического фермента.

[00046] Литический фермент или литический полипептид могут специфическим образом расщеплять связи, присутствующие в пептидогликане или бактериальных клетках, разрушая клеточную стенку бактерий. Кроме того, в настоящее время принято считать, что пептидогликан клеточной стенки бактерий является высококонсервативным у большинства бактерий, и расщепление лишь нескольких связей может разрушить клеточную стенку бактерии. Примерами литических ферментов, расщепляющих эти связи, являются мурамидазы, глюкозаминидазы, эндопептидазы или N-ацетилмурамоил-L-аланинамидазы. Fischetti и др. (1974) сообщили, что фермент-лизин фага С1 стрептококков представлял собой амидазу. Garcia и др. (1987, 1990) сообщили, что лизин Cpl S. pneumoniae из фага Ср-l представлял собой лизоцим. Caldentey, Bamford (1992) сообщили, что литический фермент фага phi 6 Pseudomonas представлял собой эндопептидазу, расщепляющую пептидный мостик, образованный мелодиаминопимилиновой кислотой и D-аланином. Литические ферменты фага Т1 и Т6 Е. Coli представляют собой амидазы, как и литический фермент фага Listeria (ply) (Loessner et al, 1996). Кроме того, в данной области техники известны и другие литические ферменты, способные расщеплять клеточную стенку бактерий.

[00047] Термин "литический фермент, генетически кодируемый бактериофагом" включает полипептид, способный уничтожать бактерию-хозяина, например, обладающий по меньшей мере некоторой активностью, вызывающей лизис клеточной стенки, по отношению к бактерии-хозяину. Полипептид может содержать последовательность, охватывающую нативную последовательность литического фермента и ее варианты. Этот полипептид можно выделить из различных источников, например, бактериофага («фага»), или изготовить с помощью рекомбинантных способов или способов синтеза. Этот полипептид может, например, содержать холин-связывающий фрагмент со стороны С-конца, и может характеризоваться ферментативной активностью, способной расщеплять пептидогликан клеточной стенки (например, амидазной активностью, действующей на амидные связи пептидогликана), со стороны N-конца. Описаны литические ферменты, обладающие несколькими видами ферментативной активности, например, содержащими два ферментативных домена, например, лизин PlyGBS. Кроме того, описаны другие литические ферменты, содержащие только каталитический домен, и не содержащие домена, связывающего клеточную стенку.

[00048] Термин "литический фаг-ассоциированный фермент с нативной последовательностью" включает полипептид с такой же аминокислотной последовательностью, что и у фермента, происходящего из бактериального генома (т.е. профага). Такой фермент с нативной последовательностью можно выделить или получить рекомбинантным или синтетическим путем.

[00049] Термин «фермент с нативной последовательностью» охватывает природные формы (например, альтернативные сплайс-варианты или модифицированные формы) и природные варианты фермента. В одном варианте реализации настоящего изобретения фермент с нативной последовательностью представляет собой зрелый или полноразмерный полипептид, генетически кодируемый геном бактериофага, специфичного по отношению к Streptococcus suis. Разумеется, возможен и известен ряд вариантов, что подтверждается в публикациях, например, Lopez et al., Microbial Drug Resistance 3: 199-211 (1997); Garcia et al., Gene 86: 81-88 (1990); Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988); Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988); Garcia et al., Streptococcal Genetics (J.J. Ferretti and Curtis eds., 1987); Lopez et al., FEMS Microbiol. Lett. 100: 439-448 (1992); Romero et al., J. Bacteriol. 172: 5064-5070 (1990); Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164: 621-624 (1987) и Sanchez et al., Gene 61: 13-19 (1987). Содержание каждого из указанных источников, особенно списков последовательностей и связанного с ними текста, содержащего сравнение последовательностей, в том числе утверждения о гомологии последовательностей, специально включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

[00050] Термин "литический фермент с вариантной последовательностью" включает литический фермент, характеризующийся полипептидной последовательностью, отличающейся от последовательности литического фермента, но сохраняющий функциональную активность. В некоторых вариантах реализации литический фермент может генетически кодировать бактериофаг, специфичный по отношению к бактерии, например, в случае PlySs2, - Streptococcus suis, обладающий определенной аминокислотной последовательностью с последовательностью(ями) литического фермента, как типичный лизин PlySs2, предложенный в настоящем документе на фигуре 1. Например, в некоторых вариантах реализации функционально активный литический фермент может уничтожать бактерии Streptococcus suis и другие чувствительные бактерии, представленные в настоящем документе, в том числе путем разрушения клеточной стенки бактерий, как показано в настоящем документе. Активный литический фермент может характеризоваться 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к последовательности(ям) литического фермента, приведенным в настоящем документе на фигуре 1. Такие варианты фаг-ассоциированного литического фермента включают, например, полипептиды литических ферментов, в которых добавлены или удалены один или более аминокислотных остатков с N- или С-конца последовательности(ей) литического фермента, представленного на фигуре 1.

[00051] В частном аспекте фаг-ассоциированный литический фермент характеризуется по меньшей мере приблизительно 80% или 85% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к нативным последовательностям фаг-ассоциированных литических ферментов, в частности, по меньшей мере приблизительно 90% (например, 90%) идентичностью аминокислотной последовательности. Конкретнее, вариант фаг-ассоциированного литического фермента должен обладать по меньшей мере 95% (например, 95%) идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к нативной(ым)последовательности(ям) фаг-ассоциированного литического фермента. Типичная нативная фаговая последовательность лизина PlySs2 предложена на фигуре 1.

[00052] "Процент идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к последовательностям фаг-ассоциированных литических ферментов в настоящем документе определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в последовательности фаг-ассоциированного литического фермента после выравнивания последовательностей в одной той же рамке считывания и, при необходимости, внедрения разрывов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, без учета консервативных замен как части идентичности последовательностей.

[00053] Термин «полипептид» включает молекулу полимера, содержащую множество аминокислот, соединенных линейно. В некоторых вариантах реализации полипептид может соответствовать молекулам, кодируемым природной полинуклеотидной последовательностью. Полипептид может содержать консервативные замены, при которых природную аминокислоту замещают аминокислотой с аналогичными свойствами, причем такие консервативные замены не влияют на функцию полипептида.

[00054] Термин «модифицированные литические ферменты» включает перекомбинированные (shuffled) и/или химерные литические ферменты.

[00055] Обнаружено, что фаговые литические ферменты, специфичные по отношению к бактериям, инфицированным конкретным фагом, эффективно и успешно разрушают клеточную стенку рассматриваемой бактерии. Считается, что литический фермент не обладает протеолитической ферментативной активностью и поэтому не разрушает белки и ткани млекопитающих, присутствующие при гидролизе клеточной стенки бактерий. Кроме того, поскольку обнаружено, что действие литических ферментов, в отличие от антибиотиков, является специфичным по отношению к патогенному(ым) организму(ам)-мишени(ям), вероятно сохранение нормальной микрофлоры в практически интактном состоянии (М.J. Loessner, G. Wendlinger, S. Scherer, Mol Microbiol 16, 1231-41. (1995), полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки). Фактически, хотя лизин PlySs2 демонстрирует уникально широкий диапазон уничтожаемых видов и штаммов бактерий, он сравнительно неактивен, в особенности против бактерий, составляющих нормальную микрофлору, в том числе Е. coli, как описано в настоящем документе.

[00056] Литический фермент или полипептид для применения согласно настоящему изобретению может продуцироваться в организме бактерии после инфекции определенным бактериофагом, либо его можно продуцировать или получить рекомбинантным или синтетическим путем в качестве профилактического средства для защиты от заболевания лиц, подвергающихся воздействию других лиц с симптомами инфекции, или терапевтического средства для лиц, уже заболевших в результате данной инфекции. Поскольку в настоящем документе содержатся описание и ссылки на последовательности полипептидов-лизинов и нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды-лизины, литический(е) фермент(ы)/полипептид(ы) предпочтительно можно продуцировать с использованием выделенного гена литического фермента из фагового генома, помещая указанный ген в вектор переноса и клонируя указанный вектор переноса в системе экспрессии с применением стандартных способов, известных в данной области техники, в том числе способов, описанных в настоящем документе в качестве примеров. Литический(е) фермент(ы) или полипептид(ы) могут быть укороченными, химерными, перекомбинированными или «природными», и могут присутствовать в комбинации. Соответствующий патент США №5604109 полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. «Модифицированный» литический фермент можно получить различными способами. В предпочтительном варианте реализации ген модифицированного литического фермента из фагового генома помещают в вектор переноса или перемещаемый вектор, предпочтительно плазмиду, и указанную плазмиду клонируют в экспрессирующем векторе или системе экспрессии. Экспрессирующий вектор для продукции полипептида-лизина или фермента в соответствии с настоящим изобретением может подходить для Е. coli, Bacillus или ряда других подходящих бактерий. Система вектора также может представлять собой бесклеточную систему экспрессии. Все указанные способы экспрессии гена или набора генов известны в данной области техники. Литический фермент также можно получить, инфицировав Streptococcus suis бактериофагом, специфичным по отношению к Streptococcus suis, причем указанный по меньшей мере один литический фермент лизирует исключительно клеточную стенку указанного Streptococcus suis, оказывая минимально возможное действие на другую, например, природную или комменсальную присутствующую бактериальную микрофлору.

[00057] Биологически активные фрагменты белка или фрагмент пептида согласно вариантам реализации, описанные в настоящем документе, включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, в значительной мере идентичные аминокислотной последовательности белка-лизина согласно настоящему описанию или происходящие от нее, которые содержат меньшее количество аминокислот, чем полноразмерный белок-лизин, и демонстрируют по меньшей мере одну активность соответствующего полноразмерного белка. Обычно биологически активные фрагменты содержат домен или мотив, обладающий по меньшей мере одной активностью соответствующего белка. Например, как описано на фигуре 1, лизин PlySs2 содержит N-концевой домен CHAP и С-концевой домен SH3. Биологически активный фрагмент белка может представлять собой полипептид длиной, например, 10, 25, 50, 100 либо меньше или больше аминокислот. Кроме того, с помощью рекомбинантных технологий можно получить другие биологически активные фрагменты с удаленными или добавленными другими областями белка и оценить их на предмет одной или более функциональных активностей нативной формы полипептида согласно вариантам реализации настоящего изобретения.

[00058] В аминокислотные последовательности или нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды и лизины для применения в способах, описанных в настоящем документе, в том числе в последовательности лизина, приведенные на фигуре 1, или в активные фрагменты или их укороченные варианты можно внести мутации, например, заменить конкретный кодон на кодон, кодирующий другую аминокислоту, заменить аминокислоту на другую аминокислоту или удалить одну или более аминокислоту. Такую мутацию обычно вносят путем изменения минимально возможного количества аминокислот или нуклеотидов. Мутацию-замену этого типа можно внести, заменив аминокислоту в полученном белке неконсервативным образом (например, путем замены кодона аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот определенного размера или обладающей определенными характеристиками, аминокислотой, принадлежащей к другой группе) или консервативным образом (например, путем замены кодона аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот определенного размера или обладающей определенными характеристиками, аминокислотой, принадлежащей к той же группе). Такая консервативная замена обычно ведет к меньшим изменениям структуры и функции полученного белка. Неконсервативная замена с большей вероятностью влияет на структуру, активность или функцию полученного белка. Подразумевается, что настоящее изобретение включает последовательности, содержащие консервативные замены, не оказывающие существенного влияния на активность или характеристики связывания полученного белка.

[00059] У таких мутантов или их вариантов можно прогнозировать наличие функции, или тестировать их на предмет наличия функции или способности уничтожать бактерии, в том числе бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Listeria или Enterococcus, и/или наличия активности, сопоставимой с активностью лизина(ов), описанных и явным образом предложенных в настоящем документе. Таким образом, можно внести изменения в последовательность лизина и протестировать мутанты или варианты с изменениями в последовательности с использованием анализов и способов, описанных и приведенных в качестве примера в настоящем документе, в том числе в разделе «Примеры». Специалист в данной области техники на основании доменной структуры лизина(ов), описанного в настоящем документе, может указать одну или более, одну или несколько аминокислот, подходящих для замены, и/или одну или более аминокислот, не подходящих для замены, в том числе обоснованной консервативной или неконсервативной замены.

[00060] Лизин PlySs2 демонстрирует активность и способность уничтожать различные отдельные штаммы и виды грамположительнызх бактерий, в том числе бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Listeria или Enterococcus. Особенно важно, что PlySs2 активно уничтожает штаммы Staphylococcus, в том числе Staphylococcus aureus, в частности, как чувствительные, так и устойчивые к антибиотикам штаммы. PlySs2 также активно уничтожает штаммы Streptococcus и демонстрирует особенно эффективное уничтожение штаммов Streptococcus группы А и группы В. Антибактериальная активность лизина PlySs2 отображена ниже в таблице 1 на основании логарифмических оценок способности к уничтожению выделенных штаммов in vitro. Чувствительные бактерии, представленные в настоящем документе, можно использовать в модифицированных способах BMD согласно настоящему изобретению для определения и сравнения значений МИК.

[00061] Термин «содержать» в общем случае используется в смысле «включать», другими словами, допускает наличие одного или более признаков или компонентов.

[00062] Термин "состоящий главным образом из" относится к продукту, в частности, пептидной последовательности с заданным количеством остатков, не являющейся ковалентно присоединенной к более крупному продукту. В случае пептида согласно настоящему изобретению специалисты в данной области техники поймут, что можно учитывать незначительные модификации на N- или С-конце пептида, например, химические модификации концевой области с целью добавления защитной группы и т.п., например, амидирование С-конца.

[00063] Термин "выделенный" («изолированный») относится к состоянию, в котором находятся полипептид(ы)-лизин(ы) согласно настоящему изобретению или нуклеиновая кислота, кодирующая такие полипептиды, в соответствии с настоящим изобретением. Полипептиды и нуклеиновая кислота не буду содержать или практически не будут содержать материал, с которым они ассоциированы в естественном окружении или окружении, в котором происходит их получение (например, культуре клеток), если такое получение осуществляют с помощью технологии рекомбинантных ДНК in vitro или in vivo. Полипептиды и нуклеиновая кислота могут быть включены в состав с разбавителями или адьювантами, и для практических целей могут быть выделенными, например, полипептиды обычно смешивают с полимерами или мукоадгезивными агентами или другими носителями либо, при применении в диагностических и терапевтических целях, с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями.

[00064] Терапевтические или фармацевтические композиции, содержащие литический(е) фермент(ы)/полипептид(ы) для применения в способах и вариантах применения согласно настоящему изобретению, можно применять в способах или включать в способы, описанные в настоящем документе. Терапевтические или фармацевтические композиции могут содержать один или более литических полипептидов и необязательно содержат природные, укороченные, химерные или перекомпонованные литические ферменты в комбинации с одним или более антибиотиками и, необязательно, в комбинации с подходящими вспомогательными веществами, носителями или основами. Настоящее изобретение включает оценку терапевтических композиций или фармацевтических композиций лизинов, в том числе PlySs2, в комбинации с антибиотиком для применения в уничтожении, смягчении, деколонизации, профилактике или лечении заболеваний, вызванных грамположительными бактериями, в том числе бактериальных инфекций или состояний, имеющих к ним отношение. Настоящее изобретение включает оценку терапевтических композиций или фармацевтических композиций лизинов, в том числе PlySs2, в комбинации с ванкомицином, линезолидом или даптомицином.

[00065] Фермент(ы) или полипептид(ы), включенные в терапевтические композиции, могут представлять собой одну или более или любую комбинацию немодифицированных фаг-ассоциированных литических ферментов, укороченных литических полипептидов, вариантных литических полипептидов и химерных и/или перекомбинированных литических ферментов. Кроме того, для лечения заболевания, вызванного одной и той же бактерией, можно применять различные литические полипептиды, генетически кодируемые различными фагами. Эти литические ферменты также могут представлять собой любую комбинацию «немодифицированных» литических ферментов или полипептидов, укороченных литических полипептидов, вариантных литических полипептидов и химерных и/или перекомбинированных литических ферментов. Литический(е) фермент(ы)/полипептид(ы) в терапевтической или фармацевтической композиции для грамположительных бактерий, в том числе Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus и Listeria, можно применять по отдельности или в комбинации с антибиотиками или, в случае обработки других инвазивных организмов-бактерий, в комбинации с другими фаг-ассоциированными литическими ферментами, специфичными по отношению к другим бактериям-мишеням. Литический фермент, укороченный фермент, вариантный фермент, химерный фермент и/или перекомбинированный литический фермент можно применять в сочетании с холиновым белком. Количество холинового белка также может меняться. В терапевтическую композицию с ферментом(ами) или полипептидом(ами) в присутствии лизостафина или без него можно необязательно включать различные антибиотики. В терапевтическую композицию можно включать более одного литического фермента или полипептида.

[00066] Фармацевтическая композиция также может содержать один или более из модифицированных литических ферментов, в том числе их изозимов, аналогов или вариантов, полученных путем химического синтеза или технологии рекомбинантных ДНК. В частности, модифицированный литический белок можно продуцировать посредством аминокислотной замены, делеции, укорачивания, химеризации, перекомбинирования или их комбинаций. Фармацевтическая композиция может содержать комбинацию одного или более природных литических белков и один или более из укороченных, вариантных, химерных или перекомбинированных литических белков. Фармацевтическая композиция также может содержать пептид или пептидный фрагмент по меньшей мере одного литического белка, происходящего от того же или другого вида бактерий, с необязательным добавлением одного или более из дополняющих агентов, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

[00067] Терапевтические или фармацевтические композиции могут содержать литический(е) полипептид(ы) в комбинации с различными носителями для лечения заболеваний, вызванных чувствительными грамположительными бактериями. Носитель в соответствующих случаях содержит небольшие количества добавок, например, веществ, повышающих изотоничность и химическую стабильность. Такие материалы нетоксичны для реципиента в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферные вещества, например, фосфат, цитрат, сукцинат, уксусную кислоту и другие органические кислоты и их соли; антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (содержащие менее десяти остатков) полипептиды, например, полиаргинин, или трипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; глицин; аминокислоты, например, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, гистидин или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу, трегалозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; сахароспирты, например, маннит или сорбит; противоионы, например, натрия; неионогенные ПАВ, например, полисорбаты, полоксамеры или полиэтиленгликоль (ПЭГ); и/или нейтральные соли. Глицерин (1,2,3-пропантриол) доступен для приобретения в целях фармацевтического применения. ДМСО представляет собой апротонный растворитель с выраженной способностью усиливать проникновение многих местно наносимых лекарственных средств. Носитель-основа также может включать раствор Рингера, буферный раствор и раствор декстрозы, в частности, когда готовят раствор для внутривенного введения.

[00068] Литический фермент/полипептид должен находиться в среде с рН, обеспечивающим активность литического фермента/полипептида. Оптимальную активность литического фермента/полипептида может обеспечивать стабилизирующий буфер. Стабилизирующий буфер также может представлять собой или содержать хелатирующий реагент, например, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, а также может содержать фосфатный или цитрат-фосфатный буфер или другой подходящий буфер.

[00069] Термин «агент» означает любую молекулу, включая полипептиды, антитела, полинуклеотиды, химические соединения и низкомолекулярные соединения. В частности, термин «агент» включает такие соединения, как исследуемые соединения, дополнительные соединения или соединения ферментов-лизинов.

[00070] Термин «агонист» относится к лиганду, стимулирующему рецептор, с которым связывается лиганд, в самом широком смысле.

[00071] Термин «анализ» означает любой процесс, используемый для измерения специфического свойства соединения. «Скрининговый анализ» означает процесс, используемый для изучения или выбора соединений из набора соединений на основании их активности.

[00072] Термин «предотвращение» относится к снижению риска возникновения или развития заболевания или нарушения (т.е. подавлению развития по меньшей мере одного из клинических симптомов заболевания) у субъекта, который может подвергаться воздействию болезнетворного агента или быть предрасположен к заболеванию, до начала заболевания.

[00073] Термин «профилактика» связан с термином «предотвращение» и включен в него, и относится к мере или процедуре, целью которой является предотвратить, а не лечить или излечивать заболевание. Неограничивающие примеры профилактических мер могут включать введение вакцин, введение низкомолекулярного гепарина пациентам в стационаре, подвергающимся риску тромбоза вследствие, например, иммобилизации; и введение средства против малярии, например, хлорохина, заранее до посещения географической области, где малярия является эндемичным заболеванием или где высок риск контакта с малярией.

[00074] «Терапевтически эффективное количество» означает количество лекарственного средства, соединения, антимикробного агента, антитела, полипептида или фармацевтического агента, которое должно вызвать биологическую или медицинскую реакцию у субъекта, ожидаемую врачом или другим практикующим медицинским работником. В частности, считается, что термин «эффективное количество» по отношению к инфекциям, вызванным грамположительными бактериями, и росту грамположительных бактерий включает эффективное количество соединения или агента, которое должно вызвать приблизительно биологически значимое количественное или качественное ослабление инфекции, вызванной грамположительными бактериями, в том числе за счет бактерицидного и/или бактериостатического действия. Фраза «терапевтически эффективное количество» используется в настоящем документе для обозначения количества, достаточного для профилактики, и, предпочтительно, снижения по меньшей мере на приблизительно 30 процентов, более предпочтительно - по меньшей мере на 50 процентов, наиболее предпочтительно - по меньшей мере на 90 процентов, клинически значимого изменения роста или количества инфекционных бактерий, или другой особенности патологического процесса, например, лихорадки или повышенного количества лейкоцитов, которая может реагировать на его присутствие и активность.

[00075] Термин «лечение» любого заболевания или инфекции в одном варианте реализации относится к облегчению заболевания или инфекции (т.е. блокировке заболевания или роста инфекционного агента или бактерии или снижению проявления, степени или тяжести по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В еще одном варианте реализации термин «лечение» относится к облегчению по меньшей мере одного физического параметра, которое может быть незаметно для субъекта. В еще одном варианте реализации термин «лечение» относится к модификации заболевания или инфекции на физическом (например, путем стабилизации заметного симптома), физиологическом (например, путем стабилизации физического параметра) или обоих уровнях. В дополнительном варианте реализации термин «лечение» имеет отношение к замедлению прогрессирования заболевания или ослаблению инфекции.

[00076] Термины «грамположительные бактерии», «грамположительный» и любые их варианты, не указанные конкретно, могут использоваться в настоящем документе на равных основаниях, и на протяжении всей заявки и формулы изобретения относятся к грамположительным бактериям, которые известны или могут быть выявлены по присутствию определенных характеристик клеточной стенки и/или клеточной мембраны и/или посредством окрашивания по Граму. Грамположительные бактерии известны и легко определяются; их можно выбрать, в числе прочего, из родов Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium и Clostridium, включая их всевозможные известные или неизвестные виды или штаммы. В одном аспекте настоящего изобретения грамположительные бактерии, чувствительные к лизину PlyS, включают бактерии, выбранные из одного или более представителей Listeria, Staphylococcus, Streptococcus и Enterococcus.

[00077] Грамположительные бактерии окружены клеточной стенкой, содержащей полипептиды и полисахарид. Грамположительные бактерии включают роды Actinomyces, Bacillus, Listeria, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium и Clostridium, но не ограничиваются ими. Обладающие медицинским значением виды включают Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis. Виды Bacillus, являющиеся спорообразующими бактериями, вызывают сибирскую язву и гастроэнтерит. Спорообразующие виды Clostridium вызывают за ботулизм, столбняк, газовую гангрену и псевдомембранозный колит. Виды Corynebacterium вызывают дифтерию, а виды Listeria - менингит.

[00078] Термин «бактерицидный» относится к способности уничтожать клетки бактерий.

[00079] Термин «бактериостатический» относится к способности ингибировать рост бактерий, в том числе ингибировать растущие клетки бактерий.

[00080] Фраза «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным структурам и композициям, которые физиологически переносятся и при введении человеку обычно не вызывают аллергических или аналогичных нежелательных реакций, например, расстройства желудка, головокружения и т.п.

[00081] Термин "восстановитель" относится к и включает вещество, вызывающее восстановление другого вещества и окисляющееся в ходе этого процесса. Восстановитель можно использовать для поддержания ферментов или белков в восстановленном состоянии и предотвращения их окисления. В одном аспекте восстановитель поддерживает стабильность полипептида или фермента, в том числе при хранении в течение определенного времени или в различных условиях.

[00082] Специалисту в данной области техники должны быть известны общепризнанные восстановители, в частности, применяемые и общепринятые для применения при анализах, в том числе клинических анализах. Примеры восстановителей включают дитиотрейтол (ДТТ), гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), Алюмогидрид лития (LiAlH₄), Боргидрид натрия (NaBH₄), диборан, бета-меркаптоэтанол (БМЭ) и Гидрид диизобутилалюминия (DIBAL-H).

[00083] Жидкая среда или среда, подходящая для использования и применения в способах и анализах согласно настоящему изобретению, включает жидкую среду или среду для роста и поддержания бактерий, общепринятую и известную специалисту в данной области техники, или любую среду общего назначения, которую можно применять при культивировании широкого спектра микроорганизмов и включает жидкую среду или среду, используемую и/или описанную в настоящем документе, но не ограничивается ими Типичная жидкая среда или среда включает жидкую среду с откорректированным катионным составом, подходящую для количественных процедур анализа чувствительности к антимикробным средствам.

[00084] Настоящее изобретение можно лучше понять, обратившись к следующим неограничивающим примерам, приведенным в качестве примеров реализации изобретения. Следующие примеры приведены с целью более полной иллюстрации предпочтительных вариантов реализации изобретения, их никоим образом не следует интерпретировать как ограничивающие сущность настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

[00085] Лизины представляют собой антимикробные ферменты, предлагаемые в качестве новой альтернативы общепринятым антибиотикам. Лизины представляют собой белки, кодируемые бактериофагами и используемые для уничтожения бактерий в естественных условиях. В биосфере существует приблизительно 10³¹ фагов, и фаги ежедневно уничтожают приблизительно одну треть всех бактерий с использованием семейства белков-лизинов - основного средства уничтожения бактерий-хозяев (Hatful GF (2015) J Virol 89(16):8107-8110). Очищенные лизины демонстрируют явление, называемое "лизис извне" (Fischetti VA et al (20016) Nature Biotechnology 24:1508-1511) и могут быть получены с помощью рекомбинантных способов синтеза. Очищенные лизины демонстрируют мощное бактериолитическое действие при контакте за счет гидролиза клеточной стенки. Полипептиды-лизины обычно представляют собой белки с молекулярной массой 20-30 кДа.

[00086] Лизин PlySs2 (также обозначаемый как CF-301) представляет собой первый и единственный лизин, допущенный к клиническим исследованиям на людях в США. FDA присвоило CF-301 статус ускоренного рассмотрения при бактериемии Staphylococcus aureus, исследования I фазы были завершены в 2015 г. PlySs2 изначально происходит из профага, содержавшегося в Streptococcus suis у свиней. Продемонстрировано, что лизин уничтожает различные штаммы клинически значимых грамположительных бактерий, в том числе штаммы, устойчивые к антибиотикам, например, штаммы Staphylococcus aureus, устойчивые и чувствительные к метициллину и ванкомицину (MRSA, MSSA, VRSA, VISA), устойчивый к даптомицину Staphylococcus aureus (DRSA) и устойчивый к линезолиду Staphylococcus aureus (LRSA). PlySs2 представляет собой уникальный лизин в том отношении, что он обладает способностью уничтожать сравнительно широкий, но определенный спектр видов бактерий, а также может уничтожать многие виды бактерий, в частности, грамположительные бактерии, в том числе штаммы бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus и Listeria, в то же время являясь неактивным против естественной микрофлоры кишечника.

[00087] PlySs2/CF-301 для клинического применения рекомбинантно продуцировали в Е. coli; он был активен в широком диапазоне рН (рН 6-9,7) и температур (16-55°С) (Gilmer et al (2013) Antimicrob Agents Chemother 57:2743-2750; Scuch et al (2014) J Infect Dis 209:1469-78). Он был активен в различных биологических жидкостях человека, в том числе крови, сыворотке, плазме, слюне, синовиальной жидкости, легочном сурфактанте и бронхиальном лаваже. Аминокислотная последовательность и структура PlySs2 (CF-301) приведена на фигуре 1.

[00088] Мишенью PlySs2 (CF-301) является клеточная стенка чувствительных бактерий, в том числе Staphylococcus aureus. Он представляет собой цистеин-гистидиновую аминопептидазу, мишенью которой является связь D-Ala-L-Gly пептидогликана клеточной стенки и которая расщепляет связь между остатками D-аланина (основной пептид) и L-глицина (поперечный мостик) клеточной стенки (фигура 2). Лизис бактерии происходит быстро (фигура 2С). CF-301 обладает определенной видоспецифичностью и уничтожает устойчивые к антибиотикам бактерии, в том числе MSSA, MRSA, VRSA, DRSA и LRSA - бактерии, устойчивые к антибиотикам метициллину, ванкомицину, даптомицину, линезолиду (Schich R et al (2014) J Infect Dis 209:1469-1478). Уничтожение является быстрым и активным, наблюдается профиль низкой устойчивости по отношению к литическому пептиду. CF-301 разрушает биопленки и уничтожает стойких бактерий. Наблюдается синергия с антибиотиками.

[00089] Для получения воспроизводимой и согласованной оценки действия литического полипептида на бактерии, в том числе в условиях клинического исследования, авторы изобретения выполнили оценку различных способов и разработали способ микроразбавления в жидкой среде (BMD), являющийся модификацией способа BMD в соответствии со стандартами, описанными в документе института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) М07-А9 (Methods for dilutional antimicrobial sensitivity tests for bacteria that grow aerobically. Volume 32 (Wayne [PA]: Clinical and Laboratory Standards Institute [US], 2012).

[00090] Обнаружено, что стандартную методологию CLSI необходимо модифицировать для решения проблем с определением МИК литических полипептидов (в частности, PlySs2 (CF-301)), в том числе следующих трех основных проблем: 1) эффекта переноса, 2) явного отклонения от результатов анализа чувствительности в крови, сыворотке или плазме человека и 3) потерю активности фермента в панелях для разбавления замороженных препаратов. После интенсивной разработки анализа был разработан модифицированный способ BMD, позволявший выполнять точный, воспроизводимый и надежный анализ чувствительности. Новый способ в максимально возможной степени соответствует стандартам CLSI и оптимизирован для применения в обычной клинической лаборатории.

[00091] Анализ чувствительности к литическому полипептиду, например, PlySs2 (CF-301), представляет собой сложную задачу. PlySs2/CF-301 представляет собой крупный бактериолитический фермент, отличающийся от антибиотиков по физическим характеристикам, механизму действия и метаболизму. Точный анализ чувствительности могут затруднять несколько факторов: Размер (26 кДа) и заряд соединения (pI=9,2) ограничивают диффузию через твердые поверхности; тиоловая группа (остаток цистеина в активном центре) может окисляться и инактивироваться (период полужизни в МНВ составляет ~5 ч); суммарный положительный заряд опосредует "прилипание" к полистироловым поверхностям (в меньшей степени, чем к полипропилену); эффект переноса (или Игла) для ~70% штаммов S. aureus при использовании микроразбавления в жидкой среде (BMD); МИК в СА-МНВ (МИК₉₀=64 мкг/мл) и крови/плазме человека (МИК₉₀=1 мкг/мл) не совпадают. Таким образом, ожидается, что альтернативный способ BMD позволит выполнять точный анализ чувствительности к литическим полипептидам, например, PlySs2/CF-301.

[00092] Примеры проблем, связанных с эффектом переноса и влиянием крови в стандартных анализах BMD согласно CLSI показаны на фигуре 3. Стандартный анализ BMD S. aureus АТСС 700699 выполнили в СА-МНВ (фигура 3А) и крови человека (фигура 3В). Наблюдали эффект переноса, или Игла, который искажает точность определения МИК в стандартной жидкой среде Мюллера-Хинтона II (MHBII) (фигура 3А). Хотя значение МИК в этих стандартных условиях составляло 64 мкг/мл, наблюдались эффекты переноса и Игла до 512 мкг/мл. Обнаружено, что CF-301 значительно более активен в крови, плазме и сыворотке человека, чем в MHBII (фигура 3В). Значение МИК в крови человека составляет 1 мкг/мл. Таким образом, продемонстрировано, что MHBII недостаточно эффективна для анализа чувствительности и что внесение добавок или модификация стандартного анализа микроразбавления в жидкой среде может помочь достичь значений МИК, аналогичных значениям в биологических жидкостях человека.

[00093] Вначале разработали два модифицированных способа BMD для анализа PlySs2/CF-301. При первом способе основные модификации состояли в использовании полипропиленовых планшетов и добавлении 1 мМ ДТТ в MHBII. ДТТ (DL-дитиотрейтол) представляет собой реагент, широко используемый в молекулярной биологии для поддержания ферментов в восстановленном состоянии. С использованием этого временного способа исследовали 223 современных клинических штаммов MSSA и MRSA и определили, что МИК₉₀=8 мкг/мл (диапазон = 1-16 мкг/мл). Эта процедура представляла собой временное решение из-за использования полипропилена, по-прежнему наблюдалось расхождение со значениями МИК в крови человека и проблемы с замороженными панелями.

[00094] Для определения следующего, лучшего способа использовали полистироловые планшеты и СА-МНВ. Выполнили скрининг панели из 30 штаммов S. aureus с использованием различных изменений процедуры и добавок (заведомо влияющих на характеристики AST) с целью поддержания активности, аналогичной активности в крови человека, и возможности использования замороженных панелей. Выполнили следующие оценки:

Сыворотка крови различных животных (5-50%) - собаки, кролика, лошади, мыши

Гемолизированная кровь лошади (1-5%)

ДТТ (0,05-5 мМ)

Сыворотка животных (5-50%) + ДТТ (0,5 мМ)

Твин-80 (0,002%)

БСА (0,05-0,5%)

NaCl (1-5%)

БСА 0,1%, NaCl 2%, перемешивание при 200 об/мин²

БСА 0,1%, NaCl 2%

CaCl₂ (до 50 мкг/мл)

MgCl₂ (до 50 мкг/мл)

CaCl₂ (до 50 мкг/мл) + MgCl₂ (до 50 мкг/мл)

ТСЕР (0,01-5 мМ)

различные жидкие среды и среды - LB, TSB, BHI, МНВ, МНВ

изменения рН, инокулята и состава атмосферы

[00095] Результаты изменений процедуры представлены ниже в таблице 2.

*Различается при использовании свежеразбавленных панелей CF-301 и панелей CF-301 для разбавления после замораживания-размораживания

[00096] На основании вышеописанных оценок определили добавки для нового способа BMD. Использовали сыворотку крови лошади и восстановитель (ДТТ), позволявшие добиться уровня активности, близкого к активности в сыворотке крови человека, и допускавшие использование замороженнных панелей полипептида-лизина (CF-301) для разбавления. В частности, добавление 25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ позволили получить удовлетворительные результаты МИК. Значимые результаты анализа чувствительности набора из 30 штаммов S. aureus приведены в табличном виде на фигуре 4. При замораживании-размораживании использовали стандартную схему 2-кратного разбавления CF-301 в указанной среде с замораживанием при -70°С на 24 ч перед размораживанием, добавлением бактерий и определением МИК. Использованная методология BMD подробно описана в процедуре, приведенной ниже.

[00097] Для проверки способа с сывороткой крови лошади/ДТТ выполнили оценку свежих и размороженных панелей CF-301 для разбавления с использованием различных условий BMD и источников материалов по отношению к 25 штаммам S. aureus. Использовали следующие модификации условий и источников:

Анализ в течение 5 дней подряд, выполненный 2 различными лицами

Различные источники сыворотки крови лошади (Sigma, Corning, Gibco, BioreclamationIVT, Mediatech, RAMBIO, ATCC, Central Biomedia, Lampire)

Различные источники порошкообразной CA-MHB/MHB II (BD и Sigma) и готовой жидкой МНВ II (BD и Teknova)

Различные источники ДТТ (Sigma (жидкость, порошок), G-Biosciences)

Температуры роста 30-37°С в воздухе окружающей среды, 37°С в 5% CO2, встряхивание планшета с частотой до 200 об/мин

Определили конечный/оптимальный диапазон рН среды 7,4±0,6

Конечный/оптимальный диапазон количества инокулята (КОЕ/мл) 5×10⁵±1-log10

[00098] Некоторые типичные результаты оценки в зависимости от источника и условий представлены ниже в таблицах 3, 4 и 5. Исследование по сравнению анализа BMD S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212 в течение пяти дней подряд с использованием сыворотки крови лошади из 14 различных источников представлено на фигуре 5.

[00099] Все протестированные модификации позволили получить ≤2-кратную изменчивость значений МИК_50/90, равных 0,5/1 мкг/мл (диапазон = 0,25-2). Кроме того, более продолжительную инкубацию панелей CF-301 при -80°С не оказывало значимого эффекта (при анализе вплоть до 365 дней на данный момент) (таблица 6). Динамика активности замороженных образцов представлена на фигуре 6.

[000100] Анализ МИК при использовании только MHBII, только 100% сыворотки крови лошади и в BHBII с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ выполнили на штамме MRSA АТСС 29213 при различных условиях (фигура 7). Только MHBII позволила получить МИК, равную 16 мкг/мл, с легким эффектом переноса. Анализ BMD в 100% сыворотке крови человека позволил получить МИК=1 мкг/мл; в MHBII с добавлением 25% сыворотки крови лошади, 0,5 мМ ДТТ МИК была близка к значению в сыворотке человека и составляла 0,5 мкг/мл.

[000101] Аналогичный анализ МИК для S. aureus АТСС 70069 с использованием нового способа в СА-МНВ с добавлением 0,25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ не демонстрировал эффекта переноса или эффекта Игла и позволил получить значение МИК, равное 1 мкг/мл, как в сыворотке крови человека (фигура 8).

[000102] Для дальнейшей оценки способа BMD с использованием MHBII с добавлением 25% сыворотки крови лошади, 0,5 мМ ДТТ выполнили оценку широкого набора клинических изолятов MSSA и MRSA и сравнение определения МИК со 100% сывороткой крови человека. Данный анализ распространили на различные грамположительные патогенные организмы, ранее демонстрировавшие чувствительность к лизину PlySs2 (CF-301) (Schich et al (2014) J Infect Dis 209:1469-1478), в том числе Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae и Enterococcus faecalis. Результаты показаны на Фигуре 9. CF-301 поддерживал свой спектр активности при использовании новой методологии.

[000103] При модифицированном способе BMD выполнили оценку стандартного антибиотика - ванкомицина. Значения МИК₅₀, МИК₉₀ и диапазона были эквивалентны при использовании стандартной СА-МНВ и СА-МНВ с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ (фигура 10).

[000104] В рамках попыток дальнейшей оценки нового способа BMD выполнили анализ с изменением места проведения анализа, включая лабораторию автора изобретения и дополнительный адрес в институте клинической микробиологии (CMI; Уилсонвилл, штат Орегон, США), для подтверждения воспроизводимости результатов у других исследователей. Штаммы, используемые для оценки КК, включали S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212. Анализ BMD с использованием МНВ II с 25% сывороткой крови лошади и 0,5 мМ ДТТ выполняли в течение 5 дней по отношению к S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212 (фигура 11). За пять дней подряд проанализировали пять повторностей на штамм. Анализ повторяли в течение 5 дней подряд в различных лабораториях.

[000105] Эксперименты по поиску диапазона выполнили с оценкой различного добавляемого количества сыворотки и восстановителя. Результаты оценки добавления сыворотки крови лошади в диапазоне от 12,5% до 30% и оценки ДТТ в диапазоне от 0 до 1 мМ изображены на фигуре 12. Условия были основаны на способности воспроизводить активность, подобную активности в сыворотке человека. При анализе с сывороткой для всех условий использовали один и тот же набор из 30 штаммов S. aureus. При анализе с ДТТ для указанного диапазона условий использовали единственный штамм S. aureus. Указаны результаты оценки качества. Концентрации добавляемой сыворотки крови лошади от 20% до 30% подходили для целей исследования. 12,5% сыворотка крови лошади давала неудовлетворительные результаты. Подходящие концентрации ДТТ составляли от 0,25 до 1 мМ, причем наиболее идеальными были концентрации 0,5 мМ и 1 мМ из-за эффекта переноса или высоких значений МИК или невозможности замораживания при концентрации 0,25 мМ и менее. В исследованиях также использовали альтернативный восстановитель ТСЕР, который позволил получить результаты, аналогичные ДТТ.

[000106] В целом для точного анализа литических полипептидов, например, в частности, PlySs2 (CF-301) с применением BMD in vitro требуется применение двух добавок: сыворотки и восстановителя. В данном случае оценка BMD с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ из различных источников позволила получить точные результаты для различных штаммов бактерий, в том числе различных штаммов S. aureus и Е. faecalis. Добавление сыворотки крови млекопитающих, в частности, сыворотки крови лошади, устраняло эффект переноса и позволяло получить количественную оценку активности, сопоставимую с активностью, наблюдаемой в крови, сыворотке или плазме крови человека. Добавление восстановителя, например, в частности, ДТТ, стабилизировало лизин, предотвращало его окисление и позволяло использовать панели замороженного литического полипептида для разбавления. Этот модифицированный способ BMD является точным, воспроизводимым и надежным.

[000107] Более подробное описание типичного способа и процедуры модифицированного анализа BMD приведено ниже.

[000108] Процедура микроразбавления в жидкой среде:

[000109] Общая процедура выполнения анализа чувствительности с микроразбавлением в жидкой среде приведена в данном разделе. Данная процедура является модификацией технологии CLSI (документ М07-А9, 2015) и основана на способе, описанном Wiegand et al., 2008 (см. приложение D, раздел D1) для оценки МИК антимикробных пептидов с большим зарядом.

[000110] Подготовка разбавленного литического полипептида к анализу: Литический полипептид (PlySs2) предоставлен в виде замороженного исходного раствора, суспендированного в буфере Демо (Demo) в концентрации 10,74 мг/мл. Буфер Демо представляет собой дигидрат дигидрофосфата натрия (7,67 мМ), дигидрат гидрофосфата натрия (7,33 мМ) и хлорид натрия (150 мМ) при рН 7,22. Для получения разведений PlySS2 в качестве разбавителя использовали МНВ II с добавлением 25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ. Каждый штамм или изолят исследовали в трех повторах, по два штамма или изолята на планшет.

1. Разморозьте замороженный исходный раствор полипептида лизина (например, CF-301) путем суспендирования в течение 5 минут на водяной бане с температурой 24°С. Размороженный образец храните на льду до использования в течение не более 30 минут. Неиспользованный полипептид (CF-301) выбросьте.

2. Выберите желательный диапазон двукратных разведений полипептида-лизина (например, CF-301), необходимом для анализа. Для большинства штаммов Staphylococcus aureus этот диапазон будет начинаться с конечной желательной концентрации 8 или 16 мкг/мл. Для некоторых штаммов Staphylococcus aureus с промежуточной устойчивостью к ванкомицину этот диапазон будет начинаться с конечной желательной концентрации 512 мкг/мл.

3. Приготовьте основные растворы разведений лизинового полипептида (например, CF-301) вдвое больше желательной конечной концентрации каждого разведения и залейте в соответствующие лунки в столбцах 1-10 по 0,05 мл. Пипеткой внесите по 0,1 мл жидкой среды в лунки столбца 12 для использования в качестве контроля стерильности и по 0,05 мл в лунки столбца 11 для использования в качестве контроля роста.

[000111] Подготовка и внесение инокулята: Для стандартизации плотности инокулята для анализа чувствительности использовали стандарт эквивалентной мутности по Мак-Фарланду (Remel, номер в каталоге R20421). В день каждого анализа используют штаммы для контроля качества, например, следующие штаммы для контроля качества: S. aureus АТСС 29213 (CFS-581), S. aureus АТСС 43300 (CFS-553), и Е. faecalis АТСС 29212 (CFS-806).

1. Подготовьте инокулят, путем непосредственного приготовления суспензии отдельных колоний, отобранных с чашек с 18-24-ч кровяным агаром, в жидкой среде. Суспензию в жидкой среде можно получить в жидкой среде Мюллера-Хинтона BBL™, в 2-мл пробирках (BD Diagnostic Systems, номер в каталоге 296164).

2. Откорректируйте суспензию для получения эквивалента мутности, соответствующего стандарту 0,5 по Мак-Фарланду, с использованием денситометра DEN-1 производства Grant Instruments.

3. В течение 15 минут после получения разбавьте жидкую среду скорректированным инокулятом таким образом, чтобы после внесения инокулята каждая лунка содержала конечную концентрацию приблизительно 5×10⁵ КОЕ/мл. Поскольку объем инокулята в каждой лунке 1-11 столбцов составлял 0,05 мл, суспензия 0,5 по Мак-Фарланду следует разбавить в соотношении 1:100 с получением концентрации 1×10⁶ КОЕ/мл. При внесении 0,05 мл этой суспензии в лунки титрационного микропланшета (уже содержащие 0,05 мл) конечная анализируемая концентрация бактерий составляет приблизительно 5×10⁵ КОЕ/мл

4. В течение 15 минут после стандартизации инокулята, как описано выше, в каждую лунку 1-11 столбцов внесите 0,05 мл инокулята. После этого конечный объем в каждой лунке составит 0,1 мл.

5. Выполните проверку чистоты суспензии инокулята посредством субкультивирования аликвоты на чашке с кровяным агаром при одновременной инкубации.

[000112] Инкубация: В течение 15 минут после внесения инокулята инокулированные лотки инкубируют при 37°С в течение 16-18 часов в инкубаторе с обычным воздухом окружающей среды. Рекомендуется не ставить планшеты в штабеля высотой более чем четыре планшета.

[000113] Определение конечных точек МИК:

1. Сравните значение роста в лунках, содержащих CF-301 со значением в лунках для контроля роста. Чтобы анализ можно было считать действительным, в лунках для контроля роста должен наблюдаться приемлемый рост. Значение МИК определяют визуально.

2. В качестве независимой регистрации считывают и сохраняют значения OD₆₀₀ (оптической плотности на 600 нм) для лунок в каждом лотке, определяя его на планшетном ридере Molecular Devices SpectraMax М3.

[000114] Среда и добавки

[000115] Добавки

Основной раствор (1 М) DL-дитиотрейтола (ДТТ) из порошка

1. 1,5 г ДТТ растворяют в 1 мл H₂0 (сверхчистая дистиллированная вода без содержания ДНКазы/РНКазы)

2. Доводят объем до 10 мл дистиллированной водой и стерилизуют, пропуская через 0,22-мкм фильтр

3. Раствор готовят в день использования (не хранят и не используют повторно)

Раствор DL-дитиотрейтола (ДТТ) (1 M в Н₂0)

1. Асептически откывают стеклянный флакон и отбирают соответствующее количество

2. Раствор готовят в день использования (не хранят и не используют повторно)

Сыворотка крови лошади (100%)

1. Замороженную сыворотку крови лошади размораживают в течение ночи при 4°С или путем инкубации в течение 1 ч при 24°С

2. Асептически добавляют соответствующее количество сыворотки в автоклавированную и охлажденную среду МНВ II

3. Хранят в замороженном виде при -20°С в виде аликвот по 50 мл

[000116] Среда с агаром

Трипсиновый соевый агар с 5% крови овцы

Готовые чашки с трипсиновым соевым агаром (с добавлением 5% крови овцы) получают из коммерческого источника

[000117] Жидкая среда

Жидкая среда Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом

Обезвоженную среду Мюллера-Хинтона II (с откорректированным катионным составом) получают из коммерческого источника.

Эта форма должна содержать 20-25 мг Са²⁺/л и 10-12,5 мг Mg²⁺/л.

1. МНВ II готовят в точном соответствии с рекомендациями производителя, автоклавируют, охлаждают до 55°С в течение 1 часа, стерилизуют фильтрацией, пропуская через мембрану с размером пор 0,22 мкм и охлаждают в течение ночи при 2-8°С.

2. Проверьте рН. Конечный рН должен был составлять 7,2-7,4.

3. Хранить при 2-8°С в темном месте в течение не более 1 недели.

Жидкая среда Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) с 25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ

1. Жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом готовят в соответствии с описанием в разделе В3.1.

2. После охлаждения среды в течение ночи при 2-8°С на каждые необходимые 100 мл к 75 мл среды добавляют 25 мл крови лошади. Получение крови лошади описано в разделе В1.2.

3. Аккуратно перемешивают, вращая сосуд.

4. После перемешивания добавляют 0,05 мл основного 1 М раствора ДТТ на каждые необходимые 100 мл жидкой среды с 25% сыворотки крови лошади. Приготовление ДТТ см. в разделах В1.1 или В1.2 в зависимости от источника ДТТ.

5. Конечный рН должен составлять 7,4.

6. Свежую среду готовят только в день использования. Среду не не хранят и не используют повторно.

[000118] Реагенты и оборудование

[000119] Среда для роста бактерий

Жидкая среда Мюллера-Хинтона II BBL™ с откорректированным катионным составом, стерилизованная автоклавированием (BD Diagnostics, номер в каталоге 212322, номер партии 5257869, срок годности 31.05.2019)

Жидкая среда Мюллера-Хинтона 2 с откорректированным катионным составом, стерилизованная автоклавированием (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 90922, номер партии BCBR3303V, срок годности 11.2020)

Жидкая среда Мюллера-Хинтона II BBL™ с откорректированным катионным составом, 400 мл, стерильная (BD Diagnostics, номер в каталоге 297963, номер партии 6014547, срок годности 12.01.2017)

Жидкая среда Мюллера-Хинтона II с откорректированным катионным составом, 1000 мл, стерильная (Teknova, номер в каталоге М5860, номер партии М586012В1601, срок годности 09.12.2016)

Чашки с соевым агаром Trypticase™ с 5% кровью овцы (TSA II) (BD Diagnostics, номер в каталоге 221239, номер партии 6049996, срок годности 10.06.2016)

[000120] Препараты крови животных и человека

Сыворотка крови лошади, донорский табун, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге Н1270, номер партии 15G382, срок годности 6.2016, хранить в замороженном виде при -20°С)

Сыворотка крови лошади, стерилизованная фильтрацией (BioreclamationIVT, номер в каталоге HSESRM, номер партии HSE1225, срок годности 10.2016, хранить в замороженном виде при -20°С)

Сыворотка крови лошади новозеландского происхождения, донорский табун, стерилизованная фильтрацией (Gibco, номер в каталоге 16050-122, номер партии 1671315, срок годности 2.2019, хранить в замороженном виде при -20°С)

Сыворотка крови лошади-донора из США, стерилизованная фильтрацией (Corning, номер в каталоге 35-030-CV, номер партии 35030105, срок годности 7.2018, хранить в замороженном виде при -20°С)

Сыворотка крови лошади-донора из США, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 12449С, номер партии 14А277, срок годности 28.02.2018, хранить в замороженном виде при -20°С)

Сыворотка крови человека (мужчины) АВ-плазма, из США, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге SLBN4664V, срок годности 4.2018, хранить в замороженном виде при -20°С)

Объединенная сыворотка крови человека (здоровых мужчин) АВ-сыворотка, стерилизованная фильтрацией (Innovative Research Inc., номер в каталоге IPLA-SERAB, номер партии 19799, хранить в замороженном виде при -20°С)

Объединенная сыворотка крови человека (здоровых мужчин) с цитратом Na в качестве антикоагулянта, стерилизованная фильтрацией (Innovative Research Inc., номер в каталоге IPLA-N, номер партии 18944, хранить в замороженном виде при -20°С)

Сыворотка крови кролика из США, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге R7136, номер партии 13Е108, срок годности 5.2017, хранить в замороженном виде при -20°С

Сыворотка крови собаки бигль категории Innovative из США (Innovative Research Inc., номер в каталоге IBG-SER, номер партии 17654, срок годности 6.2018, хранить при -20°С)

Гемолизированная кровь лошади Remel™ (Thermo Scientific, № в каталоге R54072, хранить в замороженном виде при -20°С)

[000121] Химические реагенты

Раствор DL-дитиотрейтола, 1 M в H₂O (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 646563-10X.5ML, номер партии MKBW5575V, хранить в невскрытом виде при 24°С)

DL-дитиотрейтол BioUltra для молекулярно-биологических исследований, ≥99,5% (RT) (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 43815-25G, номер партии BCBBD7009V, хранить при 2-8°С)

DL-дитиотрейтол (G-Biosciences, номер в каталоге RC-046, номер партии 151106, хранить при 2-8°С)

Раствор гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина, 0,5 М, рН 7,0 (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 646547-10X1ML, номер партии MKBW8503V, хранить в невскрытом виде при 24°С)

TWEEN® 80 (Sigma-Aldrich, номер в каталоге P4780-100ML, номер партии MKBW2896V, хранить при 24°С)

Хлорид натрия (NaCl) (Fisher BioReagents, номер в каталоге ВР358-10, номер партии 150661, хранить при 24°С)

Хлорид кальция (Fisher Bioreagents, номер в каталоге С77-212, номер партии 110651, хранить при 24°С)

Хлорид магния, безводный, ≥98% (Sigma-Aldrich, номер в каталоге M8266-100G, номер партии 120M0094V, хранить при 24°С)

Бычий сывороточный альбумин, лиофилизированный порошок, ≥96% (Sigma-Aldrich, номер в каталоге А2153, номер партии SLBL5462V, хранить при 2-8°С)

[000122] Материалы и оборудование

96-луночные планшеты для культивирования клеток Falcon^®, полистироловые, стерильные, с u-образным дном, с крышкой для снижения испарения (Corning, номер в каталоге 351177, номер партии 6026023)

Жидкая среда Мюллера-Хинтона BBL™, 2-мл пробирки (BD Diagnostic Systems, номер в каталоге 296164, номер партии 6054984)

Настольный денситометр DEN-1 (Grant Biosciences, номер в каталоге DEN-1, номер партии 050102-1111-0426)

Многорежимный микропланшетный ридер SpectraMax М3 (Molecular Devices Inc.)

[000123] ЛИТЕРАТУРА

1. Wiegand et al. 2008. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3:163-175.

2. Gilmer et al. 2013. Novel Bacteriophage Lysin with Broad Lytic Activity Protects against Mixed Infection by Streptococcus pyogenes and Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57:2743-2750.

3. Schuch et al. 2014. Combination Therapy With Lysin CF-301 and Antibiotic Is Superior to Antibiotic Alone for Treating Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus-Induced Murine Bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 209:1469-78.

4. Hatful G. 2015. Dark Matter of the Biosphere: the Amazing World of Bacteriophage Diversity. Journal of Virology. 89:8107-10.

5. Fischetti, V.A., Nelson, D. & Schuch, R. 2006. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum? Nature Biotechnology. 24:1508-11.

6. Kusuma & Kokai-Kun. 2005. Comparison of Four Methods for Determining Lysostaphin Susceptibility of Various Strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49:3256-63.

7. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Vol. 32 (Clinical and Laboratory Standards Institute (US), Wayne (PA), 2012). Clinical Microbiology Procedures Handbook 3rd Ed. Washington DC, (ASM Press, 2010).

8. Fischetti, V.A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Current opinion in microbiology 11, 393-400 (2008).

9. Fenton, M., Ross, P., McAuliffe, O., O'Mahony, J. & Coffey, A. Recombinant bacteriophage lysins as antibacterials. Bioengineered Bugs 1, 9-16 (2010).

10. Nelson, D., Loomis, L. & Fischetti, V.A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 4107-4112 (2001).

11. Witzenrath, M., et al. Systemic use of the endolysin Cpl-1 rescues mice with fatal pneumococcal pneumonia. Critical care medicine 37, 642-649 (2009).

12. Pastagia, M., et al. A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains. Antimicrobial agents and chemotherapy 55, 738-744 (2011).

13. Loeffler, J.M., Djurkovic, S. & Fischetti, V.A. Phage Lytic Enzyme Cpl-1 as a Novel Antimicrobial for Pneumococcal Bacteremia. Infection and Immunity 71, 6199-6204 (2003).

14. Entenza, J.M., Loeffler, J.M., Grandgirard, D., Fischetti, V.A. & Moreillon, P. Therapeutic effects of bacteriophage Cpl-1 lysin against Streptococcus pneumoniae endocarditis in rats. Antimicrobial agents and chemotherapy 49, 4789-4792 (2005).

15. Grandgirard, D., Loeffler, J.M., Fischetti, V.A. & Leib, S.L. Phage lytic enzyme Cpl-1 for antibacterial therapy in experimental pneumococcal meningitis. The Journal of infectious diseases 197, 1519-1522 (2008).

16. Schuch, R., Fischetti, V.A. & Nelson, D.C. A Genetic Screen to Identify Bacteriophage Lysins. in Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 2: Molecular and Applied Aspects, Vol. 502 307-319 (2009).

17. Bateman, A. & Rawlings, N.D. The CHAP domain: a large family of amidases including GSP amidase and peptidoglycan hydrolases. Trends Biochem Sci 28, 234-237 (2003).

18. Whisstock, J.C. & Lesk, A.M. SH3 domains in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences 24, 132-133 (1999).

19. Rossi, P., et al. Structural elucidation of the Cys-His-Glu-Asn proteolytic relay in the secreted CHAP domain enzyme from the human pathogen Staphylococcus saprophyticus. Proteins 74, 515-519 (2009).

20. Mueller, M., de la Pena, A. & Derendorf, H. Issues in Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Anti-Infective Agents: Kill Curves versus MIC. Antimicrobial agents and chemotherapy 48, 369-377 (2004).

21. Cottarel, G. & Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in biotechnology 25, 547-555 (2007).

22. Tallarida, R.J. Revisiting the isobole and related quantitative methods for assessing drug synergism. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 342, 2-8 (2012).

23. LaPlante, K.L., Leonard, S.N., Andes, D.R., Craig, W.A. & Rybak, M.J. Activities of clindamycin, daptomycin, doxycycline, linezolid, trimethoprim-sulfamethoxazole, and vancomycin against community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus with inducible clindamycin resistance in murine thigh infection and in vitro pharmacodynamic models. Antimicrobial agents and chemotherapy 52, 2156-2162 (2008).

24. Crandon, J.L., Kuti, J.L. & Nicolau, D.P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 5115-5119 (2010).

25. Loeffler, J.M., Nelson, D. & Fischetti, V.A. Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with a bacteriophage cell wall hydrolase. Science 294, 2170-2172 (2001).

26. Schuch, R., Nelson, D. & Fischetti, V. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature 418, 884-889 (2002).

27. Manoharadas, S., Witte, A. & Blasi, U. Antimicrobial activity of a chimeric enzybiotic towards Staphylococcus aureus. Journal of biotechnology 139, 118-123 (2009).

28. Rashel, M., et al. Efficient elimination of multidrag-resistant Staphylococcus aureus by cloned lysin derived from bacteriophage phi MR11. The Journal of infectious diseases 196, 1237-1247 (2007).

29. Daniel, A., et al. Synergism between a novel chimeric lysin and oxacillin protects against infection by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 1603-1612 (2010).

30. Kokai-Kun, J.F., Chanturiya, T. & Mond, J.J. Lysostaphin as a treatment for systemic Staphylococcus aureus infection in a mouse model. The Journal of antimicrobial chemotherapy 60, 1051-1059 (2007).

31. Sopirala, M.M., et al. Synergy testing by Etest, microdilution checkerboard, and time-kill methods for pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 4678-4683 (2010).

32. Zhang, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC bioinformatics 9, 40 (2008).

[000124] Настоящее изобретение можно реализовать в других формах или осуществить иными способами, не отклоняясь от его сущности или существенных характеристик. Поэтому следует считать, что настоящее описание во всех его аспектах является иллюстративным и неограничивающим, а сущность изобретения указана в прилагаемой формуле изобретения, и подразумевается, что она охватывает все изменения, не выходящие за пределы значений и диапазонов эквивалентности.

[000125] Настоящее описание изобретения включает ссылки на различные источники, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к способу анализа чувствительности грамположительных бактерий в отношении антибактериального пептида с микроразбавлением в жидкой среде (BMD), включающему оценку указанного антибактериального пептида в жидкой среде с добавлением сыворотки крови животного и восстановителя, причем указанный антибактериальный пептид представляет собой полипептид-лизин, и при этом оценка указанного антибактериального пептида включает определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) указанного антибактериального пептида. Настоящее изобретение обеспечивает улучшенный анализ методом микроразбавления в жидкой среде (BMD), в котором устранен эффект переноса. 13 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл., 1 пр.

1. Способ анализа чувствительности грамположительных бактерий в отношении антибактериального пептида с микроразбавлением в жидкой среде (BMD), включающий оценку указанного антибактериального пептида в жидкой среде с добавлением сыворотки крови животного и восстановителя, причем указанный антибактериальный пептид представляет собой полипептид-лизин, и при этом оценка указанного антибактериального пептида включает определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) указанного антибактериального пептида.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 10% до 50% сыворотки крови животного.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 10% до 30% сыворотки крови животного.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 15% до 30% сыворотки крови животного.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 20% до 30% сыворотки крови животного.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови лошади в концентрации от 20% до 30% сыворотки крови лошади.

7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что жидкая среда является жидкой средой с откорректированным катионным составом.

8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что жидкая среда представляет собой жидкую среду Мюллера-Хинтона (MHB).

9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что восстановитель выбирают из дитиотрейтола (ДТТ) и гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP).

10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что количество восстановителя составляет от 0,1 до 1 мМ.

11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что количество восстановителя составляет от 0,25 до 1 мМ.

12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что полипептид-лизин представляет собой PlySs2 (CF-301) или его вариант или производное, эффективно уничтожающее грамположительные бактерии.

13. Способ по п. 1 для оценки композиции, содержащей антибактериальный пептид, представляющий собой полипептид-лизин, и дополнительно содержащей один или более антибактериальных агентов.

14. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что указанный один или более антибактериальных агентов представляет собой антибиотик.