Штамм Escherichia coli с инактивированным геном lysP - продуцент L-треонина Российский патент 2021 года по МПК C12N1/21 C12N15/70 C12P13/08 

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к микробиологическому синтезу аминокислоты L-треонина с использованием бактерии вида Escherichia coli.

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают путем ферментации штаммов-продуцентов. В качестве продуцентов используют как выделенные из природных источников микроорганизмы, так и их производные (US 4278765).

Увеличения продукции L-аминокислот достигают путем повышения активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшения чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию конечным продуктом - продуцируемой L-аминокислотой (WO 9516042, US 5661012, US 6040160).

Для производства L-треонина используют штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (US 5175107; US 5661012; US 5705371; US 5939307; ЕР 219027), штаммы, устойчивые к L-треонину и его аналогам (WO 0114525, ЕР 301572, US 5376538), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации L-треонина (US 5939307 и US 6297031), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (US 5175107 и US 5661012).

Известен штамм-продуцент L-треонина Е. coli ВКПМ В-3996 (SU 1694643, US 5175107 и US 5705371), полученный путем введения в штамм Е. coli ВКПМ В-7 следующих мутаций и плазмиды:

- мутантного гена thrA (мутация thrA⁴⁴²), который кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию L-треонином по типу обратной связи;

- мутантного гена ilvA (мутация ilvA⁴⁴²), который кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, что выражается в пониженном уровне биосинтеза L-изолейцина, а в фенотипе недостатком по L-изолейцину типа "leaky"; в присутствии мутации ilvA⁴⁴² транскрипция оперона thrABC не репрессируется L-изолейцином, что оказывает положительное влияние на продукцию L-треонина;

- инактивированного гена tdh, что приводит к предотвращению деградации L-треонина,

- генетической детерминанты ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR);

- плазмиды pVTC40, содержащей мутантный треониновый оперон thrA⁴⁴²BC, что обеспечивает увеличение экспрессии генов, контролирующих биосинтез L-треонина.

Штамм Е. coli ВКПМ В-3996 в ходе ферментации в пробирках продуцирует 13 г/л L-треонина (RU 2182173), а при культивировании в ферментере - 85 г/л L-треонина (US 5175107).

При конструирования продуцентов важным является также поиск новых генов-мишеней, модификация которых приводит к увеличению продукции L-треонина.

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение является расширение арсенала штаммов Escherichia coli, способных к продукции L-треонина.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм бактерии Escherichia coli ВКПМ В-13 774 с инактивированным геном lysP, обладающий способностью продуцировать L-треонин.

Термин "ген lysP инактивирован" означает, что природный ген модифицирован таким образом, что кодирует мутантный белок со сниженной активностью, или полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена или введения missense/nonsense мутации или модификации прилегающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы, и т.д.

Инактивацию гена осуществляют любым возможным методом, например, мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, инактивации гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".

В заявляемом штамме инактивацию гена lysP осуществляют путем замены открытой рамки считывания этого гена на селективный маркер aadA, представляющий собой ген устойчивости к спекциномицину.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:

Фиг. 1. Схема плазмиды pISA.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном lysP

Инактивацию гена осуществляют в штамме Escherichia coli ВКПМ В-13207, который получен на основе дикого штамма Escherichia coli К-12 MG1655 (АТСС 47076) в результате проведения нескольких этапов мутагеза различными мутирующими агентами с целью отбора мутантов наиболее устойчивых к L-треонину, и последующего введения направленных генетических модификаций: замена промотора генов треонинового оперона, введение десенсибилизирующей мутации в ген thrA, оверэспрессия rhtA, инактивация гена sstT, инактивация гена рохВ, кодирующего пируватоксидазу.

Делецию гена lysP осуществляют путем замены его ORF (номер последовательности по базе данных GenBank NC_000913.3 (2247063..2248532), на селективный маркер устойчивости к спектиномицину, методом ПЦР с использованием следующих олигонуклеотидов:

lysPinsF 5'-aatcgtctgctacaatcgcgcctcatttttaagatggatagcatttttgtcagggttttcccagtcacga

lysPinsR 5'-attgaaaaagccctctcggttgagagggcttagcaaggaagggaggaaacatgttgtgtggaattgtgagc

В качестве матрицы для синтеза используют плазмиду pISA (Биотехнология 2019 Т. 35 №4 с. 42-54). В своем составе эта плазмида (фиг. 1) несет следующие генетические элементы: ген aadA, обуславливающий устойчивость клеток к спектиномицину для прямого отбора трансформантов; последовательности фага λ attL и attR - сайты узнавания системы рекомбинации Int/Xis; repA - репликон; ген bla, кодирующий бета-лактамазу, обуславливающий устойчивость к ампициллину.

Амплификацию фрагмента проводят с использованием полимеразы КАРА (KAPAbiosystems) позволяющей избежать ошибок в последовательности. Используют следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; 25 циклов: 20 сек при 98°С, 20 сек при 60°С, 2 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 2 мин при 72°С. ПЦР продукт размером 2161 п.о. очищают методом экстракции из агарозного геля и далее используют для трансформации штамма ВКПМ В-13207, который предварительно трансформируют плазмидой pKD46, что необходимо для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма. Плазмида pKD46 (Datsenko, К.А. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ (инвентарный номер последовательности J02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены Red гомологичной системы рекомбинации (β, γ, ехо гены) под контролем промотора ParaB; индуцируемого арабинозой.

Электрокомпетентные клетки получают следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli ВКПМ В-13207 выращивают при 30°С в жидкой среде LB (мас. %): триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавкой ампициллина (125 мг/л), разводят в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, MgCl₂ - 0,0956, MgSO₄⋅7H₂O - 0,252, NaCl - 0,0058, KCl - 0,0185, вода - остальное с добавлением ампициллина (100 мг/л) и L-арабинозы (1 мМ). Полученную культуру растят с перемешиванием при 30°С до достижения оптической плотности ОП_660нм 0,6 ед., затем выросшим клеткам придают электрокомпетентность путем концентрации их смеси в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной водой. Электропорацию проводят с использованием 40 мкл клеток и 1 мкг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубируют в 1 мл среды SOC (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, глюкоза - 0,36, MgCl₂ - 0,0956, MgSO₄⋅7H₂O - 0,252, NaCl -0,0058, KCl - 0,0185, вода - остальное при 37°С в течение 2,5 часов, после чего высевают на чашки со средой LA (мас. %): агар-агар - 2, триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавлением спектиномицина (75 мкг/мл).

Отбор трансформантов, несущих делецию в гене lysP, проводят на чашках со средой LA с добавлением спектиномицина. Наличие инсерции в локусе lysP у отобранных клонов подтверждают методом ПЦР. Для амплификации фрагмента используют полимеразу Taq (Thermo Fisher Scientific) и следующие олигонуклеотиды:

lysP-out-F 5'- ttcagcatgcattcgccaga

lysP-out-R 5'- aagccggaacagcctctgat

Для проведения ПЦР используют следующий температурный профиль: денатурация при 94°С в течение 4 мин; 25 циклов: 20 сек при 94°С, 20 сек при 55°С, 2 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.

Наличие продукта размером 2386 п. о. подтверждает интеграцию кассеты в целевой локус. Для удаления вспомогательной плазмиды pKD46, проводят 2 пассажа на среде LA со спектиномицином при 42°С и полученные колонии тестируют на чувствительность к ампициллину.

В результате отобрано 5 клонов, несущих делецию в гене lysP.

Пример 2. Получение заявляемого штамма путем отбора наиболее продуктивного клона с делецией lysP

Для подтверждения влияния делеции гена lysP на продукцию L-треонина проводят пробирочную ферментацию пяти отобранных клонов, в качестве контрольного штамма используют родительский штамм E.coli ВКПМ В-13207.

Штаммы выращивают на чашках со средой LA в течение 24 часов при 37°С. Для приготовления инокулята используют посевную среду следующего состава (мас. %):

Дрожжевой экстракт 3,5 Глюкоза 0,25 NaCl 0,25 КН₂РО₄ 0,25 Вода остальное

В пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 5 мл посевной среды вносят биомассу клеток до стартового значения оптической плотности равной ОП_660нм 0,1 ед. Пробирки инкубируют на роторной качалке в течение 5 часов при 37°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Для основного процесса ферментации используют среду следующего состава (мас. %):

Глюкоза 4,0 (NH₄)₂SO₄ 3,0 Кукурузный 1,0 экстракт КН₂РО₄ 0,25 MgSO₄⋅7H₂O 0,2 Лимонная 0,0192 кислота FeSO₄⋅7H₂O 0,003 MnSO₄⋅H₂O 0,0021 СаСО3 2,0 Вода остальное

Растворы глюкозы, сульфата марганца и сульфата магния стерилизуют отдельно автоклавированием при 121°С в течение 40 мин. Навески СаСО₃ по 40 мг стерилизуют в стеклянных пробирках автоклавированием при 121°С в течение 20 мин. рН доводят до значения 7,0. Раствор сульфата железа стерилизуют фильтрованием через мембрану диаметром пор 22 мкм.

Полученный инокулят вносят в пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 2 мл ферментационной среды до стартовой оптической плотности ОП₆₆₀ нм 0,1 ед. Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С на роторной качалке (220 об/мин).

Количество накопленного в среде L-треонина определяют с методом ВЭЖХ (Waters 2695, Alliance). Результаты ферментации для 5 клонов приведены в табл.

Таблица

Клоны, несущие делецию в гене lysP Продукция L-треонина, г/л клон 1 16,5 клон 2 16,9 клон 3 17,1 клон 4 16,3 клон 5 16,7 Контроль – штамм E.coli ВКПМ В-13207 15,1

Как видно из таблицы, наибольшее количество L-треонина по сравнению с контрольным штаммом E.coli ВКПМ В-13207 накапливает клон 3. Отобранный клон депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Escherichia coli ВКПМ В-13774.

Заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-13774 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические характеристики

Грамм-отрицательная бактерия. Суточная культура в жидкой среде LB представлена слабо подвижными клетками округлой формы 1 мкм в диаметре. При культивировании на L-агаре в течение 18-24 часов при 37°С образует круглые, беловатый, полупрозрачные на свет колонии колонии 1-2 мм, поверхность колонии гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется. При культивировании на агаризованной среде Эндо (мас. %: пептон - 1, лактоза - 1, Na₂SO₃ - 0,33, К₂НРО₄ - 0,25, фуксин основной - 0,03, агар-агар - 2%, вода - остальное) при 37°С образуются колонии, круглой формы с ровным четко очерченным краем малиново-красного цвета с металлическим блеском. Диаметр колоний 0,5-1,5 мм.

Физиолого-биохимические характеристики.

Факультативный анаэроб. Сахара не сбраживает.Ассимилирует: D-глюкозу, L-арабинозу, D-маннитол, D-ксилозу, в меньшей мере: D-галактозу, D-лактозу. Отсутствует способность к гидролизу крахмала. Отстутствует потребность в факторах роста. Штамм устойчив к спектиномицину. Оптимальное значение рН для роста 7,2-7,4. Не растет при температурах свыше 45°С. Оптимальная температура роста 37°С. Штамм не патогенен.

Таким образом, получен штамм Escherichia coli ВКПМ В-13774 с инактивированным геном lysP, способный синтезировать до 17,1 г/л L-треонина при культивировании в пробирках.

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм Escherichia coli ВКПМ В-13774 с инактивированным геном lysP, являющийся продуцентом L-треонина. Изобретение позволяет расширить арсенал штаммов Escherichia coli, продуцирующих L-треонин. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Штамм Escherichia coli ВКПМ В-13774 с инактивированным геном lysP - продуцент L-треонина.