КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ Российский патент 2021 года по МПК C07K14/325 C12N15/82 C12N15/75 

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0001] Официальная копия перечня последовательностей подана в электронном виде через EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII с названием файла "80838-WO-REG-ORG-P-l_SeqList_ST25.txt", созданного 7 июля 2015 г., и имеющего размер 56 килобайт, и поданного одновременно с данным описанием. Перечень последовательностей, содержащийся в данном документе в формате ASCII, является частью описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0002] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США с порядковым номером 62/189573, поданной 7 июля 2015 г., которая включена посредством ссылки во всей ее полноте для всех целей.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0003] Настоящее изобретение относится к пестицидным белкам и молекулам нуклеиновых кислот, которые их кодируют, а также к композициям и способам контроля вредителей растений.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Bacillus thuringiensis (Bt) является грамположительной спорообразующей почвенной бактерией, которая отличается своей способностью продуцировать кристаллические включения, которые особенно токсичны для определенных отрядов и видов вредителей растений, в том числе насекомых, но безвредны для растений и других нецелевых организмов. По этой причине композиции, содержащие штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные белки, могут применяться в качестве приемлемых с точки зрения охраны окружающей среды инсектицидов для контроля насекомых-вредителей, важных с точки зрения сельского хозяйства, или насекомых-переносчиков различных заболеваний человека или животных.

[0005] Кристаллические (Cry) белки из Bacillus thuringiensis обладают сильной инсектицидной активностью в отношении преимущественно чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых насекомых-вредителей. Эти белки также продемонстрировали активность в отношении вредителей из отрядов Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga и вредителей из отрядов подкласса Acari, а также других групп беспозвоночных, таких как Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarcomastigorphora (Feitelson, J. 1993. The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.). Эти белки изначально разделили на классы CryI-CryVI, исходя преимущественно из их инсектицидной активности. Основными классами были специфические для Lepidoptera (I), специфические для Lepidoptera и Diptera (II), специфические для Coleoptera (III), специфические для Diptera (IV) и специфические для нематод (V) и (VI). Далее белки разделили на подсемейства, белкам с более высокой степенью родства в пределах каждого семейства присвоили буквы для обозначения раздела, как например: CryIA, CryIB, CryIC и т.д. Еще более близкородственным белкам в пределах каждого раздела присвоили названия, как например: CryIC(a), CryIC(b) и т.д. Термины "токсин Cry" и "дельта-эндотоксин" применялись взаимозаменяемо с термином "белок Cry". Современная номенклатура белков и генов Cry основана на гомологии аминокислотных последовательностей, а не на специфичности в отношении целевых насекомых (Crickmore et ah (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). В этой более распространенной классификации каждому токсину присваивается уникальное название, включающее первичный ранг (арабская цифра), вторичный ранг (заглавная буква), третичный ранг (строчная буква) и четвертичный ранг (еще одна арабская цифра). В современной классификации в первичном ранге римские цифры были заменены на арабские цифры. Например, "CryIA(а)" согласно старой номенклатуре в настоящее время имеет название "Cry1 Аа" согласно современной номенклатуре. Согласно публикации Ibrahim et al. (2010, Bioeng. Bugs, 1:31-50) токсины Cry были разделены на шесть основных классов в соответствии с их специфичностью в отношении насекомого-хозяина и они включают: группу 1 - чешуекрылые (например, Cry1, Cry9 и Cry15); группу 2 - чешуекрылые и двукрылые (например, Cry2); группу 3 - жесткокрылые (Cry3, Cry7 и Cry8); группу 4 - двукрылые (Cry4, Cry10, Cry1I, Cry16, Cry17, Cry19 и Cry20); группу 5 - чешуекрылые и жесткокрылые (Cry11); и группу 6 - нематоды (Cry6). Токсины Cry11, Cry2, Cry3, Cry10 и Cry11 (73-82 кДа) являются уникальными, поскольку, по-видимому, они являются результатом естественных усечений белков большего размера Cry1 и Cry4 (130-140 кДа).

[0006] Белки Cry представляют собой молекулы глобулярного белка, которые накапливаются в виде протоксинов в кристаллической форме в ходе стадии спорообразования Bt. После поедания вредителем кристаллы, как правило, растворяются с высвобождением протоксинов, размер которых может варьировать, например от 130-140 кДа в случае белков Cry, активных в отношении многих чешуекрылых, таких как Cry1 и Cry9, и 60-80 кДа в случае белков Cry3, активных в отношении жесткокрылых, и белков Cry2, активных в отношении чешуекрылых/двукрылых. После растворения кристаллов в организме восприимчивого насекомого высвободившиеся протоксины подвергаются обработке протеазами в пищеварительном канале насекомого, например трипсином и химотрипсином, с образованием протеазаустойчивой сердцевины белкового токсина Cry. Данный протеолитический процессинг включает удаление аминокислот из разных участков различных протоксинов Cry. Например, протоксины Cry размером 130-140 кДа, как правило, активируются посредством протеолитического удаления N-концевого пептида из 25-30 аминокислот и примерно половины остального белка с С-конца, результатом чего является образование зрелого токсина Cry размером примерно 60-70 кДа. Протоксины размером 60-80 кДа, например Cry2 и Cry3, также подвергаются процессингу, но не в той же степени, как протоксины более крупного размера. Протоксины меньшего размера, как правило, характеризуются тем, что с N-конца удаляется такое же или большее количество аминокислот, чем у протоксинов более крупного размера, но на С-конце удаляется меньшее количество аминокислот. Например, протеолитическая активация представителей семейства Cry2, как правило, включает удаление примерно 40-50 N-концевых аминокислот. Многие белки Cry являются достаточно токсичными для определенных целевых насекомых, но многие обладают узкими спектрами активности.

[0007] Обычно белки Cry содержат пять доменов с консервативной последовательностью и три домена с консервативной структурой (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый домен с консервативной структурой, называемый домен I, как правило, состоит из семи альфа-спиралей и вовлечен во вставку в мембрану и образовании пор. Домен II, как правило, состоит из трех бета-складчатых слоев, расположенных в конфигурации типа греческий ключ, а домен III состоит из двух антипараллельных бета-складчатых слоев в виде структуры 'jelly-roll' (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III вовлечены в распознавание и связывание рецепторов, и поэтому считаются детерминантами специфичности токсина.

[0008] Многочисленные коммерчески ценные растения, в том числе широко распространенные сельскохозяйственные культуры, восприимчивы к нападению вредителей растений, в том числе насекомых-вредителей и нематод-вредителей, что приводит к существенному снижению урожайности и качества сельскохозяйственных культур. Например, вредители растений являются главным фактором потери урожая важных мировых сельскохозяйственных культур. Из-за повреждений, вызываемых беспозвоночными вредителями, в том числе насекомыми, ежегодный убыток в США составляет приблизительно 8 миллиардов долларов. Насекомые-вредители также становятся бременем для овощеводов и плодоводов, производителей декоративных цветов, а также владельцев приусадебных хозяйств.

[0009] Насекомых-вредителей контролируют главным образом путем интенсивного применения химических пестицидов, которые действуют путем подавления роста насекомых, препятствования питанию или размножению, или вызывая гибель. Средства для биологического контроля вредителей, например, штаммы Bacillus thuringiensis, экспрессирующие пестицидные токсины, такие как белки Cry, также применялись в отношении культурных растений с удовлетворительными результатами, что является альтернативой или дополнением к химическим пестицидам. Были выделены гены, кодирующие некоторые из этих белков Cry, и было показано, что их экспрессия в гетерологичных хозяевах, таких как трансгенные растения, обеспечивает другой инструмент для контроля экономически важных насекомых-вредителей.

[0010] Таким образом, можно достичь надлежащего контроля насекомых, но определенные химические вещества иногда могут наносить вред на нецелевым полезным насекомым, и определенные биологические вещества имеют очень узкий спектр активности. Кроме того, продолжительное применение определенных способов химического и биологического контроля повышает вероятность развития у насекомых-вредителей устойчивости к таким мерам контроля. Частично с этим боролись путем применения различных агротехнических приемов, связанных с устойчивостью, но все еще сохраняется потребность в разработке новых и эффективных средств для контроля вредителей, которые обеспечивают экономическую пользу фермерам и которые являются приемлемыми с точки зрения охраны окружающей среды. Особенно необходимыми являются средства для контроля, которые могут целенаправленно воздействовать на более широкий спектр экономически важных насекомых-вредителей, и которые обеспечивают эффективный контроль линий насекомых, которые могут стать устойчивыми к существующим средствам для контроля насекомых или являются таковыми.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0011] Ввиду этих потребностей целью настоящего изобретения является обеспечение новых средств для контроля вредителей путем обеспечения новых изолятов Bacillus thuringiensis (Bt), а также новых генов и пестицидных белков, которые можно применять для контроля множества вредителей растений.

[0012] В настоящем изобретении предусмотрены композиции и способы придания пестицидной активности бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. В частности, предусмотрены химерные гены, представляющие собой новые полинуклеотиды, которые кодируют белки Cry, выделенные из Bt, и последовательности в значительной степени идентичные им, экспрессия которых приводит к образованию белков, обладающих токсичностью в отношении экономически важных насекомых-вредителей, в частности, насекомых-вредителей, которые поражают растения. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым белкам Cry, полученным в результате экспрессии полинуклеотидов, а также к композициям и составам, содержащим белки Cry, которые оказывают токсическое воздействие на насекомых путем подавления способности насекомых-вредителей к выживанию, росту и размножению, либо путем ограничения повреждения или гибели культурных растений, вызванных насекомыми. Белки Cry по настоящему изобретению включают нативные белки Cry и мутантные или вариантные белки Cry, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций. Примеры мутантных белков Cry включают без ограничения белки, которые подвергнуты мутации с тем, чтобы обладать более широким спектром активности или более высокой специфичностью по сравнению с их аналогами, нативными белками Cry, или белки, которые подвергнуты мутации с тем, чтобы ввести эпитоп для продуцирования антител, которые избирательно распознают мутантный белок, а не нативный белок, или подвергнутые мутации с тем, чтобы модулировать экспрессию в трансгенном организме. Новые белки Cry по настоящему изобретению обладают высокой токсичностью в отношении насекомых-вредителей. Например, белки Cry по настоящему изобретению можно применять для контроля одного или нескольких экономически важных насекомых-вредителей, таких как совка-ипсилон (Agrotis ipsilon), кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis), совка травяная (Spodoptera frugiperda), американская кукурузная совка (Helicoverpa zea), огневка тростниковая (Diatraea saccharalis), гусеница совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевая совка (Chrysodeixis includes), огневка кукурузная юго-западная (Diatraea grandiosella), западная бобовая совка (Richia albicosta), табачная совка (Heliothis virescens), восточный кукурузный мотылек (Ostrinia furnacalis), хлопковая совка (Helicoverpa armigera), огневка желтая рисовая (Chilo suppressalis), розовая стеблевая совка (Sesamia calamistis), огневка рисовая (Cnaphalocrocis medinalis) и т.п.

[0013] В настоящем изобретении также предусмотрены синтетические полинуклеотиды, которые кодируют белки Cry по настоящему изобретению, которые имеют один или несколько кодонов, оптимизированных для экспрессия в трансгенных организмах, таких как трансгенные бактерии или трансгенные растения.

[0014] Настоящее изобретение дополнительно относится к кассетам экспрессии и рекомбинантным векторам, содержащим полинуклеотид, который кодирует белок Cry по настоящему изобретению. В настоящем изобретении также предусмотрены трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, ткани и семена, содержащие химерный ген, или кассету экспрессии, или рекомбинантный вектор, которые применимы для экспрессии белка Cry по настоящему изобретению в трансформированных бактериях, растениях, растительных клетках, тканях и семенах.

[0015] Настоящее изобретение также направлено на выделенные штаммы Bacillus thuringiensis (Bt), которые продуцируют белки Cry по настоящему изобретению. Такие штаммы Bt могут представлять собой встречающиеся в природе изолят или штамм рекомбинантного Bt, которые продуцируют один или несколько белков Cry по настоящему изобретению.

[0016] Настоящее изобретение также направлено на способы применения полинуклеотидов оп настоящему изобретению, например, в ДНК-конструкциях, или химерных генах, или кассетах экспрессии, или рекомбинантных векторах для трансформации и экспрессии в организмах, в том числе растениях и микроорганизмах, таких как бактерии. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут представлять собой нативные или синтетические последовательности, которые были сконструированы для экспрессии в организме, таком как растение или бактерия, или в получении гибридных токсинов Cry с усиленной пестицидной активностью. Кроме того, настоящее изобретение направлено на способы получения белков Cry и на способы применения последовательностей полинуклеотидов и белков Cry, например в микроорганизмах, для контроля насекомых, или в трансгенных растениях для обеспечения защиты от насекомых.

[0017] Другой аспект настоящего изобретения включает инсектицидные композиции и составы, содержащие белки Cry или штаммы Bacillus thuringiensis по настоящему изобретению, и способы применения композиций или составов для контроля популяций насекомых, например, путем нанесения композиций или составов на пораженные вредителями площади, или для профилактической обработки восприимчивых к насекомым площадей или растений для обеспечения защиты от насекомых-вредителей. Необязательно композиции или составы по настоящему изобретению могут, в дополнение к белку Cry или штамму Bt по настоящему изобретению, содержать другие пестицидные средства, такие как химические пестициды, для увеличения или усиления способности композиции или состава обеспечивать контроль насекомых.

[0018] Композиции и способы по настоящему изобретению являются применимыми для контроля насекомых-вредителей, которые поражают растения, в частности, культурные растения. Композиции по настоящему изобретению также применимы для получения измененных или улучшенных белков Cry, которые характеризуются пестицидной активностью, или для обнаружения наличия белка Cry или нуклеиновых кислот в коммерческих продуктах или трансгенных организмах.

[0019] Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут более понятны со ссылкой на следующее подробное описание и формулу изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0020] SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0016.

[0021] SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0026.

[0022] SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ВТ-0032.

[0023] SEQ ID NO: 4 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0016.

[0024] SEQ ID NO: 5 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0026.

[0025] SEQ ID NO: 6 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность, кодирующую белок ВТ-0032.

[0026] SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0016.

[0027] SEQ ID NO: 8 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0026.

[0028] SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок ВТ-0032.

[0029] SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0016.

[0030] SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0026.

[0031] SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность белка ВТ-0032.

[0032] SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0016.

[0033] SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0026.

[0034] SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка ВТ-0032.

[0035] SEQ ID NO: 16-17 представляют собой последовательности праймеров, используемые в данном изобретении.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0036] Не подразумевается, что данное описание является подробным перечнем всех различных способов, с помощью которых может быть реализовано настоящее изобретение, или всех признаков, которые можно добавить к настоящему изобретению. Например, признаки, проиллюстрированные в отношении одного варианта осуществления, могут быть включены в другие варианты осуществления, а признаки, проиллюстрированные в отношении конкретного варианта осуществления, могут быть удалены из этого варианта осуществления. Таким образом, настоящим изобретением предполагается, что в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно исключить или опустить любой признак или комбинацию признаков, изложенных в данном документе. Кроме того, многочисленные вариации и дополнения к различным вариантам осуществления, предлагаемым в данном документе, будут очевидны для специалистов в данной области в свете настоящего раскрытия, которое не отступает от сути настоящего изобретения. Следовательно, следующие описания предназначены для иллюстрации некоторых конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, а не исчерпывающего определения всех их преобразований, комбинаций и вариаций.

[0037] Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Терминология, применяемая в данном документе при описании настоящего изобретения, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения настоящего изобретения.

Определения

[0038] Применяемые в данном документе и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на "растение" является ссылкой на одно или несколько растений и включает их эквиваленты, известные специалистам в данной области, и т.д. Применяемое в данном документе слово "или" означает любой элемент из конкретного перечня, а также включает любую комбинацию элементов из такого перечня (то есть, включает также "и").

[0039] Применяемый в данном документе термин "приблизительно" означает примерно, ориентировочно, около или в районе. Если термин "приблизительно" применяется в сочетании с числовым диапазоном, он модифицирует этот диапазон, расширяя границы выше и ниже указанных численных значений. В целом, применяемый в данном документе термин "приблизительно" модифицирует численное значение выше и ниже указанного значения путем отклонения на 20 процентов, предпочтительно 10 процентов вверх или вниз (больше или меньше). Что касается температуры, термин "приблизительно" означает ±1°С, предпочтительно ±0,5°С. Если термин "приблизительно" применяется в контексте настоящего изобретения (например, в комбинациях с температурой или значениями молекулярной массы), предпочтительным является точное значение (то есть, без "приблизительно").

[0040] Под "активностью" токсичного белка Cry по настоящему изобретению подразумевается, что токсичный белок действует как активное при пероральном поступлении средство для контроля насекомых, обладает токсическим действием или способен нарушать или ограничивать питание насекомых, что может или не может вызвать гибель насекомого. Когда токсичный белок по настоящему изобретению доставляется в организм насекомого, как правило, результатом является гибель насекомого, или насекомое не питается источником, который делает токсичный белок доступным для насекомого.

[0041] Применяемый в данном документе термин "амплифицированный" означает создание множества копий молекулы нуклеиновой кислоты или множества копий, комплементарных молекуле нуклеиновой кислоты, с применением по меньшей мере одной из молекул нуклеиновых кислот в качестве матрицы. Системы амплификации включают систему на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему на основе лигазной цепной реакции (LCR), систему амплификации, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA, Cangene, Миссиссога, Онтарио), систему на основе Q-бета репликазы, систему амплификации, основанную на транскрипции (TAS), и амплификацию с замещением цепей (SDA). См., например, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, PERSING et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). Продукт амплификации называется "ампликоном".

[0042] Применяемый в данном документе термин "химерная конструкция", или "химерный ген", или "химерный полинуклеотид", или "химерная нуклеиновая кислота" (или подобные термины) относится к конструкции или молекуле, содержащей два или более полинуклеотидов разного происхождения, собранных в одну молекулу нуклеиновой кислоты. Термин "химерная конструкция", "химерный ген", "химерный полинуклеотид" или "химерная нуклеиновая кислота" относится к любой конструкции или молекуле, которая содержит без ограничения (1) полинуклеотиды (например, ДНК), в том числе регуляторные и кодирующие полинуклеотиды, которые вместе не встречаются в природе (то есть, по меньшей мере один из полинуклеотидов в конструкции является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из его других полинуклеотидов), или (2) полинуклеотиды, кодирующие части белков, не связанные в природе, или (3) части промоторов, которые не связаны в природе. Кроме того, химерная конструкция, химерный ген, химерный полинуклеотид или химерная нуклеиновая кислота могут содержать регуляторные полинуклеотиды и кодирующие полинуклеотиды, полученные из разных источников, или могут содержать регуляторные полинуклеотиды и кодирующие полинуклеотиды, полученные из одного и того же источника, но расположенные иным способом, чем встречающийся в природе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерная конструкция, химерный ген, химерный полинуклеотид или химерная нуклеиновая кислота содержат кассету экспрессии, содержащую полинуклеотид по настоящему изобретению под контролем регуляторных полинуклеотидов, в частности, под контролем регуляторных полинуклеотидов, функционирующих в растениях или бактериях.

[0043] "Кодирующая последовательность" представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в РНК, такую как mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно РНК затем транслируется в организме с продукцией белка.

[0044] Применяемое в данном документе выражение "кодон-оптимизированная" последовательность означает нуклеотидную последовательность рекомбинантного, трансгенного или синтетического полинуклеотида, в котором кодоны выбраны так, чтобы отражать склонность к определенным кодонам, которая может наблюдаться в клетке- или организме-хозяине. Как правило, это выполняется таким образом, чтобы сохранить аминокислотную последовательность полипептида, кодируемого кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК рекомбинантной ДНК-конструкции включает последовательность, которая была кодон-оптимизирована для клетки (например, клетки животного, растения или гриба), в которой данная конструкция будет экспрессироваться. Например, у конструкции, которая будет экспрессироваться в растительной клетке, может быть кодон-оптимизированной для экспрессии в растении вся последовательность или ее часть (например, первый элемент для супрессии гена или элемент для экспрессии гена). См., например, патент США №6121014, включенный в данный документ посредством ссылки.

[0045] "Контроль" насекомых означает подавление, посредством токсического действия, способности насекомых-вредителей к выживанию, росту, питанию или размножению, или ограничение повреждения или гибели культурных растений, вызванных насекомыми, или защиту максимального потенциального урожая сельскохозяйственной культуры при выращивании в присутствии насекомых-вредителей. "Контроль" насекомых может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя, предпочтительно, означает уничтожение насекомых.

[0046] При использовании в данном описании термины "содержит" или "содержащий" указывают на присутствие изложенных признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов или компонентов, но не исключают присутствия или добавления одного или нескольких других признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов, компонентов или их групп.

[0047] Применяемая в данном документе переходная фраза "состоящий главным образом из" (и ее грамматические варианты) означает, что объем пункта формулы изобретения следует интерпретировать как охватывающий указанные материалы или стадии, перечисленные в данном пункте формулы изобретения, и такие, которые существенно не изменяют основную и новую(новые) характеристику(характеристики) заявляемого изобретения. Таким образом, термин "состоящий главным образом из" в случае, если он используется в пункте формулы настоящего изобретения, не предназначен для интерпретации как эквивалент термина "содержащий".

[0048] В контексте настоящего изобретения "соответствующий" или "соответствует" означает, что когда аминокислотные последовательности вариантного или гомологичного белков Cry выравнивают друг с другом, аминокислоты, которые "соответствуют" определенным перечисленным положениям в вариантном или гомологичном белке, являются такими, которые выравниваются с этими положениями в эталонном белке, но не обязательно находятся именно в этих числовых положениях относительно конкретной эталонной аминокислотной последовательности по настоящему изобретению. Например, если SEQ ID NO: 10 является эталонной последовательностью, и ее выравнивают с SEQ ID NO: 12, Met623 SEQ ID NO: 12 "соответствует" Met614 SEQ ID NO: 10.

[0049] Применяемый в данном документе термин "белок Cry" означает инсектицидный белок типа кристаллического дельта-эндотоксина из Bacillus thuringiensis. Термин "белок Cry" может относиться к протоксиновой форме или к любому его инсектицидно активному фрагменту или токсину.

[0050] "Доставка" композиции или токсичного белка означает, что композиция или токсичный белок вступает в контакт с насекомым, способствуя пероральному поеданию композиции или токсичного белка, что приводит к токсическому действию и контролю насекомого. Данную композицию или токсичный белок можно доставлять множеством известных путей, в том числе без ограничения посредством экспрессии в трансгенном растении, составленной(составленных) белковой(белковых) композиции(композиций), распыляемой(распыляемых) белковой(белковых) композиции(композиций), матрицы с приманкой или с помощью любой другой известной в данной области системы доставки токсина.

[0051] Термин "домен" относится к набору аминокислот, консервативных в определенных положениях по длине выравнивания последовательностей эволюционно родственных белков. В то время как аминокислоты в других положениях гомологов могут отличаться, аминокислоты, которые являются высококонсервативными в определенных положениях, указывают на аминокислоты, которые, вероятно, являются необходимыми для структуры, стабильности или функции белка. Идентифицированные по их высокой степени консервативности в выравненных последовательностях семейства гомологов белков, они могут применяться в качестве идентификаторов для определения того, принадлежит ли любой рассматриваемый полипептид к ранее идентифицированной группе полипептидов.

[0052] "Эффективное для контроля насекомых количество" означает, что концентрация токсичного белка, которая обеспечивает подавление, посредством токсического действия, способности насекомых к выживанию, росту, питанию или размножению, или ограничение вызванных насекомыми повреждения или гибели культурного растения, или защиту максимального потенциального урожая сельскохозяйственной культуры при выращивании в присутствии насекомых-вредителей. "Эффективное для контроля насекомых количество" может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя предпочтительно оно означает уничтожение насекомых.

[0053] Применяемый в данном документе термин "кассета экспрессии" означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией по меньшей мере одного представляющего интерес полинуклеотида, такого как полинуклеотид, кодирующий белок Cry по настоящему изобретению, в соответствующей клетке-хозяине, содержащую промотор, функционально связанный с представляющим интерес полинуклеотидом, который функционально связан с сигналом терминации. "Кассета экспрессии" также, как правило, содержит дополнительные полинуклеотиды, необходимые для надлежащей трансляции представляющего интерес полинуклеотида. Кассета экспрессии также может содержать другие полинуклеотиды, которые не требуются для управления экспрессией представляющего интерес полинуклеотида, но которые присутствует из-за соответствующих сайтов рестрикции для извлечения кассеты из вектора экспрессии. Кассета экспрессии, содержащая представляющий(представляющие) интерес полинуклеотид(полинуклеотиды), может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии может также представлять собой последовательность, которая встречается в природе, но была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Тем не менее, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, то есть представляющий интерес полинуклеотид в кассете экспрессии не встречается в природе в клетке-хозяине, и его необходимо было ввести в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью процесса трансформации или процесса скрещивания. Экспрессия представляющего интерес полинуклеотида(полинуклеотидов) в кассете экспрессии обычно находится под контролем промотора. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфичным или предпочтительным по отношению к конкретной ткани, или органу, или стадии развития. После трансформации в растение кассета экспрессии или ее фрагмент также могут называться "вставленным полинуклеотидом" или "полинуклеотидом вставки".

[0054] "Ген" определяется в данном документе как единица наследственности, содержащая один или несколько полинуклеотидов, которая занимает определенное местоположение на хромосоме или плазмиде, и которая содержит генетическую инструкцию для определенной характеристики или признака, свойственных организму.

[0055] "Протеаза пищеварительного канала" представляет собой протеазу, которая в встречается в пищеварительном тракте насекомого в природе. Данная протеаза, как правило, участвует в переваривании поглощенных белков. Примеры протеаз пищеварительного канала включают трипсин, который, как правило, расщепляет пептиды с С-концевой части остатков лизина (K) или аргинина (R), и химотрипсин, который, как правило, расщепляет пептиды с С-концевой части фенилаланина (F), триптофана (W) или тирозина (Y).

[0056] Термин "гетерологичный" при применении в отношении гена, или полинуклеотида, или полипептида относится к гену, или полинуклеотиду, или полипептиду, или их части, который не находятся в его естественном окружении (т.е. который был изменен посредством вмешательства человека). Например, гетерологичный ген может предусматривать полинуклеотид одного вида, введенный в организм другого вида. Гетерологичный ген также может предусматривать полинуклеотид, нативный по отношению к организму, но который был изменен определенным образом (например, подвергнут мутации, добавлен в виде множества копий, связан с ненативным промоторным или энхансерным полинуклеотидом и т.д.). Гетерологичные гены дополнительно могут предусматривать полинуклеотиды генов растения, которые включают cDNA-формы гена растения; cDNA могут экспрессироваться либо в смысловой (с получением mRNA), либо антисмысловой ориентации (с получением антисмыслового РНК-транскрипта, комплементарного mRNA-транскрипту). В одном аспекте настоящего изобретения гетерологичные гены отличаются от эндогенных генов растения тем, что полинуклеотид гетерологичного гена, как правило, присоединен к полинуклеотидам, содержащим регуляторные элементы, такие как промоторы, которые в природе не встречаются как ассоциированные с геном белка, кодируемого гетерологичным геном, или с полинуклеотидом гена растения в хромосоме, или ассоциированы с частями хромосомы, в которых они не встречаются в природе (например, гены экспрессируются в локусах, в которых указанный ген в обычных условиях не экспрессируется). Кроме того, "гетерологичный" полинуклеотид относится к полинуклеотиду, в природе не ассоциированному с клеткой-хозяином, в которую его вводят, в том числе к не встречающимся в природе множественным копиям полинуклеотида, встречающегося в природе.

[0057] "Гомологичная рекомбинация" представляет собой обмен ("кроссинговер") фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или хроматидами пар хромосом в участке идентичных полинуклеотидов. Будет понятно, что "событие рекомбинации" в данном документе означает мейотический кроссинговер.

[0058] Последовательность нуклеиновой кислоты является "изокодонной" по отношению к эталонной последовательности нуклеиновой кислоты в том случае, когда последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, SEQ ID NO: 4 является изокодонной по отношению к SEQ ID NO: 1, поскольку они обе кодируют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.

[0059] Термин "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или белок представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или белок, которые больше не находятся в своей естественной среде. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, полинуклеотид или белок по настоящему изобретению могут находиться в очищенной форме или могут находиться в рекомбинантном хозяине, в таком как трансгенная бактерия или трансгенное растение.

[0060] "Молекула нуклеиновой кислоты" представляет собой одно- или двухнитевую ДНК или РНК, которые могут быть выделены из любого источника. В контексте настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является сегментом ДНК.

[0061] "Функционально связанный" относится к ассоциации полинуклеотидов на одном фрагменте нуклеиновой кислоты, вследствие чего функция одного влияет на функцию другого. Например, промотор является функционально связанным с кодирующим полинуклеотидом или функциональной РНК, когда он может влиять на экспрессию такого кодирующего полинуклеотида или функциональной РНК (то есть такой кодирующий полинуклеотид или функциональная РНК находятся под контролем промотора на уровне транскрипции). Кодирующий полинуклеотид в смысловой или антисмысловой ориентации может быть функционально связан с регуляторными полинуклеотидами.

[0062] Применяемые в данном документе выражения "пестицидный," инсектицидный" и т.п. относятся к способности белка Cry по настоящему изобретению обеспечивать контроль вредного организма или к количеству белка Cry, которое может обеспечивать контроль вредного организма, как определено в данном документе. Таким образом, пестицидный белок Cry может подавлять способность вредного организма (например, насекомого-вредителя) к выживанию, росту, питанию или размножению или уничтожать его.

[0063] "Растение" представляет собой любое растение на любой стадии развития, в частности, семенное растение.

[0064] "Растительная клетка" представляет собой структурную и физиологическую единицу растения, содержащую протопласт и клеточную стенку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной одиночной клетки или культивируемой клетки или в качестве части более высокоорганизованной единицы, такой как, например, растительная ткань, орган растения или целое растение.

[0065] "Культура растительных клеток" означает культуры структурных единиц растения, таких как, например, протопласты, клетки в культуре клеток, клетки растительных тканей, пыльцы, пыльцевых трубок, семязачатков, зародышевых мешков, зиготы и зародышей на различных стадиях развития.

[0066] "Растительный материал" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, черенкам, клеточным или тканевым культурам, или к любым другим частям или продуктам растения.

[0067] "Орган растения" представляет собой отдельную и визуально структурированную и дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.

[0068] Выражение "растительная ткань", применяемое в данном документе, означает группу растительных клеток, организованных в структурную и функциональную единицу. Предусматривается любая ткань растения in planta или в культуре. Данный термин включает без ограничения целые растения, органы растений, семена растений, тканевую культуру и любые группы растительных клеток, организованных в структурные или функциональные единицы. Применение данного термина в сочетании с любым специфическим типом растительной ткани, приведенным выше или иным образом охваченным данным определением, или без такового не предназначено для исключения любого другого типа растительной ткани.

[0069] "Полинуклеотид" относится к полимеру, состоящему из большого числа мономеров-нуклеотидов, ковалентно связанных в цепь. Такие "полинуклеотиды" включают ДНК, РНК, модифицированные олигонуклеотиды (например, олигонуклеотиды, содержащие основания, которые не являются типичными для биологической РНК или ДНК, такие как 2'-O-метилированные олигонуклеотиды) и т.п. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или полинуклеотид могут быть однонитевыми, двухнитевыми, многонитевыми или представлять собой их комбинацию. Если не указано иное, определенная нуклеиновая кислота или полинуклеотид по настоящему изобретению необязательно содержат или кодируют комплементарные полинуклеотиды, в дополнение к любому явно указанному полинуклеотиду.

[0070] "Представляющий интерес полинуклеотид" относится к любому полинуклеотиду, который при переносе в организм, например растение, придает организму требуемую характеристику, такую как устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням, толерантность к гербицидам, устойчивость к антибиотикам, улучшенная питательная ценность, улучшенные показатели в производственном процессе, продукция коммерчески ценных ферментов или метаболитов или измененная репродуктивная способность.

[0071] Термин "промотор" относится к полинуклеотиду, как правило, расположенному выше (5') от его кодирующего полинуклеотида, который осуществляет контроль экспрессии кодирующего полинуклеотида, обеспечивая узнавание РНК-полимеразой и другими факторами, необходимыми для правильной транскрипции.

[0072] "Протопласт" представляет собой выделенную клетку растения без клеточной стенки или только с частями клеточной стенки.

[0073] Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" относится к форме нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК) или белка, или организма, которая обычно не будет встречаться в природе, и которая как таковая была создана посредством вмешательства человека. Применяемая в данном документе "молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую комбинацию полинуклеотидов, которые в природе не встречаются вместе и являются результатом вмешательства человека, например, молекулу нуклеиновой кислоты, которая состоит из комбинации по меньшей мере двух полинуклеотидов, гетерологичных по отношению друг к другу, или молекулу нуклеиновой кислоты, синтезированную искусственно и содержащую полинуклеотид, который отличается от полинуклеотида, который будет в норме существовать в природе, или молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит трансген, искусственно введенный в геномную ДНК клетки-хозяина, и ассоциированную фланкирующую ДНК генома клетки-хозяина. Примером молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты является молекула ДНК, полученная в результате вставки трансгена в геномную ДНК растения, что в конечном итоге может приводить к экспрессии молекулы рекомбинантной РНК или белка в данном организме. Применяемое в данном документе выражение "рекомбинантное растение" представляет собой растение, которое обычно не будет существовать в природе, и оно является результатом вмешательства человека и содержит трансген или гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, встроенную в его геном. В результате такого изменения генома рекомбинантное растение явно отличается от родственного растения дикого типа.

[0074] "Регуляторные элементы" относятся к последовательностям, вовлеченным в контроль экспрессии нуклеотидной последовательности. Регуляторные элементы предусматривают промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, и сигналы терминации. Как правило, они охватывают также последовательности, необходимые для надлежащей трансляции нуклеотидной последовательности.

[0075] Термин "идентичность", или "идентичный", или "в значительной степени идентичный" в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые характеризуются по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью нуклеотидных или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, что определено с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной проверки. Предпочтительно значительная степень идентичности имеет место в пределах участка последовательностей, который состоит из по меньшей мере приблизительно 50 остатков или оснований в длину, более предпочтительно в пределах участка, состоящего из по меньшей мере приблизительно 100 остатков или оснований, и наиболее предпочтительно последовательности в значительной степени идентичны в пределах по меньшей мере приблизительно 150 остатков или оснований. В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательности являются в значительной степени идентичными по всей длине кодирующих участков. Кроме того, в значительно степени идентичные последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотные последовательности выполняют фактически одинаковую функцию.

[0076] При сравнении последовательностей одна последовательность обычно выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты подпоследовательности, и задают программные параметры алгоритма сравнения последовательностей. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей на основе заданных программных параметров вычисляют процентную идентичность последовательностей для тестируемой(тестируемых) последовательности(последовательностей) относительно эталонной последовательности.

[0077] Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии по Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с помощью способа поиска сходства по Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85: 2444 (1988), с помощью реализации данных алгоритмов в компьютерных программах (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин) или путем визуальной проверки (в целом см. Ausubel et al., ниже).

[0078] Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST является общедоступным в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Бетесда, Мэриленд 20894, США). Данный алгоритм предусматривает изначальную идентификацию пар последовательностей с наибольшим сходством (HSP) путем идентификации коротких "слов" длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому показателю Т при выравнивании со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговым показателем соседнего "слова" (Altschul et al., 1990). Эти исходные совпадения соседних "слов" выступают в качестве затравки для начала поисков с целью обнаружения более длинных HSP, содержащих их. Совпадения "слов" затем продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может увеличиваться совокупный показатель выравнивания. Совокупные показатели рассчитывают с применением, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (балл-вознаграждение, начисляемый за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл, начисляемый за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей, для расчета совокупного показателя применяют матрицу замен. Продление совпадений "слов" в каждом направлении прекращается, когда совокупный показатель выравнивания снижается на величину X от его максимального достигнутого значения, при этом совокупный показатель падает до нуля или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательными показателями, либо в случае достижения конца одной из последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используется длина "слова" (W), равная 11, ожидаемое значение (Е), равное 10, пороговое значение, равное 100, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию "длину слова" (W), равную 3, среднее значение (Е), равное 10, а также матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA 89: 10915 (1989)).

[0079] В дополнение к расчету процентной идентичности последовательностей алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Одной мерой сходства, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), являющаяся показателем вероятности, согласно которому совпадения между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будут наблюдаться случайным образом. Например, тестируемая последовательность нуклеиновой кислоты считается подобной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой последовательности нуклеиновой кислоты с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты составляет менее приблизительно 0,1, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.

[0080] Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот в значительной степени идентичны, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях. Фраза "гибридизируется специфически с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях, когда такая последовательность присутствует в сложной смеси (например, общих клеточных) ДНК или РНК. "В значительной степени связывается" относится к гибридизации комплементарных последовательностей, нуклеиновой кислоты-зонда и целевой нуклеиновой кислоты, и также охватывает незначительные несовпадения, которые могут компенсироваться за счет снижения жесткости среды для гибридизации, чтобы добиться требуемого обнаружения целевой последовательности нуклеиновой кислоты.

[0081] "Жесткие условия гибридизации" и "жесткие условия отмывки при гибридизации" в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и нозерн-гибридизация, зависят от последовательности и отличаются при разных параметрах окружающей среды. Более длинные последовательности специфично гибридизируются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. Как правило, условия гибридизации и отмывки высокой жесткости выбирают так, чтобы температура была приблизительно на 5°С ниже точки плавления (T_m) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Как правило, в "жестких условиях" зонд будет гибридизироваться со своей целевой подпоследовательностью, а не с другими последовательностями.

[0082] Значение T_m представляет собой температуру (при определенных ионной силе и значении рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизируется с точно совпадающим зондом. Для очень жестких условий выбирают температуру, равную T_m для конкретного зонда. Примером жестких условий гибридизации для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков на фильтре при Саузерн- или нозерн-блоттинге, является 50% формамида с 1 мг гепарина при 42°С, при этом гибридизацию проводят в течение ночи. Примером условий отмывки высокой жесткости является 0,15 М NaCl при 72°С в течение приблизительно 15 минут. Примером жестких условий отмывки является отмывка с помощью 0,2 × SSC при 65°С в течение 15 минут (описание буфера SSC см. в Sambrook ниже). Часто с целью избавления от фонового сигнала зонда отмывке в условиях высокой жесткости предшествует отмывка в условиях низкой жесткости. Примером условий отмывки средней жесткости для дуплекса, имеющего, например, более 100 нуклеотидов, является 1 × SSC при 45°С в течение 15 минут. Примером условий отмывки низкой жесткости для дуплекса, имеющего, например, более 100 нуклеотидов, является 4-6 × SSC при 40°С в течение 15 минут. Для коротких зондов (например, длиной от приблизительно 10 до 50 нуклеотидов) жесткие условия, как правило, предусматривают концентрации солей, составляющие менее чем приблизительно 1,0 М ионов Na, как правило, концентрации, составляющие приблизительно 0,01-1,0 М ионов Na (или других солей) при рН 7,0-8,3, а также температуру, как правило, составляющую по меньшей мере приблизительно 30°С. Жестких условий также можно достигать путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. В целом, соотношение сигнал-шум, в 2 × (или более) раза превышающее наблюдаемое для неродственного зонда в конкретном гибридизационном анализе, указывает на выявление специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизируются друг с другом в жестких условиях, все еще являются в значительной степени идентичными, если белки, которые они кодируют, в значительной степени идентичны. Например, это происходит в тем случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с применением максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

[0083] Примеры комплексов условий гибридизации/отмывки, которые можно применять для клонирования гомологичных нуклеотидных последовательностей, которые в значительной степени идентичны эталонным нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению, являются следующими: эталонная нуклеотидная последовательность предпочтительно гибридизируется с эталонной нуклеотидной последовательностью в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄,1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 2 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, более желательно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 1 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, еще более желательно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,5 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,1 × SSC, 0,1% SDS при 50°С, более предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,1 × SSC, 0,1% SDS при 65°С.

[0084] Еще одним показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот или белки являются в значительной степени идентичными, является то, что белок, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, характеризуется иммунологической перекрестной реактивностью с белком, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, или специфически связывается в таких реакциях. Таким образом, белок, как правило, является в значительной степени идентичным второму белку, например, если два белка отличаются только консервативными заменами.

[0085] "Синтетический" относится к нуклеотидной последовательности, содержащей основания или структурные признаки, отсутствующие в природной последовательности. Например, синтетической считается искусственная последовательность, кодирующая белок Cry по настоящему изобретению, которая по содержанию G+C и нормальному распределению кодонов больше похожа на гены двудольных или однодольных растений.

[0086] Как используется в данном документе, белок Cry, который является "токсичным" для насекомого-вредителя, означает, что белок Cry функционирует в качестве активного при пероральном поглощении средства контроля насекомых для уничтожения насекомых-вредителей, или белок Cry способен нарушать или ограничивать питание насекомых, или вызывать подавление роста насекомого-вредителя, причем каждый из них может вызвать гибель насекомого или может не вызывать. Когда белок Cry по настоящему изобретению доставляется в организм насекомого или насекомое контактирует с белком Cry при пероральном поглощении, как правило, результатом является гибель насекомого, или рост насекомого замедляется, или насекомое прекращается питаться источником, который делает токсичный белок Cry доступным для насекомого.

[0087] "Трансформация" представляет собой процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку- или организм-хозяин. В частности, "трансформация" означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.

[0088] "Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный" относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растение, в который была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекулу нуклеиновой кислоты можно стабильно интегрировать в геном хозяина, или же молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может быть автореплицирующейся. Подразумевается, что трансформированные клетки, ткани или растения охватывают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и его трансгенное потомство. "Нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный" хозяин относится к организму дикого типа, например, бактерии или растению, которые не содержат гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.

[0089] Нуклеотиды обозначены по их основаниям с помощью следующих стандартных сокращений: аденин (А), цитозин (С), тимин (Т) и гуанин (G). Аналогичным образом, аминокислоты обозначены с помощью следующих стандартных сокращений: аланин (Ala; А), аргинин (Arg; R), аспарагин (Asn; N), аспарагиновая кислота (Asp; D), цистеин (Cys; С), глутамин (Gin; Q), глутаминовая кислота (Glu; Е), глицин (Gly; G), гистидин (His; Н), изолейцин (Ile; 1), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), метионин (Met; М), фенилаланин (Phe; F), пролин (Pro; Р), серин (Ser; S), треонин (Thr; Т), триптофан (Trp; W), тирозин (Tyr; Y) и валин (Val; V).

[0090] В настоящем изобретении предусмотрены композиции и способы для контроля опасных вредителей растений. В частности, настоящее изобретение относится к белкам Cry, которые могут быть выделены из бактерий, таких как Bacillus thuringiensis, которые токсичны для насекомых-вредителей, и к полинуклеотидам, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие белки Cry, а также к получению и применению полинуклеотидов и белков Cry для контроля насекомых-вредителей.

[0091] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в настоящем изобретении предусмотрены молекула нуклеиновой кислоты или необязательно молекула выделенной нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок Cry в его протоксиновой форме или его биологически активный фрагмент или токсиновый фрагмент, где нуклеотидная последовательность (а) характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-3 или их фрагментом, кодирующим токсин; или (b) кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-12 или их токсиновым фрагментом; или (с) представляет собой синтетическую последовательность (а) или (b), которая имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме. В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность предусматривает любую из SEQ ID NO: 1-3 или любые фрагменты, кодирующие токсин, под любой из SEQ ID NO: 1-3. В других вариантах осуществления синтетическая нуклеотидная последовательность предусматривает любую из SEQ ID NO: 4-9 или любые фрагменты, кодирующие токсин, под любой из SEQ ID NO: 4-9.

[0092] Полинуклеотиды, которые являются фрагментами полинуклеотидов, кодирующих протоксины белков Cry, также охватываются настоящим изобретением. Под "фрагментом" подразумевается часть нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Cry. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активную часть белка Cry, так называемый "токсиновый фрагмент", или могут представлять собой фрагмент, который можно использовать в качестве гибридизационного зонда или праймера для ПНР, с применением раскрытых ниже способов. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются фрагментами нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Cry, содержат по меньшей мере приблизительно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450 смежных нуклеотидов или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в полноразмерном белке Cry, кодируемом нуклеотидной последовательностью, раскрытой в данном документе (например, 1875 нуклеотидов для SEQ ID NO: 1), в зависимости от планируемого применения. Под "смежными" нуклеотидами подразумеваются остатки нуклеотидов, которые непосредственно прилегают друг к другу. Некоторые фрагменты нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению будет кодировать токсиновые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность белка Cry и, следовательно, сохраняют инсектицидную активность. Под "сохраняет инсектицидную активность" подразумевается, что фрагмент будет характеризоваться по меньшей мере приблизительно 30%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% инсектицидной активностью белка Cry. Способы измерения инсектицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США №5743477, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

[0093] Токсиновый фрагмент белка Cry по настоящему изобретению будет кодировать по меньшей мере приблизительно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 и 450 смежных аминокислот или вплоть до полного количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке Cry по настоящему изобретению (например, 623 аминокислот для SEQ ID NO: 10).

[0094] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, состоит главным образом из или состоит из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Cry, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-12 или их токсиновым фрагментом. В некоторых других вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит, состоит главным образом из или состоит из любой из SEQ ID NO: 10-12 или их токсинового фрагмента. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления белки Cry, которые были активированы посредством протеолитического процессинга, например с помощью протеаз, полученных из пищеварительного канала насекомого, могут быть охарактеризованы, и идентифицированы N-концевые или С-концевые аминокислоты активированного токсинового фрагмента. В данном аспекте настоящего изобретения специалист в данной области сможет определить, что, например, токсиновый фрагмент с SEQ ID NO: 10, вероятно, содержит аминокислоты от приблизительно 43 до приблизительно 623 или от приблизительно 44 до приблизительно 623 из SEQ ID NO: 10, или токсиновый фрагмент с SEQ ID NO: 11, вероятно, содержит аминокислоты от приблизительно аминокислоты 41 до приблизительно 598, или от приблизительно 41 до приблизительно 631, или от приблизительно 42 до приблизительно 631, или от приблизительно 42 до 631 из SEQ ID NO: 11, или токсиновый фрагмент с SEQ ID NO: 12, вероятно, содержит аминокислоты от приблизительно аминокислоты 42 до приблизительно 585, или от приблизительно 42 до приблизительно 633, или от приблизительно аминокислоты 43 до приблизительно 585, или от приблизительно 43 до приблизительно 633 из SEQ ID NO: 12. Также в объеме настоящего изобретения находятся варианты белка Cry, полученные путем введения или удаления сайтов процессирования протеазами в соответствующих положениях в кодирующей последовательности для обеспечения или устранения протеолитического расщепления вариантов белка более крупного размера у насекомого, растения или микроорганизма. Под конечным результатом такой манипуляции следует понимать образование молекул токсинового фрагмента с такой же или лучшей активностью, как и интактный белок-протоксин Cry.

[0095] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен химерный ген, который содержит гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, содержащим, состоящим главным образом из или состоящим из нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок Cry, токсичный для вредителя, относящегося к чешуекрылым, где нуклеотидная последовательность (а) характеризуется от по меньшей мере 80% (например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) до по меньшей мере 99% (99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-3 или их фрагментом, кодирующим токсин; или (b) кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80% (например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) до по меньшей мере 99% (99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-12 или их токсиновым фрагментом; или (с) представляет собой синтетическую последовательность (а) или (b), которая имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме.

[0096] В других вариантах осуществления гетерологичный промотор представляет собой промотор, обеспечивающий экспрессию в растении. Например, без ограничения промотор, обеспечивающий экспрессию в растении, может быть выбран из группы промоторов, состоящей из промотора убиквитина, вируса, поражающего цеструм оранжевый, TrpA кукурузы, OsMADS 6, гистона Н3 маиса, 5'-UTR гена 9 бактериофага Т3, сахарозосинтетазы 1 кукурузы, алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы, светособирающего комплекса кукурузы, белка теплового шока кукурузы, mtl маиса, малой субъединицы RuBP карбоксилазы гороха, актина риса, циклофилина риса, маннопинсинтазы Ti-плазмиды, нопалинсинтазы Ti-плазмиды, халкон-изомеразы петунии, богатого глицином белка 1 бобов, пататина картофеля, лектина, 35S CaMV и малой субъединицы S-E9 RuBP карбоксилазы.

[0097] В дополнительных вариантах осуществления белок, кодируемый химерным геном, является токсичным для одного или нескольких вредителей, относящихся к чешуекрылым, выбранных из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки-ипсилон (Agrotis ipsilon), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), огневки тростниковой (Diatraea saccharalis), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes), огневки кукурузной юго-западной (Diatraea grandiosella), западной бобовой совки (Richia albicosta), табачной совки (Heliothis virescens), восточного кукурузного мотылька (Ostrinia furnacalis), хлопковой совки (Helicoverpa armigera), огневки желтой рисовой (Chilo suppressalis), розовой стеблевой совки (Sesamia calamistis) и огневки рисовой (Cnaphalocrocis medinalis).

[0098] В дополнительных вариантах осуществления полинуклеотид содержит, состоит главным образом из или состоит из нуклеотидной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или ее фрагментом, кодирующим токсин, или характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или ее фрагментом, кодирующим токсин, или характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3 или ее фрагментом, кодирующим токсин.

[0099] В других вариантах осуществления полинуклеотид содержит, состоит главным образом из или состоит из любой из SEQ ID NO: 1-3 или их фрагмента, кодирующего токсин.

[00100] В других вариантах осуществления полинуклеотид содержит, состоит главным образом из или состоит из нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, содержащий, состоящий главным образом из или состоящий из аминокислотной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-12 или их токсиновым фрагментом.

[00101] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10 или ее токсиновым фрагментом.

[00102] В дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 11 или ее токсиновым фрагментом.

[00103] В еще дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12 или ее токсиновым фрагментом.

[00104] В некоторых вариантах осуществления химерный ген по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, содержащий синтетическую последовательность нуклеотидной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере на 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 4-9, где синтетическая последовательность имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме. В других вариантах осуществления химерный ген по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, содержащий синтетическую последовательность нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-15 или ее токсиновым фрагментом, где синтетическая последовательность имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме. В дополнительных вариантах осуществления трансгенный организм представляет собой трансгенную бактерию или трансгенное растение.

[00105] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен синтетический полинуклеотид, содержащий, состоящий главным образом из или состоящий из нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, где нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 4-9 или их фрагментом, кодирующим токсин.

[00106] В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен синтетический полинуклеотид, содержащий, состоящий главным образом из или состоящий из нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, где нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсиновым фрагментом.

[00107] Белки Cry по настоящему изобретению могут быть выделены из определенных штаммов Bacillus thuringiensis (Bt), таких как С0633, С0724 и C1100. Будет понятно, что белки Cry по настоящему изобретению могут быть выделены из других штаммов Bt, и что такие штаммы Bt могут быть выделены посредством стандартных методик и протестированы в отношении токсичности для вредителя, относящегося к чешуекрылым, по настоящему изобретению. Обычно штаммы Bt могут быть выделены из любого образца окружающей среды, в том числе из почвы, растения, насекомого, зерновой пыли на элеваторе и других материалов-образцов и т.д., например с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, Travers et al. (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:1263-1266; Saleh et al. (1969) Can J. Microbiol. 15:1101-1104; DeLucca et al. (1981) Can J. Microbiol. 27:865-870; и Norris, et al. (1981) "The genera Bacillus and Sporolactobacillus." In Starr et al. (eds.), The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, Vol. II, Springer-Verlog Berlin Heidelberg. После выделения штаммы Bt можно тестировать в отношении их токсичности для вредителя, относящегося к чешуекрылым, при этом можно идентифицировать белки Cry, охваченные настоящим изобретением. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен штамм Bacillus thuringiensis (Bt), который продуцирует белок Cry или рекомбинантный белок Cry, содержащий, состоящий главным образом из или состоящий из аминокислотной последовательности, которая характеризуется от меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-12. В других вариантах осуществления штамм Bt выбран из группы, состоящей из С0633, С0724 и С1100. В еще дополнительных вариантах осуществления белок Cry или рекомбинантный белок Cry содержит, состоит главным образом из или состоит из любой из SEQ ID NO: 10-12.

[00108] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрен необязательно выделенный белок Cry, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, где белок содержит, состоит главным образом из или состоит из (а) аминокислотной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% идентичностью последовательности до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсиновым фрагментом; или (b) аминокислотной последовательности, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая характеризуется от по меньшей мере 80% идентичностью последовательности до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 4-9 или их фрагментом, кодирующим токсин.

[00109] В других вариантах осуществления необязательно выделенный белок Cry содержит, состоит главным образом из или состоит из аминокислотной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсиновым фрагментом. В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10 или ее токсиновым фрагментом.

[00110] В дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 11 или ее токсиновым фрагментом.

[00111] В еще дополнительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12 или ее токсиновым фрагментом.

[00112] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность содержит, состоит главным образом из или состоит из любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсинового фрагмента. В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей, состоящей главным образом из или состоящей из любой из SEQ ID NO: 1-3 или их фрагмента, кодирующего токсин.

[00113] В дополнительных вариантах осуществления белки Cry являются токсичными для вредителя, относящегося к чешуекрылым, выбранного из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки-ипсилон (Agrotis ipsilon), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), огневки тростниковой (Diatraea saccharalis), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes), огневки кукурузной юго-западной (Diatraea grandiosella), западной бобовой совки (Richia albicosta), табачной совки (Heliothis virescens), восточного кукурузного мотылька (Ostrinia furnacalis), хлопковой совки (Helicoverpa armigera), огневки желтой рисовой (Chilo suppressalis), розовой стеблевой совки (Sesamia calamistis) и огневки рисовой (Cnaphalocrocis medinalis).

[00114] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения охватывается рекомбинантный белок Cry, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, где рекомбинантный белок Cry содержит, состоит главным образом из или состоит из (а) аминокислотной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсиновым фрагментом; или (b) аминокислотной последовательности, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 4-9 или их фрагментом, кодирующим токсин.

[00115] В других вариантах осуществления рекомбинантный белок Cry содержит, состоит главным образом из или состоит из аминокислотной последовательности, которая характеризуется от по меньшей мере 80% до по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсиновым фрагментом. В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10 или ее токсиновым фрагментом.

[00116] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 11 или ее токсиновым фрагментом.

[00117] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12 или ее токсиновым фрагментом.

[00118] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 13 или ее токсиновым фрагментом.

[00119] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 14 или ее токсиновым фрагментом.

[00120] В еще одних вариантах осуществления аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 81%, или по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 83%, или по меньшей мере 84%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 86%, или по меньшей мере 87%, или по меньшей мере 88%, или по меньшей мере 89%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,1%, или по меньшей мере 99,2%, или по меньшей мере 99,3%, или по меньшей мере 99,4%, или по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,6%, или по меньшей мере 99,7%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 15 или ее токсиновым фрагментом.

[00121] В еще дополнительных вариантах осуществления рекомбинантный белок Cry содержит, состоит главным образом из или состоит из любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсинового фрагмента. В других вариантах осуществления рекомбинантный белок Cry кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей, состоящей главным образом из или состоящей из любой из SEQ ID NO: 4-9 или их фрагмента, кодирующего токсин.

[00122] Антитела, вырабатываемые в ответ на иммунную стимуляцию нативными или мутантными ВТ-0016, ВТ-0026 и ВТ-0032 и подобными или родственными белками Cry, также охватываются настоящим изобретением. Такие антитела могут быть получены с применением стандартных иммунологических методик получения поликлональной антисыворотки и при необходимости иммортализации антителопродуцирующих клеток иммунизированного организма-хозяина для получения источников моноклональных антител. Методики получения антител к любому представляющему интерес веществу хорошо известны, например, как описано в Harlow and Lane (1988. Antibodies a laboratory manual, pp. 726. Cold Spring Harbor Laboratory) и в Goding (Monoclonal Antibodies: Principles & practice. 1986. Academic Press, Inc., Orlando, FL). Настоящее изобретение охватывает инсектицидные белки, которые перекрестно реагируют с антителами, в частности, моноклональными антителами, вырабатываемыми против одного или нескольких инсектицидных белков Cry по настоящему изобретению.

[00123] Антитела, полученные согласно настоящему изобретению, также применимы в иммунологических анализах для определение количества или наличия нативных или мутантных ВТ-0016, ВТ-0026 и ВТ-0032 или родственного белка Cry в биологическом образце. Такие анализы также применимы в получении композиций, содержащих один или несколько белков Cry по настоящему изобретению или родственных токсичных белков, причем такое получение проводят с обеспечением контроля качества. Кроме того, антитела можно применять для оценки эффективности рекомбинантного продуцирования одного или нескольких белков Cry по настоящему изобретению или родственного белка, а также для скрининга библиотек экспрессии на предмет наличия нуклеотидной последовательности, кодирующей один или несколько белков Cry по настоящему изобретению, или последовательностей, кодирующих родственные белки. Антитела также применимы в качестве аффинных лигандов для очистки или выделения любого одного или нескольких белков по настоящему изобретению и родственных белков. Белки Cry по настоящему изобретению и белки, содержащие родственные антигенные эпитопы, могут быть получены в результате сверхэкспрессии полноразмерной или частичной последовательности, кодирующей весь белок Cry по настоящему изобретению или родственный белок, или их часть, в предпочтительной клетке-хозяине.

[00124] Считается, что последовательности ДНК, которые кодируют нативный белок Cry по настоящему изобретению, можно изменять с помощью различных способов, и что эти изменения могут приводить к образованию последовательностей ДНК, кодирующих белки с аминокислотными последовательности, отличающимися от таковых, закодированных в нативном белке Cry по настоящему изобретению. Белок Cry может быть изменен различными способами с получением мутантного белка Cry, в том числе с помощью аминокислотных замен, делеций, усечений и вставок одной или нескольких аминокислот из любой из SEQ ID NO: 10-12, включая до приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 105, приблизительно 110, приблизительно 115, приблизительно 120, приблизительно 125, приблизительно 130, приблизительно 135, приблизительно 140, приблизительно 145, приблизительно 150, приблизительно 155 или больше аминокислотных замен, делеций или вставок. Способы таких манипуляций в целом известны в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности нативного белка Cry могут быть получены посредством введения мутаций в полинуклеотид, который кодирует данный белок. Это также можно осуществлять с применением одной из нескольких форм мутагенеза или метода направленной эволюции. Согласно некоторым аспектам изменения, кодируемые аминокислотной последовательностью, не будут существенно влиять на функцию белка. Такие варианты будут обладать требуемой инсектицидной активностью. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1-3, изменяют с введением аминокислотных замен в кодируемый белок. В других вариантах осуществления полученный мутантный белок кодируется синтетическим мутантным полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 7-9. В других вариантах осуществления мутантные белки содержат, состоят главным образом или состоят из аминокислотной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: 13-15.

[00125] Понятно, что способность инсектицидного белка обеспечивать инсектицидную активность может быть улучшена путем применения таких методик для композиций по настоящему изобретению. Например, можно экспрессировать белок Cry в клетках-хозяевах, которые характеризуются высоким уровнем ошибочного включения оснований в ходе репликации ДНК, например XL-1 Red (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния). После размножения в таких штаммах можно выделять ДНК (например, путем получения плазмидной ДНК или путем амплификации с помощью ПЦР и клонирования полученного ПЦР-фрагмента в вектор), экспрессировать мутантные последовательности белка Cry в штамме, не приводящем к образованию мутаций, и идентифицировать мутированные гены с инсектицидной активностью, например, путем осуществления анализа для тестирования инсектицидной активности. Обычно белок смешивают и применяют в анализах питания. См., например Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие анализы могут включать приведение растений в контакт с одним или несколькими вредителями и определение способности растений к выживанию или способности вызывать гибель вредителей. Примеры мутаций, которые приводят к повышению токсичности, можно найти в Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

[00126] В качестве альтернативы, могут быть выполнены изменения в аминокислотной последовательности по настоящему изобретению на амино- или карбокси-конце, при этом они не оказывают существенное влияние на активность. Они могут включать вставки, делеции или изменения, введенные с применением современных способов молекулярной биологии, таких как ПЦР, в том числе ПЦР-амплификаций, обеспечивающих изменение или расширение последовательности, кодирующей белок, за счет включения последовательностей, кодирующих аминокислоты, в олигонуклеотиды, используемые при ПЦР-амплификации. В качестве альтернативы добавленные последовательности, кодирующие белок, могут включать последовательности, кодирующие весь белок, такие как в большинстве случаев применяются в уровне техники для создания белков слияния. Такие белки слияния зачастую применяют для (1) повышения уровня экспрессии представляющего интерес белка, (2) для введения связывающего домена, ферментативной активности или эпитопа для облегчения одного из очистки белка, выявления белка или других применений в эксперименте, известных из уровня техники, (3) направленной секреции в субклеточную органеллу, такую как периплазматическое пространство грам-отрицательных бактерий, или трансляции в эндоплазматическом ретикулуме эукариотических клеток, в последнем случае результатом зачастую является гликозилирования белка.

[00127] Белок Cry по настоящему изобретению также может быть подвергнут мутации с введением эпитопа для получения антител, которые распознают мутантный белок. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен мутированный белок Cry, где аминокислотная замена в нативном белке Cry дает мутантный белок Cry с антигенным участком, который позволяет отличать мутантный белок Cry от нативного белка Cry в анализе выявления белков.

[00128] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения антитела, которое способно дифференцировать мутированный белок Cry и нативный белок Cry, из которого получен мутированный белок Cry, при этом метод включает стадии замены аминокислоты в антигенной петле нативного белка Cry и стимуляции выработки антител, которые специфически распознают мутированную антигенную петлю в мутированном белке Cry и не распознают нативный белок Cry. В одном варианте осуществления антигенную петлю идентифицируют в неконсервативных участках за пределами домена I нативного белка Cry. В другом варианте осуществления антигенная петля не является петлей, вовлеченной в распознавание рецепторов белков Cry в пищеварительном канале насекомого или вовлеченной в активацию белка Cry под действием протеазы.

[00129] Варианты нуклеотидных и аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению также охватывают последовательности, полученные в результате процедур мутагенеза и рекомбинации, как, например, ДНК-шаффлинга. С помощью такой процедуры один или несколько различных участков, кодирующих токсичный белок, можно применять для создания нового токсичного белка, обладающего требуемыми свойствами. Следовательно, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов получают из популяции полинуклеотидов с родственными последовательностями, содержащими участки последовательности, которые характеризуются значительной степенью идентичности последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с применением данного подхода, мотивы последовательности, кодирующие представляющий интерес домен, можно подвергать шаффлингу между пестицидным геном по настоящему изобретению и другими известными пестицидными генами с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным представляющим интерес свойством, таким как повышенная инсектицидная активность. Стратегии для такого ДНК-шаффлинга известны из уровня техники. См., например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; и патенты США №№5605793 и 5837458.

[00130] Обмен доменов или шаффлинг является другим механизмом для получения измененных белков Cry по настоящему изобретению. Домены можно обменивать между белками Cry, что приводит к гибридным или химерным токсичным белкам с улучшенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Способы получения рекомбинантных белков и тестирования их в отношении пестицидной активности хорошо известны из уровня техники (см., например, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены гибридные белки Cry, содержащие на С-конце аминокислоты из первого белка Cry по настоящему изобретению, а на N-конце аминокислоты из второго белка Cry по настоящему изобретению, отличного от первого белка Cry по настоящему изобретению.

[00131] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, молекулу нуклеиновой кислоты, кассету экспрессии или химерный ген по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления вектор дополнительно определен как плазмида, космида, фагмида, искусственная хромосома, фаг или вирусный вектор. Некоторые векторы для применения в трансформации растений и других организмов известны из уровня техники.

[00132] Таким образом, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к кассетам экспрессии, сконструированным для экспрессии полинуклеотидов и молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Применяемое в данном документе выражение "кассета экспрессии" означает молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере последовательность контроля, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Таким образом, например, в кассетах экспрессии для экспрессии в растении, части растения или растительной клетке предусмотрены промоторы растений, функционально связанные с нуклеотидными последовательностями, подлежащими экспрессии.

[00133] Кассета экспрессии, содержащая представляющий интерес полинуклеотид, может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии также может представлять собой последовательность, которая встречается в природе, но которая была получена в рекомбинантной форме, применимой для гетерологичной экспрессии. Однако обычно кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е. конкретная последовательность нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии не встречается в клетке-хозяине в природных условиях, а должна быть введена в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью трансформации.

[00134] В дополнение к промоторам, функционально связанным с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению, кассета экспрессии по настоящему изобретению также может содержать другие регуляторные последовательности. Применяемое в данном документе выражение "регуляторные последовательности" означает нуклеотидные последовательности, расположенные выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, которые влияют на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают без ограничения энхансеры, интроны, лидерные последовательности, регулирующие трансляцию, сигналы терминации и сигнальные последовательности полиаденилирования.

[00135] В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии по настоящему изобретению также может содержать полинуклеотиды, которые кодируют другие требуемые признаки, помимо белков Cry по настоящему изобретению. Такие кассеты экспрессии, содержащие пакетированные признаки, можно применять для создания растений, частей растений или растительных клеток, обладающих требуемым фенотипом с пакетированными признаками (то есть, молекулярное пакетирование). Такие пакетированные комбинации в растениях также можно создавать с помощью других способов, включая без ограничения кроссбридинг растений с помощью любой традиционной методики. При "пакетировании" путем генетической трансформации растений представляющие интерес нуклеотидные последовательности можно комбинировать в любой момент времени и в любом порядке. Например, трансгенное растение, содержащее один или несколько требуемых признаков, можно применять в качестве мишени для введения дополнительных признаков путем последующей трансформации. Дополнительные нуклеотидные последовательности можно вводить согласно протоколу котрансформации одновременно с нуклеотидной последовательностью, молекулой нуклеиновой кислоты, конструкцией нуклеиновой кислоты или композицией по настоящему изобретению, обеспечиваемыми любой комбинацией кассет экспрессии. Например, если будут вводить две нуклеотидные последовательности, то их можно встроить в отдельные кассеты (транс), или их можно встроить в одну кассету (цис). Экспрессия полинуклеотидов может управляться одним и тем же промотором или различными промоторами. Кроме того, известно, что полинуклеотиды можно "пакетировать" в требуемом местоположении в геноме при помощи системы сайт-специфической рекомбинации. См., например, публикации международных заявок на патенты №№ WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 и WO 99/25853.

[00136] Кассета экспрессии также может содержать дополнительную последовательность, кодирующую один или несколько полипептидов или молекул двухнитевой РНК (dsRNA), обеспечивающих представляющие интерес агрономические признаки, которые преимущественно приносят пользу компании-производителю семян, сельхозпроизводителю или переработчику зерна. Представляющий интерес полипептид может быть любым полипептидом, кодируемым представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Неограничивающие примеры представляющих интерес полипептидов, которые подходят для продуцирования в растениях, включают такие полипептиды, которые обуславливают возникновение агрономически важных признаков, таких как устойчивость к гербицидам (также иногда называемая "толерантностью к гербицидам"), устойчивость к вирусам, устойчивость к патогенным бактериям, устойчивость к насекомым, устойчивость к нематодам или устойчивость к грибам. См., например, патенты США №№5569823; 5304730; 5495071; 6329504 и 6337431. Полипептид также может являться таким, который увеличивает мощность или урожайность растений (включая признаки, которые дают возможность растению произрастать при различных температурах, почвенных условиях и уровнях солнечного света и атмосферных осадков), или таким, который дает возможность идентифицировать растение, проявляющее представляющий интерес признак (например, селектируемый маркер, цвет семенной оболочки и т.д.). Разнообразные представляющие интерес полипептиды, а также способы введения этих полипептидов в растение описаны, например, в патентах США №№4761373; 4769061; 4810648; 4940835; 4975374; 5013659; 5162602; 5276268; 5304730; 5495071; 5554798; 5561236; 5569823; 5767366; 5879903, 5928937; 6084155; 6329504 и 6337431; а также в публикации заявки на патент США №2001/0016956. См. также во всемирной сети Интернет по адресу lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/.

[00137] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также могут применяться полинуклеотиды, придающие устойчивость/толерантность к гербициду, ингибирующему конус нарастания или меристему, такому как имидазолинон или сульфонилмочевина. Иллюстративные полинуклеотиды из этой категории кодируют мутантные ферменты ALS и AHAS, как описано, например, в патентах США №№5767366 и 5928937. Патенты США №№4761373 и 5013659 относятся к растениям, устойчивым к различным имидазолиноновым или сульфонамидным гербицидам. Патент США №4975374 относится к растительным клеткам и растениям, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантную глутаминсинтетазу (GS), устойчивую к ингибированию гербицидами, которые, как известно, ингибируют GS, например, фосфинотрицин и метионинсульфоксимин. В патенте США №5162602 раскрыты растения, устойчивые к ингибированию гербицидами на основе циклогександиона и арилоксифеноксипропановой кислоты. Устойчивость придает измененная ацетил-коэнзим А-карбоксилаза (АССаза).

[00138] Полипептиды, кодируемые нуклеотидными последовательностями, придающими устойчивость к глифосату, также подходят для настоящего изобретения. См., например, патент США №4940835 и патент США №4769061. В патенте США №5554798 раскрыты трансгенные растения маиса, устойчивые к глифосату, устойчивость которым придает ген измененной 5-енолпирувил-3-фосфошикиматсинтазы (EPSP).

[00139] Также подходят полинуклеотиды, кодирующие устойчивость к фосфоновым соединениям, таким как глюфосинат аммония или фосфинотрицин, а также пиридинокси- или феноксипропионовым кислотам и циклогексанонам. См. заявку на европейский патент №0242246. См. также патенты США №№5879903, 5276268 и 5561236.

[00140] Другие подходящие полинуклеотиды включают таковые, кодирующие устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосинтез, таким как триазин и бензонитрил (ген нитрилазы). См. патент США №4810648. Дополнительные подходящие полинуклеотиды, кодирующие устойчивость к гербицидам, включают таковые, кодирующие устойчивость к 2,2-дихлорпропионовой кислоте, сетоксидиму, галоксифопу, имидазолиноновым гербицидам, сульфонилмочевинным гербицидам, триазолопиримидиновым гербицидам, s-триазиновым гербицидам и бромоксинилу. Также подходят полинуклеотиды, придающие устойчивость к ингибиторам фермента protox, или которые обеспечивают повышенную устойчивость к заболеваниям растений; повышенную толерантность к неблагоприятным условиям окружающей среды (видам абиотического стресса), в том числе без ограничения к засухе, чрезмерному охлаждению, чрезмерному нагреву, или чрезмерной засоленности почвы, или экстремальной кислотности или щелочности; и изменения строения или развития растений, в том числе изменения сроков развития. См., например, публикацию заявки на патент США №2001/0016956 и патент США №6084155.

[00141] Дополнительные подходящие полинуклеотиды включают таковые, кодирующие пестицидные (например, инсектицидные) полипептиды. Эти полипептиды могут быть получены в количествах, достаточных для контроля, например, насекомых-вредителей (т.е. в количествах, обеспечивающих контроль насекомых). Считается, что количество продуцируемого в растении пестицидного полипептида, необходимое для контроля насекомых или других вредителей, может варьировать в зависимости от сорта, типа вредителя, факторов окружающей среды и т.п. Полинуклеотиды, применимые для придания дополнительной устойчивости к насекомым или вредителям, включают, например, таковые, кодирующие токсины, идентифицированные в организмах Bacillus. Полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие белки Cry Bacillus thuringiensis (Bt) из нескольких подвидов, были клонированы и было обнаружено, что рекомбинантные клоны токсичны для личинок чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых насекомых. Примеры таких инсектицидных белков Bt включают белки Cry, такие как Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1Ea, Cry1Fa, Cry3A, Cry9A, Cry9B, Cry9C, и т.п., а также вегетативные инсектицидные белки, такие как Vip1, Vip2, Vip3 и т.п. Полный перечень белков Bt можно найти во всемирной сети Интернет в базе данных номенклатуры токсинов Bacillus thuringiensis, поддерживаемой университетом Сассекса (см. также Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813).

[00142] Полипептиды, подходящие для продуцирования в растениях, дополнительно включают такие полипептиды, которые улучшают превращение собранных растений или частей растений в коммерчески применимый продукт или иным образом содействующие ему, в том числе, например, обеспечивающие повышенное или измененное содержание или распределение углеводов, улучшенные свойства сбраживаемости, повышенное содержание масла, повышенное содержание белка, улучшенную усвояемость или повышенное содержание нутрицевтиков, например, повышенное содержание фитостерола, повышенное содержание токоферола, повышенное содержание станола или повышенное содержание витаминов. Представляющие интерес полипептиды также включают, например, таковые, обуславливающие снижение содержания нежелательного компонента в собранном урожае, например, фитиновой кислоты или ферментов, расщепляющих сахара, или способствующие этому. Под "обуславливающим" или "способствующим" подразумевается, что представляющий интерес полипептид может прямо или косвенно способствовать наличию представляющего интерес признака (например, путем увеличения расщепления целлюлозы с помощью гетерологичного фермента целлюлазы).

[00143] В некоторых вариантах осуществления полипептид способствует улучшению усвояемости еды или корма. Ксиланазы представляют собой ферменты, расщепляющие гемицеллюлозу, которые усиливают разрушение клеточных стенок растений, что приводит к лучшему использованию питательных веществ растения животным. Это приводит к увеличению темпов роста и конверсии корма. Также можно снижать вязкость кормов, содержащих ксилан. Гетерологичное продуцирование ксиланаз в растительных клетках также может содействовать превращению лигноцеллюлозы в сбраживаемые сахара в ходе промышленной переработки.

[00144] Многочисленные ксиланазы из микроорганизмов, являющихся грибами и бактериями, были идентифицированы и охарактеризованы (см., например, патент США №5437992; Coughlin et al. (1993) "Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases" Espoo; Souminen and Reinikainen, eds. (1993) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135; публикацию патента США №2005/0208178; и публикацию согласно РСТ WO 03/16654). В частности, три специфичные ксиланазы (XYL-I, XYL-II и XYL-III) были идентифицированы у Т. reesei (Tenkanen et al. (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:566; Torronen et al. (1992) Bio/Technology 10:1461; и Xu et al. (1999) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:718).

[00145] В других вариантах осуществления полипептид, применимый для настоящего изобретения, может представлять собой фермент, расщепляющий полисахариды. Растения по настоящему изобретению, вырабатывающие такой фермент, могут быть применимы для получения, например, сбраживаемого сырья для биологической переработки. В некоторых вариантах осуществления ферменты, применимые для способа сбраживания, включают альфа-амилазы, протеазы, пуллуланазы, изоамилазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, циклодекстрингликозилтрансферазы, липазы, фитазы, лакказы, оксидазы, эстеразы, кутиназы, фермент, гидролизующий гранулированный крахмал, и другие глюкоамилазы.

[00146] Ферменты, расщепляющие полисахариды, включают ферменты, расщепляющие крахмал, такие как α-амилазы (ЕС 3.2.1.1), глюкуронидазы (Е.С.3.2.1.131); экзо-1,4-α-D-глюканазы, такие как амилоглюкозидазы и глюкоамилазы (ЕС 3.2.1.3), β-амилазы (ЕС 3.2.1.2), α-глюкозидазы (ЕС 3.2.1.20) и другие экзоамилазы; крахмал-деветвящие ферменты, такие как а) изоамилаза (ЕС 3.2.1.68), пуллуназа (ЕС 3.2.1.41) и т.п.; b) целлюлазы, такие как экзо-1,4-3-целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91), экзо-1,3-β-D-глюканаза (ЕС 3.2.1.39), β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21); с) L-арабиназы, такие как эндо-1,5-α-L-арабиназа (ЕС 3.2.1.99), α-арабинозидазы (ЕС 3.2.1.55) и т.п.; d) галактаназы, такие как эндо-1,4-β-D-галактаназа (ЕС 3.2.1.89), эндо-1,3-β-D-галактаназа (ЕС 3.2.1.90), β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22), β-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23) и т.п.; е) маннаназы, такие как эндо-1,4-β-D-маннаназа (ЕС 3.2.1.78), β-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25), α-маннозидаза (ЕС 3.2.1.24) и т.п.; f) ксиланазы, такие как эндо-1,4-β-ксиланаза (ЕС 3.2.1.8), β-D-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37), 1,3-β-D-ксиланаза и т.п.; и g) другие ферменты, такие как α-L-фукозидаза (ЕС 3.2.1.51), α-L-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40), леваназа (ЕС 3.2.1.65), инулиназа (ЕС 3.2.1.7) и т.п. В одном варианте осуществления α-амилаза представляет собой синтетическую α-амилазу, Amy797E, описанную в патенте США №8093453, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00147] Дополнительные ферменты, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, включают протеазы, такие как протеазы грибов и бактерий. Протеазы грибов включают без ограничений таковые, полученные из Aspergillus, Trichoderma, Mucor и Rhizopus, как, например, A. niger, A. awamori, А. oryzae и М. miehei. В некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению могут представлять собой ферменты целлобиогидролазы (СВН) (ЕС 3.2.1.91). В одном варианте осуществления фермент целлобиогидролаза может представлять собой СВН1 или СВН2.

[00148] Другие ферменты, применимые в соответствии с настоящим изобретением, включают без ограничения гемицеллюлазы, такие как манназы и арабинофуранозидазы (ЕС 3.2.1.55); лигниназы; липазы (например, Е.С. 3.1.1.3), глюкозооксидазы, пектиназы, ксиланазы, трансглюкозидазы, альфа-1,6-глюкозидазы (например, Е.С. 3.2.1.20); эстеразы, такие как естераза феруловой кислоты (ЕС 3.1.1.73) и ацетилксиланэстеразы (ЕС 3.1.1.72); и кутиназы (например, Е.С. 3.1.1.74).

[00149] Молекулы двухнитевой РНК, применимые в настоящем изобретении, включают без ограничения такие, которые подавляют экспрессию целевых генов у насекомых. Предполагается, что применяемое в данном документе словосочетание "супрессия гена" в совокупности относится к любым хорошо известным способам снижения уровней белка, продуцируемого в результате транскрипции гена в mRNA и дальнейшей трансляции mRNA. Также подразумевается, что супрессия гена означает снижение экспрессии белка с гена или кодирующей последовательности, в том числе посттранскрипционную супрессию гена и транскрипционную супрессию. Посттранскрипционная супрессия гена обусловлена гомологией всей или части mRNA, транскрибируемой с гена или кодирующей последовательности, являющихся мишенями для супрессии, и соответствующей двухнитевой РНК, используемой для супрессии, и означает значимое и измеряемое снижение количества доступной mRNA, имеющейся в клетке для связывания рибосомами. Транскрибируемая РНК может находиться в смысловой ориентации для обеспечения эффекта, называемого косупрессией, в антисмысловой ориентации для обеспечения эффекта, называемого антисмысловой супрессией, или в обеих ориентациях с получением dsRNA для обеспечения эффекта, называемого РНК-интерференцией (RNAi). Транскрипционная супрессия обусловлена присутствием в клетке dsRNA, средства, обеспечивающего супрессию гена, характеризующейся значительной идентичностью последовательности с промоторной последовательностью ДНК или комплементарной ей нитью, для обеспечения эффекта, который называется супрессией промотора в транс-положении. Супрессия гена может быть эффективной в отношении нативного гена растения, ассоциированного с признаком, например, для обеспечения в растениях сниженных уровней белка, кодируемого нативным геном, или повышенными уровнями измененного метаболита. Супрессия гена также может быть эффективной в отношении генов-мишеней во вредителях растений, которые могут проглатывать или контактировать с растительным материалом, содержащим средства для обеспечения супрессии гена, специально сконструированного для подавления или супрессии одного или нескольких гомологичных или комплементарных последовательностей в клетках вредителя. Такие гены-мишени для супрессии могут кодировать незаменимый белок, основная функция которого выбрана из группы, состоящей из формирования мышц, образования ювенильного гормона, регуляции ювенильного гормона, регуляции и транспорта ионов, синтеза пищеварительных ферментов, поддержания мембранного потенциала клетки, биосинтеза аминокислот, деградации аминокислот, образования спермы, синтеза феромонов, восприятия феромонов, формирования антенн, формирования крыльев, формирования конечностей, развития и дифференциации, формирования яиц, созревания личинок, образования пищеварительных ферментов, синтеза гемолимфы, поддержания постоянства состава гемолимфы, передачи нервных импульсов, клеточного деления, энергетического обмена, развития и дифференциации, дыхания и апоптоза.

[00150] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, которая содержит полинуклеотид, молекулу нуклеиновой кислоты, химерный ген, кассету экспрессии или рекомбинантный вектор по настоящему изобретению. Трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, может включать без ограничения растительную клетку, дрожжевую клетку, бактериальную клетку или клетку насекомого. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена бактериальная клетка, выбранная из рода Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Xenorhabdus, Photorhabdus, Pasteuria, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc или Alcaligenes. Таким образом, например, в качестве средств для биологического контроля насекомых можно получать белки Cry по настоящему изобретению путем экспрессии химерного гена, кодирующего белки Cry по настоящему изобретению в бактериальной клетке. Например, в некоторых вариантах осуществления предусмотрена клетка Bacillus thuringiensis, содержащая химерный ген по настоящему изобретению.

[00151] В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена трансгенная растительная клетка, которая представляет собой клетку двудольного растения или клетку однодольного растения. В дополнительных вариантах осуществления клетка двудольного растения выбрана из группы, состоящей из клетки сои, клетки подсолнечника, клетки томата, клетки культурной разновидности капусты, клетки хлопчатника, клетки сахарной свеклы и клетки табака. В дополнительных вариантах осуществления клетка однодольного растения выбрана из группы, состоящей из клетки ячменя, клетки маиса, клетки овса, клетки риса, клетки сорго, клетки сахарного тростника и клетки пшеницы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена совокупность клеток двудольных растений или клеток однодольных растений, экспрессирующих белок Cry по настоящему изобретению, который кодируется химерным геном по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления клетки в совокупности расположены рядом с образованием апопласта и их выращивают при естественном солнечном свете.

[00152] В других вариантах осуществления настоящего изобретения инсектицидный белок Cry по настоящему изобретению экспрессируется в высшем организме, например растении. В этом случае трансгенные растения, экспрессирующие эффективные количества инсектицидного белка, защищают себя от вредителей растений, таких как насекомые-вредители. Когда насекомое начинает питаться на таком трансгенном растении, оно также поглощает экспрессируемый инсектицидный белок Cry. Это может удерживать насекомое от дальнейшего вгрызания в растительную ткань или даже может причинять вред насекомому или уничтожать его. Полинуклеотид по настоящему изобретению вставляют в кассету экспрессии, которая затем стабильно интегрируется в геном растения. В других вариантах осуществления полинуклеотид включен в непатогенный самореплицирующийся вирус. Растения, трансформированные в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой однодольные или двудольные растения, и они включают без ограничения кукурузу (маис), сою, рис, пшеницу, ячмень, рожь, овес, сорго, просо, подсолнечник, сафлор, сахарную свеклу, хлопчатник, сахарный тростник, масличный рапс, люцерну, табак, разновидности арахиса, овощные культуры, в том числе батат, фасоль, горох, цикорий, латук, кочанную капусту, цветную капусту, брокколи, репу, морковь, баклажан, огурец, редьку, шпинат, картофель, томат, спаржу, лук, чеснок, разновидности дыни, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву обыкновенную, цуккини, плодовые культуры, включая яблоню, грушу, айву, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, землянику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан и специализированные растения, такие как Arabidopsis, а также древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья. Предпочтительно растения по настоящему изобретению представляют собой культурные растения, такие как маис, сорго, пшеница, подсолнечник, томат, крестоцветные, разновидности перца, картофель, хлопчатник, рис, соя, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень, масличный рапс и т.п.

[00153] После того как требуемый полинуклеотид введен в конкретный вид растения путем трансформации, при помощи традиционных методик размножения он может передаваться в пределах данного вида или переходить в другие разновидности того же вида, в частности, включающие коммерческие разновидности.

[00154] Полинуклеотид по настоящему изобретению экспрессируется в трансгенных растениях, обусловливая тем самым биосинтез соответствующего белка Cry в трансгенных растениях, либо в форме протоксина, либо в форме зрелого токсина. Таким способом получают трансгенные растения с улучшенной защитой урожая в присутствии нагрузки насекомых. Для экспрессии в трансгенных растениях может потребоваться модификация и оптимизация нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению. Хотя во многих случаях гены микроорганизмов могут экспрессироваться в растениях на высоких уровнях и без модификации, низкий уровень экспрессии в трансгенных растениях может быть обусловлен нуклеотидными последовательностями микроорганизмов, имеющими кодоны, которые не являются предпочтительными для растений. Как известно из уровня техники, для живых организмов характерны определенные предпочтения в отношении частоты использования кодонов, и поэтому кодоны нуклеотидных последовательностей, описанных в данном изобретении, могут быть изменены в соответствии с характерными для растений предпочтениями, при этом с сохранением аминокислот, кодируемых ими. Кроме того, высокий уровень экспрессии в растениях, например растениях кукурузы, лучше всего достигается в случае кодирующих последовательностей, которые характеризуются по меньшей мере приблизительно 35% содержанием GC, или по меньшей мере приблизительно 45%, или по меньшей мере приблизительно 50% или по меньшей мере приблизительно 60%. Нуклеотидные последовательности микроорганизмов, которые характеризуются низким содержанием GC, могут экспрессироваться в растениях на недостаточном уровне в связи с наличием мотивов АТТТА, которые могут дестабилизировать транскрипты, и мотивов ААТААА, которые могут обуславливать ненадлежащее полиаденилирование. Хотя определенные последовательности генов могут надлежащим образом экспрессироваться как в видах однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом предпочтений в отношении кодонов и предпочтений в отношении содержания GC для однодольных растений или двудольных растений, поскольку было показано, что эти предпочтения отличаются (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Кроме того, нуклеотидные последовательности подвергают скринингу на наличие неправильных сайтов сплайсинга, которые могут вызывать усечение транскрипта. Все изменения, которые требуется выполнить в пределах нуклеотидных последовательностей, такие как описанные выше, выполняют с применением хорошо известных методик сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и конструирования синтетических генов с помощью способов, описанных, например, в патентах США №№5625136; 5500365 и 6013523.

[00155] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены синтетические кодирующие последовательности или полинуклеотид, полученные согласно процедуре, раскрытой в патенте США №5625136, включенном в данный документ посредством ссылки. В этой процедуре применяют предпочтительные для маиса кодоны, т.е. один кодон, который чаще всего кодирует данную аминокислоту в маисе. Предпочтительный для маиса кодон, кодирующий конкретную аминокислоту, может быть определен, например, на основании известных последовательностей генов маиса. Например, данные о частоте использования кодонов у маиса для 28 генов из растений маиса можно найти в Murray et al, Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки. Специально приведенные в качестве примера синтетические последовательности по настоящему изобретению, полученные с применением кодонов, оптимизированных для маиса, представлены любой из SEQ ID NO: 4-9. Известно, что кодоны, оптимизированные для экспрессии в растении одного вида, также будут функционировать в растениях других видов, но, вероятно, не в той же степени, как в виде растения, для которого кодоны были оптимизированы. Подобным образом нуклеотидные последовательности могут быть оптимизированы для экспрессии в любом растении. Следует понимать, что вся нуклеотидная последовательность или любая ее часть могут быть оптимизированными или синтетическими. То есть полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая частично является нативной последовательностью и частично является последовательностью с оптимизированными кодонами.

[00156] Для эффективной инициации трансляции может потребоваться модификация последовательностей, прилегающих к инициирующему метионину. Например, их можно модифицировать путем включения последовательностей, которые, как известно, являются эффективными в растениях. Joshi предложил подходящую консенсусную последовательность для растений (NAR 15:6643-6653 (1987)), а Clonetech предлагает дополнительную консенсусную последовательность, являющуюся инициатором трансляции (каталог 1993/1994, стр. 210). Эти консенсусные последовательности подходят для использования с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению. Последовательности встраивают в конструкции, содержащие нуклеотидные последовательности, выше и включительно ATG (при этом вторая аминокислота остается немодифицированной) или в качестве альтернативы выше и включительно GTC, расположенного после ATG (с возможностью модифицирования второй аминокислоты трансгена).

[00157] Последовательности, кодирующие новый белок Cry по настоящему изобретению, либо в виде их нативной последовательности, либо в виде синтетических последовательностей, как описано выше, могут быть функционально связаны с целым рядом промоторов для экспрессии в растениях, включая конститутивные, индуцируемые, регулируемые во времени, регулируемые в процессе развития, химически регулируемые, тканепредпочтительные и тканеспецифические промоторы, для получения рекомбинантных молекул ДНК, то есть химерных генов. Выбор промотора будет различаться в зависимости от временных и пространственных требований для экспрессии, а также в зависимости от целевого вида. Таким образом, предпочтительной является экспрессия нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению в листьях, в цветоножках или стеблях, в колосьях, в соцветиях (например, колосках, метелках, початках и т.д.), в корнях или проростках. Во многих случаях, однако, требуется защита от более чем одного типа насекомого-вредителя, и, следовательно, желательна экспрессия в нескольких тканях. Не смотря на то, что многие промоторы из двудольных растений, как было показано, функционируют у однодольных и наоборот, в идеальном случае для экспрессии у двудольных растений выбирают промоторы двудольных, а промоторы однодольных выбирают для экспрессии у однодольных. Однако не существует каких-либо ограничений в отношении происхождения выбранных промоторов; при этом достаточно, чтобы они являлись функциональными в отношении управления экспрессией нуклеотидных последовательностей в требуемой клетке.

[00158] Подходящие конститутивные промоторы включают, например, промотор 35S CaMV (SEQ ID NO: 1546; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); промотор At6669 Arabidopsis (SEQ ID NO: 1652; см. публикацию согласно PCT № W004081173A2); промотор Ubi 1 маиса (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689, 1992); актина риса (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); 19S CaMV (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al., Plant J November; 2(6):837-44,1992); убиквитина (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); циклофилина риса (Bucholz et al., Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); гистона Н3 маиса (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992); актина 2 (An et al., Plant J. 10(1); 107-121, 1996), конститутивный промотор корневого кончика СТ2 (SEQ ID NO:1535; см. также заявку согласно PCT № IL/2005/000627) и синтетический Super MAS (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Другие конститутивные промоторы включают описанные в патентах США №№5659026, 5608149; 5608144; 5604121; 5569597: 5466785; 5399680; 5268463 и 5608142. Molec. Biol.

[00159] Тканеспецифические или тканепредпочтительные промоторы, применимые для экспрессии последовательностей, кодирующих новый белок cry по настоящему изобретению, в растениях, в частности маисе, представляют собой промоторы, которые управляют экспрессией в корне, паренхиме, листе или пыльце. Подходящие тканеспецифические промоторы включают без ограничения специфические для листьев промоторы [такие, которые описаны, например, в Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265,1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778,1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; и Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], предпочтительные для семени промоторы [например, из семяспецифических генов (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262:12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), промоторы альбумина из бразильского ореха (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18:235-245, 1992), легумина (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10:203-214, 1988), глютелина (рис) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208:15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221:43-47, 1987), зеина (Matzke et al., Plant Mol Biol, 143). 323-32 1990), napA (Stalberg, et al., Planta 199: 515-519,1996), SPA пшеницы (Albanietal, Plant Cell, 9: 171-184, 1997), олеозина подсолнечника (Cummins, etal., Plant Mol. Biol. 19:873-876, 1992)], специфические для эндосперма промоторы [например, LMW и HMW пшеницы, глютенина-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), глиадинов a, b и g пшеницы (EMBO3:1409-15, 1984), промотор ltrl ячменя, гордеина B1, С, D ячменя (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996), DOF ячменя (Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), синтетический промотор (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), промотор проламина NRP33 риса, глобулина Glb-1 риса (Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998), альфа-глобулина REB/OHP-1 риса (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33:513-S22, 1997), PP ADP-глюкозы риса (Trans Res 6:157-68, 1997), промотор гена семейства ESR маиса (Plant J 12:235-46, 1997), гамма-кафирина сорго (Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996)], специфические для зародышей промоторы [например, OSH1 риса (Sato et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma of al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999)

олеозина риса (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], специфические для цветков промоторы [например, AtPRP4, халкон-синтазы (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al., Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala-3, репродуктивных тканей растений [например, промоторы OsMADS (заявка на патент США №2007/0006344)].

[00160] Нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению также могут экспрессироваться под контролем промоторов, которые регулируются химическим путем. Это обеспечивает возможность синтеза белков Cry по настоящему изобретению только в случае обработки культурных растений индуцирующими химическими веществами. Примеры такой технологии химической индукции экспрессии генов подробно описаны в публикации заявки ЕР 0332104 и патенте США №5614395. В одном варианте осуществления химически регулируемый промотор представляет собой промотор PR-1а табака.

[00161] Другая категория промоторов, применимых в настоящем изобретении, включает промотор, который индуцируется ранением. Были описаны многочисленные промоторы, которые экспрессируются в участках ранения, а также в участках инфицирования фитопатогеном. В идеальном случае такой промотор должен активироваться локально в участках инвазии насекомых и, таким образом, инсектицидные белки накапливаются исключительно в клетках, где необходим синтез инсектицидных белков для уничтожения нападающего насекомого-вредителя. Примеры промоторов этого типа включают такие промоторы, которые описаны в Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993) и Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).

[00162] Неограничивающие примеры промоторов, обуславливающих тканеспецифические паттерны экспрессии, применимые в настоящем изобретении, включают специфические для зеленой ткани, специфические для корня, специфические для стебля или специфические для цветка. Промоторы, подходящие для экспрессии в зеленой ткани, включают множество промоторов, которые осуществляют регуляцию генов, участвующих в фотосинтезе, и многие из них были клонированы как из однодольных, так и из двудольных. Одним из таких промоторов является промотор РЕРС гена фосфоенолкарбоксилазы маиса (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). Другим промотором специфической для корня экспрессии является промотор, описанный de Framond (FEBS 290:103-106 (1991) или в патенте США №5466785). Другой промотор, применимый в настоящем изобретении, представляет собой специфический для стебля промотор, описанный в патенте США №5625136, который в естественных условиях управляет экспрессией гена trpA маиса.

[00163] В дополнение к выбору подходящего промотора конструкциям для экспрессии инсектицидного токсина в растениях требуется соответствующий терминатор транскрипции, который будет функционально связан ниже гетерологичной нуклеотидной последовательности. Несколько таких терминаторов доступны и известны в данной области техники (например, tml из CaMV, Е9 из rbcS). В контексте настоящего изобретения можно применять любой доступный терминатор, о котором известно, что он функционирует в растениях.

[00164] В кассеты экспрессии, описанные в настоящем изобретении, можно вводить множество других последовательностей. Они предусматривают последовательности, которые, как показано, усиливают экспрессию, как, например, интронные последовательности (например, из Adhl и bronzel) и вирусные лидерные последовательности (например, из TMV, MCMV и AMV).

[00165] Предпочтительным может быть нацеливание экспрессии нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению в различные клеточные локализации в растении. В некоторых случаях может быть желательной локализация в цитозоле, тогда как в других случаях предпочтительной может быть локализация в определенной субклеточной органелле. Для осуществления настоящего изобретения на практике можно применять любой механизм нацеливания генных продуктов, например в растениях, и, как известно, такие механизмы существуют в растениях, и последовательности, регулирующие функционирование таких механизмов, были описаны довольно подробно. Были охарактеризованы последовательности, которые обеспечивают нацеливание генных продуктов в другие компартменты клетки. Аминоконцевые последовательности могут обусловливать нацеливание представляющего интерес белка в любой компартмент клетки, такой как вакуоль, митохондрия, пероксисома, белковые тельца, эндоплазматический ретикулум, хлоропласт, крахмальное зерно, амилопласт, апопласт или клеточная стенка растения (например, Unger et. al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989); Rogers et. al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-651; патенты США №7102057; WO 2005/096704, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Необязательно сигнальная последовательность может представлять собой N-концевую сигнальную последовательность из waxy, N-концевую сигнальную последовательность из гамма-зеина, домен, связывающий крахмал, С-концевой домен, связывающий крахмал, последовательность, нацеливающую в хлоропласт, которая обеспечивает доставку зрелого белка в хлоропласт (Comai et. al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15104-15109; van den Broeck, et. al. (1985) Nature 313: 358-363; патент США №5639949) или сигнальную последовательность секреции из клеток алейронового слоя (Koehler & Но, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Кроме того, аминоконцевые последовательности вместе с карбоксиконцевыми последовательностями обусловливают нацеливание генных продуктов в вакуоль (Shinshi et. al. (1990) Plant Molec. Biol. 14: 357-368). В одном варианте осуществления выбранная сигнальная последовательность включает известный сайт расщепления, и при конструировании слияния учитываются любые аминокислоты после сайта(сайтов) расщепления, необходимые для расщепления. В некоторых случаях это требование может быть выполнено путем добавления небольшого числа аминокислот между сайтом расщепления и ATG трансгена или, в качестве альтернативы, путем замещения некоторых аминокислот в пределах последовательности трансгена. Эти методики конструирования хорошо известны из уровня техники и одинаково применимы к любому клеточному компартменту.

[00166] Будет понятно, что описанные выше механизмы нацеливания в клетке можно использовать не только с сочетании когнатными для них промоторами, но также в сочетании с гетерологичными промоторами, так что специфическая задача нацеливания в клетке осуществляется под транскрипционным контролем промотора, характеризующегося паттерном экспрессии, отличный от такового для промотора, из которого получен нацеливающий сигнал.

Трансформация растений

[00167] Процедуры трансформации растений хорошо известны и общеприняты в данной области и описаны в литературе во всех отношениях. Неограничивающие примеры способов трансформации растений включают трансформацию с помощью доставки нуклеиновых кислот, опосредованной бактериями (например, с помощью Agrobacterium), доставки нуклеиновых кислот, опосредованной вирусами, доставки нуклеиновых кислот, опосредованной карбидом кремния или микроиглами с нуклеиновыми кислотами, доставки нуклеиновых кислот, опосредованной липосомами, микроинъекцию, бомбардировку микрочастицами, трансформацию, опосредованную фосфатом кальция, трансформацию, опосредованную циклодекстринами, электропорацию, трансформацию, опосредованную наночастицами, обработку ультразвуком, инфильтрацию, поглощение нуклеиновых кислот, опосредованное PEG, а также любой другой электрический, химический, физический (механический) или биологический механизм, который приводит к введению нуклеиновой кислоты в растительную клетку, включая любую их комбинацию. Общие руководства по разнообразным способам трансформации растений, известным в данной области, включают Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), pages 67-88) и Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858 (2002)).

[00168] Для трансформации, опосредованной Agrobacterium, подходят бинарные векторы или векторы, несущие по меньшей мере одну граничную последовательность T-DNA, тогда как для прямого переноса генов (например, с помощью бомбардировки частицами и т.п.) подходит любой вектор, при этом можно применять линейную ДНК, содержащую только представляющую интерес конструкцию. В случае прямого переноса генов можно применять трансформацию при помощи одного вида ДНК или котрансформацию (Schocher et al., Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). В случае как прямого переноса генов, так и переноса, опосредованного Agrobacterium, трансформацию обычно (но не обязательно) выполняют с селектируемым маркером, который может представлять собой средство для позитивного отбора (фосфоманнозоизомераза), которое обеспечивает устойчивость к антибиотику (канамицину, гигромицину или метотрексату) или гербициду (глифосату или глюфосинату). Однако выбор селектируемого маркера не является критически важным для настоящего изобретения.

[00169] Трансформация, опосредованная Agrobacterium, представляет собой способ, широко применяемый для трансформации растений в связи с высокой эффективностью трансформации и в связи с широкой применимостью в отношении множества различных видов. Трансформация, опосредованная Agrobacterium, как правило, предполагает перенос бинарного вектора, несущего чужеродную ДНК, представляющую интерес, в соответствующий штамм Agrobacterium, что может зависеть от набора генов vir штамма-хозяина Agrobacterium, расположенного либо в корезидентной Ti-плазмиде, либо в хромосоме (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169). Перенос рекомбинантного бинарного вектора в Agrobacterium можно выполнять с помощью процедуры трехродительского скрещивания с применением Escherichia coli, несущей рекомбинантный бинарный вектор, хелперного штамма E.coli, несущего плазмиду, которая способна мобилизовать рекомбинантный бинарный вектор в целевом штамме Agrobacterium. В качестве альтернативы, рекомбинантный бинарный вектор можно переносить в Agrobacterium путем трансформации нуклеиновой кислоты ( & Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16:9877).

[00170] Двудольные, а также однодольные можно трансформировать с использованием Agrobacterium. Способы опосредованной Agrobacterium трансформации риса включают хорошо известные способы трансформации риса, такие как описанные в любом из следующего: Европейская патентная заявка ЕР 1198985 A1, Aldemita and Hodges (Planta 199:612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены. В случае трансформации кукурузы предпочтительным способом является описанный или в Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996), или Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены. Указанные способы также описаны в качестве примера в Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 и в Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Нуклеиновые кислоты или конструкция, подлежащие экспрессии, предпочтительно клонируют в вектор, который является подходящим для трансформации Agrobacterium tumefaciens, например pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Агробактерии, трансформированные таким вектором, затем можно применять известным способом для трансформации растений, таких как растения, применяемые в качестве модели, такие как Arabidopsis, или сельскохозяйственные культуры, такие как, в качестве примера, растения табака, например, посредством погружения истолоченных листьев или нарубленных листьев в раствор агробактерий и затем культивирования их в подходящей среде. Трансформация растений посредством Agrobacterium tumefaciens описана, например, Hagen and Willmitzer в Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 или известна, в частности, из F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; в Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

[00171] Трансформация растения с помощью рекомбинантной Agrobacterium обычно включает совместное культивирование Agrobacterium с эксплантатами растения, и ее проводят в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. Трансформированную ткань регенерируют на селективной среде, содержащей маркер устойчивости к антибиотикам или гербицидам между граничными последовательностями T-DNA бинарной плазмиды.

[00172] Как обсуждалось ранее, другой способ трансформации растений, частей растений и растительных клеток включает внедрение инертных или биологически активных частиц в растительные ткани и клетки. См, например, патенты США №№4945050, 5036006 и 5100792. В общем случае этот способ включает внедрение в растительные клетки инертных или биологически активных частиц в условиях, эффективных для проникновения через наружную поверхность клетки и возможности встраивания в ее внутреннюю часть. При использовании инертных частиц вектор можно вводить в клетку путем покрытия частиц вектором, содержащим представляющую интерес нуклеиновую кислоту. В качестве альтернативы, клетка или клетки могут быть окружены вектором так, чтобы вектор переносился в клетку вслед за частицей. Биологически активные частицы (например, высушенная дрожжевая клетка, высушенная бактерия или бактериофаг, каждая(каждый) из которых содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, подлежащих введению) также можно внедрять в растительную ткань.

[00173] В других вариантах осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению можно напрямую вводить в геном пластид путем трансформации. Основное преимущество трансформации пластид состоит в том, что пластиды обычно способны экспрессировать бактериальные гены без существенной модификации, при этом пластиды способны экспрессировать несколько открытых рамок считывания под контролем одного промотора. Технология трансформации пластид подробно описана в патентах США №№5451513, 5545817 и 5545818, в заявке согласно PCT №WO 95/16783 и в McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Основная методика трансформации хлоропластов включает введение участков клонированной пластидной ДНК, фланкирующих селектируемый маркер, вместе с представляющим интерес геном в подходящую целевую ткань, например, с применением биолистики или трансформации протопластов (например, трансформации, опосредованной хлоридом кальция или PEG). Фланкирующие участки размером 1-1,5 т.о., называемые нацеливающими последовательностями, содействуют гомологичной рекомбинации с геномом пластид и, таким образом, обеспечивают замещение или модификацию специфических участков пластома. Сначала в качестве селектируемого маркера трансформации можно использовать точечные мутации в генах 16S рРНК и rps12 хлоропластов, придающие устойчивость к спектиномицину или стрептомицину (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.M., and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Наличие сайтов клонирования между этими маркерами позволяет создать вектор, нацеленный на пластиды, для введения чужеродных генов (Staub, J.М., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Существенного повышения частоты трансформации можно достичь путем замещения рецессивных генов rRNA или r-белка, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, на доминантный селектируемый маркер, бактериальный ген aadA, кодирующий фермент аминогликозид-3'-аденилтрансферазу, обезвреживающий спектиномицин (Svab, Z., and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Ранее этот маркер успешно применяли для трансформации генома пластид зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с высокой частотой (Goldschmidt-Clermont, М. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Другие селектируемые маркеры, применимые для трансформации пластид, известны из уровня техники и включены в объем настоящего изобретения. Как правило, для достижения состояния, при котором все пластиды являются одинаковыми, требуется около 15-20 циклов клеточного деления после трансформации. При экспрессии в пластидах, при которой гены вставлены с помощью гомологической рекомбинации во все несколько тысяч копий кольцевого пластидного генома, присутствующего в каждой растительной клетке, используют преимущество огромного числа копий по сравнению с генами, экспрессируемыми в ядре, что допускает уровни экспрессии, которые легко могут превышать 10% общего количества растворимых растительных белков. В одном варианте осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению может быть вставлен в вектор, нацеленный на пластиды, и введен в геном пластид требуемого растения-хозяина путем трансформации. Таким образом, можно получить растения, гомопластические в отношении геномов пластид, содержащих нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, способные экспрессировать полинуклеотид на высоком уровне.

[00174] Способы отбора трансформированных трансгенных растений, растительных клеток или культур растительных тканей являются общепринятыми в данной области техники и могут использоваться в способах настоящего изобретения, предусмотренных в данном документе. Например, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению также может включать кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность селектируемого маркера, который можно применять для отбора трансформированного растения, части растения или растительной клетки. Применяемое в данном документе выражение "селектируемый маркер" означает нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии придает отличительный фенотип растению, части растения или растительной клетке, экспрессирующим данный маркер, и, таким образом, позволяет отличать такие трансформированные растения, части растений или растительные клетки от тех, которые не имеют маркера. Такая нуклеотидная последовательность может кодировать либо селектируемый, либо подвергаемый скринингу маркер в зависимости от того, придает ли маркер признак, по которому можно провести отбор с помощью химических средств, например, путем применения селективного средства (например, антибиотика, гербицида и т.п.), или от того, является ли маркер просто признаком, который можно идентифицировать посредством наблюдения или тестирования, например, путем скрининга (например, признаком, определяемым в R-локусе). Разумеется, существует много примеров подходящих селектируемых маркеров, которые известны из уровня техники и могут применяться в кассетах экспрессии, описанных в данном документе.

[00175] Примеры селектируемых маркеров включают без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую neo или nptII, которые придают устойчивость к канамицину, G418 и т.п. (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188); нуклеотидную последовательность, кодирующую bar, который придает устойчивость к фосфинотрицину; нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSP), которая придает устойчивость к глифосату (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922); нуклеотидную последовательность, кодирующую нитрилазу, такую как bxn от Klebsiella ozaenae, которая придает устойчивость к бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную ацетолактатсинтазу (ALS), которая придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ALS-ингибирующим химическим веществам (европейская патентная заявка №154204); нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивую к метотрексату дигидрофолатредуктазу (DHFR) (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); нуклеотидную последовательность, кодирующую далапондегалогеназу, которая придает устойчивость к далапону; нуклеотидную последовательность, кодирующую маннозо-6-фосфатизомеразу (также называемую фосфоманнозоизомеразой (PMI)), которая придает способность к метаболизму маннозы (патенты США №5767378 и №5994629); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную антранилатсинтазу, которая придает устойчивость к 5-метилтриптофану; или нуклеотидную последовательность, кодирующую hph, который придает устойчивость к гигромицину. Специалист в данной области способен выбрать подходящий селектируемый маркер для применения в кассете экспрессии по настоящему изобретению.

[00176] Дополнительные селектируемые маркеры включают без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую β-глюкуронидазу или uidA (GUS), который кодирует фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты; нуклеотидную последовательность R-локуса, которая кодирует продукт, регулирующий продуцирование антоцианиновых пигментов (красного цвета) в растительных тканях (Dellaporta et al., "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac," pp. 263-282, в Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustafson & Appels eds., Plenum Press 1988)); нуклеотидную последовательность, кодирующую β-лактамазу, фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты (например, PADАС, хромогенный цефалоспорин) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741); нуклеотидную последовательность, кодирующую xylE, который кодирует катехолдиоксигеназу (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101-1105); нуклеотидную последовательность, кодирующую тирозиназу, фермент, способный окислять тирозин до DOPA и допахинона, который, в свою очередь, конденсируется с образованием меланина (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); нуклеотидную последовательность, кодирующую β-галактозидазу, фермент, для которого существуют хромогенные субстраты; нуклеотидную последовательность, кодирующую люциферазу (lux), которая обеспечивает выявление с помощью биолюминесценции (Ow et al. (1986) Science 234:856-859); нуклеотидную последовательность, кодирующую экворин, который может быть использован в обнаружении чувствительной к кальцию биолюминесценции (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268); или нуклеотидную последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406). Специалист в данной области способен выбрать подходящий селектируемый маркер для применения в кассете экспрессии по настоящему изобретению.

[00177] Дополнительно, как хорошо известно из уровня техники, целые трансгенные растения можно регенерировать из трансформированных растительных клеток, культур растительных тканей или культивируемых протопластов с помощью любой из множества известных методик. Регенерация растений из растительных клеток, культуры растительных тканей или культивируемых протопластов описана, например, в Evans et al. (Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMilan Publishing Co. New York (1983)); и Vasil I.R. (ed.) (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I (1984), and Vol. II (1986)).

[00178] Кроме того, описанные выше свойства генов, обеспеченные с помощью методик генной инженерии в трансгенных семенах и растениях, частях растения или растительных клетках по настоящему изобретению, могут передаваться путем полового размножения или вегетативного роста и, следовательно, могут поддерживаться и передаваться по наследству растениям-потомкам. Как правило, при поддержании и передаче по наследству применяют известные сельскохозяйственные способы, разработанные для соответствия конкретным целям, таким как уборка урожая, посев или возделывание.

[00179] Следовательно, полинуклеотид можно вводить в растение, часть растения или растительную клетку с помощью любого из целого ряда способов, хорошо известных из уровня техники, как описано выше. Следовательно, не придерживаются какого-либо конкретного способа введения одного или нескольких полинуклеотидов в растение, а наоборот, можно применять любой способ, обеспечивающий стабильную интеграцию одного или нескольких полинуклеотидов в геном растения. Если требуется ввести более одного полинуклеотида, то соответствующие полинуклеотиды можно собрать как части одной молекулы нуклеиновой кислоты или как отдельные молекулы нуклеиновых кислот и можно расположить в пределах одной и той же или различных молекул нуклеиновых кислот. Соответственно, введение полинуклеотидов в представляющую интерес клетку можно осуществлять в ходе одного события трансформации, в ходе отдельных событий трансформации или, например, в растения, в виде части протокола скрещивания.

[00180] Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают собранные продукты, полученные из трансгенных растений или их частей по настоящему изобретению, а также переработанный продукт, полученный из данных собранных продуктов. Собранный продукт может представлять собой целое растение или любую часть растения, как раскрыто в данном документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления неограничивающие примеры собранного продукта включают семя, плод, цветок или его часть (например, пыльник, рыльце и т.п.), лист, стебель и т.п. В других вариантах осуществления переработанный продукт включает без ограничения муку тонкого помола, муку грубого помола, масло, крахмал, крупу и т.п., полученные из собранного семени или другой части растения по настоящему изобретению, при этом указанное семя или другая часть растения содержат молекулу нуклеиновой кислоты/полинуклеотид/нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению.

[00181] В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен экстракт из трансгенного семени или трансгенного растения по настоящему изобретению, при этом экстракт содержит молекулу нуклеиновой кислоты, полинуклеотид, нуклеотидную последовательность или токсичный белок по настоящему изобретению. Экстракты из растений или частей растений можно получить согласно процедурам, хорошо известным в данной области (см. de la Torre et al., Food, Agric. Environ. 2(1):84-89 (2004); Guidet, Nucleic Acids Res. 22(9): 1772-1773 (1994); Lipton et al., Food Agric. Immun. 12:153-164 (2000)).

Инсектицидные композиции

[00182] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена инсектицидная композиция, содержащая белок Cry по настоящему изобретению в приемлемом с точки зрения сельского хозяйства носителе. Применяемое в данном документе выражение "приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель" может включать природный или синтетический, органический или неорганический материал, который объединен с активным белком Cry для содействия его применению по отношению к растению или его части или в растении или его части. Примеры приемлемых с точки зрения сельского хозяйства носителей включают без ограничения порошки, дусты, пеллеты, гранулы, аэрозоли, эмульсии, коллоиды и растворы. Приемлемые с точки зрения сельского хозяйства носители дополнительно включают без ограничения инертные компоненты, диспергирующие вещества, поверхностно-активные вещества, вспомогательные вещества, придающие липкость вещества, клейкие вещества, связующие вещества или их комбинации, которые можно применять в составах, используемых в сельском хозяйстве. Такие композиции можно применять любым способом, посредством которого пестицидные белки или другие средства для контроля вредителей приводят в контакт с вредителями. Соответственно, композиции можно наносить на поверхности растений или частей растений, в том числе на семена, листья, цветки, стебли, клубни, корни и т.п. В других вариантах осуществления растение, продуцирующее белок Cry по настоящему изобретению in planta, представляет собой используемый в сельском хозяйстве носитель экспрессируемого белка Cry.

[00183] В дополнительных вариантах осуществления инсектицидная композиция содержит бактериальную клетку или трансгенную бактериальную клетку по настоящему изобретению, при этом бактериальная клетка или трансгенная бактериальная клетка продуцирует белок Cry по настоящему изобретению. Такую инсектицидную композицию можно получить путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, осаждения или концентрирования культуры клеток Bacillus thuringiensis (Bt). Такие культуры Bt можно подвергать отбору из группы штаммов Bt, состоящей из С0633, С0724, С1100, описанных ниже в примерах, или трансгенных культур Bt. В дополнительных вариантах осуществления композиция содержит от приблизительно 1% до приблизительно 99% по весу белка Cry по настоящему изобретению.

[00184] Белки Cry по настоящему изобретению можно применять в комбинации с другими средствами для контроля вредителей для увеличения спектра целевых вредителей или для предупреждения или управления устойчивостью насекомых. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, обеспечивающая контроль одного или нескольких вредителей растений, при этом композиция содержит первый белок Cry по настоящему изобретению и второе средство для контроля вредителей, отличное от первого белка Cry. В других вариантах осуществления композиция представляет собой состав для местного нанесения на растение. В еще одних вариантах осуществления композиция представляет собой трансгенное растение. В дополнительных вариантах осуществления композиция представляет собой комбинацию, предусматривающую состав и трансгенное растение, на которое он наносится. В некоторых вариантах осуществления состав содержит первый белок Cry по настоящему изобретению, если трансгенное растение содержит второе средство для контроля вредителей. В других вариантах осуществления состав содержит второе средство для контроля вредителей, если трансгенное растение содержит первый белок Cry по настоящему изобретению.

[00185] В некоторых вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей может представлять собой средство, выбранное из группы, состоящей из химического пестицида, как, например, инсектицида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis (Bt), инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Brevibacillus laterosporus, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, ингибиторов протеаз (как сериновых, так и цистеиновых типов), лектинов, альфа-амилазы, пероксидазы, холестериноксидазы и молекулы двухнитевой РНК (dsRNA).

[00186] В других вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей представляет собой химический пестицид, выбранный из группы, состоящей из пиретроидов, карбаматов, неоникотиноидов, блокаторов натриевых каналов нейронов, инсектицидных макроциклических лактонов, антагонистов гамма-аминомасляной кислоты (GABA), инсектицидных мочевин и миметиков ювенильного гормона. В других вариантах осуществления химический пестицид выбран из группы, состоящей из абамектина, ацефата, ацетамиприда, амидофлумета (S-1955), авермектина, азадирахтина, азинфос-метила, бифентрина, бинфеназата, бупрофезина, карбофурана, хлорфенапира, хлорфлуазурона, хлорпирифоса, хлорпирифос-метила, хромафенозида, клотианидина, цифлутрина, бета-цифлутрина, цигалотрина, лямбда-цигалотрина, циперметрина, циромазина, дельтаметрина, диафентиурона, диазинона, дифлубензурона, диметоата, диофенолана, эмамектина, эндосульфана, эсфенвалерата, этипрола, фенотикарба, феноксикарба, фенпропатрина, фенпроксимата, фенвалерата, фипронила, флоникамида, флуцитрината, тау-флювалината, флуфенерима (UR-50701), флуфеноксурона, фонофоса, галофенозида, гексафлумурона, имидаклоприда, индоксакарба, изофенфоса, луфенурона, малатиона, метальдегида, метамидофоса, метидатиона, метомила, метопрена, метоксихлора, монокротофоса, метоксифенозида, нитиазина, новалурона, новифлумурона (XDE-007), оксамила, паратиона, паратион-метила, перметрина, фората, фозалона, фосмета, фосфамидона, пиримикарба, профенофоса, пиметрозина, пиридалила, пирипроксифена, ротенона, спиносада, спиромезифена (BSN 2060), сульпрофоса, тебуфенозида, тефлубензурона, тефлутрина, тербуфоса, тетрахлорвинфоса, тиаклоприда, тиаметоксама, тиодикарба, тиосултап-натрия, тралометрина, трихлорфона и трифлумурона, алдикарба, оксамила, фенамифоса, амитраза, хинометионата, хлоробензилата, цигексатина, дикофола, диенохлора, этоксазола, феназаквина, оксида фенбутатина, фенпропатрина, фенпироксимата, гекситиазокса, пропаргита, пиридабена и тебуфенпирада. В еще одних вариантах осуществления химический пестицид выбран из группы, состоящей из циперметрина, цигалотрина, цифлутрина и бета-цифлутрина, эсфенвалерата, фенвалерата, тралометрина, фенотикарба, метомила, оксамила, тиодикарба, клотианидина, имидаклоприда, тиаклоприда, индоксакарба, спиносада, абамектина, авермектина, эмамектина, эндосульфана, этипрола, фипронила, флуфеноксурона, трифлумурона, диофенолана, пирипроксифена, пиметрозина и амитраза.

[00187] В дополнительных вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей может представлять собой один или несколько из любого числа инсектицидных белков Bacillus thuringiensis, в том числе без ограничения белок Cry, вегетативный инсектицидный белок (VIP) и инсектицидные химерные варианты любого из перечисленных выше инсектицидных белков. В других вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей представляет собой белок Cry, выбранный из группы, состоящей из Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ad, Cry1Ae, Cry1Af, Cry1Ag, Cry1Ah, Cry1Ai, Cry1Aj, Cry1Ba, Cry1Bb, Cry1Bc, Cry1Bd, Cry1Be, Cry1Bf, Cry1Bg, Cry1Bh, Cry1Bi, Cry1Ca, Cry1Cb, Cry1Da, Cry1Db, Cry1Dc, Cry1Dd, Cry1Ea, Cry1Eb, Cry1Fa, Cry1Fb, Cry1Ga, Cry1Gb, Cry1Gc, Cry1Ha, Cry1Hb, Cry1Hc, Cry1Ia, Cry1Ib, Cry1Ic, Cry1Id, Cry1Ie, Cry1If, Cry1Ig, Cry1Ja, Cry1Jb, Cry1Jc, Cry1Jd, Cry1Ka, Cry1La, Cry1Ma, Cry1Na, Cry1Nb, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac, Cry2Ad, Cry2Ae, Cry2Af, Cry2Ag, Cry2Ah, Cry2Ai, Cry2Aj, Cry2Ak,Cry2Al, Cry2Ba, Cry3Aa, Cry3Ba, Cry3Bb, Cry3Ca, Cry4Aa, Cry4Ba, Cry4Ca, Cry4Cb, Cry4Cc, Cry5Aa, Cry5Ab, Cry5Ac, Cry5Ad, Cry5Ba, Cry5Ca, Cry5Da, Cry5Ea, Cry6Aa, Cry6Ba, Cry7Aa, Cry7Ab, Cry7Ac, Cry7Ba, Cry7Bb, Cry7Ca, Cry7Cb, Cry7Da, Cry7Ea, Cry7Fa, Cry7Fb, Cry7Ga, Cry7Gb, Cry7Gc, Cry7Gd, Cry7Ha, Cry7Ia, Cry7Ja, Cry7Ka, Cry7Kb, Cry7La, Cry8Aa, Cry8Ab, Cry8Ac, Cry8Ad, Cry8Ba, Cry8Bb, Cry8Bc, Cry8Ca, Cry8Da, Cry8Db, Cry8Ea, Cry8Fa, Cry8Ga, Cry8Ha, Cry8Ia, Cry8Ib, Cry8Ja, Cry8Ka, Cry8Kb, Cry8La, Cry8Ma, Cry8Na, Cry8Pa, Cry8Qa, Cry8Ra, Cry8Sa, Cry8Ta, Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Bb, Cry9Ca, Cry9Da, Cry9Db, Cry9Dc, Cry9Ea, Cry9Eb, Cry9Ec, Cry9Ed, Cry9Ee, Cry9Fa, Cry9Ga, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry11Ba, Cry11Bb, Cry12Aa, Cry13Aa, Cry14Aa, Cry14Ab, Cry15Aa, Cry16Aa, Cry17Aa, Cry18Aa, Cry18Ba, Cry18Ca, Cry19Aa, Cry19Ba, Cry19Ca, Cry20Aa, Cry20Ba, Cry21Aa, Cry21Ba, Cry21Ca, Cry21Da, Cry21Ea, Cry21Fa, Cry21Ga, Cry21Ha, Cry22Aa, Cry22Ab, Cry22Ba, Cry22Bb, Cry23Aa, Cry24Aa, Cry24Ba, Cry24Ca, Cry25Aa, Cry26Aa, Cry27Aa, Cry28Aa, Cry29Aa, Cry29Ba, Cry30Aa, Cry30Ba, Cry30Ca, Cry30Da, Cry30Db, Cry30Ea, Cry30Fa, Cry30Ga, Cry31Aa, Cry31Ab, Cry31Ac, Cry31Ad, Cry32Aa, Cry32Ab, Cry32Ba, Cry32Ca, Cry32Cb, Cry32Da, Cry32Ea, Cry32Eb, Cry32Fa, Cry32Ga, Cry32Ha, Cry32Hb, Cry32Ia, Cry32Ja, Cry32Ka, Cry32La, Cry32Ma, Cry32Mb, Cry32Na, Cry32Oa, Cry32Pa, Cry32Qa, Cry32Ra, Cry32Sa, Cry32Ta, Cry32Ua, Cry33Aa, Cry34Aa, Cry34Ab, Cry34Ac, Cry34Ba, Cry35Aa, Cry35Ab, Cry35Ac, Cry35Ba, Cry36Aa, Cry37Aa, Cry38Aa, Cry39Aa, Cry40Aa, Cry40Ba, Cry40Ca, Cry40Da, Cry41Aa, Cry41Ab, Cry41Ba, Cry42Aa, Cry43Aa, Cry43Ba, Cry43Ca, Cry43Cb, Cry43Cc, Cry44Aa, Cry45Aa, Cry46Aa Cry46Ab, Cry47Aa, Cry48Aa, Cry48Ab, Cry49Aa, Cry49Ab, Cry50Aa, Cry50Ba, Cry51Aa, Cry52Aa, Cry52Ba, Cry53Aa, Cry53Ab, Cry54Aa, Cry54Ab, Cry54Ba, Cry55Aa, Cry56Aa, Cry57Aa, Cry57Ab, Cry58Aa, Cry59Aa, Cry59Ba, Cry60Aa, Cry60Ba, Cry61Aa, Cry62Aa, Cry63Aa, Cry64Aa, Cry65Aa, Cry66Aa, Cry67Aa, Cry68Aa, Cry69Aa, Cry69Ab, Cry70Aa, Cry70Ba, Cry70Bb, Cry71Aa, Cry72Aa и Cry73Aa.

[00188] В дополнительных вариантах осуществления второе средство для контроля вредителей представляет собой вегетативный инсектицидный белок Vip3, выбранный из группы, состоящей из Vip3Aa1, Vip3Aa2, Vip3Aa3, Vip3Aa4, Vip3Aa5, Vip3Aa6, Vip3Aa7, Vip3Aa8, Vip3Aa9, Vip3Aa10, Vip3Aa11, Vip3Aa12, Vip3Aa13, Vip3Aa14, Vip3Aa15, Vip3Aa16, Vip3Aa17, Vip3Aa18, Vip3Aa19, Vip3Aa20, Vip3Aa21, Vip3Aa22, Vip3Aa2, Vip3Aa24, Vip3Aa25, Vip3Aa26, Vip3Aa27, Vip3Aa28, Vip3Aa29, Vip3Aa30, Vip3Aa31, Vip3Aa32, Vip3Aa33, Vip3Aa34, Vip3Aa35, Vip3Aa36, Vip3Aa37, Vip3Aa38, Vip3Aa39, Vip3Aa40, Vip3Aa41, Vip3Aa42, Vip3Aa43, Vip3Aa44, Vip3Ab1, Vip3Ab2, Vip3Ac1, Vip3Ad1, Vip3Ad2, Vip3Ae1, Vip3Af1, Vip3Af2, Vip3Af3, Vip3Ag1, Vip3Ag2, Vip3Ag3 HM117633, Vip3Ag4, Vip3Ag5, Vip3Ah1, Vip3Ba1, Vip3Ba2, Vip3Bb1, Vip3Bb2 и Vip3Bb3.

[00189] В еще дополнительных вариантах осуществления первый белок Cry по настоящему изобретению и второе средство для контроля вредителей коэкспрессируются в трансгенном растении. Такой коэкспрессии нескольких пестицидных компонентов в одном и том же трансгенном растении можно достигнуть путем получения растения, содержащего и экспрессирующего все необходимые гены, с помощью методов генной инженерии. В качестве альтернативы растение, родитель 1, может быть получено с помощью методов генной инженерии для экспрессии белка Cry по настоящему изобретению. Второе растение, родитель 2, может быть получено с помощью методов генной инженерии для экспрессии второго средства для контроля вредителей. Путем скрещивания родителя 1 с родителем 2 получают растений-потомков, которые экспрессируют все гены, введенные в родителей 1 и 2.

[00190] В других вариантах осуществления настоящего изобретения

предусматривается трансгенное растение с пакетированными признаками, устойчивое к заражению вредителями растений, содержащее последовательность ДНК, кодирующую dsRNA для супрессии основного гена в организме целевого вредителя, и последовательность ДНК, кодирующую белок Cry по настоящему изобретению, проявляющий биологическую активность в отношении целевого вредителя. Ранее сообщалось о том, что dsRNA являются неэффективными против определенных вредителей, относящихся к чешуекрылым (Rajagopol et al. 2002. J. Biol. Chem. 277:468-494) вероятно из-за высокого показателя рН в средней кишке, который нарушает устойчивость dsRNA. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления, в которых целевой вредитель является вредителем, относящимся к чешуекрылым, белок Cry по настоящему изобретению функционирует для транзиентного снижения показателя рН в средней кишке, который обеспечивает стабилизацию совместно поглощаемой dsRNA, делая dsRNA эффективной в сайленсинге генов-мишеней.

[00191] В дополнение к получению композиций в настоящем изобретении предусматриваются способы продуцирования белка Cry, токсичного для вредителя, относящегося к чешуекрылым. Такой способ предусматривает культивирование трансгенной клетки-хозяина, отличной от клетки человека, которая содержит полинуклеотид, или химерный ген, или молекулу нуклеиновой кислоты, или рекомбинантный вектор по настоящему изобретению, в условиях, при которых клетка-хозяин продуцирует белок, токсичный для вредителя, относящегося к чешуекрылым. В некоторых вариантах осуществления трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, представляет собой растительную клетку. В некоторых других вариантах осуществления растительная клетка представляет собой клетку маиса. В других вариантах осуществления условия, при которых выращивают растительную клетку или клетку маиса, включают естественный солнечный свет. В других вариантах осуществления трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, представляет собой бактериальную клетку. В еще одних вариантах осуществления трансгенная клетка-хозяин, отличная от клетки человека, представляет собой дрожжевую клетку.

[00192] В других вариантах осуществления способа вредитель, относящийся к чешуекрылым, выбран из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки-ипсилон (Agrotis ipsilon), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), огневки тростниковой (Diatraea saccharalis), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes), огневки кукурузной юго-западной (Diatraea grandiosella), западной бобовой совки (Richia albicosta), табачной совки (Heliothis virescens), восточного кукурузного мотылька (Ostrinia furnacalis), хлопковой совки (Helicoverpa armigera), огневки желтой рисовой (Chilo suppressalis), розовой стеблевой совки (Sesamia calamistis), огневки рисовой (Cnaphalocrocis medinalis) и любой их комбинации.

[00193] В дополнительных вариантах осуществления способа химерный ген содержит любую из SEQ ID NO: 1-3 или их фрагмент, кодирующий токсин. В еще одних вариантах осуществления продуцируемый белок содержит аминокислотную последовательность под любой из SEQ ID NO: 10-12 их токсиновый фрагмент.

[00194] В некоторых вариантах осуществления способа химерный ген содержит нуклеотидную последовательность, кодон-оптимизированную для экспрессии в растении. В других вариантах осуществления химерный ген содержит любую из SEQ ID NO: 4-9 или их фрагмент, кодирующий токсин. В дополнительных вариантах осуществления продуцируемый белок содержит аминокислотную последовательность под любой из SEQ ID NO: 10-15 или их токсиновый фрагмент.

[00195] В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения устойчивого к вредителям (например, устойчивого к насекомым) трансгенного растения, предусматривающий введение в растение полинуклеотида, химерного гена, рекомбинантного вектора, кассеты экспрессии или молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, содержащих нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок Cry по настоящему изобретению, где нуклеотидная последовательность экспрессируется в растении, за счет чего растению придается устойчивость по меньшей мере к чешуекрылому вредителю, и получение устойчивого к вредителям трансгенного растения. В некоторых вариантах осуществления устойчивое к вредителям трансгенное растение является устойчивым по меньшей мере к кукурузному мотыльку (Ostrinia nubilalis) или совке-ипсилон (Agrotis ipsilon) в сравнении с контрольным растением, у которого отсутствует полинуклеотид, химерный ген, рекомбинантный вектор, кассета экспрессии или молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления введение достигается путем трансформации растения. В других вариантах осуществления введение достигается путем скрещивания первого растения, содержащего химерный ген, рекомбинантный вектор, кассету экспрессии или молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, с отличающимся вторым растением.

[00196] В некоторых вариантах осуществления трансгенное растение по настоящему изобретению, устойчивое по меньшей мере к кукурузному мотыльку (Ostrinia nubilalis) или совке-ипсилон (Agrotis ipsilon), дополнительно является устойчивым по меньшей мере к одному дополнительному насекомому, где дополнительное насекомое включает без ограничения совку травяную (Spodoptera frugiperda), американскую кукурузную совку (Helicoverpa zea), огневку тростниковую (Diatraea saccharalis), гусеницу совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевую совку (Chrysodeixis includes), огневку кукурузную юго-западную (Diatraea grandiosella), западную бобовую совку (Richia albicosta), табачную совку (Heliothis virescens), восточного кукурузного мотылька (Ostrinia furnacalis), хлопковую совку (Helicoverpa armigera), огневку желтую рисовую (Chilo suppressalis), розовую стеблевую совку (Sesamia calamistis) или огневку рисовую (Cnaphalocracis medinalis) и любую их комбинацию.

[00197] В дополнительных вариантах осуществления предусмотрен способ контроля по меньшей мере чешуекрылого насекомого-вредителя, такого как кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis) или совка-ипсилон (Agrotis ipsilon), при этом способ предусматривает доставку в организм насекомых эффективного количества белка Cry по настоящему изобретению. Для эффективного воздействия белок Cry вначале попадает в насекомое пероральным путем. Однако белок Cry может доставляться в насекомое с помощью многих известных способов. Способы доставки белка в организм насекомого пероральным путем предусматривают без ограничения обеспечение белка (1) в трансгенном растении, при этом насекомое съедает (поглощает) одну или несколько частей трансгенного растения, поглощая тем самым полипептид, экспрессируемый в трансгенном растении; (2) в составленной белковой(белковых) композиции(композициях), которые можно наносить, например, на питательную среду насекомых или включать в ее состав; (3) в белковой(белковых) композиции(композициях), которые можно наносить на поверхность, например, путем опрыскивания поверхности части растения, и которая затем заглатывается насекомым в силу того, что насекомое съедает одну или несколько подвергнутых опрыскиванию частей растения; (4) в матрице приманки или (5) с помощью любой другой известной в данной области системы доставки белков. Таким образом, для доставки токсичных белков Cry по настоящему изобретению можно применять любой способ пероральной доставки в насекомое. В некоторых конкретных вариантах осуществления белок Cry по настоящему изобретению доставляют в организм насекомого пероральным путем, при этом насекомое поедает одну или несколько частей трансгенного растения.

[00198] В других вариантах осуществления белок Cry по настоящему изобретению доставляют в организм насекомого пероральным путем, при этом насекомое поедает одну или несколько частей растения, подвергнутых опрыскиванию композицией, содержащей белки Cry по настоящему изобретению. Доставку композиций по настоящему изобретению на поверхность растения можно осуществлять с помощью любого способа нанесения соединений, композиций, составов и т.п. на поверхности растений, известного специалистам в данной области. Некоторые неограничивающие примеры доставки на растение или его часть или приведения в контакт с ними включают опрыскивание, опыливание, посыпание, распыление, орошение туманом, мелкодисперсное разбрызгивание, разбрасывание, пропитывание, впрыскивание в почву, введение в почву, смачивание (например, обработку корней, почвы), погружение, полив, нанесение покрытия, впитывание в листья или стебли, внесение в междурядья или обработку семян и т.п. и их комбинации. Эти и другие процедуры приведения растения или его части в контакт с соединением(соединениями), композицией(композициями) или составом(составами) хорошо известны специалистам в данной области.

[00199] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ предоставления фермеру средств для контроля вредителя, относящегося к чешуекрылым, при этом способ предусматривает поставку или продажу фермеру растительного материала, такого как семя, при этом растительный материал содержит полинуклеотид, химерный ген, кассету экспрессии или рекомбинантный вектор, способные экспрессировать белок Cry по настоящему изобретению в растении, выращиваемом из семени, как описано выше.

[00200] Варианты осуществления настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на следующие примеры. Предполагается, что предыдущее и последующее описание вариантов осуществления настоящего изобретения и различные варианты осуществления не ограничивают формулу изобретения, а скорее иллюстрируют ее. Таким образом, будет понятно, что формула изобретения не ограничивается конкретными подробностями данных примеров. Специалистам в данной области будет понятно, что другие варианты осуществления настоящего изобретения могут быть осуществлены на практике без отклонения от сущности и объема данного раскрытия, объем которого определяется прилагаемой формулой изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Идентификация активных штаммов Bt

[00201] Изоляты Bacillus thuringiensis культивировали из спор, присутствующих в текущих коллекциях, и поддерживали на чашках с Т3 + агаром с добавлением пенициллина. Каждый изолят выращивали в аэробных условиях в 24-луночных планшетах с глубокими лунками в течение приблизительно 10 дней при 28°С до споруляции, которую подтверждали с помощью окрашивания раствором кумасси синего/уксусной кислоты и визуализации с помощью микроскопа. После споруляции как растворимые, так и нерастворимые фракции тестировали, чтобы определить активность в отношении представляющих интерес видов чешуекрылых. Фракции тестировали в биологическом анализе контаминации поверхности, при котором фракциями покрывали искусственную питательную среду для культивирования множества видов. Каждый изолят подвергали скринингу в отношении по меньшей мере четырех видов чешуекрылых, в том числе Helicoverpa zea (американская кукурузная совка), Agrotis ipsilon (совка-ипсилон), Ostrinia nubilalis (кукурузный мотылек) и Spodoptera frugiperda (совка травяная), при размере выборки 12 новорожденных личинок. Продолжительность каждого анализа составляла приблизительно 7 дней при комнатной температуре; планшеты оценивали в отношении смертности, а также ингибирования роста личинок. Наблюдаемое повышение смертности на 30% по сравнению с отрицательным контролем считалось показателем активности. На основе результатов первичного тестирования на насекомых для дальнейшего анализа отобрали штаммы С0633, С0724 и С1100.

Пример 2. Выделение и секвенирование генов Bt

[00202] Конструирование фосмидной геномной библиотеки: Для некоторых штаммов Bt, идентифицированных в примере 1, гены, кодирующие предположительно активные белки, выделяли с применением способа фосмидной библиотеки, описанного, главным образом, в Park et al. (FEMSLett. 284:28-34 (2008). Фосмидную библиотеку конструировали с применением набора для получения фосмидных библиотек CopyControl™ Fosmid Library Production Kit (Epicentre, Мэдисон, Висконсин) согласно протоколу производителя. Вкратце, очищенную ДНК из каждого штамма Bt (примерно 0,5 мкг) обрабатывали ферментами для репарации концов с образованием "тупых" концов и затем лигировали в фосмидный вектор pCC1FOS (Epicentre). После упаковки in vitro в фаги лямбда и инфицирования Escherichia coli (Е. coli) EPI1300-T1^® бактериальные клетки высевали на среду Лурия-Бертани (LB), содержащую 12,5 мкг/мл хлорамфеникола. До отбора колоний планшеты инкубировали при приблизительно 37°С в течение 24 ч. Трансфицированные колонии Е. coli переносили в 96-луночные планшеты, содержащие 150 мкл среды LB, содержащей хлорамфеникол, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч.

[00203] Скрининг колоний с помощью гибридизации: Фосмидную библиотеку высевали при плотности 300 КОЕ на 100×15 мм чашку с L-агаром и 15 мкг/мл хлорамфеникола. В общей сложности высевали 3000 бактерий с фосмидами. Гибридизации на фильтре осуществляли с использованием фильтров в виде кружков Immobilon-Ny + размером 87 мм (EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс). Перенос колоний выполняли следующим образом: фильтры помещали на чашки на приблизительно 5 мин., затем с помощью пинцета фильтры снимали с поверхности агара и помещали стороной с колониями кверху на фильтровальную бумагу Ватмана, пропитанную 0,5 М NaOH, на 5 мин. Затем фильтры с колониями помещали на фильтровальную бумагу Ватмана, пропитанную 2Х SSC, на 5 мин. ДНК иммобилизировали на мембране с использованием UV Stratalinker^®, установленного на 2000×100 мкДж (Stratagene, Inc., Ла-Хойя, Калифорния). Затем фильтры сушили на воздухе на фильтровальной бумаге Ватмана. Фильтры подвергали предварительной гибридизации и гибридизации в 250 мМ NaPO4, рН 7,0, 7% SDS, 1% BSA при 65°С согласно описанию поставщика. Гибридизационные фильтры промывали в 2Х SSC, 0,5% SDS в течение 30 мин. при 65°С, затем в 0,2Х SSC, 0,2% SDS в течение 30 мин. при 65°С. Фильтры экспонировали на рентгеновскую пленку (Kodak^® BIOMAX^® XAR, Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания) в течение ночи с использованием усиливающих экранов при -80°С. Положительные колонии переносили на L-arap с 15 мкг/мл хлорамфеникола.

[00204] Гибридизационные зонды: конструировали ПЦР-праймеры для амплификации фрагмента cry2-подобного гена из геномной ДНК штамма Bt, обозначенного как С0633. Пара праймеров включала прямой праймер, обозначенный OAR2609a, имеющий последовательность GTTTAAACATGAATAATGTATTGAATAGCG (SEQ ID NO: 16), и обратный праймер, обозначенный OAR2610a, имеющий последовательность GGCGCGCCTTAATACAGTGGTAGAAGATTAG (SEQ ID NO: 17). ПЦР-реакцию проводили при следующих условиях проведения циклов: [94°С, 5 мин.], 25x [94°С, 30 с, 55°С, 30 с, 72°С, 2 мин.]. Реакционная смесь содержала 1X буфер One Taq^® (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс), 200 мкМ dNTP, 80 нг ДНК, 2,5 ед. ДНК-полимеразы One Taq^®, по 50 нг каждого праймера и стерильную дистиллированную воду для доведения общего объема реакционной смеси до 50 мкл.

[00205] Полученный ампликон разделяли на 1% агарозном геле с ТАЕ, содержащем бромистый этидий. Ампликон визуализировали под УФ-светом и вырезали из геля. ДНК выделяли с применением набора для экстракции из геля согласно описанию поставщика (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Зонды метили с помощью EasyTide (-32P) dCTP, 3000 Ки/ммоль (Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс) с применением системы мечения произвольных праймеров Rediprime II (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания). Невстроившиеся нуклеотиды удаляли с применением хроматографических колонок Micro Bio-Spin 30 (Biorad, Геркулес, Калифорния). Зонды нагревали при 95°С в течение 5 мин. перед добавлением в раствор для гибридизации.

[00206] Секвенирование генов Bt: Препараты ДНК для 2-4 независимых клонов готовили в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen). Реакции секвенирования с праймерами, сконструированными к двум нитям прогнозируемой представляющей интерес нуклеотидной последовательности, осуществляли с применением набора BigDye™ Terminator (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Продукты реакции подвергали электрофоретическому разделению на приборах для секвенирования ABI373 или ABI377. Все данные секвенирования анализировали с применением пакета программного обеспечения Phred/Phrap/Consed (Вашингтонский университет) с частотой ошибок, равной или меньше 10^-4, на уровне консенсусной последовательности. Последовательность собирали с помощью программы Sequencher™ (версия 4.7, Gene Codes Corp., Энн-Арбор, Мичиган). Каждый ген секвенировали с 4Х перекрыванием.

Пример 3. Клонирование и синтез генов Bt

[00207] Конструировали пары Cry2-специфических праймеров для облегчения идентификации и клонирования генов типа cry2. Пару праймеров конструировали для гибридизации с 5'-концом гена типа cry2 с добавлением сайта рестрикции для PmeI и с -концом с добавлением сайта рестрикции для AscI. -Прямой праймер, обозначенный OAR2609a, имел последовательность GTTTAAACATGAATAATGTATTGAATAGG (SEQ ID NO: 16), и обратный праймер, обозначенный OAR2610a, имел последовательность GGCGCGCCCTACTCTTGTGTTTCAATAAA (SEQ ID NO: 17). Вставленные сайты рестрикции подчеркнуты в соответствующих праймерах. ПЦР-реакцию осуществляли с использованием следующих условий проведения циклов: 30х [98°С, 10 с, 55°С, 30 с, 72°С, 2 мин.]. Реакционная смесь содержала 1X буфер Phusion HF, 200 мкМ dNTP, 80 нг ДНК, 1 ед. ДНК-полимеразы Phusion (New England Biolabs), по 50 нг каждого праймера и стерильную дистиллированную воду для доведения общего объема реакционной смеси до 50 мкл.

[00208] Продукты ПЦР реакции очищали с использованием набора для очистки и концентрирования ДНК Zymo Research DNA. ДНК расщепляли с использованием 10 ед. AscI (New England Biolabs) с 2,4 мкг ампликона, 1X буфера Cutsmart в 40 мкл, а затем инкубировали при 37°С в течение 3 часов. Расщепленную ДНК очищали с использованием набора для очистки и концентрирования ДНК Zymo Research DNA.

[00209] Полученный ампликон клонировали в вектор ТОРО pCR 4.0 согласно описанию поставщика (Life Technologies). Выделенную плазмидную ДНК расщепляли с использованием PmeI и AscI согласно описанию поставщика (New England Biolabs).

[00210] Фрагмент PmeI/AscI клонировали в челночный вектор, обозначенный , сконструированный для экспрессии как в Е. coli,, так и в B. thuringiensis. Вектор расщепляли с использованием PmeI и AscI. Расщепленный вектор и фрагмент гена очищали путем прогона в 1% агарозном геле на основе буфера, содержащего трис-ацетат-EDTA. Фрагменты вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAGEN согласно описанию поставщика. Фрагменты лигировали вместе с использованием набора для лигирования от New England Biolabs согласно описанию поставщика. Продукты реакции лигирования трансформировали в клетки ТОР10 (Life Technologies) согласно описанию поставщика и высевали их на L-arap, содержащий 100 мг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК выделяли из отдельной колонии и идентифицированный клон снова секвенировали с 2Х перекрыванием с целью подтверждения правильной последовательности.

[00211] Некоторые гены Bt, которые были отобраны для рекомбинантной продукции, но не были напрямую клонированы из геномной ДНК, передали сторонним подрядчикам для синтеза полного гена. Эти синтезированные гены Bt субклонировали в описанные выше челночные векторы для последующей экспрессии и дальнейшего тестирования биологической активности.

Пример 4. Сборка и анализ генома

[00212] Ряд генов cry из Bt по настоящему изобретению выделяли из штаммов, идентифицированных в примере 1, с использованием подхода полногеномного секвенирования. Вкратце, ДНК Bacillus разрезали с помощью ультразвукового прибора Covaris S2 (Covaris, Inc., Вобурн, Массачусетс) с использованием программы DNA_400bp с такими установками: рабочий режим: 10%; интенсивность: 4; циклы/импульс: 200. ДНК обрабатывали с помощью модуля для репарации концов/добавления dA-хвоста NEBNext^® Ultra™ (New England Biolabs, Inc. Ипсвич, Массачусетс). Индексные адаптеры 1-57 от Biooscience (1-27 Бразилия, 28-57 США, Великобритания и Швейцария) лигировали с использованием NEB Quick Ligation™ согласно описанию поставщика (New England Biolabs, Inc. Ипсвич, Массачусетс). Продукты лигирования очищали с использованием гранул Agencourt AMPure ХР согласно описанию поставщика (Beckman Coulter, Inc., Индианаполис, Индиана).

[00213] Библиотеку разделяли на фракции по размеру следующим образом: 50 мкл образца смешивали с 45 мкл 75% смеси гранул (25% гранул AMPure и 75% раствора NaCl/PEG от TekNova, № по кат. Р4136). Смесь перемешивали и помещали на магнитную подставку. Полученный супернатант переносили в новую лунку и добавляли 45 мкл 50% смеси гранул (50% гранул AMPure и 50% раствора NaCl/PEG от TekNova, № по кат. Р4136). Данную смесь перемешивали и помещали на магнитную подставку. Полученный супернатант удаляли и гранулы промывали 80% этанолом. Добавляли 25 мкл элюирующего буфера (ЕВ) и смесь помещали на магнитную подставку. Полученный конечный супернатант удаляли и помещали в пробирку на 1,5 мл. Этот способ позволяет получать библиотеки с диапазоном размеров ДНК 525 пар оснований (п.о.) (вставка плюс адаптер).

[00214] Отсортированную по размеру ДНК-библиотеку амплифицировали с применением КАРА Biosystem HiFi Hot Start (Кара Biosystems, Inc., Уилмингтон, Массачусетс) с применением следующих условий проведения циклов: [98°С, 45 с]; 12х [98°С, 15 с, 60°С, 30 с, 72°С, 30 с]; [72°С, 1 мин.]. Каждая реакционная смесь содержала: 5 мкл ДНК-библиотеки, 1 мкл универсальных праймеров от Bioscience (25 мкМ), 18 мкл стерильной воды, 1 мкл индексированных праймеров от Bioscience (25 мкМ), 25 мкл 2Х полимеразы КАРА HiFi.

[00215] Библиотеки анализировали на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) с применением высокочувствительных чипов для определения диапазона размеров и среднего размера вставок в библиотеке. Все библиотеки подвергали секвенированию спаренных концов (РЕ) (100 циклов на рид; 12-24 библиотек на дорожку) в системе секвенирования HiSeq 2500 с применением стандартных протоколов секвенирования от производителя (Illumina, Inc., Сан-Диего, Калифорния).

[00216] Разрабатывали инструмент для проведения расчетов в отношении Bacillus, чтобы идентифицировать и охарактеризовать вероятные гены Cry-подобных белков для расстановки приоритетов в отношении направлений дополнительных лабораторных тестов.

[00217] Сборка и анализ генома, а также анализ геномной библиотеки, описанный выше, привели к идентификации в штаммах Bacillus thuringiensis трех Cry2-подобных генов, проявляющих токсичность в отношении по меньшей мере кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis) или американской кукурузной совки (Helicoverpa zea). Идентифицирующие характеристики Cry2-подобных генов и белков приведены в таблице 1.

Пример 5. Гомология ВТ0016, ВТ0026 и ВТ0032 с известными белками Cry Bt

[00218] Поиск по базам данных белков с применением аминокислотных последовательностей белков по настоящему изобретению показал, что они являются гомологичными известным инсектицидным белкам. Сравнение аминокислотных последовательностей белков по настоящему изобретению с неизбыточной (nr) базой данных, поддерживаемой NCBI (веб-сайт в сети Интернет ncbi.nlm.nih.gov), используя алгоритм BLAST, позволило выявить, что белки по настоящему изобретению характеризуются наивысшей степенью идентичности с белками семейства Cry2. Более конкретно, ВТ0016 характеризуются приблизительно 71% идентичностью с белками Cry2A, иллюстративные последовательности которых можно найти в NCBI под номерами доступа М31738, М23724, Х57252, AF200816, AAQ52362, EF439818, АСН91610 и EU939453, и приблизительно 88% идентичностью с белками Cry2В, иллюстративные последовательности которых можно найти в NCBI под номерами доступа КС156655 и KF014123. ВТ0026 характеризуется приблизительно 77% идентичностью с белками Cry2A и приблизительно 66% идентичностью с белками Cry2B. ВТ0032 характеризуется приблизительно 88% идентичностью с белками Cry2A и приблизительно 72% идентичностью с белками Cry2B.

Пример 6. Экспрессия белков Bt в рекомбинантных клетках-хозяевах

[00219] Экспрессия в Bacillus. Белки Cry, описанные в примере 4, были экспрессированы в штамме Bacillus thuringiensis (Bt) crystal minus (не продуцирующем белок Cry), у которого отсутствует наблюдаемая исходная инсектицидная активность, посредством челночного вектора, обозначенного , сконструированного для экспрессии как в Е. coli,, так и в Bt. Вектор содержит промотор Cry1Ac, который управляет экспрессией клонированного гена Cry Bt, и маркер устойчивости к эритромицину. Кассетами экспрессии, содержащими представляющую интерес последовательность, кодирующую Cry, трансформировали клетку-хозяина штамма Bt посредством электропорации и проводили отбор трансгенных штаммов Bt на чашках с агаром, содержащих эритромицин. Отобранные трансгенные штаммы Bt выращивали до фазы споруляции в средах Т3 при 28°С в течение 4-5 дней. Клеточные осадки собирали и промывали несколько раз перед солюбилизацией в карбонатном буфере с высоким рН (50 мМ), содержащем 2 мМ DTT.

[00220] Экспрессия в Е. coli. Белки Cry экспрессировали в штаммах Е. coli,, используя векторы рЕТ28а или рЕТ29а (Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Конструкции трансформировали посредством электропорации и проводили отбор трансгенных клонов Е. coli на чашках с агаром, содержащих канамицин. Отобранные трансгенные штаммы Е. coli выращивали и индуцировали экспрессию белка Cry путем индукции с помощью IPTG при 28°С. Клетки ресуспендировали в карбонатном буфере с высоким рН (50 мМ), содержащем 2 мМ DTT, а затем разрушали с применением гомогенизатора Microfluidics LV-1.

[00221] Анализ экспрессии. Полученные в результате клеточные лизаты из трансгенных штаммов либо Bt, либо Е. coli осветляли посредством центрифугирования и образцы анализировали в отношении чистоты посредством SDS-PAGE и электрофореграммы, используя систему BioRad Experion system (Biorad, Геркулес, Калифорния). Концентрации общего белка определяли с помощью анализа по Брэдфорду или Thermo 660. Очищенные белки Cry затем тестировали в описанных ниже биологических анализах.

Пример 7. Активность белков Cry в биологических анализах

[00222] Белки Cry, полученные в примере 6, тестировали с использованием известного в данной области биологического анализа с использованием искусственного рациона в отношении одного или нескольких следующих видов насекомых-вредителей: совка травяная (FAW; Spodoptera frugiperda), американская кукурузная совка (CEW; Helicoverpa zea), кукурузный мотылек (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), совка-ипсилон (BCW; Agrotis ipsilon), огневка тростниковая (SCB; Diatraea saccharlis), гусеница совки бархатных бобов (VBC; Anticarsia gemmatalis), соевая совка (SBL; Pseudoplusia includens), огневка кукурузная юго-западная (SWCB; Diatraea grandiosella), западная бобовая совка (WBCW; Striacosta albicosta), табачная совка (TBW; Heliothis virescens), восточный кукурузный мотылек (АСВ; Ostrinia furnacalis), хлопковая совка (CBW; Helicoverpa armigera), огневка желтая рисовая (SSB; Chilo suppressalis), розовая стеблевая совка (PSB; Sesamia inferens) и огневка рисовая (RLF; Cnaphalocrocis medinails).

[00223] Равное количество белка в виде раствора наносили на поверхность искусственной питательной среды для насекомых (Bioserv, Inc., Френчтаун, Нью-Джерси) в 24-луночных планшетах. После высыхания поверхности питательной среды в каждый планшет добавляли личинок видов насекомых, подлежащих тестированию. Планшеты запечатывали и выдерживали в окружающих условиях лаборатории с учетом температуры, освещения и относительной влажности. Группа положительного контроля состояла из личинок, подвергаемых воздействию очень активного штамма Bacillus дикого типа с широким спектром действия. Группы отрицательного контроля состояли из личинок, подвергаемых воздействию питательной среды для насекомых, обработанной только буферным раствором, и личинок на необработанной питательной среде для насекомых; то есть только на питательной среде. Смертность определяли через приблизительно 120 часов и оценивали в баллах в сравнении с контролями.

[00224] Результаты показаны в таблице 2, где "-" означает отсутствие активности в сравнении с контрольной группой, "+/-" означает 0-10% активность в сравнении с контролем (эта категория также включала 0% смертность при сильном ингибировании роста личинок), "+" означает 10-25% активность в сравнении с контролем, "++" означает 26-75% активность в сравнении с контролем, а "+++" означает 76-100% активность в сравнении с контролем. Обозначение "nt" в таблице 2 означает, что указанный белок не тестировали в отношении этого конкретного вредителя.

Пример 8. Введение генов в вектор для экспрессии в растении

[00225] Перед экспрессией в растениях синтетические полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный белок Cry, mBT-00032 (SEQ ID NO: 15), синтезировали с использованием платформы для автоматизированного синтеза генов (Genscript, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси). В этом примере получали первую кассету экспрессии, содержащую убиквитиновый промотор маиса (Ubi1), функционально связанный с последовательностью, кодирующей белок Cry, которая была функционально связана с терминатором Nos, а также получали вторую кассету экспрессии, содержащую промотор Ubi1, функционально связанный с последовательностью, кодирующей фосфоманнозоизомеразу (PMI), которая была функционально связана с терминатором Nos. Экспрессия PMI позволяет осуществлять положительную селекцию трансгенных растений на маннозе. Обе кассеты экспрессии клонировали в подходящий вектор для трансформации маиса, опосредованной Agrobacterium.

Пример 9. Экспрессия и активность белков Cry в растениях маиса

[00226] Трансформацию незрелых зародышей маиса выполняли, главным образом, как описано в Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798 803. Вкратце, штамм Agrobacterium LBA4404 (pSB1), содержащий вектор экспрессии, описанный в примере 5, выращивали на твердой среде YEP, содержащей (дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л), NaCl (5 г/л), 15 г/л агара, рН 6,8), в течение 2-4 дней при 28°С. Примерно 0,8×10⁹ клеток Agrobacterium суспендировали в среде LS-inf, дополненной 100 мкМ As. Бактерий предварительно индуцировали в данной среде в течение примерно 30-60 минут.

[00227] Незрелых зародышей инбредной линии маиса вырезали из початков возрастом 8-12 дней с переносом в жидкую среду LS-inf + 100 мкМ As. Зародышей однократно ополаскивали свежей средой для инфицирования. Затем добавляли раствор Agrobacterium, и зародышей перемешивали на вихревой мешалке в течение 30 секунд и оставляли осесть с бактериями в течение 5 минут. Затем зародышей переносили стороной со щитком зародыша кверху на среду LSAs и культивировали в темноте в течение двух-трех дней. Впоследствии примерно 20-25 зародышей на чашку Петри переносили на среду LSDc, дополненную цефотаксимом (250 мг/л) и нитратом серебра (1,6 мг/л), и культивировали в темноте при примерно 28°С в течение 10 дней.

[00228] Незрелых зародышей, образующих эмбриогенный каллюс, переносили в среду LSD1M0.5S. Селекцию культур на этой среде осуществляли в течение примерно 6 недель, при этом через приблизительно 3 недели проводили стадию субкультивирования. Выжившие каллюсы переносили на среду Reg1, дополненную маннозой. После культивирования на свету (в режиме 16 часов света/8 часов темноты) зеленые ткани затем переносили на среду Reg2 без регуляторов роста и инкубировали в течение приблизительно 1-2 недель. Проростки переносили в контейнеры Magenta GA-7 (Magenta Corp, Чикаго, Иллинойс), содержащие среду Reg3, и выращивали на свету. Спустя приблизительно 2-3 недели растения тестировали с помощью ПЦР в отношении наличия генов PMI, а также гена cry Bt. Растения, показавшие положительные результаты в ПЦР-анализе, переносили в теплицу для дальнейшей оценки.

[00229] Трансгенные растения из 14 отдельных объектов оценивали в отношении числа копий (определяли с помощью анализа Taqman), уровня экспрессия белка (определяли с помощью ELISA) и эффективности в отношении представляющих интерес видов насекомых в биологических анализах с вырезанием листа. В частности, ткань растения вырезали из однокопийных объектов (на стадии V3-V4) и заражали новорожденными личинками целевого вредителя, затем инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно 5 дней. Листовые диски из трансгенных растений, экспрессирующих ВТ-0032, тестировали в отношении поражения кукурузным мотыльком (Ostrinia nubilalis), американской кукурузной совкой (Helicoverpa zea), совкой травяной (Spodoptera frugiperda) и табачной совкой (Heliothis virescens).

[00230] Результаты биологического анализа, подтверждающие, что стабильно трансформированные растения, экспрессирующие Cry2-подобный белок ВТ-0032 в диапазоне 4,12-13,1 мкг/грамм сырой ткани, являются активными в отношении американской кукурузной совки (Helicopverpa zea) и табачной совки (Heliothis virescens).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты для экспрессии инсектицидного белка Cry, а также к конструкции, вектору, клетке, трансгенному растению и семени, содержащим вышеуказанную молекулу. Также раскрыты инсектицидный белок Cry, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, а также способ его получения. Изобретение позволяет эффективно бороться с чешуекрылым вредителем, выбранным из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes) и табачной совки (Heliothis virescens). 10 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 табл., 9 пр.

1. Молекула нуклеиновой кислоты для экспрессии инсектицидного белка Cry, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный белок, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, где инсектицидный белок включает SEQ ID NO:15, где вредитель, относящийся к чешуекрылым, выбран из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes) или табачной совки (Heliothis virescens).

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, где нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO:9.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, где нуклеотидная последовательность представляет собой синтетическую последовательность, которая имеет кодоны, оптимизированные для экспрессии в трансгенном организме.

4. Конструкция для экспрессии инсектицидного белка Cry, которая представляет собой химерный ген, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, где молекула нуклеиновой кислоты включает гетерологичный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью.

5. Конструкция по п. 4, где гетерологичный промотор представляет собой промотор, обеспечивающий экспрессию в растении.

6. Конструкция по п. 5, где промотор, обеспечивающий экспрессию в растении, выбран из группы промоторов, состоящей из промотора убиквитина, вируса желтой курчавости листьев цеструма, TrpA кукурузы, OsMADS 6, гистона H3 маиса, 5'-UTR гена 9 бактериофага T3, сахарозосинтетазы 1 кукурузы, алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы, светособирающего комплекса кукурузы, белка теплового шока кукурузы, mtl маиса, малой субъединицы RuBP карбоксилазы гороха, актина риса, циклофилина риса, маннопинсинтазы Ti-плазмиды, нопалинсинтазы Ti-плазмиды, халкон-изомеразы петунии, богатого глицином белка 1 бобов, пататина картофеля, лектина, 35S CaMV и малой субъединицы S-E9 RuBP карбоксилазы.

7. Выделенный или рекомбинантный инсектицидный белок Cry, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, где белок Cry содержит SEQ ID NO:15 и где вредитель, относящийся к чешуекрылым, выбран из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes) или табачной совки (Heliothis virescens).

8. Рекомбинантный вектор для экспрессии инсектицидного белка, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1.

9. Трансгенная бактериальная или растительная клетка для экспрессии инсектицидного белка по п. 7, где клетка содержит рекомбинантный вектор по п. 8.

10. Трансгенная бактериальная клетка по п. 9, где бактериальная клетка является представителем рода Bacillus, Clostridium, Xenorhabdus, Photorhabdus, Pasteuria, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc или Alcaligenes.

11. Трансгенная клетка Bacillus по п. 10, где клетка Bacillus представляет собой клетку Bacillus thuringiensis.

12. Трансгенная растительная клетка по п. 9, где растительная клетка представляет собой a) клетку двудольного растения; или b) клетку однодольного растения; или c) клетку двудольного растения, выбранную из группы, состоящей из клетки сои, клетки подсолнечника, клетки томата, клетки культурной разновидности капусты, клетки хлопчатника, клетки сахарной свеклы и клетки табака; или d) клетку однодольного растения, выбранную из группы, состоящей из клетки ячменя, клетки маиса, клетки овса, клетки риса, клетки сорго, клетки сахарного тростника и клетки пшеницы.

13. Трансгенное растение для борьбы с насекомым-вредителем, содержащее трансгенную растительную клетку по п. 12, где растение представляет собой a) двудольное растение; или b) однодольное растение; или c) двудольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения сои, растения подсолнечника, растения томата, растения культурной разновидности капусты, растения хлопчатника, растения сахарной свеклы и растения табака; или d) однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из растения ячменя, растения маиса, растения овса, растения риса, растения сорго, растения сахарного тростника и растения пшеницы, а вредитель, относящийся к чешуекрылым, выбран из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes) или табачной совки (Heliothis virescens).

14. Трансгенное семя для размножения трансгенного растения по п. 13, в котором семя содержит конструкцию по п. 4.

15. Способ получения белка Cry, который является токсичным для вредителя, относящегося к чешуекрылым, предусматривающий культивирование трансгенной клетки по п. 9 в условиях, при которых трансгенная клетка продуцирует белок Cry, и где вредитель, относящийся к чешуекрылым, выбран из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes) или табачной совки (Heliothis virescens).

16. Способ по п. 15, где нуклеотидная последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в растении.

17. Способ по п. 15, где молекула нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO:9.

18. Способ получения устойчивого к насекомым трансгенного растения, предусматривающий введение в растение конструкции по п. 4, где белок Cry экспрессируется в растении, с получением таким образом устойчивого к насекомым трансгенного растения.

19. Способ по п. 18, где растение представляет собой растение маиса.

20. Способ борьбы с вредителем, который относится к чешуекрылым, предусматривающий доставку в организм вредителя, относящегося к чешуекрылым, или окружающую его среду композиции, содержащей эффективное количество белка Cry по п. 7, и где вредитель, относящийся к чешуекрылым, выбран из группы, состоящей из кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), совки травяной (Spodoptera frugiperda), американской кукурузной совки (Helicoverpa zea), гусеницы совки бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), соевой совки (Chrysodeixis includes) или табачной совки (Heliothis virescens).