КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, КОДИРУЮЩИЕ БЕЛОК Cry2Ai, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/82 C07K14/325 A01H1/06 

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[001] Официальная копия файла со списком последовательностей под названием «PD033499IN-SC sequence listing.txt», созданного 23 апреля 2019 г. и имеющего размер 25 килобайт, которая подана в электронном виде одновременно со спецификацией, является частью спецификации.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[002] Настоящее изобретение относится к кодон-оптимизированным синтетическим нуклеотидным последовательностям, кодирующим инсектицидный кристаллический белок Bacillus thuringiensis (Bt), обладающий инсектицидной активностью в отношении насекомых-вредителей, включая, но без ограничения, насекомых-вредителей, принадлежащих к порядку «Чешуекрылые». Настоящее изобретение также относится к экспрессии этих последовательностей в растениях.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Насекомые-вредители являются одной из основных причин потерь сельскохозяйственных культур в мире. Считается, что они ежегодно уничтожают пятую часть всех производимых в мире сельскохозяйственных культур. В процессе искусственного отбора культур, пригодных для потребления человеком, также отбираются и растения, в высокой степени восприимчивые к заражению насекомыми, что в конечном итоге снижает их экономическую ценность и увеличивает себестоимость продукции.

[004] Традиционно борьбу с насекомыми-вредителями проводят путем применения химических и/или биологических пестицидов. Существуют определенные опасения по поводу использования химических пестицидов в связи с опасностью для окружающей среды, связанной с производством и использованием химических пестицидов. В связи с такими опасениями регулирующие органы запретили или ограничили использование некоторых наиболее опасных пестицидов.

[005] Далее, хорошо известен тот факт, что насекомые-вредители способны эволюционировать со временем в процессе естественного отбора, адаптироваться к новым ситуациям, например, преодолевать действие токсичных материалов или обходить растения, которые естественным или искусственным образом являются устойчивыми, что еще больше усугубляет проблему.

[006] Биологический пестицид является экологически и коммерчески приемлемой альтернативой химическим пестицидам. Он представляет меньший риск загрязнения и экологической опасности, и отличается большей специфичностью в отношении мишени, чем традиционные химические инсектициды широкого спектра действия.

[007] Известно, что некоторые виды микроорганизмов рода Bacillus, например, Bacillus thuringiensis (B.t.), обладают инсектицидной активностью в отношении широкого спектра насекомых-вредителей. Инсектицидная активность, судя по всему, сконцентрирована в параспоральных тельцах включения кристаллического белка, хотя инсектицидные белки также были выделены из Bacillus thuringiensis на стадии вегетативного роста.

[008] Экспрессия генов инсектицидного кристаллического (cry) белка Bacillus thuringiensis (Bt) в растениях описана в данной области, однако было обнаружено, что экспрессировать природный ген Bt в растениях чрезвычайно сложно. Были сделаны попытки экспрессировать ген белка cry Bt в растениях в сочетаниях с различными промоторами, функциональными в растениях. Однако в трансгенных растениях белок был получен лишь на низких уровнях.

[009] Одной из причин низкой экспрессии гена Bt в растениях является высокое содержание A/T в последовательности ДНК Bt, в отличие от генов растений, в которых содержание G/C выше, чем A/T. Общий показатель A/T для генов бактерий составляет 60-70%, а для генов растений 40-50%. Как следствие, соотношение GC при использовании кодонов генов cry является в значительной степени недостаточным для экспрессии на оптимальном уровне. Кроме того, богатая A/T область также может содержать сайты терминации транскрипции (полиаденилирования AATAAA), мотив нестабильности мРНК (ATTTA) и скрытые сайты сплайсинга мРНК. Было обнаружено, что использование кодонов для природного гена cry Bt значительно отличается от у такового у генов растений. В результате мРНК данного гена может использоваться неэффективно. Использование кодонов может влиять на экспрессию генов на уровне трансляции или транскрипции, или процессинга мРНК. С целью оптимизации инсектицидного гена для экспрессии в растениях предпринимались попытки изменить ген, чтобы он как можно больше походил на гены, естественным образом присутствующие в трансформируемом растении-хозяине.

[0010] Однако создание сортов сельскохозяйственных растений, экспрессирующих на высоком/оптимальном уровне белок cry Bt, придающий устойчивость к определенным насекомым-вредителям, таким как листовертка рисовая, стеблевой точильщик рисовый, по-прежнему является серьезной проблемой в сельском хозяйстве. Были предприняты различные попытки контроля или предотвращения заражения растений насекомыми, однако некоторые насекомые-вредители остаются значительной проблемой в сельском хозяйстве. Вследствие этого, сохраняется необходимость в создании устойчивых к насекомым трансгенных сельскохозяйственных культур с желаемыми уровнями экспрессии инсектицидных белков в трансгенных растениях.

[0011] Настоящее изобретение предлагает решение существующей проблемы заражения насекомыми-вредителями за счет предоставления кодон-оптимизированной для растений синтетической последовательности ДНК, кодирующей белок Cry2Ai Bt, обладающий инсектицидной активностью в отношении насекомых-вредителей, включая, но без ограничения, насекомых-вредителей, относящихся к порядку «Чешуекрылые».

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] В настоящем документе раскрыты кодон-оптимизированные синтетические нуклеотидные последовательности, кодирующие белок Cry2Ai B. thuringiensis, обладающий инсектицидной активностью в отношении насекомых-вредителей. Настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии гетерологичных генов в клетках растений. Сконструирован ген, или кодирующая область гена, cry2Ai для обеспечения специфической для растений предпочтительной последовательности кодонов. Таким образом, изменено использование кодонов для белка Cry2Ai с целью повышения экспрессии в растениях. Такие оптимизированные для растений кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с промотором, способным управлять экспрессией кодирующих последовательностей в растительной клетке. Трансформированные клетки-хозяева и трансгенные растения, содержащие кодон-оптимизированные синтетические нуклеотидные последовательности B. thuringiensis, также являются аспектами настоящего изобретения.

[0013] Одной из целей настоящего изобретения является предложение кодон-оптимизированных синтетических нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидный белок, которые были оптимизированы для экспрессии в растениях.

[0014] Другой целью настоящего изобретения является предложение кодон-оптимизированных нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидный белок Bt, для достижения максимальной экспрессии белков Bt в растении, предпочтительно, в растении, выбранном из группы, состоящей из баклажана, хлопка, риса, томата, пшеницы, кукурузы, сорго, овса, проса, бобовых растений, капусты, цветной капусты, брокколи, видов Brassica, фасоли, гороха, голубиного гороха, картофеля, перца, тыквенных, салата, сладкого картофеля, канолы, сои, люцерны, арахиса и подсолнечника. Одним из признаков настоящего изобретения является то, что кодон-оптимизированные синтетические гены cry2Ai Bt сконструированы с использованием наиболее предпочтительных кодонов в баклажане, рисе и бобовых растениях.

[0015] В соответствии с настоящим изобретением авторы синтезировали гены Cry2Ai инсектицидного кристаллического белка Bt, в которых было изменено использование кодонов с целью повышения экспрессии в растениях, в частности, в баклажане, рисе и бобовых растениях. Однако вместо того, чтобы изменять использование кодонов для сходства с генами баклажана, риса или бобовых растений в отношении общего распределения кодонов, авторы изобретения оптимизировали использование кодонов путем использования кодонов, которые являются наиболее предпочтительными у таких растений, как рис, баклажан, томат, кукуруза и бобовые растения, в синтезе нуклеотидных последовательностей по изобретению. Оптимизированное, предпочтительное использование кодонов в растениях является эффективным для экспрессии инсектицидного белка Bt на высоких уровнях в двудольных растениях, таких как баклажан и томат; в однодольных растениях, таких как рис, и в бобовых растениях, таких как нут и голубиный горох.

[0016] Кодон-оптимизированные синтетические нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению получены из белка Cry2Ai Bacillus thuringiensis, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 (NCBI GenBank: ACV97158.1). Белок, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, активен против различных чешуекрылых насекомых, включая Helicoverpa armigera - совку хлопковую и совку кукурузную, Cnaphalocrocis medinalis - листовертку рисовую, а также Scirpophaga incertulas - стеблевого точильщика рисового и Pectinophora gossypiella.

[0017] Хотя настоящее изобретение описано на примерах синтеза оптимизированных для баклажана, риса и бобовых растений нуклеотидов cry2Ai Bt для экспрессии в рисе, баклажане и нуте, соответственно, понятно, что оптимизированные для баклажана нуклеотиды cry2Ai Bt могут быть использованы для оптимизации экспрессии белка также и в других растениях, таких как томат, кукуруза и хлопчатник. Кроме того, понятно, что оптимизированные для риса нуклеотиды cry2Ai Bt могут быть использованы для оптимизации экспрессии белка также и в других растениях. Аналогично, понятно, что оптимизированные для бобовых растений нуклеотиды cry2Ai Bt могут быть использованы для оптимизации экспрессии белка также и в других растениях.

[0018] Соответственно, один из аспектов настоящего изобретения относится к кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, где указанная нуклеотидная последовательность представляет собой

a. последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, или комплементарную ей нуклеотидную последовательность, или

b. нуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизуется с по меньшей мере 10 нуклеотидами нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, в положениях нуклеотидов от 251 до 402 и/или от 1456 до 1628, или комплементарную ей последовательность.

[0019] Другой аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантной ДНК, содержащей кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, где нуклеотидная последовательность функционально связана с гетерологичным регуляторным элементом.

[0020] Другой аспект настоящего изобретения относится к конструкции ДНК для экспрессии интересующего инсектицидного белка, содержащей 5'-нетранслируемую последовательность, кодирующую последовательность, кодирующую инсектицидный белок Cry2Ai, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или его инсектицидный фрагмент, и 3’-нетранслируемую область, где указанная 5’-нетранслируемая последовательность содержит промотор, функциональный в растительной клетке, где указанная кодирующая последовательность представляет собой кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, и где указанная 3’-нетранслируемая последовательность содержит последовательность терминации транскрипции и сигнал полиаденилирования.

[0021] Другой аспект настоящего изобретения относится к плазмидному вектору, содержащему рекомбинантную ДНК, раскрытую в настоящем документе, или конструкцию ДНК, раскрытую в настоящем документе.

[0022] Другой аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе.

[0023] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу придания растению устойчивости к насекомым, включающему

a. введение в растительную клетку кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе, где нуклеотидная последовательность функционально связана с (i) промотором, функциональным в растительной клетке, и (ii) терминатором;

b. получение трансформированной растительной клетки из растительной клетки этапа (a), где указанная трансформированная растительная клетка содержит указанную кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе; и

c. получение трансгенного растения из указанной трансформированной растительной клетки этапа (b), где указанное трансгенное растение содержит указанную кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе.

[0024] Другой аспект настоящего изобретения относится к трансгенному растению, содержащему кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе.

[0025] Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей Bacillus thuringiensis, содержащую кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, кодирующую белок Cry2Ai, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1.

[0026] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу борьбы с насекомыми, поражающими сельскохозяйственные культуры, и обеспечения устойчивости к насекомым, где указанный способ включает создание контакта указанной сельскохозяйственной культуры с эффективным для инсектицидного действия количеством композиции, раскрытой в настоящем документе.

[0027] Другой аспект настоящего изобретения относится к применению кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, конструкции ДНК или плазмиды, раскрытых в настоящем документе, для производства устойчивых к насекомым трансгенных растений.

[0028] Другой аспект настоящего изобретения относится к применению кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе, для производства инсектицидной композиции, которая содержит клетки Bacillus thuringiensis, содержащие указанные нуклеотидные последовательности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СОПРОВОДИТЕЛЬНЫХ ФИГУР

[0029] На ФИГУРЕ 1 представлена карта конструкции T-ДНК pGreen0179-CaMV35S-201M1.

[0030] На ФИГУРЕ 2 показана генетическая трансформация и регенерация трансгенных растений риса.

[0031] На ФИГУРЕ 3 представлена карта конструкции T-ДНК pGreen0029-CaMV35S-201M1.

[0032] На ФИГУРЕ 4 показана генетическая трансформация и регенерация трансгенных растений томата.

[0033] На ФИГУРЕ 5 представлены результаты биоанализа эффекта отделенного фрагмента стебля трансгенного растения риса, содержащего нуклеотидную последовательность 201M1, против личинок стеблевого точильщика рисового, S. incertulas.

[0034] На ФИГУРЕ 6 представлены результаты биоанализа эффекта отделенного фрагмента листа трансгенного растения риса, содержащего нуклеотидную последовательность 201M1, против личинок совки рисовой полевой, S. mauritia.

[0035] На ФИГУРЕ 7 представлены результаты биоанализа эффекта листового диска трансгенного растения томата, содержащего нуклеотидную последовательность 201M1, против личинок H. armigera.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0036] SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность белка Cry2Ai (NCBI GenBank: ACV97158.1).

[0037] SEQ ID NO: 2 представляет собой полноразмерную последовательность ДНК кодон-оптимизированного для однодольных растений синтетического гена cry2Ai (201M1), кодирующего белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

[0038] SEQ ID NO: 3 представляет собой полноразмерную последовательность ДНК кодон-оптимизированного для однодольных растений синтетического гена cry2Ai (201M2), кодирующего белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

[0039] SEQ ID NO: 4 представляет собой полноразмерную последовательность ДНК кодон-оптимизированного для однодольных растений синтетического гена cry2Ai (201M3), кодирующего белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

[0040] SEQ ID NO: 5 представляет собой полноразмерную последовательность ДНК кодон-оптимизированного для однодольных растений синтетического гена cry2Ai (201M4), кодирующего белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

[0041] SEQ ID NO: 6 представляет собой полноразмерную последовательность ДНК кодон-оптимизированного для однодольных растений синтетического гена cry2Ai (201M5), кодирующего белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

[0042] SEQ ID NO: 7 представляет собой полноразмерную последовательность ДНК кодон-оптимизированного для однодольных растений синтетического гена cry2Ai (201M6), кодирующего белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

[0043] SEQ ID NO: 8 представляет собой последовательность прямого праймера для амплификации последовательности ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2).

[0044] SEQ ID NO: 9 представляет собой последовательность обратного праймера для амплификации последовательности ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2).

[0045] SEQ ID NO: 10 представляет собой последовательность прямого праймера для амплификации ДНК гена nptII.

[0046] SEQ ID NO: 11 представляет собой последовательность обратного праймера для амплификации ДНК гена nptII.

[0047] SEQ ID NO: 12 представляет собой последовательность прямого праймера для амплификации гена hptII.

[0048] SEQ ID NO: 13 представляет собой последовательность обратного праймера для амплификации гена hptII.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0049] Подробное описание, приведенное в настоящем документе, предназначено для оказания помощи специалисту в данной области в осуществлении на практике настоящего изобретения и не должно толковаться как неоправданно ограничивающее сферу применения изобретения, поскольку модификации и вариации вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, могут быть применены специалистами в данной области без отклонения от сущности или объема изобретения. Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на сопроводительные чертежи и/или список последовательностей, в этом описании представлены и/или описаны некоторые, но не все, варианты осуществления изобретения. Изобретение может быть осуществлено во многих различных формах и не должно толковаться как ограниченное вариантами осуществления, приведенными в настоящем документе.

[0050] Хотя в настоящем документе использованы специальные термины, они использованы лишь в общем и описательном смысле, а не для целей ограничения. Следующие определения приведены для облегчения понимания вариантов осуществления.

[0051] Следует отметить, что при использовании в спецификации и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа терминов означает «один или более чем один» (то есть, по меньшей мере один) грамматический объект, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, упоминание «зонда» означает, что в композиции может присутствовать более чем один такой зонд. Аналогично, упоминание «элемента» означает «один или более элементов».

[0052] В тексте спецификации слова «включает» или «включающий» следует понимать как включение указанного элемента, целого числа или этапа, либо группы элементов, целых чисел или этапов, но не исключение какого-либо другого элемента, целого числа или этапа, либо группы элементов, целых чисел или этапов.

[0053] Единицы, префиксы и символы могут быть приведены в принятой в системе СИ форме. Если нет иных указаний, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в ориентации 5' - 3', и аминокислотные последовательности записаны слева направо в ориентации от амино- к карбоксильному концу, соответственно. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. В настоящем документе аминокислоты могут быть обозначены либо их общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды могут быть обозначены их общепринятыми однобуквенными кодами. Вышеуказанные термины более полно определены со ссылкой на спецификацию в целом.

[0054] Термин «нуклеиновая кислота», как правило, относится к крупным полинуклеотидам. В настоящем документе термины «нуклеиновая кислота» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо. Они означают дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер в одноцепочечной или двухцепочечной форме и, если нет иных ограничений, охватывают известные аналоги (например, пептидо-нуклеиновые кислоты), имеющие сущностную природу естественных нуклеотидов в том, что они гибридизуются с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами аналогично существующим в природе нуклеотидам. Нуклеотиды представляют собой субъединицы, которые полимеризованы (соединены в длинную цепь), с образованием нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Нуклеотиды состоят из трех меньших по размеру компонентов: сахара рибозы, азотистого основания и фосфатной группы(групп).

[0055] Термин «полинуклеотид» означает одну цепь, либо параллельную и антипараллельную цепи нуклеиновой кислоты. Таким образом, полинуклеотид может представлять собой либо одноцепочечную, либо двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

[0056] Термин «олигонуклеотид», как правило, относится к коротким полинуклеотидам, длиной обычно не более примерно 50 нуклеотидов. Следует понимать, что, когда нуклеотидная последовательность представлена последовательностью ДНК (то есть, A, T, G, C), она также включает последовательность РНК (то есть, A, U, G, C), в которой «U» заменяет «T».

[0057] Термин «кодон-оптимизированные синтетические нуклеотидные последовательности» относится к не геномным нуклеотидным последовательностям и используется в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения синтетических нуклеотидных последовательностей или молекулы нуклеиновой кислоты, которая имеет одно или более изменений в нуклеотидной последовательности в сравнении с природной или геномной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления изменение в природной или геномной молекуле нуклеиновой кислоты включает, но не ограничивается ими, изменения в последовательности нуклеиновой кислоты вследствие кодон-оптимизации последовательности нуклеиновой кислоты для экспрессии в конкретном организме, например, растении, вырожденности генетического кода, изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для внесения замены, вставки, делеции и/или добавления по меньшей мере одной аминокислоты в сравнении с природной или геномной последовательностью, изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для введения сайтов ферментов рестрикции, удаления одного или более интронов, связанных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты, вставки одного или более гетерологичных интронов, делеции одной или более регуляторных областей, расположенных выше или ниже по ходу транскрипции и связанных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты, вставки одной или более гетерологичных регуляторных областей, расположенных выше или ниже по ходу транскрипции, делеции 5' и/или 3' нетранслируемой области, связанной с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты, вставки гетерологичной 5' и/или 3' нетранслируемой области, а также модификации сайта полиаденилирования.

[0058] В контексте настоящего изобретения использованы следующие аббревиатуры для часто встречающихся нуклеотидных оснований. «A» означает аденозин, «C» означает цитидин, «G» означает гуанозин, «T» означает тимидин и «U» означает уридин.

[0059] В некоторых вариантах осуществления не геномная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой кДНК. В некоторых вариантах осуществления не геномная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность. Кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности могут быть получены для любого интересующего организма с использованием способов, известных в данной области, например, описанных в Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Оптимизированные нуклеотидные последовательности используют для повышения экспрессии пестицидного белка в растении, например, однодольных и двудольных растениях, таких как растения риса, томата и хлопчатника.

[0060] Новые разработанные последовательности ДНК cry2Ai, раскрытые в настоящем документе, называют «кодон-оптимизированными синтетическими нуклеотидными последовательностями cry2Ai».

[0061] Термины «конструкция ДНК», «нуклеотидные конструкции» и «экспрессионная кассета ДНК» в настоящем документе используются взаимозаменяемо и не должны ограничивать варианты осуществления нуклеотидными конструкциями, представляющими собой ДНК. Специалисты в данной области понимают, что нуклеотидные конструкции, в частности, полинуклеотиды и олигонуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и сочетаний рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, также могут быть использованы в способах, раскрытых в настоящем документе.

[0062] Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантная» молекула нуклеиновой кислоты, или ДНК, или полинуклеотид, означает молекулу нуклеиновой кислоты, или ДНК, полинуклеотид, которая была изменена или произведена рукой человека и находится в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. Например, рекомбинантный полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, выделенный из генома, кДНК, полученную путем обратной транскрипции РНК, синтетическую молекулу нуклеиновой кислоты или искусственное сочетание двух в ином случае разделенных сегментов последовательности, например, полученное путем химического синтеза или за счет манипуляций с выделенными сегментами полинуклеотидов методами генетической инженерии.

[0063] Используемый в настоящем документе термин «гомологичные» означает сходство нуклеотидных последовательностей между двумя областями одной и той же цепи нуклеиновой кислоты или между областями двух разных цепей нуклеиновой кислоты. Когда положение нуклеотида в обеих областях занято одним и тем же нуклеотидом, области являются гомологичными в этом положении. Первая область является гомологичной второй области, если по меньшей мере одно положение нуклеотида в каждой области занято одним и тем же нуклеотидом. Гомологию между двумя областями выражают в виде относительной доли положений нуклеотидов в двух областях, которые заняты одним и тем же нуклеотидом. В качестве примера, область, имеющая нуклеотидную последовательность 5'-ATTGCC-3', и область, имеющая нуклеотидную последовательность 5'-TATGGC-3', имеют 50% гомологию. Предпочтительно, первая область содержит первый фрагмент, и вторая область содержит второй фрагмент, при этом, по меньшей мере примерно 50% и предпочтительно по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% положений нуклеотидов каждого из фрагментов заняты одним и тем же нуклеотидом. Более предпочтительно, все положения нуклеотидов каждого из фрагментов заняты одним и тем же нуклеотидом.

[0064] Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять с использованием компьютеризированных реализаций алгоритмов, известных в данной области (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), или путем визуальной инспекции.

[0065] В настоящем документе «процентную идентичность последовательностей» определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где фрагмент полинуклеотидной или аминокислотной последовательности в окне сравнения может иметь добавления или делеции (например, пробелы или выступающие концы) в сравнении с эталонной последовательностью (которая не имеет добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения числа положений, в которых идентичные нуклеотидные основания или аминокислотные остатки присутствуют в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100, с получением процентной идентичности последовательностей.

[0066] Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять с использованием компьютеризированных реализаций алгоритмов, известных в данной области (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), или путем визуальной инспекции.

[0067] Используемый в настоящем документе термин «существенная идентичность последовательностей» между двумя нуклеотидными последовательностями относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, которая имеет по меньшей мере 65% идентичность последовательности, предпочтительно по меньшей мере 69% - 77% идентичность последовательности в сравнении с эталонной последовательностью.

[0068] Используемый в настоящем документе термин «промотор/регуляторная последовательность» означает нуклеотидную последовательность, необходимую для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промотором/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может представлять собой основную последовательность промотора и в других случаях эта последовательность может также включать последовательность энхансера и другие регуляторные элементы, необходимые для экспрессии продукта гена. Промотор/регуляторная последовательность может, например, представлять собой последовательность, которая обеспечивает экспрессию продукта гена специфическим для ткани образом.

[0069] «Конститутивный» промотор представляет собой промотор, управляющий экспрессией гена, с которым он функционально связан, на постоянной основе в клетке. В качестве примера, промоторы, управляющие экспрессией клеточных генов «домашнего хозяйства», считают конститутивными промоторами.

[0070] «Индуцируемый» промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, будучи функционально связанной с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает образование продукта гена в живой клетке практически только тогда, когда соответствующий промотору индуктор присутствует в клетке.

[0071] «Тканеспецифический» промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, будучи функционально связанной с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает образование продукта гена в живой клетке практически только в том случае, если клетка представляет собой клетку типа ткани, который соответствует промотору.

[0072] Используемый в настоящем документе термин «функционально связанные» относится к любой связи, независимо от ориентации или расстояния, между регуляторной последовательностью и кодирующей последовательностью, где связь позволяет регуляторной последовательности контролировать экспрессию кодирующей последовательности. Термин «функционально связанные» также означает, что связанные нуклеотидные последовательности являются смежными и, в случае необходимости соединения двух кодирующих белок областей, смежными и в одной рамке считывания. Термин «функционально связанные» также относится к функциональной связи между промотором и второй последовательностью, где последовательность промотора запускает и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности.

[0073] Используемый в настоящем документе термин «гетерологичная кодирующая последовательность ДНК», или «гетерологичная нуклеиновая кислота», или «гетерологичный полинуклеотид», означает любую кодирующую последовательность, отличную от той, которая естественным образом кодирует белок Cry2Ai или любой гомолог белка Cry2Ai.

[0074] Используемый в настоящем документе термин «кодирующая область» означает тот фрагмент гена, ДНК или нуклеотидной последовательности, который кодирует белок. Термин «некодирующая область» означает тот фрагмент гена, ДНК или нуклеотидной последовательности, который не является кодирующей областью.

[0075] В настоящем документе термины «кодирующая» или «закодированная», при использовании в контексте определенной нуклеиновой кислоты, означают, что нуклеиновая кислота содержит необходимую информацию для прямой трансляции нуклеотидной последовательности в конкретный белок. Информация, с помощью которой закодирован белок, определяется использованием кодонов. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок, может содержать нетранслируемые последовательности (например, интроны) в транслируемых областях нуклеиновой кислоты или может не содержать такие промежуточные нетранслируемые последовательности (например, как в кДНК).

[0076] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» в настоящем документе используются взаимозаменяемо для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков, как природных структурных вариантов, так и синтетических не существующих в природе их аналогов, связанных пептидными связями. Синтетические полипептиды могут быть синтезированы, например, с использованием автоматического синтезатора полипептидов. Термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственные химические аналоги соответствующих природных аминокислот, а также к природным аминокислотным полимерам. Термины «остаток» или «аминокислотный остаток», или «аминокислота» в настоящем документе используются взаимозаменяемо для обозначения аминокислоты, которая включена в белок, полипептид или пептид (общее название «белок»). Аминокислота может представлять собой природную аминокислоту и, если нет иных ограничений, может представлять собой известные аналоги природных аминокислот, которые могут действовать аналогично природным аминокислотам.

[0077] Термин «белок», как правило, относится к крупным полипептидам. Термин «пептид», как правило, относится к коротким полипептидам. Однако термин «полипептид» при использовании в настоящем документе относится к любому аминокислотному полимеру, состоящему из двух или более аминокислотных остатков, связанных пептидными связями.

[0078] Используемый в настоящем документе термин «экспрессионная кассета» означает генетический модуль, включающий ген и регуляторные области, необходимые для его экспрессии, которые могут быть включены в вектор.

[0079] «Вектор» представляет собой химическое соединение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, которое может быть использовано для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Многие векторы известны в данной области, включая, но без ограничения, линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, связанные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Так, термин «вектор» включает автономно реплицируемую плазмиду или вирус. Термин следует также толковать как включающий не являющиеся плазмидой и вирусом соединения, которые способствуют переносу нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, соединения полилизина, липосомы и тому подобное. Примеры вирусных векторов включают, но без ограничения, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы и тому подобное.

[0080] Термин «экспрессионный вектор» означает вектор, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. Экспрессионный вектор содержит достаточное количество действующих в цис-положении элементов для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут быть предоставлены клеткой-хозяином или находиться в in vitro системе экспрессии. Экспрессионные векторы включают все экспрессионные векторы, известные в данной области, такие как космиды, плазмиды (например, «голые» или заключенные в липосомы) и вирусы, которые заключают в себе рекомбинантную нуклеиновую кислоту.

[0081] Используемый в настоящем документе термин «клетка-хозяин» означает клетку, которая содержит вектор и поддерживает репликацию и/или экспрессию нужного экспрессионного вектора. Клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки, такие как E. coli, или эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей, насекомых, амфибий или млекопитающих, либо клетки однодольных или двудольных растений. Примером клетки-хозяина однодольного растения является клетка-хозяин риса, и примером клетки-хозяина двудольного растения является клетка-хозяин баклажана или томата. Когда это возможно, последовательность модифицируют во избежание предсказанных шпилечных вторичных структур мРНК.

[0082] Используемый в настоящем документе термин «токсин» означает полипептид, проявляющий пестицидную активность или инсектицидную активность. Токсин «Bt» или «Bacillus thuringiensis» должен включать широкий класс токсинов Cry, встречающихся в разных штаммах Bt, содержащих такие токсины.

[0083] Термин «зонд», или «зонд образца», означает молекулу, которую узнает ее комплемент или определенный элемент микрочипа. Примеры зондов, которые могут быть использованы по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, ДНК, РНК, олигонуклеотиды, олигосахариды, полисахариды, сахара, белки, пептиды, моноклональные антитела, токсины, вирусные эпитопы, гормоны, гормональные рецепторы, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы и лекарственные средства, включая агонисты и антагонисты клеточных поверхностных рецепторов.

[0084] Используемый в настоящем документе термин «комплементарные», или «комплемент», относится к спариванию оснований, пуринов и пиримидинов, которые связываются водородными связями в двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Следующие пары оснований являются комплементарными: гуанин и цитозин; аденин и тимидин; а также аденин и урацил. Используемые в настоящем документе термины включают полную и частичную комплементарность.

[0085] Используемый в настоящем документе термин «гибридизация» относится к процессу, в котором цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью за счет спаривания оснований. Условия, используемые для гибридизации двух не идентичных, но очень сходных, комплементарных нуклеиновых кислот, варьируются в зависимости от степени комплементарности двух цепей и длины цепей. Таким образом, термин предусматривает частичную, а также полную гибридизацию. Такие методы и условия хорошо известны практикующим специалистам в данной области.

[0086] Термины «инсектицидная активность» и «пестицидная активность» в настоящем документе используются взаимозаменяемо для обозначения активности микроорганизма или вещества (такого как, например, белок), которая может быть измерена, например, но без ограничения, смертностью вредителей, уменьшением массы вредителей, отпугиванием вредителей, и другими поведенческими и физическими изменениями вредителей после поедания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Таким образом, микроорганизм или вещество с пестицидной активностью негативно влияет по меньшей мере на один измеряемый параметр приспособленности вредителя. Например, «инсектицидные белки» представляют собой белки, которые проявляют инсектицидную активность сами или в сочетании с другими белками.

[0087] Используемый в настоящем документе термин «воздействие на насекомых-вредителей» означает сдерживающие насекомых изменения в питании, росте и/или поведении насекомых на любой стадии развития, включая, но не ограничиваясь этим, уничтожение насекомых, замедление роста, предотвращение способности к размножению, антифидантную активность и тому подобное.

[0088] Используемый в настоящем документе термин «эффективное для пестицидного действия количество» означает количество вещества или микроорганизма, обладающее пестицидной активностью в случае его присутствия в среде обитания вредителя. Для каждого вещества или микроорганизма эффективное для пестицидного действия количество определяют эмпирически в отношении каждого вредителя, поражаемого в конкретной среде. Аналогично, термин «эффективное для инсектицидного действия количество» может быть использован вместо термина «эффективное для пестицидного действия количество», когда вредитель является насекомым-вредителем.

[0089] Используемые в настоящем документе термины «трансформированное растение» и «трансгенное растение» означают растение, которое содержит один или более гетерологичных полинуклеотидов в своем геноме. Гетерологичный полинуклеотид(ы) стабильно интегрирован в геном трансгенного или трансформированного растения, так что полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетерологичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном отдельно или в виде части рекомбинантной молекулы ДНК.

[0090] Следует понимать, что используемый в настоящем документе термин «трансгенные» включает любую растительную клетку, линию растительных клеток, каллус, ткань, часть растения или растение, генотип которых был изменен за счет присутствия одной или более гетерологичных нуклеиновых кислот. Термин охватывает трансгенные объекты, исходно полученные с использованием способа генетической трансформации, известного в данной области, а также те, которые были получены в результате полового скрещивания или бесполого размножения из исходного трансгенного объекта.

[0091] Используемый в настоящем документе термин «исходный трансгенный объект» не относится к изменению генома (хромосомного или внехромосомного) общепринятыми методами селекции растений или в результате естественного события, такого как случайное перекрестное оплодотворение, не рекомбинантная вирусная инфекция, не рекомбинантная бактериальная трансформация, не рекомбинантная транспозиция или спонтанная мутация.

[0092] Используемый в настоящем документе термин «растение» включает целые растения, растительные клетки, растительные протопласты, тканевые культуры растительных клеток, из которых можно регенерировать растения, растительные каллусы, растительные маточные корни и растительные клетки, которые не повреждены в растениях или частях растений, таких как зародыши, пыльца, семяпочки, семена, листья, цветы, ветви, плоды, ядра, колосья, початки, шелуха, стебли, корни, кончики корня, пыльники и тому подобное, а также их потомков. Части трансгенных растений входят в объем вариантов осуществления и представляют собой, например, растительные клетки, протопласты, ткани, каллус, эмбрионы, а также цветки, стебли, плоды, листья и корни трансгенных растений, или их потомков, ранее трансформированных молекулой ДНК по вариантам осуществления и, таким образом, состоящих, по меньшей мере частично, из трансгенных клеток.

Ген cry Bacillus thuringiensis и оптимизация кодонов

[0093] На сегодняшний день секвенированы примерно 400 генов cry, кодирующих δ-эндотоксины (Crickmore, N. 2005. Using worms to better understand how Bacillus thuringiensis kills insects. Trends in Microbiology, 13(8): 347-350). Различные δ-эндотоксины были классифицированы в классы (Cry 1, 2, 3, 4 и так далее) на основании сходства аминокислотных последовательностей. Эти классы состоят из нескольких подклассов (Cry1A, Cry1B, Cry1C и так далее), которые сами подразделяются на подсемейства или варианты (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac и так далее). Гены каждого класса более чем на 45% идентичны друг другу. Продукт каждого отдельного гена cry, как правило, имеет лимитированный спектр активности, которая ограничена личиночными стадиями небольшого числа видов. Однако не удалось установить корреляцию между степенью идентичности белков Cry и спектром их активности. Белки Cry1Aa и Cry1Ac на 84% идентичны, однако лишь Cry1Aa является токсичным для Bombyx mori (L.). И наоборот, Cry3Aa и Cry7Aa, которые лишь на 33% идентичны, оба активны против колорадского жука, Leptinotarsa decemlineata. Другие токсины Cry совершенно не активны против насекомых, но активны против других беспозвоночных. Например, белки классов Cry5 и Cry6 активны против нематод. Совсем недавно также были охарактеризованы бинарные токсины из Bt, обозначенные Cry34Ab1/Cry35Ab1, которые активны против различных жесткокрылых насекомых-вредителей семейства Chrysomelidae. Им было присвоено название Cry, хотя они имеют небольшую гомологию с другими членами семейства токсинов Cry.

[0094] Для достижения желаемых уровней экспрессии гетерологичных белков в трансгенных растениях было признано полезным изменение природной, иногда называемой «дикого типа» или оригинальной, геномной кодирующей последовательности ДНК различными способами, чтобы использование кодонов более точно соответствовало использованию кодонов в растениях-хозяевах, и аналогично, чтобы содержание G+C кодирующей последовательности более точно соответствовало содержанию G+C видов растений-хозяев.

[0095] Специалист в области молекулярной биологии растений понимает, что можно сконструировать множество последовательностей ДНК для кодирования одной аминокислотной последовательности. Обычным способом повышения экспрессии кодирующей области для интересующего белка является модификация кодирующей области таким образом, чтобы ее состав кодонов напоминал общий состав кодонов хозяина, в котором ген должен быть экспрессирован.

[0096] Геномная/природная нуклеиновая кислота может быть оптимизирована для повышения экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, когда организмом-хозяином является растение, синтетические нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для растений кодонов с целью повышения экспрессии. Например, хотя нуклеотидные последовательности по вариантам осуществления могут быть экспрессированы как в однодольных, так и в двудольных, растениях, последовательности могут быть изменены для учета специфических предпочтений кодонов и предпочтительного содержания GC в однодольных или двудольных растениях, поскольку, как показано, эти предпочтения отличаются (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Таким образом, предпочтительный кодон для конкретной аминокислоты в рисе может быть установлен из известных генных последовательностей риса, и предпочтительный кодон для конкретной аминокислоты в баклажане может быть установлен из известных генных последовательностей баклажана.

[0097] Известно, что дополнительные модификации последовательности повышают экспрессию гена в клеточном хозяине. Эти модификации включают удаление последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы сайта сплайсинга экзон-интрон, транспозон-подобные повторы и другие хорошо изученные последовательности, которые могут быть неблагоприятными для экспрессии генов. Содержание GC в последовательности может быть скорректировано до средних уровней у конкретного клеточного хозяина, что рассчитывают, исходя из известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине.

[0098] В статье Vaeck et al., ((Vaeck M, Reynaerts A, Höfte H, Jansens S, De Beukeleer M, Dean C, Zabeau M, Van Montagu M, Leemans J (1987) Transgenic plants protected from insect attack. Nature 327:33-37) описано получение устойчивых к насекомым трансгенных растений табака, экспрессирующих ген cry1Ab Bt, для защиты от европейского зернового точильщика, одного из главных вредителей, атакующих кукурузу в США и Европе. Однако, несмотря на использование сильных промоторов, продуцирование токсина в растениях изначально было слишком слабым для эффективного использования в сельском хозяйстве (Koziel G M, Beland G L, Bowman C, Carozzi N B, Crenshaw R, Crossland L, Dawson J, Desai N, Hill M, Kadwell S, Launis K, Maddox D, McPherson K, Heghji M, Merlin E, Rhodes R, Warren G, Wright M, Evola S (1993) Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. Biotechnology 11:194-200). В отличие от генов растений, гены Bt имеют высокое содержание A+T (66%), что является неоптимальным использованием кодонов для растений и потенциально приводит к неправильному сплайсингу или преждевременному прекращению транскрипции (De la Riva and Adang, 1996).

[0099] Perlak с соавторами (Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A, McPherson S L, Fishhoff D A (1991) Modification of the coding sequences enhances plant expression of insect control protein genes, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:3324-3328) модифицировали кодирующую последовательность генов cry без модификации закодированной пептидной последовательности для обеспечения оптимального для растений использования кодонов, что позволило в два раза увеличить продуцирование токсинов в растениях в сравнении с природным геном. Эта стратегия была успешно использована для многих растений, таких как хлопчатник, рис и кукуруза, трансформированных модифицированными генами cry1, и картофеля, трансформированного модифицированным геном cry3A. Bt кукурузу и Bt хлопчатник выращивают в больших масштабах по всему миру.

[00100] Таким образом, естественно существующее предпочтение кодонов в разных организмах приводит к неоптимальной экспрессии генов в гетерологичном организме. В настоящем изобретении природный ген cry2Ai из Bacillus thuringiensis был модифицирован in-silico для оптимальной экспрессии рекомбинантного белка в растениях, включая двудольные и однодольные растения. При проектировании с помощью многофакторного анализа редкие и очень редкие кодоны были заменены на наиболее предпочтительные кодоны у двудольных/однодольных растений. Модифицированный синтетический ген, сконструированный с помощью конструктора генов, был проверен вручную на использование редких кодонов, стабильность вторичной структуры мРНК, наличие начала вторичной транскрипции гена во избежание экспрессии укороченных белков. Структура и стабильность оптимизированной мРНК была проверена и подтверждена с помощью программы оптимизации мРНК.

[00101] Конкретный аспект изобретения относится к кодон-оптимизированной синтетической нуклеиновой кислоте, кодирующей инсектицидные белки Cry2Ai, инсектицидным композициям, полинуклеотидным конструкциям, рекомбинантной нуклеотидной последовательности, рекомбинантному вектору, трансформированным микроорганизмам и растениям, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению. Эти композиции используют в способах борьбы с насекомыми-вредителями, в частности, насекомыми-вредителями сельскохозяйственных культур.

[00102] Кодон-оптимизированная синтетическая нуклеотидная последовательность, раскрытая в настоящем документе, может быть слита с различными промоторами, включая конститутивные, индуцируемые, временно регулируемые, регулируемые развитием, тканепредпочтительные и тканеспецифические промоторы, с получением рекомбинантных молекул ДНК. Кодон-оптимизированные синтетические нуклеотидные последовательности cry2Ai, раскрытые в настоящем документе (кодирующие последовательности), обеспечивают гораздо более высокие уровни экспрессии в трансформированном растении, чем природный ген cry2Ai. Соответственно, могут быть получены растения, устойчивые к чешуекрылым вредителям, таким как Helicoverpa armigera - совка хлопковая и совка кукурузная, Cnaphalocrocis medinalis - листовертка рисовая, а также Scirpophaga incertulas - стеблевой точильщик рисовый и Pectinophora gossypiella.

[00103] Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к синтетическим кодон-оптимизированным нуклеотидным последовательностям cry2Ai с предпочтительными для растений кодонами. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к экспрессии синтетической кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности(ей) cry2Ai в таких растениях, как рис, томат и баклажан. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к экспрессионным кассетам ДНК, векторам для трансформации растений, содержащим синтетическую нуклеотидную последовательность(и) cry2Ai по изобретению. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к композициям, содержащим синтетическую кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность(и) cry2Ai, раскрытую в настоящем документе, или инсектицидный полипептид, закодированный синтетической кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью(ми) cry2Ai, раскрытой в настоящем документе. Композиция, раскрытая в настоящем документе, может представлять собой пестицидную и/или инсектицидную композиции, содержащие пестицидные и/или инсектицидные белки/полипептиды по изобретению. Другой вариант осуществления относится к трансгенным растениям, содержащим кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность(и) cry2Ai по изобретению и экспрессирующим белковый токсин Cry2Ai.

[00104] В частности, настоящее изобретение относится к кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, при этом указанный нуклеотид кодирует инсектицидный белок Cry2Ai, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1.

[00105] В некоторых вариантах осуществления изобретение также относится к растениям и микроорганизмам, трансформированным кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью(ми) cry2Ai, раскрытой в настоящем документе, и способам, включающим применение такой нуклеотидной последовательности(ей), пестицидных композиций, трансформированных организмов и их продуктов в борьбе с насекомыми-вредителями.

[00106] Полинуклеотидные последовательности по вариантам осуществления могут быть использованы для трансформации любого организма, например, растений и микроорганизмов, таких как Bacillus thuringiensis, для получения закодированного инсектицидного и/или пестицидного белков. Предложены способы, которые включают использование таких трансформированных организмов для воздействия на насекомых-вредителей растений или борьбы с ними. Нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности по вариантам осуществления также могут быть использованы для трансформации органелл, таких как хлоропласты. В данной области хорошо известен способ трансформации желаемого организма, позволяющий специалисту в данной области выполнять трансформацию с использованием полинуклеотидных последовательностей, раскрытых в настоящем документе.

[00107] Нуклеиновые кислоты по вариантам осуществления включают нуклеиновую кислоту или нуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы для экспрессии клетками конкретного организма, например, нуклеотидные последовательности, которые были обратно транслированы (то есть, восстановлены по пептиду) с использованием предпочтительных для растений кодонов, исходя из аминокислотной последовательности полипептида, обладающего пестицидной активностью.

[00108] Изобретение относится к кодон-оптимизированным синтетическим нуклеиновым кислотам/нуклеотидным последовательностям, кодирующим инсектицидные белки Cry2ai. Синтетические кодирующие последовательности специально адаптированы для использования в экспрессии белков в двудольных и однодольных растениях, таких как рис, томат, баклажан, кукуруза, хлопчатник и бобовые растения.

[00109] Изобретение относится к синтетическим нуклеотидным последовательностям, кодирующим белок Cry2Ai, которые специально адаптированы для высокой экспрессии в растениях. В раскрытых кодон-оптимизированных синтетических нуклеотидных последовательностях использованы оптимизированные для растений кодоны примерно с той же частотой, с которой они используются в среднем в генах, естественным образом присутствующих у данного вида растений. Изобретение также относится к кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, предназначенной для придания растениям устойчивости к насекомым. По настоящему изобретению для трансформации растений используют гены селективных маркеров. Описаны конструкции ДНК и трансгенные растения, содержащие синтетические последовательности, раскрытые в настоящем документе, а также способы и композиции для использования с важными для сельского хозяйства растениями.

[00110] Каждый из белков, закодированных кодон-оптимизированными синтетическими нуклеотидными последовательностями, проявляет ингибирующую биологическую активность в отношении видов чешуекрылых насекомых. Двудольные и/или однодольные растения могут быть трансформированы каждой из нуклеотидных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, отдельно или в сочетаниях с другими нуклеотидными последовательностями, кодирующими инсектицидные средства, такие как белки, кристаллические белки, токсины и/или специфические для вредителей двухцепочечные РНК, спроектированные для супрессии генов в организме одного или более целевых вредителей, и тому подобное, для достижения средств управления устойчивостью к насекомым в полевых условиях, которые ранее не были возможны за счет простого использования известных инсектицидных для чешуекрылых насекомых белков, полученных из штаммов Bacillus thuringiensis.

[00111] Кодон-оптимизированные синтетические нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению также могут быть использованы в растениях в сочетании с другими видами нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидные токсины, с получением растений, трансформированных для содержания по меньшей мере одного средства для борьбы с одним или более из обычных вредителей растений, выбранных из группы, состоящей из чешуекрылых насекомых-вредителей, жесткокрылых насекомых-вредителей, прокалывающих ткани растений и сосущих насекомых-вредителей, и тому подобного.

Регуляторные последовательности

[00112] Транскрипционные и трансляционные регуляторные сигналы включают, но без ограничения, промоторы, сайты инициации транскрипции, операторы, активаторы, энхансеры, другие регуляторные элементы, сайты связывания рибосом, кодон инициации, сигналы терминации и тому подобное.

[00113] Полинуклеотид/конструкция ДНК будет включать в направлении транскрипции от 5' к 3'-концу: область инициации транскрипции и трансляции (то есть, промотор), последовательность ДНК по вариантам осуществления, а также область терминации транскрипции и трансляции (то есть, область терминации), функциональные в организме, выступающем в качестве хозяина. Область инициации транскрипции (то есть, промотор) может быть природной, аналогичной, инородной или гетерологичной для организма-хозяина и/или для последовательности по вариантам осуществления. Кроме того, промотор может представлять собой природную последовательность или, альтернативно, синтетическую последовательность. Используемый в настоящем документе термин «инородный» означает, что промотор не встречается естественным образом в организме, в который вводят промотор. Если промотор является «инородным» или «гетерологичным» для последовательности по вариантам осуществления, подразумевают, что промотор не является естественным или природным промотором для функционально связанной последовательности по вариантам осуществления.

[00114] При практическом использовании вариантов осуществления можно использовать целый ряд промоторов. Промоторы можно выбирать, исходя из желаемого результата. Кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность по изобретению можно объединять с конститутивным, тканепредпочтительным, индуцируемым или другими промоторами для экспрессии в организме-хозяине. Подходящие конститутивные промоторы для использования в растительной клетке-хозяине включают, например, коровый промотор CaMV 35S; актина риса; убиквитина; промотор ALS и так далее.

[00115] В зависимости от желаемого результата может быть полезно экспрессировать ген с индуцируемого промотора. Особый интерес для регулирования экспрессии нуклеотидных последовательностей по вариантам осуществления в растениях представляют индуцируемые повреждением промоторы. Такие индуцируемые повреждением промоторы могут отвечать на повреждение, вызываемое поеданием насекомыми, и включают промоторы гена ингибитора протеазы картофеля (pin II); wun1 и wun2, win1 и win2; WIP1; MPI и так далее.

[00116] Кроме того, в способах и нуклеотидных конструкциях по вариантам осуществления можно использовать патоген-индуцируемые промоторы. Такие патоген-индуцируемые промоторы включают промоторы связанных с патогенезом белков (PR белков), которые индуцируются после инфекции патогеном; например, PR белков, SAR белков, β-1,3-глюканазы, хитиназы и так далее.

[00117] Можно использовать химически регулируемые промоторы для модулирования экспрессии гена в растении за счет применения экзогенного химического регулятора. В зависимости от цели промотор может представлять собой химически индуцируемый промотор, когда применение химического вещества индуцирует экспрессию гена, или химически репрессируемый промотор, когда применение химического вещества подавляет экспрессию гена. Химически индуцируемые промоторы известны в данной области и включают, но без ограничения, промотор In2-2 кукурузы, активируемый антидотами бензолсульфонамидных гербицидов, промотор GST кукурузы, активируемый гидрофобными электрофильными соединениями, которые используют в качестве довсходовых гербицидов, и промотор PR-1a табака, активируемый салициловой кислотой. Другие представляющие интерес химически регулируемые промоторы включают стероид-зависимые промоторы.

[00118] Промотор, который характеризуется «предпочтительной» экспрессией в конкретной ткани, обеспечивает в этой ткани большую степень экспрессии, чем по меньшей мере в одной другой растительной ткани. Некоторые тканепредпочтительные промоторы демонстрируют экспрессию почти исключительно в конкретной ткани. Тканепредпочтительные промоторы могут быть использованы для целевого обеспечения повышенной экспрессии пестицидного белка в конкретной растительной ткани. Такие промоторы могут быть модифицированы, при необходимости, для слабой экспрессии.

[00119] Примеры некоторых из тканеспецифических промоторов включают, но не ограничиваются ими, лист-предпочтительные промоторы, корень-специфические или корень-предпочтительные промоторы, семя-специфические или семя-предпочтительные промоторы, пыльца-специфические промоторы, а также паренхима-специфические промоторы.

[00120] Корень-предпочтительные или корень-специфические промоторы известны, и могут быть выбраны из промоторов, описанных в литературе или выделенных de novo из различных совместимых биологических видов.

[00121] «Семя-предпочтительные» промоторы включают как «семя-специфические» промоторы (эти промоторы активны во время развития семян, например, промоторы запасных белков семян), так и промоторы «прорастающих семян» (эти промоторы активны во время прорастания семян). Промоторы гамма-зеина и Glob-1 представляют собой эндосперм-специфические промоторы. В случае двудольных растений семя-специфические промоторы включают, но без ограничения, промоторы β-фазеолина, β-конглицинина, соевого лектина, круциферина и тому подобное. В случае однодольных растений семя-специфические промоторы включают, но без ограничения, промоторы кукурузного 15-кДа зеина, 22-кДа зеина, 27-кДа зеина, g-зеина, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулина 1 и так далее.

[00122] Там, где требуется низкий уровень экспрессии, могут быть использованы слабые промоторы. Как правило, используемый в настоящем документе термин «слабый промотор» означает промотор, который управляет экспрессией кодирующей последовательности на низком уровне. Такие слабые конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор Rsyn7, коровый промотор 35S CaMV и так далее.

[00123] Области терминации могут быть получены из Ti-плазмиды A. tumefaciens, например, области терминации октопин-синтазы (OCS) и нопалин-синтазы (NOS).

[00124] Экспрессионные кассеты ДНК могут также содержать 5'-последовательности лидера. Такие последовательности лидера могут способствовать повышению уровня трансляции. Трансляционные лидеры известны в данной области и включают: лидеры пикорнавирусов, например, лидер EMCV (5'-некодирующая область вируса энцефаломиокардита); лидеры потивирусов, например, лидер TEV (вирус гравировки табака), лидер MDMV (вирус карликовой мозаики кукурузы), нетранслируемый лидер из мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (РНК 4 AMV); лидер вируса мозаики табака (TMV) и лидер вируса хлоротической крапчатости кукурузы (MCMV).

[00125] В одном конкретном варианте осуществления изобретения, раскрытого и заявленного в настоящем документе, тканепредпочтительный или тканеспецифический промотор функционально связан с синтетической последовательностью ДНК по изобретению, кодирующей инсектицидный белок, и трансгенное растение стабильно трансформировано по меньшей мере одной такой рекомбинантной молекулой. Полученное растение будет устойчивым к конкретным насекомым, питающимся теми частями растения, в которых экспрессируется молекула(ы) ДНК.

Ген селективного маркера

[00126] Как правило, экспрессионная кассета будет содержать ген селективного маркера для селекции трансформированных клеток. Гены селективных маркеров используют для селекции трансформированных клеток или тканей. Гены маркеров включают гены, определяющие устойчивость к антибиотикам, например, гены, кодирующие неомицин-фосфотрансферазу II (nptII) и гигромицин-фосфотрансферазу (hptII), а также гены, придающие устойчивость к гербицидам, таким как глюфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Дополнительные примеры подходящих генов селективных маркеров включают, но без ограничения, гены, определяющие устойчивость к хлорамфениколу, метотрексату, стрептомицину, спектиномицину, блеомицину, сульфонамиду, бромоксинилу, глифосату, фосфинотрицину.

[00127] Приведенный выше перечень генов селективных маркеров не должен быть ограничивающим. В вариантах осуществления можно использовать любой ген селективного маркера.

Конструкции ДНК и векторы

[00128] Кодон-оптимизированные ДНК/нуклеотидные последовательности по изобретению предоставляют в конструкциях ДНК для экспрессии в интересующем организме. Конструкция будет включать 5' и 3' регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью по изобретению.

[00129] Такую полинуклеотидную конструкцию предоставляют с множеством сайтов рестрикции для вставки последовательностей ДНК, кодирующих белковую последовательность токсина Cry2Ai, под транскрипционной регуляцией регуляторных областей. Полинуклеотидная конструкция может также содержать гены селективных маркеров. Кроме того, конструкция может содержать по меньшей мере один дополнительный ген для совместного введения трансформацией в нужный организм. Альтернативно, дополнительный ген(ы) можно предоставлять на нескольких полинуклеотидных конструкциях.

[00130] При создании конструкции ДНК/экспрессионной кассеты различными фрагментами ДНК можно манипулировать таким образом, чтобы получать последовательности ДНК в правильной ориентации, по мере необходимости, в правильной рамке считывания. С этой целью можно использовать адаптеры или линкеры для соединения фрагментов ДНК, или можно проводить другие манипуляции для создания удобных сайтов рестрикции, удаления лишней ДНК, удаления сайтов рестрикции или тому подобного. Для этих целей можно использовать in vitro мутагенез, восстановление за счет праймеров, рестрикцию, отжиг, повторные замены, например, трансзиции и трансверсии.

[00131] В соответствии с настоящим изобретением, конструкция ДНК/экспрессионная кассета, раскрытая в настоящем документе, может быть вставлена в рекомбинантный экспрессионный вектор. Выражение «рекомбинантный экспрессионный вектор» означает бактериальную плазмиду, фаг, дрожжевую плазмиду, вирус растительных клеток, вирус клеток млекопитающих или другой вектор. Как правило, можно использовать любую плазмиду или вектор при условии, что он(а) может реплицироваться и стабилизироваться в организме хозяина. Важной характеристикой экспрессионного вектора является то, что он имеет точку начала репликации, промотор, ген маркера и элемент контроля трансляции.

[00132] Множество клонирующих векторов, содержащих репликационную систему в E. coli и маркер, позволяющий проводить селекцию трансформированных клеток, доступны для подготовки к вставке инородных генов в высшие растения. Векторы включают, например, pBR322, серию pUC, серию M13 mp, pACYC184, в числе прочих. Соответственно, фрагмент ДНК, имеющий последовательность, кодирующую белок токсина Bt, может быть вставлен в вектор в подходящем сайте рестрикции. Полученную плазмиду используют для введения трансформацией в E. coli. Клетки E. coli культивируют в соответствующей питательной среде, затем собирают и лизируют. Плазмиду извлекают. В качестве методов анализа, как правило, используют анализ последовательности, рестрикционный анализ, электрофорез и другие биохимические и молекулярно-биологические методы. После каждой манипуляции используемую последовательность ДНК можно расщеплять и соединять со следующей последовательностью ДНК. Все последовательности плазмид можно клонировать в одну и ту же, или в другие плазмиды. В зависимости от способа вставки нужных генов в растения могут понадобиться и другие последовательности ДНК. При использовании, например, Ti или Ri-плазмиды для трансформации растительной клетки по меньшей мере правую границу, но часто правую и левую границу, T-ДНК Ti или Ri-плазмиды, следует присоединять в качестве фланкирующей области вставляемых генов.

[00133] Экспрессионный вектор, содержащий кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность по изобретению и соответствующий сигнал для регуляции транскрипции/трансляции, можно конструировать методом, хорошо известным специалистам в данной области. Примеры таких методов включают метод in vitro рекомбинации ДНК, метод синтеза ДНК и метод in vivo рекомбинации. Последовательность ДНК может быть эффективно связана с соответствующим промотором в экспрессионном векторе для индукции синтеза мРНК. Кроме того, экспрессионный вектор может содержать, в качестве сайта инициации трансляции, сайт связывания рибосомы и терминатор транскрипции.

[00134] Предпочтительным примером рекомбинантного вектора по настоящему изобретению является Ti-плазмидный вектор, который может переносить часть себя, то есть, так называемую T-область, в растительную клетку, когда вектор присутствует в соответствующем хозяине, таком как Agrobacterium tumefaciens. Другие виды Ti-плазмидного вектора в настоящее время используют для переноса гибридного гена в протопласты, способные образовывать новое растение, путем соответствующей вставки ДНК растительной клетки или гибридной ДНК в геном растения.

[00135] Экспрессионный вектор может содержать по меньшей мере один ген селективного маркера. Ген селективного маркера представляет собой нуклеотидную последовательность, обладающую способностью, на основании которой она может быть отобрана обычным химическим методом. Каждый ген, который может быть использован для различения трансформированных клеток и не трансформированных клеток, может быть геном селективного маркера. Пример включает ген устойчивости к гербициду, такому как глифосат и фосфинотрицин, и ген устойчивости к антибиотику, такому как канамицин, гигромицин, G418, блеомицин и хлорамфеникол, но не ограничивается ими.

[00136] Для рекомбинантного вектора по настоящему изобретению промотор может представлять собой любой из промоторов CaMV 35S, актина или убиквитина, но не ограничивается ими. Поскольку трансформант может быть отобран за счет различных механизмов на разных стадиях, конститутивный промотор может быть предпочтительным по настоящему изобретению. Таким образом, в настоящем документе возможность выбора конститутивного промотора не ограничена.

[00137] Для рекомбинантного вектора по настоящему изобретению может быть использован любой общепринятый терминатор. Примеры включают терминатор нопалин-синтазы (NOS), терминатор α-амилазы RAmy1 A риса, терминатор фазеолина и терминатор для гена оптопина Agrobacterium tumefaciens, и так далее, но не ограничиваются ими. Что касается необходимости терминатора, общеизвестно, что такая область может повышать надежность и эффективность транскрипции в растительных клетках. Таким образом, использование терминатора является весьма предпочтительным с учетом контекстов настоящего изобретения.

[00138] Квалифицированный специалист в данной области знает, что конструкция ДНК и вектор, раскрытые в настоящем документе, могут быть использованы для производства устойчивых к насекомым трансгенных растений и/или получения инсектицидной композиции, которая может содержать клетки Bacillus thuringiensis, содержащие указанную нуклеотидную последовательность, или любой другой микроорганизм, способный экспрессировать нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, для продуцирования инсектицидного белка Cry2Ai.

Рекомбинантная клетка

[00139] Варианты осуществления также включают микроорганизм, трансформированный по меньшей мере одной кодон-оптимизированной нуклеиновой кислотой по изобретению, экспрессионной кассетой, содержащей нуклеиновую кислоту, или вектором, содержащим экспрессионную кассету. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм представляет собой микроорганизм, который размножается в растениях. Один из вариантов осуществления изобретения относится к инкапсулированному пестицидному белку, который содержит трансформированный микроорганизм, способный экспрессировать белок Cry2Ai по изобретению.

[00140] Следующий вариант осуществления относится к трансформированному организму, такому как организм, выбранный из группы, состоящей из клеток растений и насекомых, бактерий, дрожжей, бакуловирусов, простейших, нематод и водорослей. Трансформированный организм содержит кодон-оптимизированную синтетическую молекулу ДНК по изобретению, экспрессионную кассету, содержащую указанную молекулу ДНК, или вектор, содержащий указанную экспрессионную кассету, способную стабильно встраиваться в геном трансформированного организма.

[00141] Признано, что гены, кодирующие белок Cry2Ai, можно использовать для трансформации патогенных для насекомых организмов. Такие организмы включают бакуловирусы, грибы, простейшие, бактерии и нематоды.

[00142] Кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность(и), кодирующую белок Cry2Ai по вариантам осуществления, можно вводить при помощи соответствующего вектора в микробного хозяина, и указанного хозяина внедрять в окружающую среду, наносить на растения или животных. Термин «введение» в контексте вставки нуклеиновой кислоты в клетку означает «трансфекция» или «трансформация», или «трансдукция», и включает введение нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеиновая кислота может встраиваться в геном клетки (например, хромосому, плазмиду, пластиду или митохондриальную ДНК), превращаться в автономный репликон или временно экспрессироваться (например, трансфицированная мРНК).

[00143] Существует ряд способов введения инородной ДНК, экспрессирующей пестицидный белок, в микроорганизм-хозяина в условиях, допускающих стабильное сохранение и экспрессию ДНК. Например, можно конструировать экспрессионные кассеты, включающие интересующие нуклеотидные конструкции, функционально связанные с сигналами регуляции транскрипции и трансляции для экспрессии нуклеотидных конструкций, и нуклеотидную последовательность, гомологичную последовательности в организме-хозяине, за счет чего будет происходить интеграция, и/или систему репликации, которая функциональна в организме хозяина, за счет чего будет происходить интеграция или стабильное сохранение.

Способы трансформации растений и получения трансгенных растений

[00144] Кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность (последовательность ДНК) по настоящему изобретению, кодирующую белок токсина Cry2Ai Bt, можно вводить в растительные клетки с использованием различных методов, хорошо известных в данной области. После интегрирования введенной ДНК в растительный геном, она является относительно стабильной. Вектор для трансформации обычно содержит селективный маркер, придающий трансформированным растительным клеткам устойчивость к биоциду или к антибиотику, такому как канамицин, биалафос, G418, блеомицин или гигромицин. Отдельно используемый маркер должен, соответственно, позволять отбирать трансформированные клетки, а не клетки, не содержащие вставленную ДНК.

[00145] Существует большое количество методов для вставки ДНК в растительную клетку-хозяина. Эти методы включают трансформацию T-ДНК с использованием Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве средства трансформации, слияние, инъекцию, биолистические методы (бомбардировку микрочастицами) или электропорацию, а также другие возможные методы. В случае использования для трансформации агробактерий вставляемая ДНК должна быть клонирована в специальные плазмиды, а именно, либо в промежуточный вектор, либо в бинарный вектор. Промежуточные векторы могут быть встроены в Ti или Ri-плазмиду по механизму гомологичной рекомбинации за счет последовательностей, гомологичных последовательностям в T-ДНК. Ti или Ri-плазмида также содержит область vir, необходимую для переноса T-ДНК.

[00146] Промежуточные векторы не способны реплицироваться в агробактериях. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium tumefaciens при помощи плазмиды-помощника (конъюгация). Бинарные векторы способны реплицироваться как в E. coli, так и в агробактериях. Они содержат ген селективного маркера и линкер или полилинкер, который ограничен правой и левой пограничными областями T-ДНК. Они могут быть введены трансформацией непосредственно в агробактерии. Агробактерия, используемая в качестве клетки-хозяина, должна содержать плазмиду, несущую область вирулентности (vir). Область vir необходима для переноса T-ДНК в растительную клетку. Могут также содержаться дополнительные T-ДНК. Бактерию, трансформированную таким образом, используют для трансформации растительных клеток. Растительные эксплантаты можно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку. Затем целые растения могут быть регенерированы из инфицированного растительного материала (например, фрагментов листьев, сегментов стебля, корней, а также протопластов или культивируемых в суспензии клеток) в соответствующей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды для селекции. Полученные таким образом растения затем можно тестировать на наличие введенной ДНК. В случае инъекции и электропорации к плазмидам не предъявляют никаких особых требований. Можно использовать обычные плазмиды, такие как, например, производные pUC.

[00147] Клетки, которые были трансформированы, можно выращивать в растения общепринятыми методами. Затем эти растения можно выращивать и опылять тем же самым трансформированным штаммом или другими штаммами, и полученный гибрид будет иметь конститутивную или индуцируемую экспрессию определенной желаемой фенотипической характеристики. Можно выращивать два или более поколений, чтобы убедиться, что экспрессия желаемого фенотипического признака стабильно поддерживается и наследуется, а затем собирать семена, чтобы убедиться, что экспрессия желаемого фенотипического признака достигнута. Они могут образовывать зародышевые клетки и передавать возникший за счет трансформации признак (признаки) растениям-потомкам. Такие растения можно выращивать обычным способом и скрещивать с растениями, имеющими те же возникшие за счет трансформации наследственные факторы или другие наследственные факторы. Полученные гибридные растения обладают соответствующими фенотипическими свойствами.

[00148] Способы трансформации растений по настоящему изобретению включают введение полинуклеотида(ов) по изобретению в растение и не зависят от конкретного способа введения полинуклеотида(ов) в растение. Способы введения полинуклеотида(ов) в растения известны в данной области, включая, но без ограничения, способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и вирус-опосредованные способы.

[00149] В одном варианте осуществления настоящего изобретения растения были трансформированы кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательностью(ми), раскрытой в настоящем документе. Некоторыми неограничивающими примерами трансформированных растений являются фертильные растения трансгенного риса и томата, содержащие кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность(и) по изобретению, кодирующую белок Cry2Ai. Способы трансформации риса и томата известны в данной области. Различные другие растения также могут быть трансформированы с использованием кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности(ей), раскрытой в настоящем документе.

[00150] Термин «стабильная трансформация» должен означать, что нуклеотидная конструкция, введенная в растение, встраивается в геном растения и может наследоваться его потомками. Термин «временная трансформация» должен означать, что полинуклеотид введен в растение и не интегрируется в геном растения, либо в растение введен полипептид.

[00151] Протоколы трансформации, а также протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения, могут варьироваться в зависимости от вида растения, или растительной клетки, то есть, однодольного или двудольного, предназначенного для трансформации. Соответствующие способы введения нуклеотидных последовательностей в растительные клетки, с последующим встраиванием в растительный геном, включают микроинъекцию, электропорацию, опосредованную агробактериями трансформацию и баллистическое ускорение частиц.

[00152] В одном варианте осуществления изобретения кодон-оптимизированная синтетическая нуклеотидная последовательность(и) по изобретению, кодирующая токсин Cry2Ai, экспрессируется в высшем организме, например, растении, благодаря кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности по изобретению. В этом случае трансгенные растения, экспрессирующие эффективные количества токсина, защищают себя от насекомых-вредителей. Когда насекомое начинает питаться таким трансгенным растением, оно также поглощает экспрессированный токсин. Это удержит насекомое от дальнейшего поедания тканей растения, или может даже навредить или убить насекомое. Нуклеотидная последовательность по изобретению вставлена в экспрессионную кассету, который затем стабильно интегрируется в геном растения.

[00153] Варианты осуществления также включают трансформированные или трансгенные растения, содержащие по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность по вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления растение стабильно трансформировано нуклеотидной конструкцией, включающей по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность по вариантам осуществления, функционально связанную с промотором, управляющим экспрессией в растительной клетке.

[00154] При том, что варианты осуществления не зависят от конкретного биологического механизма повышения устойчивости растения к вредителям растений, экспрессия нуклеотидных последовательностей по вариантам осуществления в растении может приводить к продуцированию пестицидных белков по вариантам осуществления и повышению устойчивости растения к вредителям растений. Растения по вариантам осуществления могут быть использованы в сельском хозяйстве для борьбы с насекомыми-вредителями. Конкретные варианты осуществления относятся к трансформированным сельскохозяйственным культурам, таким как, например, растения риса и томата, используемым в способах борьбы с насекомыми-вредителями растений, такими как, например, различные чешуекрылые насекомые, включая Cnaphalocrocis medinalis - листовертку рисовую и Scirpophaga incertulas - стеблевого точильщика рисового.

[00155] «Экспериментальное растение или растительная клетка» представляет собой объект, в котором было произведено генетическое изменение, такое как трансформация интересующим геном, или представляет собой растение или растительную клетку, которые происходят от растения или клетки, измененных указанным образом и имеющих такое изменение. «Контроль» или «контрольное растение», или «контрольная растительная клетка», обеспечивает точку отсчета для определения изменений фенотипа экспериментального растения или растительной клетки. Контрольное растение, или растительная клетка, может включать, например: (a) растение или клетку дикого типа, то есть, с тем же генотипом, что и исходный материал для генетического изменения, которое приводит к экспериментальному растению или клетке; (b) растение, или растительную клетку, с тем же генотипом, что и исходный материал, но которое было трансформировано «нулевой» конструкцией (то есть, конструкцией, не проявляющей известный эффект на интересующий признак, например, конструкцией, содержащей ген маркера); (c) растение, или растительную клетку, которое является нетрансформированным сегрегантом среди потомков экспериментального растения или растительной клетки; (d) растение, или растительную клетку, генетически идентичное экспериментальному растению, или растительной клетке, но которое не подвергнуто воздействию условий или стимулов, которые индуцировали бы экспрессию интересующего гена; или (e) само экспериментальное растение, или растительную клетку, в условиях, в которых интересующий ген не экспрессируется.

[00156] Перенос (или интрогрессия) нуклеотидов cry2Ai, определяющих признак, в инбредные растения, такие как хлопчатник, рис, баклажан (бринджал), томат и бобовые культуры, может быть достигнут путем рекуррентной селекции, например, путем обратного скрещивания. В этом случае нужного рекуррентного родителя сначала скрещивают с инбредным донором (не рекуррентным родителем), несущим нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, для определяемых cry2Ai признаков. Потомков от данного скрещивания затем обратно скрещивают с рекуррентным родителем, с последующей селекцией полученных потомков на наличие желаемого признака(ов), переданного от не рекуррентного родителя. После трех, предпочтительно четырех, более предпочтительно пяти или более поколений от обратного скрещивания с рекуррентным родителем, с селекцией на наличие желаемого признака(ов), потомки будут гетерозиготными по локусам, контролирующим переносимый признак(и), но будут подобны рекуррентному родителю по большинству или почти всем другим генам.

[00157] Варианты осуществления также относятся к материалу для размножения трансформированного растения по вариантам осуществления, включая, но без ограничения, семена, клубни, клубнелуковицы, луковицы, листья, а также черенки корней и побегов.

[00158] Класс растений, которые могут быть использованы в способах по вариантам осуществления, как правило, столь же широк, как и класс высших растений, поддающихся методам трансформации, включая, но без ограничения, однодольные и двудольные растения. Примеры интересующих растений включают, но без ограничения, зерновые, злаковые, овощные, масличные, фруктовые, декоративные, газонные и другие растения. Например, рис (Oryza sativa, Oryza spp.), кукурузу (Zea mays), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, просо американское (Pennisetum glaucum), просо обыкновенное (Panicum miliaceum), просо итальянское (Setaria italica), просо пальчатое (Eleusine coracana)), пшеницу (Triticum aestivum, Triticum sp.), овес (Avena sativa), ячмень (Hordeum vulgare L), сахарный тростник (Saccharum spp.), хлопчатник (Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, Gossypium sp.), томаты (Lycopersicon esculentum), бринджал/баклажан (Solanum melongena), картофель (Solanum tuberosum), сахарную свеклу (Beta vulgaris), сладкий картофель (Ipomoea batatus), маниоку (Manihot esculenta), салат-латук (Lactuca sativa), капусту (Brassica oleracea var. capitata), цветную капусту (Brassica oleracea var. botrytis), брокколи (Brassica oleracea var. indica), виды Brassica (например, B. napus, B. rapa, B. juncea), в частности, те виды Brassica, которые полезны в качестве источника масла семян, сою (Glycine max), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), арахис (Arachis hypogaea), голубиный горох (Cajanus cajan), нут (Cicer arietinum), зеленую фасоль (Phaseolus vulgaris), лимскую фасоль (Phaseolus limensis), горох (Pisum sativum), чину (Lathyrus spp.), огурец (Cucumis sativus), дыню (Cucumis cantalupensis) и мускусную дыню (Cucumis melo), люцерну (Medicago sativa), табак (Nicotiana tabacum) и арабидопсис (Arabidopsis thaliana).

[00159] Интересующие растения включают зерновые растения, производящие представляющие интерес семена, масличные растения и бобовые растения. Семена, представляющие интерес, включают семена зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, рожь, просо и так далее. Масличные растения включают хлопчатник, сою, сафлор, подсолнечник, капусту, кукурузу, люцерну, пальму, кокос, лен, клещевину, оливу и так далее. Бобовые растения включают бобы и горох. Бобы включают гуар, плод рожкового дерева, пажитник, сою, садовые бобы, коровий горох, маш, лимскую фасоль, стручковую фасоль, чечевицу, нут и так далее.

[00160] В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере одну кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность(и) по изобретению можно пакетировать с любым сочетанием интересующих полинуклеотидных последовательностей для создания растений с желаемым фенотипом. Например, кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность можно пакетировать с любым другим полинуклеотидом, кодирующим полипептид, обладающий пестицидной и/или инсектицидной активностью, например, другими токсичными белками Bt, и тому подобным. Полученные сочетания также могут включать несколько копий любого из представляющих интерес полинуклеотидов. Нуклеотидные последовательности по вариантам осуществления также можно пакетировать с любым другим геном или сочетанием генов для получения растений с различными желаемыми сочетаниями признаков, включая, но без ограничения, признаки, желательные для корма животных, например, гены, отвечающие за высокое содержание масла, сбалансированное содержание аминокислот, устойчивость к абиотическим стрессам и так далее.

[00161] Нуклеотидные последовательности по изобретению также можно пакетировать с признаками, желательными для устойчивости к болезням или гербицидам, генами, связанными с авирулентностью и устойчивостью к болезням, к ингибиторам ацетолактатсинтазы (ALS), ингибиторам глутамин-синтетазы, таким как фосфинотрицин или баста (например, геном bar), устойчивостью к глифосату, признаками, желательными для переработки или продуктов переработки, такими как высокое содержание масла, модифицированные масла, модифицированный крахмал (например, ADPG пирофосфорилазы (AGPазы), синтазы крахмала (SS), ферменты разветвления крахмала (SBE) и ферменты расщепления разветвленной структуры крахмала. (SDBE)). Можно также комбинировать полинуклеотиды по вариантам осуществления с полинуклеотидами, обеспечивающими агрономические признаки, такие как мужская стерильность, прочность стебля, время цветения, или признаки, полезные для технологии трансформации, такие как регуляция клеточного цикла или нацеливание генов.

[00162] Эти пакетированные сочетания можно создавать любым способом, включая, но без ограничения, скрещивание растений общепринятыми методами, генетическую трансформацию или любой другой способ, известный в данной области. Если признаки пакетируют путем генетической трансформации растений, интересующие полинуклеотидные последовательности можно объединять в любое время и в любом порядке. Например, трансгенное растение, имеющее один или более желаемых признаков, можно использовать в качестве мишени для введения дополнительных признаков путем последующей трансформации. Признаки можно вводить одновременно в протоколе совместной трансформации интересующими полинуклеотидами, предоставляемыми любым сочетанием трансформирующих кассет. Например, если будут введены две последовательности, две последовательности могут содержаться в отдельных трансформирующих кассетах (транс), или содержаться в одной и той же трансформирующей кассете (цис). Экспрессией последовательностей может управлять один и тот же промотор или разные промоторы. В некоторых случаях может быть желательно вводить трансформирующую кассету, которая будет подавлять экспрессию интересующего полинуклеотида. Ее можно комбинировать с любым сочетанием других кассет для супрессии или кассет для избыточной экспрессии, получая желаемую комбинацию признаков в растении. Кроме того, признано, что полинуклеотидные последовательности можно пакетировать в любом нужном участке генома с использованием системы сайт-специфической рекомбинации.

Анализ трансгенных растений

[00163] Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

[00164] Настоящее изобретение относится к способу ПЦР-амплификации фрагмента кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, раскрытой в настоящем документе и кодирующей белок Cry2Ai, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, включающему амплификацию ДНК методом ПЦР в присутствии набора праймеров, приведенных в SEQ ID NO: 8-9. Аналогично, фрагмент кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 3-8, раскрытой в настоящем документе, можно амплифицировать с использованием праймеров, специфических для указанной нуклеотидной последовательности. Специалист в данной области может проектировать набор праймеров для амплификации указанных нуклеотидов. Протоколы и условия для ПЦР-амплификации фрагмента ДНК с матрицы ДНК описаны в другом разделе настоящего документа или известны в данной области.

[00165] Можно конструировать олигонуклеотидные праймеры для использования в реакциях ПЦР с целью амплификации соответствующих последовательностей ДНК с кодон-оптимизированных последовательностей ДНК по изобретению. Способы конструирования ПЦР-прймеров и ПЦР-клонирования, в целом, известны в данной области и описаны в сборнике Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), далее в настоящем документе «Sambrook». Известные методы ПЦР включают, но без ограничения, методы с использованием парных праймеров, вложенных праймеров, односпецифичных праймеров, вырожденных праймеров, ген-специфичных праймеров, вектор-специфичных праймеров, частично ошибочно спариваемых праймеров и тому подобного.

[00166] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров, подходящих для ПЦР-амплификации фрагмента кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности(ей) по настоящему изобретению, кодирующей пестицидный полипептид, и способам применения набора праймеров в ПЦР-амплификации ДНК. Наборы праймеров включают прямые и обратные праймеры, которые были спроектированы для отжига с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению.

[00167] Наборы праймеров для амплификации нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, по изобретению включают прямой и обратный праймеры, приведенные в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9.

[00168] Саузерн-гибридизация

[00169] В методах гибридизации всю известную нуклеотидную последовательность, или ее часть, используют в качестве зонда, который избирательно гибридизуется с другими соответствующими нуклеотидными последовательностями, присутствующими в популяции клонированных фрагментов геномной ДНК, или из выбранного организма. Зонды для гибридизации могут представлять собой ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК кодон-оптимизированной последовательности(ей) ДНК по настоящему изобретению, или линеаризованную плазмиду, содержащую нуклеотидную последовательность(и), или другие олигонуклеотиды, которые способны гибридизоваться с соответствующими последовательностями синтетического полинуклеотида, раскрытого в настоящем документе, и могут быть мечены детектируемой группой, такой как ³²P, или любым другим детектируемым маркером. Таким образом, например, зонды для гибридизации могут быть получены путем мечения синтетических олигонуклеотидов на основе последовательностей по вариантам осуществления. Способы получения зондов для гибридизации, в целом, известны в данной области и описаны в Sambrook.

[00170] Например, целую последовательность, раскрытую в настоящем документе, либо один или более ее фрагментов, можно использовать в качестве зонда, способного специфически гибридизоваться с соответствующими последовательностями. Для достижения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, являющиеся уникальными для последовательностей по вариантам осуществления и имеющие длину, как правило, по меньшей мере примерно 10 или 20 нуклеотидов. Такие зонды можно использовать для амплификации соответствующей нуклеотидной последовательности(ей) cry2Ai из нуклеотидных последовательностей методом ПЦР.

[00171] Гибридизацию таких последовательностей можно проводить в строгих условиях. Используемый в настоящем документе термин «строгие условия», или «строгие условия гибридизации», означает условия, в которых зонд будет гибридизоваться с его последовательностью-мишенью в значительно большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере с превышением фона в 2 раза, 5 раз или 10 раз). Строгие условия зависят от последовательностей и будет разным при разных обстоятельствах. Контролируя строгость условий гибридизации и/или промывания, можно обнаруживать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). Альтернативно, строгость условий можно корректировать, допуская некоторое несовпадение последовательностей, за счет чего обнаруживают сходство в более низкой степени (гетерологичное зондирование).

[00172] Как правило, строгими условиями являются условия, когда концентрация соли составляет менее примерно 1,5 M ионов Na, как правило, концентрация примерно 0,01-1,0 M ионов Na (или других солей) при pH 7,0-8,3, и температура составляет по меньшей мере примерно 30°C в случае коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°C в случае длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Строгие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизаторов, таких как формамид. Иллюстративные условия низкой строгости включают гибридизацию с буферным раствором, содержащим 30% - 35% формамида, 1 M NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия), при 37°C и промывание в 1x - 2x SSC (20x SSC=3,0 M NaCl/0,3 M цитрат тринатрия) при 50°C - 55°C. Иллюстративные условия умеренной строгости включают гибридизацию в буфере, содержащем 40% - 45% формамида, 1,0 M NaCl, 1% SDS, при 37°C и промывание в 0,5x - 1x SSC при 55-60°C. Иллюстративные условия высокой строгости включают гибридизацию в буфере, содержащем 50% формамида, 1 M NaCl, 1% SDS, при 37°C, и окончательное промывание в 0,1x SSC при 60°C - 65°C в течение по меньшей мере примерно 20 минут. Необязательно, промывающие буферы могут содержать от примерно 0,1% до примерно 1% SDS. Продолжительность гибридизации обычно составляет менее примерно 24 часов, как правило, от примерно 4 до примерно 12 часов.

[00173] Специфичность, как правило, зависит от промываний после гибридизации, при этом критическими факторами являются ионная сила и температура последнего промывающего раствора. В случае гибридов ДНК-ДНК Tm (температура плавления) может быть аппроксимирована из уравнения Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm =81,5°C +16,6 (log M)+0,41 (% GC)-0,61 (% форм)-500/L; где M представляет собой молярность одновалентных катионов, % GC представляет собой процентное содержание нуклеотидов гуанозина и цитозина в ДНК, «% форм» представляет собой процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и L представляет собой длину гибрида в парах оснований. T^m представляет собой температуру (при определенной ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с идеально подобранным зондом. Промывания, как правило, выполняют по меньшей мере до достижения равновесия и достижения низкого фонового уровня гибридизации, например, в течение 2 часов, 1 часа или 30 минут. T^m уменьшают примерно на 1°C для каждого 1% несовпадений; таким образом, T^m гибридизации и/или условия промывания можно корректировать для гибридизации с последовательностями, имеющими желаемую идентичность. Например, если нужны последовательности с 90% идентичностью, T^m можно уменьшать на 10°C. Как правило, строгие условия выбирают так, чтобы температура составляла примерно на 5°C ниже, чем T^m для конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и pH. Однако для очень строгих условий можно использовать гибридизацию и/или промывание при температуре на 1, 2, 3 или 4°C ниже, чем T^m; для умеренно строгих условий можно использовать гибридизацию и/или промывание при температуре на 6°C, 7°C, 8°C, 9°C или 10°C ниже, чем T^m; для нестрогих условий можно использовать гибридизацию и/или промывание при температуре на 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C или 20°C ниже, чем T^m.

[00174] Используя уравнение, композиции для гибридизации и промывания, а также нужную T^m, специалисты в данной области поймут, что описаны, по сути, вариации в условиях гибридизации и/или промывающих растворах. Если желаемая степень несовпадения приводит к T^m менее чем 45°C (водный раствор) или 32°C (раствор с формамидом), концентрация SSC может быть увеличена, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в сборниках Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); и Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Смотри также Sambrook et al.

[00175] Настоящее изобретение охватывает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, или нуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизуется с по меньшей мере 10 нуклеотидами нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, в положениях нуклеотидов от 251 до 402 и/или от 1456 до 1628, или комплементарную ей последовательность. Специалисты в данной области способны изготавливать зонды на основании нуклеотидных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, для гибридизации нуклеиновых кислот.

Биоанализ

[00176] Множество методов биоанализа известны специалисту в данной области. Общие методы включают добавление экспериментального соединения или организма к источнику питания в закрытом контейнере. Пестицидную активность можно оценивать на основании, но без ограничения, изменений смертности, потери веса, привлечения, отталкивания, а также других поведенческих и физических изменений после поедания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Биоанализы, описанные в настоящем документе, можно использовать с любым питающимся насекомым-вредителем в личиночной или взрослой стадии.

Инсектицидная композиция

[00177] Биологический пестицид является одной из наиболее перспективных альтернатив обычным химическим пестицидам, он наносит меньший, или совсем не наносит, вред окружающей среде и биоте. Bacillus thuringiensis (известная как Bt) представляет собой инсектицидную грамположительную спорообразующую бактерию, продуцирующую кристаллические белки, называемые дельта-эндотоксинами (δ-эндотоксинами) во время ее стационарной фазы или замедления ее роста. Bt первоначально была обнаружена в пораженном болезнью шелковичном черве (Bombyx mori) ученым Shigetane Ishiwatari в 1902 г. Но формально она была охарактеризована Ernst Berliner при изучении пораженных болезнью гусениц мучной моли (Ephestia kuhniella) в 1915 г. Первая запись о ее применении для борьбы с насекомыми была сделана в Венгрии в конце 1920 года, и в Югославии в начале 1930-х годов ее использовали для борьбы с европейским кукурузным зерновым точильщиком. Bt, ведущий биорациональный пестицид, была первоначально охарактеризована как патоген насекомых, и ее инсектицидная активность была соотнесена преимущественно, или полностью, с параспоральными кристаллами. Она активна против более 150 видов насекомых-вредителей. Токсичность культуры Bt заключается в ее способности продуцировать кристаллический белок, это наблюдение привело к разработке биоинсектицидов на основе Bt для борьбы с некоторыми видами насекомых из порядков Чешуекрылые, Двукрылые и Жесткокрылые.

[00178] Композиции по вариантам осуществления находят применение для защиты растений, семян и растительной продукции различными способами. Например, композиции могут быть использованы в способе, включающем помещение эффективного количества пестицидной композиции в среду обитания вредителя методом, выбранным из группы, состоящей из распыления, обсыпания, разбрасывания или покрытия семян.

[00179] Прежде чем материал для размножения растений (плод, клубень, луковица, корневище, зерна, семена), но особенно семена, будет продан в качестве коммерческого продукта, его обычно обрабатывают защитным покрытием, включающим гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематициды, моллюскициды, или смеси некоторых из этих препаратов, при желании, совместно с другими носителями, сурфактантами или способствующими нанесению адъювантами, обычно используемыми в области формулирования препаратов, для обеспечения защиты от повреждений, вызываемых бактериальными, грибковыми или животными вредителями. Для обработки семян защитное покрытие может быть нанесено на семена либо путем пропитки клубней или зерен жидким препаратом, либо путем покрытия их комбинированным влажным или сухим препаратом. Кроме того, в особых случаях могут быть использованы и другие способы нанесения на растения, например, обработка, направленная на бутоны или плоды.

[00180] Семя растения по вариантам осуществления, содержащее нуклеотидную последовательность, кодирующую пестицидный белок по вариантам осуществления, может быть обработано защитным покрытием, включающим соединение для обработки семян, такое как, например, каптан, карбоксин, тирам, металаксил, пиримифос-метил и другие, обычно используемые для обработки семян. В одном варианте осуществления покрытие для защиты семян, включающее пестицидную композицию по вариантам осуществления, используют отдельно или в сочетании с одним из защитных покрытий для семян, обычно используемых при обработке семян. Композиции по вариантам осуществления могут находиться в форме, подходящей для непосредственного применения, или в виде концентрата основной композиции, который должен быть разбавлен соответствующим количеством воды или другого разбавителя перед применением. Концентрация пестицида будет варьироваться в зависимости от природы конкретного препарата, в частности, является ли он концентратом или может быть использован непосредственно. Композиция содержит 1-98% твердого или жидкого инертного носителя, и 0-50% или 0,1-50% сурфактанта. Эти композиции будут применяться в соответствии с указанной нормой для коммерческого продукта, например, примерно 0,01-5,0 фунтов на акр в сухом виде и примерно 0,01-10 пинт на акр в жидком виде.

[00181] Кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, можно также использовать для получения трансформированной Bacillus thuringiensis, способной продуцировать белок Cry2Ai. Трансформированную Bacillus thuringiensis затем можно использовать для получения инсектицидной и/или пестицидной композиции, полезной для сельскохозяйственной деятельности, такой как борьба с насекомыми-вредителями.

[00182] В вариантах осуществления трансформированный микроорганизм (который включает целые организмы, клетки, споры), такой как Bacillus thuringiensis, трансформированный кодон-оптимизированными синтетическими нуклеотидными последовательностями, раскрытыми в настоящем документе, пестицидным белком(ами), пестицидным компонентом(ами), поражающим вредителей компонентом(ами), мутантом(ами), живыми или мертвыми клетками и клеточными компонентами, включая смеси живых и мертвых клеток и клеточных компонентов, и включая разрушенные клетки и клеточные компоненты, или выделенный пестицидный белок, может быть сформулирован с приемлемым носителем в пестицидную композицию(и), то есть, например, суспензию, раствор, эмульсию, порошок, диспергируемую гранулу или драже, смачиваемый порошок и эмульгируемый концентрат, аэрозоль или спрей, пропитанную гранулу, адъювант, пасту для нанесения покрытия, коллоид, а также инкупсулирован, например, в полимерные вещества. Такие сформулированные композиции могут быть получены общепринятыми методами, такими как обезвоживание, лиофилизация, гомогенизация, экстрагирование, фильтрование, центрифугирование, осаждение или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид.

[00183] Такие композиции, описанные выше, могут быть получены путем добавления поверхностно-активного средства, инертного носителя, консерванта, увлажняющего средства, стимулятора питания, аттрактанта, инкапсулирующего средства, связывающего средства, эмульгатора, красителя, УФ-протектора, буфера, средства, повышающего текучесть, или удобрений, доноров микроэлементов или других препаратов, которые влияют на рост растений. Один или более агрохимикатов, включая, но без ограничения, гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематициды, моллюскициды, акарициды, регуляторы роста растений, средства для повышения урожайности и удобрения, можно комбинировать с носителями, сурфактантами или адъювантами, обычно используемыми в области формулирования препаратов, или другими компонентами для облегчения работы с продуктом и применения для конкретных целевых вредителей. Подходящие носители и адъюванты могут быть твердыми или жидкими, и представляют собой вещества, обычно используемые в технологии формулирования, например, природные или регенерированные минеральные вещества, растворители, диспергирующие средства, увлажняющие средства, средства, придающие липкость, связывающие вещества или удобрения. Активные ингредиенты по вариантам осуществления обычно применяют в форме композиций, и они могут быть нанесены на площадь, занятую сельскохозяйственными растениями, растения или семена, которые должны быть обработаны. Например, композиции по вариантам осуществления можно наносить на зерно при подготовке к хранению или во время хранения в зернохранилище или силосной яме, и так далее. Композиции по вариантам осуществления можно применять одновременно или последовательно с другими соединениями. Способы применения активного ингредиента по вариантам осуществления или агрохимической композиции по вариантам осуществления, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, продуцируемых бактериальными штаммами по вариантам осуществления, включают, но без ограничения, внекорневое нанесение, покрытие семян и внесение в почву. Количество применений и норма внесения зависят от интенсивности заражения соответствующим вредителем.

[00184] В следующем варианте осуществления композиции, а также трансформированные микроорганизмы и пестицидный белок по вариантам осуществления, могут быть обработаны перед формулированием для продления пестицидной активности при применении в среде обитания целевого вредителя, при условии, что предварительная обработка не оказывает вредного воздействия на пестицидную активность. Такую обработку можно осуществлять химическими и/или физическими средствами при условии, что она не оказывает пагубного влияния на свойства композиции(й). Примеры химических реагентов включают, но не ограничиваются ими, галогенирующие средства; альдегиды, такие как формальдегид и глутаральдегид; противоинфекционные препараты, такие как зефиран хлорид; спирты, такие как изопропанол и этанол.

[00185] В других вариантах осуществления может быть полезно обрабатывать полипептиды токсина Cry протеазой, например, трипсином, для активации белка перед внесением пестицидной белковой композиции по вариантам осуществления в среду обитания целевого вредителя. Способы активации протоксина сериновой протеазой хорошо известны в данной области.

[00186] Композиции (включая трансформированные микроорганизмы и пестицидный белок по вариантам осуществления) можно вносить в среду обитания насекомого-вредителя путем, например, распыления, разбрызгивания, опыления, разбрасывания, нанесения покрытия или заливки, внесения в, или на, почву, внесения в оросительную воду, путем обработки семян или общего нанесения или распыления в момент начала появления вредителей или до появления вредителей в качестве защитной меры. Например, пестицидный белок и/или трансформированные микроорганизмы по вариантам осуществления можно смешивать с зерном для защиты зерна во время хранения. Как правило, важно обеспечивать хорошую защиту от вредителей на ранних стадиях роста растений, поскольку именно в это время растение может быть наиболее сильно повреждено. Композиции по вариантам осуществления могут содержать другой инсектицид, если это считается необходимым. В одном варианте осуществления композицию вносят непосредственно в почву во время посадки в гранулированном виде композиции из носителя и мертвых клеток штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма по вариантам осуществления. Другой вариант осуществления представляет собой гранулированную форму композиции, содержащей агрохимикат, такой как, например, гербицид, инсектицид, удобрение, инертный носитель и мертвые клетки штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма по вариантам осуществления.

[00187] Специалисты в данной области понимают, что не все соединения одинаково эффективны против всех вредителей. Соединения по вариантам осуществления проявляют активность против насекомых-вредителей, которые могут включать вредителей экономически значимых сельскохозяйственных, лесных, тепличных, питомниковых, декоративных, пищевых и волокнистых, полезных для здоровья людей и животных, бытовых и коммерческих, используемых в домашнем хозяйстве, хранимых продуктов. Насекомые-вредители включают насекомых из порядка «Чешуекрылые». Личинки насекомых порядка «Чешуекрылые» включают, но без ограничения, «походных червей», гусениц озимой совки, пядениц и личинки совок в семействе Noctuidae Spodoptera frugiperda J E Smith (совка травяная); S. exigua Hubner (совка малая); S. litura Fabricius (азиатская хлопковая совка, кластерные гусеницы); Mamestra configurata Walker (большой походный червь); M. brassicae Linnaeus (совка капустная); Agrotis ipsilon Hufnagel (совка-ипсилон); A. orthogonia Morrison (совка прямоугольная); A. subterranea Fabricius (совка хлопковая); Alabama argillacea Hubner (совка хлопковая американская); Trichoplusia ni Hubner (совка капустная); Pseudoplusia includens Walker (соевая совка); Anticarsia gemmatalis Hubner (совка бархатных бобов); Hypena scabra Fabricius (совка клеверная); Heliothis virescens Fabricius (табачная листовертка); Pseudaletia unipuncta Haworth (совка луговая); Athetis mindara Barnes and Mcdunnough (совка шершавая); Euxoa messoria Harris (чернобокая совка); Earias insulana Boisduval (совка хлопковая египетская); E. vittella Fabricius (совка пятнистая); Helicoverpa armigera Hubner (совка щетинконогая резедовая); H. zea Boddie (совка кукурузная или совка хлопковая); Melanchra picta Harris (совка); Egira (Xylomyges) curialis Grote (совка цитрусовая); точильщиков, моли-чехлоноски, паутинных червей, чехликовые моли и пестрянки в семействе Pyralidae Ostrinia nubilalis Hubner (мотылек стеблевой кукурузный); Amyelois transitella Walker (огневка); Anagasta kuehniella Zeller (огневка мельничная); Cadra cautella Walker (огневка сухофруктовая); Chilo suppressalis Walker (стеблевой точильщик рисовый); C. partellus (сорговая совка); Corcyra cephalonica Stainton (рисовая моль); Crambus caliginosellus Clemens (огневка); C. teterrellus Zincken (огневка); Cnaphalocrocis medinalis Guenee (листовертка рисовая); Desmia funeralis Hubner (листовертка виноградная); Diaphania hyalinata Linnaeus (дынная моль); D. nitidalis Stoll (огневка); Diatraea grandiosella Dyar (огневка кукурузная юго-западная), D. saccharalis Fabricius (тростниковый точильщик); Eoreuma loftini Dyar (рисовая моль); Ephestia elutella Hubner (огневка табачная (шоколадная)); Galleria mellonella Linnaeus (моль большая восковая); Herpetogramma licarsisalis Walker (луговой мотылек); Homoeosoma electellum Hulst (огневка подсолнечниковая); Elasmopalpus lignosellus Zeller (точильщик зерновой); Achroia grisella Fabricius (моль мелкая вощинная); Loxostege sticticalis Linnaeus (мотылек луговой); Orthaga thyrisalis Walker (моль чайного дерева); Maruca testulalis Geyer (огневка акациевая); Plodia interpunctella Hubner (моль индийская мучная); Scirpophaga incertulas Walker (желтый стеблевой точильщик); Udea rubigalis Guenee (огневка ржаво-коричневая); а также листоверток, почковых червей, семенных червей и плодовых червей в семействе Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (западная черноголовая листовертка); A. variana Fernald (восточная черноголовая листовертка); Archips argyrospila Walker (листовертка плодовых деревьев); A. rosana Linnaeus (листовертка резанная) и другие виды Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (сетчатая листокрутка); Cochylis hospes Walsingham (метлица подсолнечниковая); Cydia latiferreana Walsingham (плодожорка); C. pomonella Linnaeus (плодожорка яблоневая); Platynota flavedana Clemens (листовертка пестро-золотистая); P. stultana Walsingham (листовертка всеядная); Lobesia botrana Denis & Schiffermuller (гроздевая листовертка); Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller (листовертка почковая); Endopiza viteana Clemens (листовертка виноградная); Eupoecilia ambiguella Hubner (листовертка гроздевая); Bonagota salubricola Meyrick (листовертка яблоневая); Grapholita molesta Busck (листовертка восточная персиковая); Suleima helianthana Riley (огневка подсолнечниковая); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.

[00188] Выбранные другие сельскохозяйственные вредители из порядка «Чешуекрылые» включают, но без ограничения, Alsophila pometaria Harris (пяденица); Anarsia lineatella Zeller (моль фруктовая полосатая); Anisota senatoria J. E. Smith (оранжево-полосатая дубовая моль); Antheraea pernyi Guerin-Meneville (шелкопряд дубовый китайский); Bombyx mori Linnaeus (шелкопряд тутовый); Bucculatrix thurberiella Busck (совка хлопковая; Collas eurytheme Boisduval (совка люцерновая); Datana integerrima Grote & Robinson (совка ореховая); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (сибирский шелкопряд), Ennomos subsignaria Hubner (пяденица вязовая); Erannis tiliaria Harris (пяденица липовая); Euproctis chtysorrhoea Linnaeus (златогузка); Harrisina americana Guerin-Meneville (пестрянка виноградная); Hemileuca oliviae Cockrell (пастбищная совка); Hyphantria cunea Drury (американская белая бабочка); Keiferia lycopersicella Walsingham (томатная острица); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (восточная пяденица тсуговая); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (западная пяденица тсуговая); Leucoma salicis Linnaeus (шелкопряд ивовый); Lymantria dispar Linnaeus (шелкопряд непарный); Manduca quinquemaculata Haworth (бражник пятнистый, бражник томатный); M. sexta Haworth (бражник томатный, бражник табачный); Operophtera brumata Linnaeus (пяденица зимняя); Paleacrita vemata Peck (пяденица весенняя); Papilio cresphontes Cramer (парусник гигантский, парусник); Phryganidia californica Packard (калифорнийская дубовая моль); Phyllocnistis citrella Stainton (цитрусовый листовой минер); Phyllonotycter blancardella Fabricius (плодовая нижнеминирующая моль-пестрянка); Pieris brassicae Linnaeus (белянка капустная); P. rapae Linnaeus (белянка репная); P. napi Linnaeus (белянка брюквенная); Platyptilia carduidactyla Riley (пальцекрылка артишоковая); Plutella xylostella Linnaeus (моль капустная); Pectinophora gossypiella Saunders (розовый коробочный червь); Pontia protodice Boisduval & Leconte (капустница южная); Sabulodes aegrotata Guenee (пяденица всеядная); Schizura concinna J. E. Smith (хохлатка); Sitotroga cerealella Olivier (моль зерновая); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (шелкопряд сосновый крапчатый); Tineola bisselliella Hummel (моль мебельная); Tuta absolute Meyrick (томатный листовой минер); Yponomeuta padella Linnaeus (горностаевая моль); Heliothis subflexa Guenee; Malacosoma spp. и Orgyia spp.

[00189] Пестицидную активность композиций по вариантам осуществления можно тестировать на насекомых-вредителях на ранних стадиях развития, например, в виде личинок или других незрелых форм. Насекомых можно выращивать в полной темноте при температуре от примерно 20°C до примерно 30°C и относительной влажности от примерно 30% до примерно 70%. Способы выращивания личинок насекомых и проведения биоанализов хорошо известны специалистам в данной области.

[00190] Способ борьбы с насекомыми, в частности, чешуекрылыми насекомыми, по настоящему изобретению может включать нанесение (например, распыление) на площадь или растение, требующие защиты, на участок (площадь), где требуется защита, инсектицидной/пестицидной композиции, раскрытой в настоящем документе, содержащей клетки-хозяева, трансформированные кодон-оптимизированными нуклеотидными последовательностями cry2Ai по изобретению. Участок, где требуется защита, может включать, например, зону обитания насекомых-вредителей или растущие растения, или участок, на котором будут выращивать растения.

[00191] Настоящее изобретение относится к способу борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями баклажана, включающему нанесение инсектицидной/пестицидной композиции, раскрытой в настоящем документе, на площадь или растение, требующие защиты, посадку растений баклажана, трансформированных нуклеотидной последовательностью(ми) cry2Ai по изобретению, или распыление композиции, содержащей белок Cry2Ai по изобретению. Изобретение также относится к применению композиции по изобретению против чешуекрылых насекомых-вредителей баклажана, с минимизацией ущерба для растений баклажана.

[00192] Настоящее изобретение также относится к способу борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями риса, в частности, чешуекрылыми стеблевыми рисовыми точильщиками, рисовыми листовертками, рисовыми толстоголовками, рисовыми совками, рисовыми походными червями, или куколками рисовых насекомых-вредителей, предпочтительно, с насекомым, выбранным из группы, состоящей из: Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Scirpophaga innotata, включающему нанесение инсектицидной/пестицидной композиции, раскрытой в настоящем документе, на площадь или растение, требующие защиты, посадку растений риса, трансформированных нуклеотидной последовательностью(ми) cry2Ai по изобретению, или распыление композиции, содержащей белок Cry2Ai по изобретению. Изобретение также относится к применению композиции, раскрытой в настоящем документе, против чешуекрылых насекомых-вредителей риса, с минимизацией ущерба для растений риса.

[00193] Настоящее изобретение также относится к способу борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями томата, в частности, чешуекрылым насекомым Helicoverpa armigera, включающему нанесение инсектицидной/пестицидной композиции, раскрытой в настоящем документе, на площадь или растение, требующие защиты, посадку растений томата, трансформированных нуклеотидной последовательностью(ми) cry2Ai по изобретению, или распыление композиции, содержащей белок Cry2Ai по изобретению. Изобретение также относится к применению композиции, раскрытой в настоящем документе, против чешуекрылых насекомых-вредителей томата, с минимизацией ущерба для растений томата.

[00194] Настоящее изобретение также относится к способу борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями хлопчатника, включающему нанесение инсектицидной/пестицидной композиции, раскрытой в настоящем документе, на площадь или растение, требующие защиты, посадку растений хлопчатника, трансформированных нуклеотидной последовательностью(ми) cry2Ai по изобретению, или распыление композиции, содержащей белок Cry2Ai по изобретению. Изобретение также относится к применению композиции, раскрытой в настоящем документе, против чешуекрылых насекомых-вредителей хлопчатника, с минимизацией ущерба для растений хлопчатника.

[00195] Для получения белка токсина Cry2Ai (SEQ ID NO: 1) клетки рекомбинантных хозяев, экспрессирующие белок Cry2Ai, можно выращивать общепринятым образом на подходящей культуральной среде, а затем лизировать обычными методами, такими как разрушение ферментами или детергентами, или тому подобное. Затем токсин можно выделять и очищать стандартными методами, такими как хроматография, экстракция, электрофорез или тому подобное.

[00196] Соответственно, настоящее изобретение относится к композициям и способам воздействия на насекомых-вредителей, в частности, вредителей растений. Более конкретно, изобретение относится к кодон-оптимизированным полинуклеотидам, кодирующим биологически активные инсектицидные полипептиды, направленные против насекомых-вредителей, таких как, но без ограничения, насекомые-вредители порядка «Чешуекрылые», например, Helicoverpa armigera - совка хлопковая и совка кукурузная, Cnaphalocrocis medinalis - листовертка рисовая и Scirpophaga incertulas - стеблевой точильщик рисовый, а также Pectinophora gossypiella.

[00197] Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, где указанная нуклеотидная последовательность представляет собой

a. последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, или комплементарную ей нуклеотидную последовательность, или

b. нуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизуется с по меньшей мере 10 нуклеотидами нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, в положениях нуклеотидов от 251 до 402 и/или от 1456 до 1628, или комплементарную ей последовательность.

[00198] Другой вариант осуществления относится к кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, где нуклеотидная последовательность, которая специфически гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.

[00199] Другой вариант осуществления относится к рекомбинантной ДНК, содержащей кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, где нуклеотидная последовательность функционально связана с гетерологичным регуляторным элементом. Другой вариант осуществления относится к рекомбинантной ДНК, раскрытой в настоящем документе, где указанная кодон-оптимизированная синтетическая нуклеотидная последовательность, необязательно, содержит ген селективного маркера, ген репортера или их сочетание. Другой вариант осуществления относится к рекомбинантной ДНК, раскрытой в настоящем документе, где указанная кодон-оптимизированная синтетическая нуклеотидная последовательность, необязательно, содержит последовательность ДНК, кодирующую направляющий или транзитный пептид для направления к вакуоли, митохондрии, хлоропласту, пластиде, или для секреции.

[00200] Другой вариант осуществления относится к конструкции ДНК для экспрессии интересующего инсектицидного белка, содержащей 5’-нетранслируемую последовательность, кодирующую последовательность, кодирующую инсектицидный белок Cry2Ai, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или его инсектицидный фрагмент, и 3’-нетранслируемую область, при этом указанная 5’-нетранслируемая последовательность содержит промотор, функциональный в растительной клетке, указанная кодирующая последовательность представляет собой кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, и при этом указанная 3’-нетранслируемая последовательность содержит последовательность терминации транскрипции и сигнал полиаденилирования.

[00201] Другой вариант осуществления относится к плазмидному вектору, содержащему рекомбинантную ДНК или конструкцию ДНК по настоящему изобретению.

[00202] Другой вариант осуществления относится к клетке-хозяину, содержащей кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению. Клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку растения, бактериальную клетку, вирус, клетку грибов и дрожжей. В другом варианте осуществления описанная клетка-хозяин представляет собой клетку растения, Agrobacterium или E. coli.

[00203] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу придания растению устойчивости к насекомым, включающему

a. введение в растительную клетку кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе, где нуклеотидная последовательность функционально связана с (i) промотором, функциональным в растительной клетке, и (ii) терминатором;

b. получение трансформированной растительной клетки из растительной клетки этапа (a), где указанная трансформированная растительная клетка содержит указанную кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе; и

c. получение трансгенного растения из указанной трансформированной растительной клетки этапа (b), где указанное трансгенное растение содержит указанную кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе.

[00204] Другой вариант осуществления относится к трансгенному растению, полученному способом придания растению устойчивости к насекомым, раскрытым в настоящем документе. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к трансгенному растению, содержащему кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к трансгенному растению, содержащему кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к трансгенному растению, раскрытому в настоящем документе, которое выбрано из группы, состоящей из риса, пшеницы, кукурузы, сорго, овса, проса, бобовых растений, хлопчатника, томата, баклажана, капусты, цветной капусты, брокколи, видов Brassica, фасоли, гороха, голубиного гороха, картофеля, перца, тыквенных, салата, сладкого картофеля, канолы, сои, люцерны, арахиса, подсолнечника, сафлора, табака, сахарного тростника, маниоки, кофе, ананаса, цитрусовых, какао, чая, банана и дыни.

[00205] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к тканям, семенам или потомкам, полученным от трансгенного растения по настоящему изобретению, где указанные семена или потомки содержат кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к биологическому образцу, полученному из тканей или семян, или потомков, раскрытых в настоящем документе, где указанный образец содержит поддающееся обнаружению количество указанной кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к товарному продукту, полученному из трансгенного растения, раскрытого в настоящем документе, где указанный продукт содержит поддающееся обнаружению количество указанной кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе.

[00206] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции, содержащей Bacillus thuringiensis, содержащую кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, кодирующую белок Cry2Ai, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. Композиция, раскрытая в настоящем документе, может, необязательно, содержать дополнительное инсектицидное средство, токсичное для того же насекомого-вредителя, но имеющее механизм его инсектицидного действия, отличный от механизма действия указанного инсектицидного белка. Инсектицидное средство композиции по изобретению выбрано из группы, состоящей из токсина Bacillus, токсина Xenorhabdus, токсина Photorhabdus и дцРНК, специфически подавляющей один или более важных генов у указанного насекомого-вредителя.

[00207] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу борьбы с насекомыми, поражающими сельскохозяйственные растения, и обеспечения устойчивости к насекомым, включающему создание контакта указанного сельскохозяйственного растения с эффективным для инсектицидного действия количеством композиции, описанной выше.

[00208] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, конструкции ДНК или плазмиды по изобретению для производства устойчивых к насекомым трансгенных растений. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе, для производства инсектицидной композиции, которая содержит клетки Bacillus thuringiensis, содержащие указанные нуклеотидные последовательности.

[00209] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к трансгенным растениям, экспрессирующим по меньшей мере одну кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе. Другой вариант осуществления относится к трансгенному растению, полученному способом, раскрытым в настоящем документе. Трансгенное растение, раскрытое в настоящем документе, выбрано из группы, состоящей из риса, пшеницы, кукурузы, сорго, овса, проса, бобовых растений, хлопчатника, томата, баклажана, капусты, цветной капусты, брокколи, видов Brassica, фасоли, гороха, голубиного гороха, картофеля, перца, тыквенных, салата, сладкого картофеля, канолы, сои, люцерны, арахиса, подсолнечника, сафлора, табака, сахарного тростника, маниоки, кофе, ананаса, цитрусовых, какао, чая, банана и дыни. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к тканям, семенам или потомкам, полученным от трансгенного растения(й) по изобретению, где указанные семена или потомки содержат кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность, описанную в настоящем документе. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к биологическим образцам, полученным из тканей или семян, или потомков, где образец содержит поддающееся обнаружению количество указанной кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности. Один вариант осуществления относится к товарному продукту, полученному из трансгенного растения по изобретению, где продукт содержит поддающееся обнаружению количество кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности.

[00210] Один вариант осуществления относится к композиции, содержащей Bacillus thuringiensis, содержащую по меньшей мере одну кодон-оптимизированную синтетическую нуклеотидную последовательность по изобретению, где нуклеотидная последовательность кодирует белок Cry2Ai, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. Композиция, необязательно, содержит дополнительное инсектицидное средство, токсичное для того же насекомого-вредителя, но имеющее механизм его инсектицидного действия, отличный от механизма действия указанного инсектицидного белка. Инсектицидное средство выбрано из группы, состоящей из токсина Bacillus, токсина Xenorhabdus, токсина Photorhabdus и дцРНК, специфически подавляющей один или более важных генов у указанного насекомого-вредителя.

[00211] Другой вариант осуществления относится к способу борьбы с насекомыми, поражающими сельскохозяйственные растения, и обеспечения устойчивости к насекомым, включающему создание контакта указанного сельскохозяйственного растения с эффективным для инсектицидного действия количеством композиции, описанной в настоящем документе.

[00212] Другой вариант осуществления относится к применению кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, конструкции ДНК или плазмиды по изобретению для производства устойчивых к насекомым трансгенных растений. Другой вариант осуществления относится к применению кодон-оптимизированной синтетической нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе, для производства инсектицидной композиции, которая содержит клетки Bacillus thuringiensis, содержащие указанные нуклеотидные последовательности.

[00213] Эти и/или другие варианты осуществления настоящего изобретения отражены в формуле изобретения, которая является частью описания изобретения.

[00214] Различные модификации и другие варианты осуществления настоящего изобретения могут быть предложены специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение, с учетом идей, изложенных в описании и прилагаемых чертежах. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в настоящем документе, и что модификации и другие варианты осуществления должны быть включены в объем прилагаемой формулы изобретения.

[00215] Следующие далее примеры иллюстрируют изобретение, и не должны ограничивать изобретение или искомую патентную защиту.

ПРИМЕРЫ

[00216] Следующие примеры изложены таким образом, чтобы предоставить специалистам в данной области полное раскрытие информации и описание того, как осуществлять на практике и применять настоящее изобретение, и не должны ограничивать объем того, что авторы считают своим изобретением, они также не должны быть восприняты так, будто приведенные ниже эксперименты представляют собой все, или единственные, проведенные эксперименты. Были предприняты усилия для обеспечения точности используемых цифр (например, количеств, температур и так далее), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения.

Общие методы

[00217] Манипуляции с ДНК проводили методами, стандартными в данной области. Эти методы часто могут быть модифицированы и/или заменены без существенного изменения результата. За исключением случаев, когда указаны другие ссылки, большинство этих процедур описаны в сборнике Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, второе издание, 1989.

Пример 1: Разработка кодон-оптимизированной последовательности, кодирующей белок CRY2Ai (SEQ ID NO: 1)

[00218] Последовательность ДНК, отличающуюся предпочтением кодонов, характерным для однодольных растений, проектировали и синтезировали для экспрессии белка Cry2Ai, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, в трансгенных растениях. Таблицу использования кодонов для однодольного растения составляли на основании кодирующих последовательностей, полученных из последовательности SEQ ID NO: 1 белка Cry2Ai (NCBI GenBank ACV97158.1). Последовательность ДНК оптимизировали с использованием алгоритма Монте-Карло (Villalobos A, Ness J E, Gustafsson C, Minshull J and Govindarajan S (2006) Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments; BMC Bioinformatics 67:285-293) в качестве основного критерия для выбора кодонов. Оптимизируя последовательность ДНК, рассматривали вероятности из таблицы использования кодонов. Редкие и реже встречающиеся кодоны заменяли наиболее распространенными кодонами. Средневзвешенный набор растительных кодонов рассчитывали после исключения любого избыточного кодона, используемого менее чем в 10% от общего количества кодонов для данной аминокислоты. Средневзвешенное представительство для каждого кодона рассчитывали по формуле:

[00219] Средневзвешенное % значение CI=1/(%C1 + %C2 + %C3+и так далее) x %C1×100, where CI представляет собой рассматриваемый кодон, и %C2, %C3, и так далее, представляют собой средние % значения использования остальных синонимичных кодонов.

[00220] Для выведения кодон-оптимизированной для однодольных растений последовательности ДНК, кодирующей белок Cry2Ai с SEQ ID NO: 1, выполняли замену кодонов в последовательности ДНК, кодирующей белок Cry2Ai, так, что полученная последовательность ДНК имела общий состав кодонов, оптимизированный в соответствии с таблицей предпочтительного использования кодонов в однодольных растениях. Проводили дополнительное уточнение последовательностей для удаления нежелательных сайтов узнавания ферментов рестрикции, потенциальных сайтов сплайсинга интронов в растении, длинной череды остатков A/T или C/G и других мотивов, которые могут препятствовать стабильности РНК, транскрипции или трансляции кодирующей области в растительных клетках. Ген оптимизировали in-silico с использованием программного обеспечения для проектирования генов с величиной отсечки 6,0 ккал/моль для формирования стабильной вторичной структуры мРНК. Выполняли другие изменения для включения нужных сайтов узнавания ферментов рестрикции и для удаления длинных внутренних открытых рамок считывания (рамки, кроме +1). Сайты узнавания ферментов рестрикции XbaI, NcoI и BamHI включали перед инициирующим кодоном ATG, и сайт узнавания фермента рестрикции SmaI включали перед стоп-кодоном для обеспечения возможности клонирования оптимизированного гена в прокариотический вектор для слияния C-концевых белковых меток. Сайты узнавания ферментов рестрикции EcoRI, HindIII и SacI включали после стоп-кодона. В оптимизированном гене использовали стоп-кодон TGA.

[00221] Все эти изменения были сделаны в рамках ограничений, связанных с сохранением примерного состава кодонов, предпочтительно используемых в однодольных растениях. Полная кодон-оптимизированная для однодольных растений последовательность, кодирующая белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1), приведена в SEQ ID NO: 2-7. In-silico трансляция кодон-оптимизированной для однодольных растений последовательности ДНК показала 100% идентичность с природным белком Cry2Ai (SEQ ID NO: 1). Кодон-оптимизированные для однодольных растений последовательности ДНК (SEQ ID NO: 2-7) были обозначены 201M1, 201M2, 201M3, 201M4, 201M5 и 201M6. Синтез фрагментов ДНК 201M1-M6 (SEQ ID NO: 2-7) был выполнен коммерческим поставщиком услуги (Genscript Inc., USA). Фрагмент ДНК 201M1 клонировали в вектор pUC57 способом, известным в данной области, и конструкция была названа pUC57-201M1. Аналогично, фрагменты ДНК 201M2, ДНК 201M3, ДНК 201M4, ДНК 201M5 и ДНК 201M6 клонировали в вектор pUC57, и конструкции были названы pUC57-201M2, pUC57-201M3, pUC57-201M4, pUC57-201M5 и pUC57-201M6, соответственно.

Пример 2: Конструирование экспрессионного вектора

[00222] Вектор pUC57-201M1 примера 1 расщепляли BamHI и HindIII, получая фрагмент ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2) (объем реакционной среды - 20 мкл, плазмидная ДНК - 8,0 мкл, 10X буфер - 2,0 мкл, фермент рестрикции BamHI - 0,5 мкл, фермент рестрикции HindIII - 0,5 мкл, дистиллированная вода - 9,0 мкл). Все реагенты смешивали, получая реакционную смесь, и инкубировали при 37°C в течение 30 мин, затем реакционную смесь анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле, и фрагмент ДНК 201M1 вырезали из агарозного геля чистым острым скальпелем при УФ освещении. Фрагмент ДНК элюировали из геля с использованием набора для элюирования из геля. Участок геля, содержащий фрагмент ДНК, переносили в 2-мл пробирку эппендорф и добавляли буфер DE-A в 3X объеме образца. Гель повторно суспендировали в буфере DE-A путем перемешивания на вихревой мешалке, и содержимое пробирки нагревали при 75°C до полного растворения геля, после чего добавляли 0,5X буфер DE-A и смешивали с DE-B. Пробирку эппендорф подготавливали, помещая в нее колонку, и смесь для связывания переносили в колонку. Пробирку эппендорф с колонкой центрифугировали короткое время. Колонку помещали в новую пробирку эппендорф и добавляли 500 мкл буфера для промывки W I (Qiagen Kit), с последующим центрифугированием. Супернатант отбрасывали, и добавляли 700 мкл буфера для промывки W 2 по стенкам колонки, чтобы смыть остатки буфера, после чего центрифугировали. Данный этап повторяли с 700-мкл аликвотой буфера W 2. Колонку переносили в новую пробирку эппендорф и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 1 мин для удаления остаточного буфера. Колонку вновь помещали в новую пробирку эппендорф и добавляли 40 мкл элюирующего буфера в центр мембраны. Колонку с элюирующим буфером оставляли на 1 минуту при комнатной температуре, и пробирки центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 мин. Элюированный фрагмент ДНК 201M1 хранили при -20°C до использования.

[00223] Полученный таким образом выделенный и очищенный фрагмент ДНК 201M1 лигировали в линеаризованный вектор pET32a. Лигирование проводили с использованием фермента T4 ДНК-лигазы (объем реакционной смеси - 30 мкл, 10X буфер для лигирования - 3,0 мкл, ДНК вектора - 5,0 мкл, ДНК вставки - 15,0 мкл, фермент T4 ДНК-лигаза - 1,0 мкл, дистиллированная вода - 6,0 мкл). Реагенты тщательно смешивали, и полученную реакционную смесь инкубировали при 16°C в течение 2 часов. Затем компетентные клетки штамма BL21 (DE3) E. coli трансформировали смесью для лигирования, содержащей вектор pET32a, несущий ДНК 201M1, путем добавления 10 мкл смеси для лигирования к 100 мкл компетентных клеток BL21 DE3. Полученную таким образом клеточную смесь помещали на лед на 30 мин, инкубировали на водяной бане при 42°C в течение 60 сек для теплового шока и вновь помещали на лед на 5-10 мин. Затем к смеси добавляли 1 мл бульона LB и дополнительно инкубировали при 37°C в течение 1 часа в шейкере-инкубаторе при 200 об/мин. Смесь клеток наносили на LB агар с 50 мкг/мл карбенициллина и инкубировали при 37°C в течение ночи. Положительные клоны идентифицировали с помощью анализа рестрикционного расщепления. Полученный таким образом экспрессионный вектор был обозначен pET32a-201M1.

[00224] Аналогичным образом конструировали экспрессионные векторы, несущие другие кодон-оптимизированные для однодольных растений последовательности ДНК с SEQ ID NO: 3-7, которые были обозначены pET32a-201M2, pET32a-201M3, pET32a-201M4, pET32a-201M5 и pET32a-201M6.

Пример 3: Экспрессия белка CRY2Ai, закодированного 201M1 (SEQ ID NO: 2)

[00225] Проводили экспрессию ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2), клонированную в pET32a, обозначенный pET32a-201M1, в E. coli BL 21 D3. Экспрессию индуцировали 1 мМ IPTG при плотности клеток OD нм примерно 0,5-1,0. После индукции клетки E. coli инкубировали в шейкере в течение 24-40 часов при 16°C для продуцирования белка. Белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1) был экспрессирован в клетке в растворимой форме (не секретирован). Затем культуру переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали, 10 мл клеток расщепляли лизоцимом и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин, и супернатант отбрасывали. Осадок суспендировали в стерильной дистиллированной воде и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Этот этап повторяли дважды, и осадок хранили при -20°C. Осадок, содержащий белки из индуцированных клеток рекомбинантного штамма, анализировали в 10% SDS-ПААГ.

[00226] Аналогично, последовательности ДНК, приведенные в SEQ ID NO: 3-7, были клонированы в pET32a и экспрессированы в E. coli BL 21 D3.

Пример 4: Конструирование вектора для трансформации растений, содержащего ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2), кодирующую белок CRY2Ai (SEQ ID NO: 1)

[00227] Вектор pUC57-201M1 с ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2) расщепляли ферментами рестрикции для высвобождения фрагмента ДНК 201M1 (объем реакционной среды - 20 мкл, ДНК плазмиды - 8,0 мкл, 10X буфер - 2,0 мкл, фермент рестрикции EcoRV - 0,5 мкл, дистиллированная вода - 9,5 мкл). Все реагенты смешивали, и смесь инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Продукт, полученный после рестрикционного расщепления, анализировали методом электрофореза в геле и дополнительно очищали.

[00228] Вектор, Ti-плазмиду pGreen0029, получали путем рестрикционного расщепления ферментом EcoRV (объем реакционной среды - 20 мкл, ДНК плазмиды - 8,0 мкл, 10X буфер - 2,0 мкл, фермент рестрикции EcoRV - 0,5мкл, дистиллированная вода - 9,5 мкл). Все реагенты смешивали, и смесь инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Продукт, полученный после рестрикционного расщепления, анализировали методом электрофореза в геле.

[00229] Очищенный фрагмент ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2) лигировали в линеаризованный вектор pGreen0029. Лигирование проводили с использованием фермента T4 ДНК-лигазы (объем реакционной смеси - 30 мкл, 10X буфер для лигирования - 3,0 мкл, ДНК вектора - 5,0 мкл, ДНК вставки - 15,0 мкл, фермент T4 ДНК-лигаза - 1,0 мкл, дистиллированная вода - 6,0 мкл). Реагенты тщательно смешивали, и полученную реакционную смесь инкубировали при 16°C в течение 2 часов. Затем компетентные клетки штамма BL21 (DE3) E. coli трансформировали смесью для лигирования, содержащей вектор pGreen0029, несущий ДНК 201M1 ДНК (SEQ ID NO: 2), путем добавления 10 мкл смеси для лигирования к 100 мкл компетентных клеток BL21 DE3. Полученную таким образом клеточную смесь помещали на лед на 30 мин, инкубировали на водяной бане при 42°C в течение 60 сек для теплового шока и вновь помещали на лед на 5-10 мин. Затем к смеси добавляли 1 мл бульона LB и дополнительно инкубировали при 37°C в течение 1 часа в шейкере-инкубаторе при 200 об/мин. Суспензию клеток (100 мкл) равномерно распределяли на LB агаровой среде, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина. Чашки инкубировали при 37°C в течение ночи. Положительные клоны идентифицировали с помощью анализа рестрикционного расщепления. Полученный таким образом рекомбинантный вектор был обозначен pGreen0029 CaMV35S-201M1.

[00230] Таким образом, рекомбинантная плазмида pGreen0029-CaMV35S-201M1 содержит оптимизированную для растений последовательность ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2) под транскрипционным контролем промотора 35SCaMV. Кроме того, pGreen0029-CaMV35S-201M1 содержит ген nptII, ген селективного маркера для растений, под транскрипционным контролем промотора NOS. Физическое расположение компонентов T-области pGreen0029-CaMV35S-201M1 является следующим:

[00231] RB>35SCaMV: 201M1 CDS: CaMV полиA>NOS промотор: nptII CDS: NOS поли A>LB

[00232] Аналогично, последовательности ДНК, приведенные в SEQ ID NO: 3-7, клонировали в Ti-плазмиду pGreen0029, и полученные таким образом рекомбинантные векторы были обозначены pGreen0029-CaMV35S-201M2, pGreen0029-CaMV35S-201M3, pGreen0029-CaMV35S-201M4, pGreen0029-CaMV35S-201M5 и pGreen0029-CaMV35S-201M6. Физическое расположение компонентов pGreen0029-CaMV35S с указанными последовательностями ДНК (SEQ ID NO: 3-7) в T-области является следующим:

[00233] RB>35SCaMV: 201M2 CDS: CaMV полиA>NOS промотор: nptII CDS: NOS Поли A>LB

[00234] RB>35SCaMV: 201M3 CDS: CaMV полиA>NOS промотор: nptII CDS: NOS Поли A>LB

[00235] RB>35SCaMV: 201M4 CDS: CaMV полиA>NOS промотор: nptII CDS: NOS Поли A>LB

[00236] RB>35SCaMV: 201M5 CDS: CaMV полиA>NOS промотор: nptII CDS: NOS Поли A>LB

[00237] RB>35SCaMV: 201M6 CDS: CaMV полиA>NOS промотор: nptII CDS: NOS Поли A>LB

[00238] Затем последовательности ДНК, приведенные в SEQ ID NO: 2-7, также клонировали в Ti-плазмиду pGreen0179, и полученные таким образом рекомбинантные векторы были обозначены pGreen0179-CaMV35S-201M1, pGreen0179-CaMV35S-201M2, pGreen0179-CaMV35S-201M3, pGreen0179-CaMV35S-201M4, pGreen0179-CaMV35S-201M5 и pGreen0179-CaMV35S-201M6. Таким образом, рекомбинантная плазмида pGreen0179-CaMV35S-201M1 содержит оптимизированную для растений последовательность ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2) под транскрипционным контролем промотора 35SCaMV. Кроме того, pGreen0029-CaMV35S-201M1 содержит ген hptII, ген селективного маркера для растений, под транскрипционным контролем промотора CaMV35S. Физическое расположение компонентов pGreen0179-CaMV35S с последовательностью ДНК в T-области является следующим:

[00239] RB>35SCaMV промотор: 201M1: CaMV полиA>35SCaMV промотор: hptII: CaMV ПолиA>LB

[00240] RB>35SCaMV промотор: 201M2: CaMV полиA>35SCaMV промотор: hptII: CaMV ПолиA>LB

[00241] RB>35SCaMV промотор: 201M3: CaMV полиA>35SCaMV промотор: hptII: CaMV ПолиA>LB

[00242] RB>35SCaMV промотор: 201M4: CaMV полиA>35SCaMV промотор: hptII: CaMV ПолиA>LB

[00243] RB>35SCaMV промотор: 201M5: CaMV полиA>35SCaMV промотор: hptII: CaMV ПолиA>LB

[00244] RB>35SCaMV промотор: 201M6: CaMV полиA>35SCaMV промотор: hptII: CaMV ПолиA>LB

[00245] Трансформация Agrobacterium tumefaciens рекомбинантным вектором pGreen0179-CaMV35S-201M1

[00246] Agrobacterium tumefaciens штамма LBA440 трансформировали рекомбинантной плазмидой pGreen0179-CaMV35S-201M1, несущей последовательность ДНК, приведенную в SEQ ID NO: 2. 200 нг ДНК плазмиды pGreen0179-CaMV35S-201M1 добавляли к 100-мкл аликвоте компетентных клеток A. tumefaciens штамма LBA440. Смесь инкубировали на льду в течение 30 мин и переносили в жидкий азот на 20 мин, с последующим размораживанием при комнатной температуре. Затем клетки Agrobacterium переносили в 1 мл бульона LB и инкубировали при 28°C в течение 24 часов в шейкере на водяной бане при 200 об/мин. Суспензию клеток равномерно распределяли на LB агаровой среде, содержащей 50 мкг/мл рифампицина, 30 мкг/мл канамицина и 5 мкг/мл тетрациклина. Чашки инкубировали при 28°C в течение ночи. Трансформированные клетки Agrobacterium анализировали путем экстрагирования плазмиды и проведения рестрикционного расщепления, положительные колонии A. tumefaciens отбирали и хранили для дальнейшего использования.

Пример 5 (A) Опосредованная Agrobacterium трансформация риса конструкцией pGreen0179-CaMV35S-201M1

[00247] Опосредованную Agrobacterium трансформацию риса проводили с использованием рекомбинантного вектора pGreen0179-CaMV35S-201M1, содержащего T-ДНК, как показано на Фиг. 1. Незрелые зародыши риса использовали в качестве эксплантатов для трансформации (Hiei, Y. and T. Komari, 2008, Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nat. Protocols., 3: 824-834), которую проводили на кафедре биотехнологии растений, Центра молекулярной биологии и биотехнологии растений, Сельскохозяйственного университета Тамил Наду, Коимбатор, Индия. Подробности экспериментов по трансформации риса описаны ниже.

[00248] Специалисты в области трансформации риса понимают, что доступны и другие способы трансформации риса и селекции трансформированных растений в случае использования других экспрессируемых в растениях генов селективных маркеров.

Растительный материал

[00249] В экспериментах по трансформации использовали местный элитный культивар риса ASD16 с кафедры изучения риса, Центра селекции и генетики растений, Сельскохозяйственного университета Тамил Наду (TNAU), Коимбатор, Индия. Доступ к растительному материалу был получен TNAU.

Подготовка эксплантатов незрелых зародышей риса для трансформации

[00250] Незрелые семена риса собирали через 12-14 дней после опыления в селекционной станции для риса, TNAU, для экспериментов по трансформации. Незрелые семена очищали от шелухи и обрабатывали 70% этанолом в течение одной минуты, с последующей обработкой 1,5% раствором гипохлорита натрия, содержащим каплю Tween-20, а затем промывали стерильной водой. Незрелые зародыши из семян вырезали асептически с использованием стерильного пинцета под микроскопом (ZEISS, Germany или Leica, Switzerland) и культивировали на чашке с 0,8% (масс/об) агаром. Для трансформации использовали незрелые зародыши размером от 1,3 мм до 1,8 мм.

Предварительная обработка незрелых зародышей

[00251] Незрелые зародыши инкубировали на водяной бане при 43°C в течение 30 минут, немедленно охлаждали на водяной бане в течение 1 минуты и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 10 минут при 25°C. Предварительно обработанные зародыши использовали в качестве эксплантатов в последующих экспериментах по трансформации.

Предварительная обработка и совместное культивирование эксплантатов с Agrobacterium tumefaciens

[00252] За три дня до совместного культивирования A. tumefaciens LBA4404, несущую плазмиду pGreen0179-CaMV35S-201M1, описанную в Примере 4, инокулировали в 5 мл бульона YEP, содержащего рифампицин (20 мг/л), канамицин (100 мг/л), стрептомицин (50 мг/л) и тетрациклин (5 мг/л), и инкубировали при 28°C в шейкере при 200 об/мин в течение 2-3 дней. Во время трансформации незрелых зародышей полную петлю культуры A. tumefaciens суспендировали в 1,0 мл среды AA для инфицирования (Таблица 1; pH 5,2) при плотности 1×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл с OD 1,0 при 660 нм.

Состав среды YEP:

Дрожжевой экстракт: 10,0 г

Пептон: 10,0 г

NaCl: 5,0 г

Дистиллированная вода: до 1000,0 мл

Агар: 18,0 г

pH: 6,8

[00253] Бульон YEP имеет тот же состав, но без агара.

[00254] Предварительно обработанные незрелые зародыши затем переносили в среду NB-As (Таблица 2) щитком вверх. Пять мкл суспензии культуры A. tumefaciens, описанной выше, наносили на каждый из незрелых зародышей и инкубировался при 25°C в течение 15. Затем зародыши переносили в чашку Петри со средой NB-As щитком вверх и инкубировали в темноте при 25°C в течение 7 дней.

Индукция каллуса и селекция

[00255] После 7 дней совместного культивирования из незрелых зародышей сформировался каллус. Полученный таким образом каллус переносили в среду CCMC (Таблица 3) и инкубировали при 31°C в течение 5 дней при непрерывном освещении (5000 лк). Через 5 дней каллус разрезали на 4 части (в зависимости от размера каллуса), переносили на среду CCMC и инкубировали при 31°C в течение 10 дней при непрерывном освещении (5000 лк). Далее каллусы переносили на селекционную среду CCMCH50, содержащую гигромицин (Таблица 4), инкубировали при 31°C в течение 10 дней при непрерывном освещении (5000 лк) с периодической селекцией на среде CCMCH50.

[00256] После двух раундов селекции на среде CCMCH50 каллусы, устойчивые к гигромицину, переносили на предрегенерационную среду NBPRCH40 (Таблица 5) и инкубировали при 31°C в течение 7 дней при непрерывном освещении (5000 лк).

[00257] Желтовато-белые хорошо пролиферированные каллусы переносили на регенерационную среду RNMH30 (Таблица 6) и инкубировали при 31°C в течение 14 дней при непрерывном освещении (5000 лк) для получения побегов. Полученные таким образом побеги переносили на среду для образования корней 1/2 MS (Murashige, T; Skoog, F, 1962, «A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures», Physiologia Plantarum. 15 (3): 473-497) с 30 мг/л гигромицина B и инкубировали при 31°C в течение 14 дней при непрерывном освещении (5000 лк) для дальнейшего развития. Затем хорошо выросшие регенерированные проростки риса переносили во флаконы для культивирования, содержащие среду для образования корней с 30 мг/л гигромицина B, растения риса с хорошо развитыми корнями переносили в почву и содержали в теплице. Таким образом было получено восемь T₀ предположительно трансгенных растений риса (Фиг. 2) из устойчивых к гигромицину каллусов с различным числом регенерированных растений на каждое событие.

Пример 5 (B) Молекулярный анализ предположительно трансгенных растений риса, трансформированных последовательностью ДНК 201M1 (SEQ ID NO: 2)

(i) Выделение геномной ДНК

[00258] Суммарную геномную ДНК экстрагировали из тканей листа предположительно трансгенных растений риса Примера 5 (A) и контрольных не трансгенных растений культивара ASD16. Листья собирали с предположительно трансгенных растений риса и не трансгенных растений риса, гомогенизировали с 300 мкл буфера для экстракции (1M Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl, 200 мМ ЭДТА и 10 процентов SDS) с использованием QIAGEN TissueLyser II (Retsch) и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносили в стерильную микроцентрифужную пробирку. К супернатанту добавляли смесь хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут. Водный слой переносили в микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляли равный объем ледяного изопропанола и выдерживали при -20°C в течение 20 минут. Затем супернатант отбрасывали, и к осадку добавляли 300 мкл этанола. После центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 минут супернатант отбрасывали, осадок ДНК сушили на воздухе в течение 15 минут, а затем растворяли в 40 мкл 0,1X буфера TE (Tris pH 8,0: 10,0 мМ и ЭДТА pH 8,0: 1,0 мМ). Качество и количество геномной ДНК оценивали с использованием спектрофотометра Nanodrop 1000^® (Thermo Scientific, USA) путем измерения OD при 260 нм. Также оценивали целостность ДНК методом электрофореза в 0,8-процентном агарозном геле.

ПЦР-анализ

[00259] Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на геномной ДНК (100 нг) предположительно трансгенных растений риса и не трансгенных контрольных растений риса для анализа синтетической ДНК cry2Ai-201M1 с использованием праймеров с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, и гена hptII с использованием праймеров с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13.

[00260] Условия ПЦР

94°C в течение 5 мин: 1 цикл

94°C в течение 45 сек

58°-62°C в течение 45 сек 30 циклов

72°C в течение 45 сек

72°C в течение 10 мин: 1 цикл

[00261] Все восемь предположительно трансгенных растений риса были положительными по ДНК cry2Ai-201M1, имеющей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и гену hptII.

(ii) Биохимический анализ предположительно трансгенных линий риса (T0) методом ELISA

[00262] Проводили сэндвич-анализ ELISA с использованием набора EnviroLogix Quantiplate (EnviroLogix Inc., USA) в соответствии с инструкциями производителя для количественной оценки белка Cry2Ai (SEQ ID NO: 1) в предположительно трансгенных ПЦР-положительных растениях риса. Положительный и отрицательный контроли, предоставленные в наборе, использовали в качестве эталона. Для данного эксперимента использовали второй лист от основного отростка предположительно трансгенного растения риса. Примерно 30 мг листовой ткани гомогенизировали в 500 мкл буфера для экстракции, центрифугировали при 6000 об/мин при 4°C в течение 7 минут, и супернатант использовали для анализа. Супернатант (100 мкл) наносили в лунки планшета, предварительно покрытые антителом против белка Cry2Ai. Планшет накрывали парафильмом и инкубировали при комнатной температуре (24±2°C) в течение 15 минут. Ферментный конъюгат (100 мкл) добавляли в каждую лунку. Через час лунки тщательно промывали 1X промывочным буфером. В каждую лунку добавляли субстрат (100 мкл) и инкубировали в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением остановочного раствора (0,1 Н соляная кислота). Оптическую плотность (O.D.) в планшете определяли при 450 нм с использованием отрицательного контроля в качестве холостой пробы. Каждый образец анализировали в двойном повторе, и каждую лунку считали повтором.

[00263] Строили график на основании значений оптической плотности калибровочных растворов в разных концентрациях, (предоставленных в наборе). Концентрацию белка Cry2Ai (SEQ ID NO: 1) определяли путем соотнесения его значения O.D. с соответствующим уровнем концентрации на графике. Концентрацию рассчитывали, как описано ниже.

[00264] Количество белка Cry2Ai (SEQ ID NO: 1), присутствующее в образцах, выражали в размерности микрограмм на грамм свежей листовой ткани. Все восемь ПЦР-положительных трансгенных растений риса (T0), подвергнутых скринингу с использованием набора для ELISA для количественного определения Cry2Ai, были положительными в отношении экспрессии белка Cry2Ai (SEQ ID NO: 1) в ткани молодых трансгенных листьев риса трансгенных растений риса. Установлено, что экспрессия белка Cry2Ai (SEQ ID NO: 1) в этих трансгенных растениях риса находится в диапазоне от 0,083 до 0,766 мкг/г свежей листовой ткани во время вегетативной стадии (Таблица A).

Таблица A: Экспрессия белка Cry2Ai (SEQ ID NO: 1) в T0 трансгенных растениях риса

Образец № Растения риса Концентрация белка Cry2Ai на вегетативной стадии
(мкг/г свежей листовой ткани)* 1 Контрольное растение - не трансгенное растение риса - ASD 16 0,0 2 OS-1 0,145 3 OS-2 0,107 4 OS-3 0,083 5 OS-4 0,143 6 OS-5 0,095 7 OS-6 0,135 8 OS-7 0,118 9 OS-8 0,766

*Среднее из двух реплик

(iii) Саузерн-гибридизация

[00265] Семь положительных по результатам ELISA растений риса (OS-1 - OS-7) были выбраны для саузерн-гибридизации. Геномную ДНК (5 мкг каждой) положительных по результатам ELISA T₀ трансгенных растений риса расщепляли ферментами рестрикции NcoI или XbaI, или BamHI и подвергали саузерн-блоттингу с использованием [α-³²P]-дЦТФ-меченого зонда для cry2Ai длиной 1077 п.н.

[00266] Геномную ДНК положительных по результатам ПЦР и ELISA трансгенных растений риса и не трансгенных растений риса расщепляли ферментом рестрикции NcoI при 37°C в течение 16 часов. ДНК плазмиды pGreen 0179-CaMV35S-201M1 использовали в качестве положительного контроля. Образцы расщепленной геномной ДНК и ДНК плазмиды подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле при 20 В в течение ночи в 1X буфере TAE, визуализировали после окрашивания бромидом этидия в приборе для УФ-просвечивания и документировали в системе документации гелей (SYNGENE).

[00267] Рестрикционно расщепленную и разделенную электрофорезом геномную ДНК денатурировали, погружая гели в два объема денатурирующего раствора на 30 минут при осторожном перемешивании. Гели нейтрализовали, погружая их в два объема нейтрализующего раствора на 30 минут при осторожном перемешивании. Гель быстро промывали в стерильной деионизированной воде, и ДНК переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Sigma) посредством восходящего капиллярного переноса в 20X буфере SSC в течение 16 ч, следуя стандартному протоколу. После полного переноса геномной ДНК нейлоновую мембрану быстро промывали в 2X буфере SSC и сушили на воздухе в течение 5 минут. ДНК сшивали, подвергая мембрану воздействию сшивающего УФ-излучения (UV Stratalinker^® 1800 Stratagene, CA, USA) при 1100 мкДж в течение 1 минуты. Сшитую мембрану запечатывали в пластиковые пакеты и хранили при 4°C до использования в саузерн-гибридизации.

Денатурирующий раствор:

NaCl: 1 M

NaOH: 0,5 Н

Нейтрализующий раствор:

NaCl: 1,5 M

Tris: 0,5 M

20X SSC:

NaCl: 3,0 M

Цитрат натрия: 0,3 M

pH: 7,0 при помощи конц. HCl

20x раствор SSC можно разбавлять следующим образом:

Конечная концентрация SSC 20x Раствор SSC Дистиллированная или деионизированная вода 3x SSC 30 мл 170 мл 2x SSC 20 мл 180 мл 1x SSC 10 мл 190 мл 0,5x SSC 5 мл 195 мл

Получение зонда

[00268] Примерно 100 нг фрагмента ДНК cry2Ai-201M1 длиной 1077 п.н., амплифицированного с бинарного вектора и очищенного с использованием мини-набора для экстракции из геля (Bio Basic Inc., Canada), радиоактивно меченого [α-³²P]-дЦТФ, использовали в качестве зонда для мечения. Четыре мкл ДНК-матрицы (ДНК cry2Ai-201M1) смешивали с 10 мкл случайного праймера (DecaLabel DNA Labeling Kit, Thermo Fisher Scientific Inc. USA) в микроцентрифужной пробирке. Объем доводили до 40 мкл стерильной дистиллированной водой, денатурировали путем нагревания в течение 5 минут на кипящей водяной бане и охлаждали на льду. К денатурированной ДНК добавляли 5 мкл смеси для мечения, содержащей дАТФ, дГТФ, дТТФ, 5 мкл [α-³²P]-дЦТФ (50 мкКи) и 1 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, и инкубировали при 37°C в течение 10 минут на водяной бане. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0,5 M ЭДТА, инкубировали на кипящей водяной бане в течение 4 минут и переносили на лед на 4-5 минут.

[00269] Предварительная гибридизация и гибридизация с зондом

[00270] Мембрану со сшитой ДНК, описанную выше, осторожно помещали во флакон для гибридизации, содержащий 30 мл буферного раствора для гибридизации. Флакон плотно закрывали и помещали в печь с температурой 65°C на 45 минут - 1 час для предварительной обработки перед гибридизацией.

[00271] Буфер для гибридизации сливали из флакона и заменяли на 30 мл раствора для гибридизации (поддерживаемого при 65°C), содержащего денатурированный меченый [α-³²P]-дЦТФ ДНК-зонд. Флакон с раствором для гибридизации плотно закрывали и помещали в печь с температурой 65°C на 16 ч.

Раствор для гибридизации:

Na₂HPO₄, pH 7,2: 0,5 M

SDS: 7% (масс/об)

ЭДТА, pH 7,2: 1 мМ

[00272] Буфер для гибридизации сливали из флакона. Добавляли промывающий раствор I, и флакон помещали в печь на медленно вращающуюся платформу при 65°C на 10 минут. Через 10 минут промывающий раствор I заменяли на 30 мл промывающего раствора II и инкубировали при 65°C в течение 5-10 мин при осторожном перемешивании. Затем промывающий раствор II сливали, и количество радиоактивности на мембране определяли с помощью счетчика Грегора-Мюллера. В зависимости от результатов определения во флакон добавляли 30 мл промывающего раствора III и инкубировали при 65°C в течение 30 секунд - 1 минуты при осторожном перемешивании. Затем промывающий раствор III удаляли, мембрану сушили на фильтровальной бумаге Whatman №1 в течение 5-10 минут при комнатной температуре и проводили облучение рентгеновской пленки (Kodak XAR) в темной комнате с усиливающим сигнал экраном (Hyper cassette^® от компании Amersham, USA) в течение 2 дней при -80°C.

[00273] После 2 дней облучения рентгеновскую пленку снимали в темной комнате и погружали в раствор проявителя на 1 минуту, с последующим погружением в воду на 1 минуту. В заключение рентгеновскую пленку погружали в раствор фиксатора на 2 минуты, затем промывали в воде в течение 1-2 минут и высушивали на воздухе.

Промывающий раствор

Промывающий раствор I: 3X SSC+0,1% SDS

Промывающий раствор II: 0,5X SSC+0,1% SDS

Промывающий раствор III: 0,1X SSC+0,1% SDS

Раствор проявителя:

[00274] 13,2 г содержимого пакета A растворяли в 800 мл дистиллированной воды, после полного растворения добавляли 89 г компонента из пакета B и растворяли при медленном перемешивании. После полного растворения объем доводили до 1000 мл и хранили в бутылке из темного стекла.

Раствор фиксатора:

[00275] 268 г фиксатора растворяли в 800 мл дистиллированной воды при медленном перемешивании, после полного растворения объем доводили до 1000 мл, фильтровали через фильтровальную бумагу и хранили в бутылке из темного стекла.

[00276] В случае всех семи положительных по результатам ELISA трансгенных объектов риса были обнаружены сигналы гибридизации разных размеров, свидетельствующие об интеграции трансгена в геном риса. У трансгенного растения риса OS-6 имела место интеграция гена cry2Ai в один локус. Сигнал гибридизации также наблюдали в положительном контроле, при этом в случае не трансгенного контрольного растения риса (ASD16) сигнал гибридизации отсутствовал.

(iv) Получение следующего поколения трансгенного по cry2Ai риса (T2) линии OS 6

[00277] Тридцать T1 семян трансгенного растения риса OS 6 высевали в лотки. Двадцать три семени проросли, и 15-дневные проростки были пересажены в горшки и размещены в теплице. Методом количественного анализа ELISA было установлено, что двадцать из 23 T1 потомков трансгенного растения риса OS 6 экспрессируют ген cry2Ai. Концентрация белка Cry2A (SEQ ID NO: 1), экспрессируемого в T1 растениях трансгенного риса OS 6, находилась в диапазоне 0,192-0,588 мкг/г через 55 ДПП и 0,082-0,387 мкг/г свежей листовой ткани через 84 ДПП. Анализ методом саузерн-гибридизации шести T1 растений трансгенного риса OS 6 с использованием фермента NcoI показал интеграцию cry2AiM1 (SEQ ID NO: 2) в один локус аналогично таковому в T0 трансгенном растении риса.

[00278] Пятьдесят (50) семян трансгенного T1 растения риса, а именно OS 6-8 и OS 6-20, высевали для получения T2 трансгенных растений риса. Всего был проведен скрининг 83 T2 растений, 46 из OS 6-8 и 37 из OS 6-20, на присутствие ДНК cry2AiM1 (SEQ ID NO: 2) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Результаты ПЦР показали присутствие указанной ДНК во всех 83 трансгенных T2 растениях риса. Результаты количественного анализа ELISA репрезентативных десяти T2 растений показали концентрацию белка Cry2Ai (SEQ ID NO: 2) от 0,433 до 0,857 мкг/г свежей листовой ткани через 77 дней после посева (ДПП) (Таблица B).

Таблица B: Экспрессия белка Cry2Ai и инсектицидная активность в T2 растениях риса

Образец № T2 растение Концентрация белка Cry2Ai, мкг/г
(77 ДПП, 77-дневные растения) Смертность, в процентах, личинок походных червей рисовых (86 ДПП) 1 OS 6-8-13 0,433 100 2 OS 6-8-25 0,625 100 3 OS 6-8-28 0,746 100 4 OS 6-8-31 0,665 90 5 OS 6-8-35 0,471 100 6 OS 6-20-3 0,741 100 7 OS 6-20-7 0,594 100 8 OS 6-20-8 0,649 100 9 OS 6-20-9 0,857 100 10 OS 6-20-10 0,539 95 11 Контрольное растение - Не трансгенное растение риса - ASD 16 Экспрессия отсутствует 0

Пример 5 (C) Биоанализ с насекомыми

Биоанализ с отделенными фрагментами стебля на активность против стеблевого точильщика рисового

[00279] Яичную массу стеблевого точильщика рисового (Scirpophaga incertulas) собирали непосредственно с рисового поля (селекционная станция Paddy, TNAU) и инкубировали в лаборатории в условиях 25±1°C и 60 процентов относительной влажности для выведения из яиц. Альтернативно, взрослых бабочек стеблевого точильщика рисового собирали с поля и выпускали в клетках для насекомых, содержащих 30-дневные проростки риса уязвимого сорта TN1, для откладывания яиц. Затем яйца, отложенные на листья, собирали из клеток и инкубировали в лаборатории, держа листья с яйцами в микропробирке в условиях 25±1°C и 60 процентов относительной влажности для выведения из яиц. Вылупившиеся из яичной массы личинки использовали для биоанализа с насекомыми.

[00280] Стебель положительных по результатам ELISA трансгенных растений риса разрезали на шесть частей (длиной примерно 5 см), каждый из псевдо-стеблевых фрагментов помещали на влажную фильтровальную бумагу в отдельной пластиковой чашке Петри, и пять недавно вылупившихся личинок стеблевого точильщика рисового помещали на каждый псевдо-стебель (Chakraborty et al., 2016). В качестве контроля использовали псевдо-стебли не трансгенного риса ASD16. Чашки Петри накрывали тонкой пленкой для предотвращения выползания личинок из чашек и поддерживали в условиях 25±1°C и 60 процентов относительной влажности. Через 6 дней фрагменты псевдо-стеблей осторожно вскрывали, используя тонкое лезвие, и оценивали смертность личинок в трансгенных, а также контрольных растениях. Биоанализ с отделенными фрагментами стебля и использованием недавно вылупившихся личинок стеблевого точильщика рисового на T2 растениях риса продемонстрировал смертность личинок в диапазоне 80-85 процентов. В контрольных растениях личинки не погибли. За шесть дней выжившие личинки в контроле уничтожили большую часть внутренних тканей стебля и пробурили отверстия во фрагментах стебля, оставив большое количество экскрементов насекомых (Фиг. 5).

[00281] Биоанализ активности против походных червей рисовых

Яичную массу походных червей рисовых (Spodoptera mauritia) собирали непосредственно с рисового поля (селекционная станция Paddy, TNAU) и инкубировали в лаборатории в условиях 25±1°C и 60 процентов относительной влажности для выведения из яиц. Вылупившиеся из яичной массы личинки использовали для биоанализа с насекомыми.

Проводили биоанализ активности против походных червей рисовых с использованием фрагментов листьев положительных по результатам ELISA трансгенных растений риса и соответствующих контрольных растений.

Биоанализ с отделенными фрагментами листьев и использованием недавно вылупившихся личинок походных червей рисовых продемонстрировал гибель личинок в T2 растениях риса. В контрольных растениях личинки не погибли, и большая часть листовой ткани была уничтожена выжившими личинками за шесть дней (Фиг. 6).

Биоанализ с использованием недавно вылупившихся личинок походных червей (Spodoptera mauritia) продемонстрировал 100-процентную смертность в восьми из десяти протестированных T2 растений, и в остальных двух растениях смертность составляла 90 и 95 процентов (Таблица B).

Пример 6(A): Опосредуемая Agrobacterium трансформация томата

[00282] Опосредуемую Agrobacterium трансформацию томата проводили с использованием рекомбинантного вектора pGreen0029-CaMV35S-201M1, содержащего конструкцию T-ДНК, представленную на Фиг. 3. Семядольные эксплантаты томата использовали в качестве эксплантатов для трансформации.

[00283] Опосредуемую Agrobacterium трансформацию томата проводили на кафедре биотехнологии растений, Центра молекулярной биологии и биотехнологии растений, Сельскохозяйственного университета Тамил Наду, Коимбатор, Индия. Подробности экспериментов по трансформации томата описаны ниже.

[00284] Специалисты в области трансформации томата понимают, что доступны и другие способы трансформации томата и селекции трансформированных растений в случае использования других экспрессируемых в растениях генов селективных маркеров.

Источник растений

[00285] Семена томата культивара PKM1 были получены из Колледжа и научно-исследовательского института садоводства, Коимбатор, Индия представителями Сельскохозяйственного университета Тамил Наду (TNAU), PN Pudur, Coimbatore, Tamil Nadu-641003, India. Доступ к семенам томата был получен на кафедре биотехнологии растений, Центра молекулярной биологии и биотехнологии растений, TNAU.

In vitro проращивание семян и предварительное культивирование

[00286] Семена томата культивара PKM1 промывали 3 раза стерильной дистиллированной водой, обрабатывали 70% этанолом в течение 5 минут и 4% раствором гипохлорита натрия, содержащим Tween 20, в течение 5-7 минут. Затем семена промывали стерильной дистиллированной водой и высушивали на воздухе на стерильной бумаге. Стерилизованные семена проращивали в течение 8-10 дней на среде MS половинной концентрации (как описано выше) в темноте, с последующим циклом 16-часового фотопериода с использованием флуоресцентных ламп холодного белого света (интенсивность 110-130 наномоль/м²/с) и 8 часов темноты при 25°C в камере для выращивания растений.

[00287] Семядольные эксплантаты из выращенных in vitro 8-10-дневных проростков вырезали и культивировали на среде для предварительного культивирования, представляющей собой модифицированную среду MS, содержащую зеатин (1,0 мг/л), в течение двух дней перед совместным культивированием.

Состав модифицированной среды MS/л

Порошок модифицированной среды MS (PT025-Himedia, Mumbai): 4,2 г

Сахароза: 30,0 г

Агар: 8,0 г

Дистиллированная вода: 1000 мл

pH: 5,8

Совместное культивирование, селекция и регенерация растений

[00288] Через два дня эксплантаты из среды для предварительного культивирования инфицировали суспензионной культурой A. tumefaciens LBA4404, несущей плазмиду pGreen0029-CaMV35S-201M1, в течение 10-12 минут. Избыток суспензионной культуры удаляли промоканием стерильной фильтровальной бумагой, и эксплантаты переносили в среду для совместного культивирования, представляющую собой модифицированную среду MS+зеатин (1,0 мг/л) + ацетосирингон (100 мкМ). После 48 часов совместного культивирования в темноте при 26°C эксплантаты промывали стерильной дистиллированной водой и водным раствором, содержащим 250 мг/л цефотаксима, а затем 2 раза стерильной дистиллированной водой. Совместно культивированные эксплантаты сушили на стерильной фильтровальной бумаге и культивировали на селекционной среде, представляющей собой модифицированную среду MS+зеатин (1,0 мг/л) + канамицин (50 мг/л) + цефотаксим (250 мг/л). Эксплантаты субкультивировали на той же среде три раза с интервалом 15-20 дней. Полученные хорошо развитые побеги переносили в среду для развития корней, содержащую в половинной концентрации 1,0 MS+IBA (1 мг/л) + канамицин (30 мг/л) (Фиг. 4).

[00289] После обильного развития корней (15-20 дней) проростки осторожно извлекали из флаконов для культивирования и закаливали в маленьких бумажных стаканчиках с закаливающей смесью (красная земля: чернозем: вермикомпост в соотношении 1:1:1), выдерживали при 25±2°C в течение 7-8 дней, а затем переносили в теплицу.

Пример 6(B): Молекулярные и биохимические анализы предположительно трансгенных растений томата

[00290] Проводили скрининг предположительно трансгенных растений томата на присутствие фрагмента ДНК cry2Ai 201M1 (SEQ ID NO: 2) путем ПЦР-анализа, и экспрессию белка анализировали методом ELISA.

Выделение геномной ДНК томата и ПЦР-анализ

[00291] Геномную ДНК экстрагировали из листьев предположительно трансгенных растений томата и не трансформированных растений томата (в качестве отрицательного контроля). Для выделения ДНК использовали способ, описанный выше.

[00292] Проводили ПЦР, как описано выше, с выделенной геномной ДНК для подтверждения присутствия фрагмента ДНК cry2Ai (201M1), используя праймеры с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9. В двадцати трех из 29 предположительно трансгенных растений томата (T0) было подтверждено присутствие фрагмента ДНК cry2Ai (201M1).

[00293] ПЦР-анализ проводили, используя праймеры с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, для амплификации гена nptII (гена селективного маркера устойчивости к канамицину) с целью проверки присутствия гена nptII в вероятных трансформантах томата (T0). Анализ показал амплификацию гена nptII.

Скрининг T0 трансгенных растений томата в количественном анализе ELISA и анализе по Саузерну

[00294] Семнадцать из двадцати трех ПЦР-положительных растений томата являлись положительными в анализе ELISA (с использованием набора Envirologix Cry2A), и концентрация белка Cry2A находилась в диапазоне 0,006-0,159 мкг/г свежей листовой ткани во время вегетативной стадии.

[00295] Саузерн-гибридизацию проводили для пяти положительных по результатам ELISA объектов томата с использованием ДНК, расщепленной ферментом XbaI. Результаты саузерн-гибридизации продемонстрировали интеграцию трансгена в один-два локуса в T0 растениях, и в объекте SL-34 интеграция гена cry2Ai имела место в один локус.

Получение следующего поколения трансгенного по cry2Ai объекта SL-34 томата

[00296] Все 18 семян одного плода от объекта SL-34 томата помещали для проращивания на среду MS в половинной концентрации. Двенадцатидневные проростки переносили для закаливания. Из 16 проростков, 12 T1 потомков были помещены в теплицу и подвергнуты скринингу методом ПЦР. Одиннадцать из двенадцати T1 потомков были положительными по результатам ПЦР, и все 11 потомков, как установлено методом ELISA, экспрессировали ген cry2Ai. Концентрация белка Cry2Ai, экспрессируемого в одиннадцати T1 растениях, находилась в диапазоне от 0,320 до 0,695 мкг/г свежей листовой ткани через 82 ДПП (Таблица C). Саузерн-гибридизация пяти T1 растений показала интеграцию гена cry2Ai в один локус аналогично таковому в T0 трансгенном растении.

Таблица C. Экспрессия белка Cry2Ai и инсектицидная активность в T1 потомках объекта SL-34 томата

Образец № T1 растение томата ПЦР Концентрация белка Cry2Ai (мкг/г) через 82 ДПП Смертность Helicoverpa armigera (%) через 83 ДПП 1 SL-34-1 Отрицательный 0,000 0 2 SL-34-2 Положительный 0,442±0,001 100 3 SL-34-3 Положительный 0,474±0,000 100 4 SL-34-4 Положительный 0,695±0,004 100 5 SL-34-6 Положительный 0,649±0,008 100 6 SL-34-7 Положительный 0,382±0,008 100 7 SL-34-8 Положительный 0,358±0,008 100 8 SL-34-9 Положительный 0,370±0,012 100 9 SL-34-10 Положительный 0,591±0,000 100 10 SL-34-11 Положительный 0,566±0,008 100 11 SL-34-12 Положительный 0,320±0,004 100 12 SL-34-13 Положительный 0,524±0,000 100 13 Контрольное растение - не трансгенное растение томата Отрицательный 0,000 0

[00297] Из всех 19 семян одного плода T1 растения SL-34-11, 14 T2 потомков были выращены в теплице. Все четырнадцать T2 потомков, как установлено, экспрессировали ген cry2Ai, количество белка было определено методом ELISA. Концентрация белка Cry2Ai, экспрессируемого в T2 трансгенных растениях, находилась в диапазоне 0,540-0,783 мкг/г через 80 ДПП и 0,287-0,547 мкг/г свежей листовой ткани через 104 ДПП.

[00298] Из всех 33 семян одного плода T2 растения SL-34-11-1 26 растений были выращены в теплице. Из всех 42 семян другого плода того же растения (SL-34-11-1) 37 проростков были выращены в теплице. Всего 63 T3 потомка были выращены из всех 75 семян двух плодов одного и того же T2 растения. Все 63 T3 растения были положительными при скрининге методом ПЦР и количественным методом ELISA. Это предполагало гомозиготный характер T2 растения SL-34-11-1. Концентрацию белка Cry2Ai оценивали количественным методом ELISA в 37 из T3 трансгенных растений, и она находилась в диапазоне 0,329-0,881 мкг/г свежей листовой ткани через 42 ДПП. Концентрация белка Cry2A в неспелых и спелых плодах четырех T3 потомков в течение 119-128 ДПП составляла примерно 0,118-0,330 мкг/г свежей плодовой ткани.

Пример 7: Биоанализ с насекомыми

Биоанализ с насекомыми активности трансгенных по cry2Ai растений томата против H. armigera

[00299] Трансформанты томата, для которых было подтверждено присутствие белка Cry2Ai методом ELISA, подвергали биоанализу для оценки их устойчивости к H. armigera. Проводили биоанализ с листовыми дисками для определения степени устойчивости к насекомым трансгенных по cry2A растений томата в лабораторных условиях. Второй лист сверху от трансгенных растений и контрольных (не трансформированных) растений томата отрезали на репродуктивной стадии и использовали для биоанализа с листовыми дисками. Листовой диск помещали в стерильную чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой. Одну недавно вылупившуюся личинку H. armigera помещали на каждый фрагмент листа, помещенного на фильтровальную бумагу, с использованием тонкой щетки из верблюжьего волоса. После помещения насекомого чашки оборачивали клинфильмом и помещали в темное место. Каждый вариант обработки выполняли в двух репликах, с десятью чашками на каждую реплику. В эксперименте поддерживали условия 26-28°C и 60 процентов относительной влажности. Смертность личинок и повреждение листовой площади регистрировали через 48 часов с 24-часовым интервалом в течение шести дней.

[00300] Результаты биоанализа показали 100-процентную смертность H. armigera в случае пяти из 12 положительных по результатам ELISA T0 растений. Анализ с насекомыми, с использованием недавно вылупившихся личинок H. armigera на листовых дисках T1, T2 и T3 потомков трансгенного по cry2Ai объекта SL-34 томата, также продемонстрировал 100-процентную смертность в случае всех протестированных трансгенных растений (Фиг. 7). На листовых дисках контрольных растений личинки не погибли.

[00301] Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров для ясности понимания, очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть применены на практике в рамках объема настоящего изобретения.

Таблица 1. Среда для инфицирования AA (Hiei and Komari, 2008) Химические регенты Конечная конц./литр Сток/1000 мл Количество/литр 20X основные соли AA KCl 29,50 г 59,0 г 50 мл CaCl₂-2H₂O 0,15 г 3,00 г MgSO₄-7H₂O 0,50 г 10,0 г NaH₂PO₄-H₂O 0,15 г 3,00 г 100X Fe ЭДТА FeSO₄-7H₂O 27,80 мг 2,78 г 10 мл ЭДТА, динатриевая соль 37,30 мг 3,73 г 10X соли микроэлементов B5 MnSO₄-4H₂O 13,20 мг 1,320 г 10 мл ZnSO₄-7H₂O 2,00 мг 0,200 г CuSO₄-5H₂O 25,00 мг 2,500 г Na₂MoO₄-2H₂O 0,25 мг 0,025 г CoCl₂-6H₂O 25,00 мг 2,500 г H₃BO₃ 3,00 мг 0,300 г KI 0,75 мг 0,075 г 100X витамины B5 Мио-инозитол 100,0 мг 10,000 г 10 мл Тиамина гидрохлорид 10,0 мг 1,000 г Пиридоксина гидрохлорид 1,0 мг 0,100 г Никотиновая кислота 1,0 мг 0,100 г 10X аминокислоты AA (pH-5,8) Gln 0,876 г 8,760 г 100 мл Asp 0,266 г 2,660 г Arg 0,174 г 1,740 г Gly 7,500 мг 0,075 г 100 мМ Ацетосирингон 0,392 мг 0,392 г 1 мл Сахароза 20,0 г - - Глюкоза 10,0 г - - Казминокислоты, витаминный анализ 0,5 г - -

pH до 5,2 и стерилизовать фильтрованием через 0,22-мм фильтр из ацетата целлюлозы

Таблица 2. Среда NB-As (Hiei and Komari, 2008) Химические регенты Конечная конц./литр Сток/1000 мл Количество/литр 10X основные соли N6 KNO₃ 2,830 г 28,30 г 100 мл CaCl₂-2H₂O 0,166 г 1,66 г MgSO₄-7H₂O 0,185 г 1,85 г KH₂PO₄ 0,400 г 4,00 г 100X Fe ЭДТА FeSO₄-7H₂O 27,80 мг 2,78 г 10 мл ЭДТА, динатриевая соль 37,30 мг 3,73 г 100X соли микроэлементов B5 MnSO₄-4H₂O 13,20 мг 1,320 г 10 мл ZnSO₄-7H₂O 2,00 мг 0,200 г CuSO₄-5H₂O 25,00 мг 2,500 г Na₂MoO₄-2H₂O 0,25 мг 0,025 г CoCl₂-6H₂O 25,00 мг 2,500 г H₃BO₃ 3,00 мг 0,300 г KI 0,75 мг 0,075 г 100X витамины B5 Мио-инозитол 100,0 мг 10,000 г 10 мл Тиамина гидрохлорид 10,0 мг 1,000 г Пиридоксина гидрохлорид 1,0 мг 0,100 г Никотиновая кислота 1,0 мг 0,100 г 2,4-D 2,000 мг 0,100 г 20 мл NAA 1,000 мг 0,100 г 10 мл 6BA 1,000 мг 0,100 г 10 мл Сахароза 20,000 г - - Глюкоза 10,000 г - - Пролин 0,500 г - - Казминокислоты, витаминный анализ 0,500 г - - Агароза типа I 8,000 г - - 100 мМ Ацетосирингон 0,392 мг 0,392 г 1 мл

[00302] Готовят отдельно 10X раствор основных солей N6, 100X раствор Fe ЭДТА, 100X раствор солей микроэлементов B5, 100X раствор витаминов, 100 мг л^-1 раствор 2,4-D, 100 мг л^-1 раствор NAA, 100 мг л^-1 раствор 6BA, и смешивают необходимое количество или вышеуказанный сток-раствор с сахарозой, глюкозой, пролином и казаминокислотами для витаминного анализа. Добавляют необходимое количество агарозы после доведения pH до 5,2 и стерилизуют. После стерилизации добавляют необходимое количество ацетосирингона из сток-раствора в стерильных условиях.

Таблица 3. Среда CCMC Химические регенты Конечная конц./литр Сток/1000 мл Количество/литр 10X основные соли CC KNO₃ 1,212 г 12,12 г 100 мл NH₄NO₃ 0,640 г 6,40 г CaCl₂-2H₂O 0,588 г 5,88 г MgSO₄-7H₂O 0,247 г 2,47 г KH₂PO₄ 0,136 г 1,36 г 100X Fe ЭДТА FeSO₄-7H₂O 27,80 мг 2,78 г 10 мл ЭДТА, динатриевая соль 37,30 мг 3,73 г 100X соли микроэлементов CC MnSO₄-4H₂O 11,150 мг 1,115 г 10 мл ZnSO₄-7H₂O 5,760 мг 0,576 г CuSO₄-5H₂O 0,025 мг 2,500 мг Na₂MoO₄-2H₂O 0,240 мкг 0,024 мг CoSO₄-7H₂O 0,028 мг 2,800 мг H₃BO₃ 3,100 мг 0,310 г KI 0,830 мг 0,083 г 100X витамины CC Мио-инозитол 90,00 мг 9,000 г 10 мл Тиамина гидрохлорид 8,50 мг 0,850 г Пиридоксина гидрохлорид 1,00 мг 0,100 г Никотиновая кислота 6,00 мг 0,600 г Глицин 2,00 мг 0,200 г 2,4-D 2,000 мг 0,100 г 20 мл NAA 1,00 мг 0,100 г 10 мл 6BA 0,200 мг 0,100 г 2 мл Мальтоза 20,000 г - - Маннит 36,000 г - - Пролин 0,500 г - - Казминокислоты, витаминный анализ 0,500 г - - Гельрит 5,000 г - - Цефотаксим 0,250 г 250 г 1,0 мл

[00303] Готовят отдельно 10X раствор основных солей CC, 100X раствор Fe ЭДТА, 100X раствор солей микроэлементов CC, 100X раствор витаминов CC, 100 мг л^-1 раствор 2,4-D, 100 мг л^-1 раствор NAA, 100 мг л^-1 раствор 6BA, 250 г л^-1 раствор цефотаксима, и смешивают необходимое количество или вышеуказанный сток-раствор с мальтозой, маннитом, пролином и казаминокислотами для витаминного анализа. Добавляют необходимое количество гельрита после доведения pH до 5,8 и стерилизуют. После стерилизации добавляют необходимое количество цефотаксима из сток-раствора в стерильных условиях.

Таблица 4. Среда CCMCH50 (Hiei and Komari, 2008) Химические регенты Конечная конц./литр Сток/1000 мл Количество/литр 10X основные соли CC KNO₃ 1,212 г 12,12 г 100 мл NH₄NO₃ 0,640 г 6,40 г CaCl₂-2H₂O 0,588 г 5,88 г MgSO₄-7H₂O 0,247 г 2,47 г KH₂PO₄ 0,136 г 1,36 г 100X Fe ЭДТА FeSO₄-7H₂O 27,80 мг 2,78 г 10 мл ЭДТА, динатриевая соль 37,30 мг 3,73 г 100X соли микроэлементов CC MnSO₄-4H₂O 11,150 мг 1,115 г 10 мл ZnSO₄-7H₂O 5,760 мг 0,576 г CuSO₄-5H₂O 0,025 мг 2,500 мг Na₂MoO₄-2H₂O 0,240 мкг 0,024 мг CoSO₄-7H₂O 0,028 мг 2,800 мг H₃BO₃ 3,100 мг 0,310 г KI 0,830 мг 0,083 г 100X витамины Мио-инозитол 90,00 мг 9,000 г 10 мл Тиамина гидрохлорид 8,50 мг 0,850 г Пиридоксина гидрохлорид 1,00 мг 0,100 г Никотиновая кислота 6,00 мг 0,600 г Глицин 2,00 мг 0,200 г 2,4-D 2,000 мг 0,100 г 20 мл NAA 1,00 мг 0,100 г 10 мл 6BA 0,200 мг 0,100 г 2 мл Мальтоза 20,00 г - - Маннит 36,000 г - - Пролин 0,500 г - - Казминокислоты, витаминный анализ 0,500 г - - Агароза 8,000 г - - Цефотаксим 0,250 г 250 г 1,0 мл Гигромицин B 0,050 г 50 г 1,0 мл

[00304] Готовят отдельно 10X раствор основных солей CC, 100X раствор Fe ЭДТА, 100X раствор солей микроэлементов CC, 100X раствор витаминов CC, 100 мг л^-1 раствор 2,4-D, 100 мг л^-1 раствор NAA, 100 мг л^-1 раствор 6BA, 50 г л^-1 раствор гигромицина B, и смешивают необходимое количество или вышеуказанный сток-раствор с мальтозой, маннитом, пролином и казаминокислотами для витаминного анализа. Добавляют необходимое количество агарозы после доведения pH до 5,8 и стерилизуют. После стерилизации добавляют необходимое количество 50 г л^-1 раствора гигромицина B из сток-раствора.

Таблица 5. Среда NBPRCH40 (Hiei and Komari, 2008) Химические регенты Конечная конц./литр Сток/1000 мл Количество/литр 10X основные соли N6 KNO₃ 2,830 г 28,30 г 100 мл CaCl₂-2H₂O 0,166 г 1,66 г MgSO₄-7H₂O 0,185 г 1,85 г KH₂PO₄ 0,400 г 4,00 г 100X Fe ЭДТА FeSO₄-7H₂O 27,80 мг 2,78 г 10 мл ЭДТА, динатриевая соль 37,30 мг 3,73 г 100X соли микроэлементов B5 MnSO₄-4H₂O 13,20 мг 1,320 г 10 мл ZnSO₄-7H₂O 2,00 мг 0,200 г CuSO₄-5H₂O 25,00 мг 2,500 г Na₂MoO₄-2H₂O 0,25 мг 0,025 г CoCl₂-6H₂O 25,00 мг 2,500 г H₃BO₃ 3,00 мг 0,300 г KI 0,75 мг 0,075 г 100X витамины B5 Мио-инозитол 100,0 мг 10,000 г 10 мл Тиамина гидрохлорид 10,0 мг 1,000 г Пиридоксина гидрохлорид 1,0 мг 0,100 г Никотиновая кислота 1,0 мг 0,100 г 2,4-D 2,000 мг 0,100 г 20 мл NAA 1,000 мг 0,100 г 10 мл 6BA 1,000 мг 0,100 г 10 мл Мальтоза 30,000 г - - Пролин 0,500 г - - Казминокислоты, витаминный анализ 0,500 г - - Агароза типа I 8,000 г - - Глутамин 0,300 г 30,00 г 10 мл Цефотаксим 0,250 г 250,0 г 1,0 мл Гигромицин B 0,040 г 50,00 г 0,8 мл

[00305] Готовят отдельно 10X раствор основных солей N6, 100X раствор Fe ЭДТА, 100X раствор солей микроэлементов B5, 100X раствор витаминов, 100 мг л^-1 раствор 2,4-D, 100 мг л^-1 раствор NAA, 100 мг л^-1 раствор 6BA, 30 г л^-1 раствор глутамина, 250 г л^-1 раствор цефотаксима, 50 г л^-1 раствор гигромицина B, и смешивают необходимое количество или вышеуказанный сток-раствор с мальтозой, пролином и казаминокислотами для витаминного анализа. Добавляют необходимое количество агарозы после доведения pH до 5,8 и стерилизуют. После стерилизации добавляют необходимое количество глутамина, цефотаксима и гигромицина B из сток-раствора в стерильных условиях.

Таблица 6. Среда RNMH30 (Hiei and Komari, 2008) Химические регенты Конечная конц./литр Сток/1000 мл Количество/литр 10X основные соли N6 KNO₃ 2,830 г 28,30 г 100 мл CaCl₂-2H₂O 0,166 г 1,66 г MgSO₄-7H₂O 0,185 г 1,85 г KH₂PO₄ 0,400 г 4,00 г 100X Fe ЭДТА FeSO₄-7H₂O 27,80 мг 2,78 г 10 мл ЭДТА, динатриевая соль 37,30 мг 3,73 г 100X соли микроэлементов B5 MnSO₄-4H₂O 13,20 мг 1,320 г 10 мл ZnSO₄-7H₂O 2,00 мг 0,200 г CuSO₄-5H₂O 25,00 мг 2,500 г Na₂MoO₄-2H₂O 0,25 мг 0,025 г CoCl₂-6H₂O 25,00 мг 2,500 г H₃BO₃ 3,00 мг 0,300 г KI 0,75 мг 0,075 г 100X витамины B5 Мио-инозитол 100,0 мг 10,000 г 10 мл Тиамина гидрохлорид 10,0 мг 1,000 г Пиридоксина гидрохлорид 1,0 мг 0,100 г Никотиновая кислота 1,0 мг 0,100 г NAA 1,000 мг 0,100 г 10 мл 6BA 1,000 мг 0,100 г 10 мл Мальтоза 30,000 г - - Пролин 0,500 г - - Казминокислоты, витаминный анализ 0,500 г - - Агароза типа I 7,500 г - - Глутамин 0,300 г 30,00 г 10 мл Цефотаксим 0,250 г 250 г 1,0 мл Гигромицин B 0,030 г 50 г 0,6 мл

[00306] Готовят отдельно 10X раствор основных солей N6, 100X раствор Fe ЭДТА, 100X раствор солей микроэлементов B5, 100X раствор витаминов, 100 мг л^-1 раствор NAA, 100 мг л^-1 раствор 6BA, 30 г л^-1 раствор глутамина, 250 г л^-1 раствор цефотаксима, 50 г л^-1 раствор гигромицина B, и смешивают необходимое количество или вышеуказанный сток-раствор с мальтозой, пролином и казаминокислотами для витаминного анализа. Добавляют необходимое количество агарозы после доведения pH до 5,8 и стерилизуют. После стерилизации добавляют необходимое количество глутамина, цефотаксима и гигромицина B из сток-раствора в стерильных условиях.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДиСиЭм ШРИРАМ ЛИМИТЕД

<120> КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, КОДИРУЮЩИЕ БЕЛОК CRY2Ai, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PD033499IN-SC

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 633

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность

белка Cry2Ai (NCBI GenBank: ACV97158.1)

<400> 1

Met Asn Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Asn Ile Thr Cys His Ala His

1 5 10 15

Asn Val Val Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Glu His Lys Ser Leu Asn

20 25 30

Thr Ile Glu Lys Glu Trp Lys Glu Trp Lys Arg Thr Asp His Ser Leu

35 40 45

Tyr Val Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Gly Ser Phe Leu Leu Lys Lys

50 55 60

Val Gly Ser Leu Val Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Gln Asn Leu

65 70 75 80

Ile Phe Pro Ser Gly Ser Ile Asp Leu Met Gln Glu Ile Leu Arg Ala

85 90 95

Thr Glu Gln Phe Ile Asn Gln Arg Leu Asn Ala Asp Thr Leu Gly Arg

100 105 110

Val Asn Ala Glu Leu Ala Gly Leu Gln Ala Asn Val Ala Glu Phe Asn

115 120 125

Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Gln Asn Pro Val Pro Leu

130 135 140

Ala Ile Ile Asp Ser Val Asn Thr Leu Gln Gln Leu Phe Leu Ser Arg

145 150 155 160

Leu Pro Gln Phe Gln Ile Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu

165 170 175

Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile

180 185 190

Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Val Arg Thr Tyr

195 200 205

Arg Asp His Leu Arg Asn Phe Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile

210 215 220

Asn Thr Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp

225 230 235 240

Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val

245 250 255

Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Met Val Ser Ser Gly

260 265 270

Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser Phe

275 280 285

Thr Ala Gln Asn Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser

290 295 300

Asn Tyr Ile Leu Ser Gly Ile Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Thr Phe

305 310 315 320

Pro Asn Ile Gly Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ser Leu Asn

325 330 335

Ser Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Ser Gly Leu Ile Gly

340 345 350

Ala Thr Asn Leu Asn His Asn Phe Asn Cys Ser Thr Val Leu Pro Pro

355 360 365

Leu Ser Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Thr Asp Arg

370 375 380

Glu Gly Val Ala Thr Ser Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Gln Thr

385 390 395 400

Thr Leu Ser Leu Arg Cys Gly Ala Phe Ser Ala Arg Gly Asn Ser Asn

405 410 415

Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu Val

420 425 430

Ile Arg Asn Glu Asp Leu Thr Arg Pro Leu His Tyr Asn Gln Ile Arg

435 440 445

Asn Ile Glu Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr Leu

450 455 460

Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile Tyr Ala Ala Asn Glu Tyr

465 470 475 480

Gly Thr Met Ile His Leu Ala Pro Glu Asp Tyr Thr Gly Phe Thr Ile

485 490 495

Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe Ile

500 505 510

Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln Ser

515 520 525

Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Asn

530 535 540

Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val Thr

545 550 555 560

Ile Asn Gly Arg Ala Tyr Thr Val Ser Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn

565 570 575

Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile

580 585 590

Gly Asn Ile Val Ala Ser Asp Asn Thr Asn Val Thr Leu Asp Ile Asn

595 600 605

Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Pro Phe Asp Leu Met Asn Ile Met Phe

610 615 620

Val Pro Thr Asn Leu Pro Pro Leu Tyr

625 630

<210> 2

<211> 2041

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 2 представляет собой полноразмерную

кодон-оптимизированную синтетическую последовательность

ДНК cry2Ai (201M1), кодирующую белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

<400> 2

gcgcgccctg caggggccgg ccgtttaaac gcggccgcat ttaaaggtac ctctagacca 60

tggggatcca tgaataacgt cctgaatagt ggccgcaata tcacctgtca cgcccacaac 120

gttgtcgcac acgacccttt ctctttcgag cacaaatctc tgaacactat agagaaggag 180

tggaaagaat ggaaaagaac cgaccacagt ttgtatgtag cccctatcgt cgggactgtg 240

ggcagttttc tacttaagaa agtgggttcc ctggtcggca agcgtatttt atcagagttg 300

cagaacttga tttttccatc cggctccatc gatttgatgc aggagatcct tcgtgccacg 360

gaacagttca ttaatcagcg gctgaatgcg gacactctgg ggagggtcaa tgcggaactc 420

gccggactgc aagccaacgt agcggagttc aatagacagg tcgataactt cttgaaccct 480

aatcaaaacc cagtcccgct ggcaataatt gactccgtga ataccctgca acaactcttc 540

ctgtcccggt taccccagtt ccaaattcaa ggctaccagt tgctcttgct cccactcttc 600

gcacaagctg caaaccttca cttgtccttt atcagagatg tgatcctcaa cgccgatgag 660

tggggcatat cggctgctac ggttcggacc taccgggacc acctgcgcaa cttcacacgg 720

gactactcaa actattgtat caacacatat caaacagcgt ttcgcggatt gaacacacgc 780

ctgcacgaca tgctggagtt tcggacctac atgtttttga acgttttcga gtacgtgtcc 840

atatggtcct tgttcaaata tcaatcacta atggtctctt ctggcgctaa tctctatgcc 900

agcggttcag ggccccagca aacacaatcg tttacagccc aaaactggcc gttcctctac 960

agcctgttcc aggtgaatag caactacatt ctctccggca tttcaggtac acgactttcc 1020

ataactttcc caaacatagg cggcctgccc ggttccacga cgactcactc attaaacagc 1080

gcgagagtga actacagcgg cggtgttagt tctggtctca ttggggcaac caacctgaac 1140

cataatttca attgttcgac tgtcctacca cctttaagca ctcccttcgt ccgcagttgg 1200

ctcgattcag gtacggatag ggaaggcgta gctaccagca cgaattggca gacagagagt 1260

ttccaaacca ctctctccct ccgctgcgga gcgttttcag cacgaggcaa cagcaactat 1320

ttccctgact attttatccg taacattagc ggcgtcccgc tggtcataag aaatgaggac 1380

ttgactcgac ccctgcacta caatcagata cgcaacatcg aatccccttc gggaacacct 1440

gggggagcac gtgcttacct agtctcagta cacaaccgaa agaacaacat ctacgcggcc 1500

aatgagtacg ggaccatgat ccatctcgct cccgaggact acaccgggtt cacgatttct 1560

ccgatacatg ctacccaggt taataaccaa acccggactt tcatcagcga gaagttcggc 1620

aaccagggag attctctgag atttgagcaa agcaatacca cagctaggta caccctccgg 1680

ggaaatggca atagctataa cttgtatctg agggcgtctt caatcggcaa ttcaactatt 1740

agggtgacta ttaacggcag ggcatataca gtttctaatg tgaacacaac gactaacaac 1800

gatggcgtaa acgacaatgg ggcacgtttt tctgacatca atatagggaa catagtcgcc 1860

agtgataaca caaacgtgac actggatatt aacgtcaccc tcaactctgg tactccgttc 1920

gatctcatga acatcatgtt cgtacccaca aaccttcctc cgctttatta gggggctgaa 1980

ttcaagcttg agctctccgg agcgatcgcg agatcgcggc cggccgttta aacatttaaa 2040

t 2041

<210> 3

<211> 2041

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 3 представляет собой полноразмерную

кодон-оптимизированную синтетическую последовательность

ДНК cry2Ai (201M2), кодирующую белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

<400> 3

gcgcgccctg caggggccgg ccgtttaaac gcggccgcat ttaaaggtac ctctagacca 60

tggggatcca tgaataacgt gctgaacagc ggccgcaata tcacctgtca tgcccacaat 120

gttgtagccc acgacccttt ttccttcgag cacaaaagct tgaatacgat agagaaggaa 180

tggaaggagt ggaaaagaac cgaccatagt ttgtacgtcg caccaatcgt cgggactgtt 240

ggcagtttcc tacttaagaa agtgggttcc ctggtcggca agcgtatttt atcagagttg 300

cagaacttga tttttccatc cggctccatc gatttgatgc aggagatcct tcgtgccacg 360

gaacagttca ttaatcagcg gctgaatgcg gacactctgg ggagagtcaa tgcggagctt 420

gcaggactcc aagctaacgt cgcagagttc aacagacagg ttgataactt cctcaatccg 480

aatcagaacc cagtcccgct agccattata gactctgtca atactctcca acaactcttt 540

ttgtcccggt tacctcagtt ccaaattcaa ggctaccagc ttttgctgct accactcttt 600

gctcaagctg cgaacctcca cctgtcattc atcagagatg tcatcttgaa cgcggacgag 660

tggggcatat ccgctgcgac ggttcgcacc taccgggatc acctgcgtaa ttttacacga 720

gattacagca actattgcat caacacgtac cagacagcgt tccgaggatt gaacacaaga 780

ctacatgata tgctggagtt ccgaacctat atgtttttga acgtatttga gtatgtctcc 840

atttggtcat tgttcaaata tcaatcgtta atggtttctt ctggcgcgaa cctctatgcg 900

agcggcagtg gaccccagca aacacaatcc tttactgccc aaaattggcc gtttctctac 960

tcccttttcc aggtgaatag caactacata ctgtccggca tttcaggcac tcgcctctcg 1020

atcacctttc ctaacattgg agggctgccc gggtcaacaa cgacgcattc attgaacagt 1080

gcgagggtta attacagcgg cggagtaagt agcggactca tcggggcgac taacctcaac 1140

cacaacttta actgtagcac tgtgctacca cctttatcaa cacctttcgt gcggagttgg 1200

ctcgactcag gaacagatcg ggaaggcgtc gcgacgagca cgaattggca gactgagtcc 1260

ttccaaacaa ccctatctct ccggtgcggg gcgttttcag cgagaggcaa ctcgaactac 1320

tttcccgatt atttcatacg gaacatttct ggcgtccccc tggtcattag aaacgaagat 1380

ttgacgcgcc cactccacta caaccagata aggaacatag agtctccttc agggacacca 1440

ggaggcgctc gtgcgtacct agtctcagta cacaaccgaa agaacaacat ctacgcggcc 1500

aatgagtacg ggaccatgat ccatctcgct cccgaggact acaccgggtt cacgatttct 1560

ccgatacatg ctacccaggt taataaccaa acccggactt tcatcagcga gaagttcggc 1620

aaccagggcg actctctgag atttgagcaa agcaacacca ccgcccgata tacattacgg 1680

ggcaacggca acagttacaa cctctatctg cgtgcgtcct caataggcaa ctcaacgata 1740

agggtgacaa ttaacggtcg ggcgtataca gtgtcgaatg ttaataccac aacaaacaat 1800

gacggcgtca acgacaatgg tgcgcgtttt tctgatatta acattggcaa catcgtcgcc 1860

agtgacaaca ccaacgttac gttagacatc aacgtgacgc ttaactctgg cactcctttc 1920

gatcttatga acatcatgtt cgtgccgacc aatttgccgc cactctacta gggggctgaa 1980

ttcaagcttg agctctccgg agcgatcgcg agatcgcggc cggccgttta aacatttaaa 2040

t 2041

<210> 4

<211> 2041

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 4 представляет собой полноразмерную

кодон-оптимизированную синтетическую последовательность

ДНК cry2Ai (201M3), кодирующую белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

<400> 4

gcgcgccctg caggggccgg ccgtttaaac gcggccgcat ttaaaggtac ctctagacca 60

tggggatcca tgaataatgt gttgaacagt ggccgaaata taacttgcca cgcccacaac 120

gttgtcgcgc acgacccatt ttcgttcgag cacaagagtc tgaatacaat cgagaaggaa 180

tggaaagaat ggaaaagaac cgaccacagt ctatacgttg cacctattgt cgggactgtg 240

ggtagtttcc tacttaagaa agtgggttcc ctggtcggca agcgtatttt atcagagttg 300

cagaacttga tttttccatc cggctccatc gatttgatgc aggagatcct tcgtgccacg 360

gaacagttca ttaatcagcg gctgaatgcg gacactctgg ggcgggtcaa cgccgaacta 420

gcggggcttc aggctaacgt cgccgagttc aaccgacaag ttgataactt cctgaatccg 480

aaccagaacc cagtcccgct agctataatc gactccgtga acactttgca acaactattc 540

ctgtcccggt taccgcagtt ccaaattcaa ggctaccagc tactactgct accgctattc 600

gcccaagctg caaacctgca cttgagcttc atacgagatg tgatcttgaa tgccgacgag 660

tggggcatat ctgctgctac cgttcggacg tacagggatc acctcagaaa cttcacgcgg 720

gattattcta actactgcat caatacttac cagaccgcgt ttcgtggatt aaacacgaga 780

ctccacgata tgctagagtt tcggacctat atgtttttga acgttttcga atacgtgtcc 840

atctggtcat tgttcaaata ccaatcatta atggtgtctt ccggcgcgaa tctgtatgct 900

agcgggtcgg ggccccagca aacccaatcc tttacagccc aaaactggcc ttttttgtat 960

tccctattcc aagtgaatag caactacatc ctttccggca tttcagggac tcgcctctcc 1020

atcacgtttc caaacatagg aggcttgccc ggctctacca cgacccactc attgaactca 1080

gcaagagtca attacagcgg tggagtttca tcgggactca tcggggctac caatctgaac 1140

cataatttca actgctcaac tgtgctacca ccattaagca ctccttttgt cagaagttgg 1200

cttgactctg ggacagacag ggaaggagtg gcgacaagca ctaattggca gaccgagtcc 1260

tttcaaacta ccctgtctct gagatgtggt gcgttcagtg cccgtggcaa ttcaaactac 1320

tttcctgatt acttcattcg caatatctct ggcgtgcctc tggtcataag aaacgaggat 1380

ctcacacgac cactgcacta taaccagata cgcaacattg agtctccgag cggcactccg 1440

ggtggcgctc gtgcatacct agtctcagta cacaaccgaa agaacaacat ctacgcggcc 1500

aatgagtacg ggaccatgat ccatctcgct cccgaggact acaccgggtt cacgatttct 1560

ccgatacatg ctacccaggt taataaccaa acccggactt tcatcagcga gaagttcggc 1620

aaccagggcg acagcctacg atttgagcaa agcaacacca cggctcggta cacactccgg 1680

ggtaacggca attcttacaa cctctatctg cgtgcgtcgt caattggcaa ctcaacaatc 1740

agggtgacta tcaatggtcg ggcttatact gtctctaacg tcaatactac caccaataac 1800

gatggcgtga acgataacgg tgctcgtttc tctgacatca acatcggaaa tatcgtggct 1860

agtgacaaca ccaacgtcac tctcgatatt aacgtaacat tgaactctgg aacacctttc 1920

gatctgatga acattatgtt tgttcctact aacctaccgc cgctttacta gggggctgaa 1980

ttcaagcttg agctctccgg agcgatcgcg agatcgcggc cggccgttta aacatttaaa 2040

t 2041

<210> 5

<211> 2041

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 5 представляет собой полноразмерную

кодон-оптимизированную синтетическую последовательность

ДНК cry2Ai (201M4), кодирующую белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

<400> 5

gcgcgccctg caggggccgg ccgtttaaac gcggccgcat ttaaaggtac ctctagacca 60

tggggatcca tgaataatgt cttgaacagt ggccgaaata ttacgtgcca cgcccacaat 120

gttgtagcgc atgacccatt ctcgttcgag cacaagagct tgaacactat agagaaggaa 180

tggaaagagt ggaaaagaac cgaccacagt ctgtacgtcg cccccatcgt cgggactgtg 240

gggagtttcc tacttaagaa agtgggttcc ctggtcggca agcgtatttt atcagagttg 300

cagaacttga tttttccatc cggctccatc gatttgatgc aggagatcct tcgtgccacg 360

gaacagttca ttaatcagcg gctgaatgcg gacactctgg ggagggtgaa cgccgaactt 420

gccgggctgc aagcgaacgt cgcagagttt aacagacagg tggataattt cctgaaccct 480

aaccagaatc cagtcccgct tgccatcatt gactccgtta atacgctaca gcaacttttc 540

ctgtcccggt taccgcaatt ccaaattcaa ggctaccaac tcctgttgct cccgctgttt 600

gcacaggctg caaacctcca cctgtcattc attcgcgatg tgatcctgaa cgccgacgaa 660

tggggcatat ccgctgccac cgttcgtaca taccgggacc acctgcgtaa ctttactcgc 720

gattattcta actactgcat taacacatac cagacagcgt ttcggggctt gaatactaga 780

ctccacgata tgctggagtt ccgcacctat atgtttttga acgtattcga atatgtatcc 840

atttggtcct tgttcaaata tcaatcccta atggtatctt caggcgcgaa tctgtatgct 900

agcggtagtg ggccccagca aacccaatcc tttacagccc aaaactggcc gtttctgtac 960

agcctcttcc aggtgaatag caactacata ctgtccggca tttcaggaac gcggctcagt 1020

ataactttcc ccaatattgg cgggttgccc ggttctacca caacccattc attgaactca 1080

gctagagtga attacagcgg tggagtgtcg tcggggctca tcggggcgac taatcttaat 1140

cataacttta attgctcaac tgtgctacca cctttaagca cacctttcgt ccgcagttgg 1200

ctggattcgg gaacagatcg ggaaggagtc gccacatcca caaattggca aacagagtcg 1260

ttccagacca cactctcact gcggtgcgga gccttctcag cgagagggaa ctctaactac 1320

ttccctgatt actttattag gaacatatct ggcgtccccc tcgtcatcag aaacgaggac 1380

ttgacccgac cattacacta caaccagata cgtaatatag agtctccctc cggtacaccg 1440

ggcggtgcgc gtgcgtacct agtctcagta cacaaccgaa agaacaacat ctacgcggcc 1500

aatgagtacg ggaccatgat ccatctcgct cccgaggact acaccgggtt cacgatttct 1560

ccgatacatg ctacccaggt taataaccaa acccggactt tcatcagcga gaagttcggc 1620

aaccagggag acagcctcag attcgaacaa tccaacacta ccgctagata tacgcttcgc 1680

ggaaacggta atagctacaa cctctatttg agggcgtcct caataggcaa ttcaactatc 1740

cgggtgacta tcaatggaag ggcttatacg gtgtccaatg tcaatactac gaccaacaat 1800

gacggcgtca atgacaacgg cgcacgtttc tctgacatta acatcggcaa catcgtcgcg 1860

agtgacaaca caaacgtgac actcgacatc aacgtcacac ttaattctgg cacgccgttc 1920

gatctgatga acatcatgtt tgtccctact aacttacccc cactttacta gggggctgaa 1980

ttcaagcttg agctctccgg agcgatcgcg agatcgcggc cggccgttta aacatttaaa 2040

t 2041

<210> 6

<211> 2041

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 6 представляет собой полноразмерную

кодон-оптимизированную синтетическую последовательность

ДНК cry2Ai (201M5), кодирующую белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

<400> 6

gcgcgccctg caggggccgg ccgtttaaac gcggccgcat ttaaaggtac ctctagacca 60

tggggatcca tgaataacgt cctgaatagt ggccgcaata tcacctgtca cgcccacaac 120

gttgtcgcac acgacccttt ctctttcgag cacaaatctc tgaacactat agagaaggag 180

tggaaagaat ggaaaagaac cgaccacagt ttgtatgtag cccctatcgt cgggactgtg 240

ggcagttttc tacttaagaa agtgggttcc ctggtcggca agcgtatttt aagcgagctc 300

cagaacttga ttttcccatc cggctccatc gatttgatgc aggaaatact tcgtgcgact 360

gagcaattca ttaatcagcg gctgaatgcg gatactttgg gcagggtcaa tgcggaactc 420

gccggactgc aagccaacgt agcggagttc aatagacagg tcgataactt cttgaaccct 480

aatcaaaacc cagtcccgct ggcaataatt gactccgtga ataccctgca acaactcttc 540

ctgtcccggt taccccagtt ccaaattcaa ggctaccagt tgctcttgct cccactcttc 600

gcacaagctg caaaccttca cttgtccttt atcagagatg tgatcctcaa cgccgatgag 660

tggggcatat cggctgctac ggttcggacc taccgggacc acctgcgcaa cttcacacgg 720

gactactcaa actattgtat caacacatat caaacagcgt ttcgcggatt gaacacacgc 780

ctgcacgaca tgctggagtt tcggacctac atgtttttga acgttttcga gtacgtgtcc 840

atatggtcct tgttcaaata tcaatcacta atggtctctt ctggcgctaa tctctatgcc 900

agcggttcag ggccccagca aacacaatcg tttacagccc aaaactggcc gttcctctac 960

agcctgttcc aggtgaatag caactacatt ctctccggca tttcaggtac acgactttcc 1020

ataactttcc caaacatagg cggcctgccc ggttccacga cgactcactc attaaacagc 1080

gcgagagtga actacagcgg cggtgttagt tctggtctca ttggggcaac caacctgaac 1140

cataatttca attgttcgac tgtcctacca cctttaagca ctcccttcgt ccgcagttgg 1200

ctcgattcag gtacggatag ggaaggcgta gctaccagca cgaattggca gacagagagt 1260

ttccaaacca ctctctccct ccgctgcgga gcgttttcag cacgaggcaa cagcaactat 1320

ttccctgact attttatccg taacattagc ggcgtcccgc tggtcataag aaatgaggac 1380

ttgactcgac ccctgcacta caatcagata cgcaacatcg aatccccttc gggaacacct 1440

gggggagcac gtgcttacct agtctcagta cacaaccgaa agaacaacat ctacgcggcc 1500

aatgagtacg ggaccatgat ccatctcgct cccgaggact acaccgggtt cacgatttct 1560

ccgatacatg ctacccaggt taataaccaa acccggactt tcatcagcga gaagttcggc 1620

aaccagggag attctctgag atttgagcaa agcaatacca cagctaggta caccctccgg 1680

ggaaatggca atagctataa cttgtatctg agggcgtctt caatcggcaa ttcaactatt 1740

agggtgacta ttaacggcag ggcatataca gtttctaatg tgaacacaac gactaacaac 1800

gatggcgtaa acgacaatgg ggcacgtttt tctgacatca atatagggaa catagtcgcc 1860

agtgataaca caaacgtgac actggatatt aacgtcaccc tcaactctgg tactccgttc 1920

gatctcatga acatcatgtt cgtacccaca aaccttcctc cgctttatta gggggctgaa 1980

ttcaagcttg agctctccgg agcgatcgcg agatcgcggc cggccgttta aacatttaaa 2040

t 2041

<210> 7

<211> 2041

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 7 представляет собой полноразмерную

кодон-оптимизированную синтетическую последовательность

ДНК cry2Ai (201M6), кодирующую белок Cry2Ai (SEQ ID NO: 1).

<400> 7

gcgcgccctg caggggccgg ccgtttaaac gcggccgcat ttaaaggtac ctctagacca 60

tggggatcca tgaataacgt cctgaatagt ggccgcaata tcacctgtca cgcccacaac 120

gttgtcgcac acgacccttt ctctttcgag cacaaatctc tgaacactat agagaaggag 180

tggaaagaat ggaaaagaac cgaccacagt ttgtatgtag cccctatcgt cgggactgtg 240

ggcagttttc tacttaagaa agtgggttcc ctggtcggca agcgtatttt atcagagttg 300

cagaacttga tttttccatc cggctccatc gatttgatgc aggagatcct tcgtgccacg 360

gaacagttca ttaatcagcg gctgaatgcg gacactctgg ggagggtcaa tgcggaactc 420

gccggactgc aagccaacgt agcggagttc aatagacagg tcgataactt cttgaaccct 480

aatcaaaacc cagtcccgct ggcaataatt gactccgtga ataccctgca acaactcttc 540

ctgtcccggt taccccagtt ccaaattcaa ggctaccagt tgctcttgct cccactcttc 600

gcacaagctg caaaccttca cttgtccttt atcagagatg tgatcctcaa cgccgatgag 660

tggggcatat cggctgctac ggttcggacc taccgggacc acctgcgcaa cttcacacgg 720

gactactcaa actattgtat caacacatat caaacagcgt ttcgcggatt gaacacacgc 780

ctgcacgaca tgctggagtt tcggacctac atgtttttga acgttttcga gtacgtgtcc 840

atatggtcct tgttcaaata tcaatcacta atggtctctt ctggcgctaa tctctatgcc 900

agcggttcag ggccccagca aacacaatcg tttacagccc aaaactggcc gttcctctac 960

agcctgttcc aggtgaatag caactacatt ctctccggca tttcaggtac acgactttcc 1020

ataactttcc caaacatagg cggcctgccc ggttccacga cgactcactc attaaacagc 1080

gcgagagtga actacagcgg cggtgttagt tctggtctca ttggggcaac caacctgaac 1140

cataatttca attgttcgac tgtcctacca cctttaagca ctcccttcgt ccgcagttgg 1200

ctcgattcag gtacggatag ggaaggcgta gctaccagca cgaattggca gacagagagt 1260

ttccaaacca ctctctccct ccgctgcgga gcgttttcag cacgaggcaa cagcaactat 1320

ttccctgact attttatccg taacattagc ggcgtcccgc tggtcataag aaatgaggac 1380

ttgactcgac ccctgcacta caatcagata cgcaacatcg aatccccttc gggaacacct 1440

gggggagcac gtgcttacct agtgtctgtt cacaaccgaa agaacaacat ctacgcggcc 1500

aatgagtacg gcaccatgat ccatctcgct cccgaggact atacgggctt cacgatttct 1560

ccgatacatg ctacccaggt taacaatcag acccggacat ttattagcga gaagttcggc 1620

aatcaaggag attctctgag gttcgaacag agcaatacca cagcacggta caccctccgg 1680

ggaaatggca atagctataa cttgtatctg agggcgtctt caatcggcaa ttcaactatt 1740

agggtgacta ttaacggcag ggcatataca gtttctaatg tgaacacaac gactaacaac 1800

gatggcgtaa acgacaatgg ggcacgtttt tctgacatca atatagggaa catagtcgcc 1860

agtgataaca caaacgtgac actggatatt aacgtcaccc tcaactctgg tactccgttc 1920

gatctcatga acatcatgtt cgtacccaca aaccttcctc cgctttatta gggggctgaa 1980

ttcaagcttg agctctccgg agcgatcgcg agatcgcggc cggccgttta aacatttaaa 2040

t 2041

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 8 - Прямой праймер для амплификации

нуклеотидной последовательности 201M1 (SEQ ID NO: 2)

<400> 8

aagaaagtgg gttccctggt 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 9 - Обратный праймер для амплификации

нуклеотидной последовательности 201M1 (SEQ ID NO: 2)

<400> 9

tctctgtctg ccaattcgtg 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 10 - Прямой праймер для амплификации гена nptII

<400> 10

ctgatgctct tcgtccagat 20

<210> 11

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 11 - Обратный праймер для амплификации гена nptII

<400> 11

agaggctatt cggctatgac t 21

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 12 Прямой праймер для амплификации гена hptII

<400> 12

gctgttatgc ggccattggt c 21

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO: 13 Обратный праймер для амплификации гена hptII

<400> 13

gacgtctgtc gagaagtttg 20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к полинуклеотиду, кодирующему инсектицидный белок Cry2Ai, а также к конструкции, вектору, клетке, растению, ткани растения, семени растения, биологическому образцу растения, а также к товарному продукту и композиции, его содержащим. Также раскрыт способ получения трансгенного растения, предусматривающий введение в растительную клетку вышеуказанного полинуклеотида. Изобретение эффективно для борьбы с насекомыми Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera. 16 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл., 7 пр.

1. Кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, или комплементарную ей нуклеотидную последовательность.

2. Рекомбинантная ДНК, кодирующая инсектицидный белок Cry2Ai, содержащая кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1, где полинуклеотид функционально связан с гетерологичным регуляторным элементом.

3. Рекомбинантная ДНК по п. 2, где указанный кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид, необязательно, содержит ген селективного маркера, ген репортера или их сочетание.

4. Рекомбинантная ДНК по п. 2, где указанный кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид, необязательно, содержит последовательность ДНК, кодирующую направляющий или транзитный пептид для направления к вакуоли, митохондрии, хлоропласту, пластиде или для секреции.

5. Конструкция ДНК для экспрессии инсектицидного белка Cry2Ai, содержащая 5’-нетранслируемую последовательность, кодирующую последовательность, кодирующую инсектицидный белок Cry2Ai, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и 3’-нетранслируемую область, где указанная 5’-нетранслируемая последовательность содержит промотор, функциональный в растительной клетке, где указанная кодирующая последовательность представляет собой кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1 и где указанная 3’-нетранслируемая последовательность содержит последовательность терминации транскрипции и сигнал полиаденилирования.

6. Экспрессионный плазмидный вектор, содержащий рекомбинантную ДНК по п. 2 или конструкцию ДНК по п. 5.

7. Клетка-хозяин для экспрессии инсектицидного белка Cry2Ai, содержащая кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1.

8. Клетка-хозяин по п. 7, которая представляет собой клетку растения, бактериальную клетку, вирус, клетку грибов или дрожжей.

9. Клетка-хозяин по п. 8, где указанная бактериальная клетка представляет собой клетку Agrobacterium или E. coli.

10. Способ получения трансгенного растения, устойчивого к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, включающий

a) введение в растительную клетку кодон-оптимизированного синтетического полинуклеотида по п. 1, где полинуклеотид функционально связан с (i) промотором, функциональным в растительной клетке, и (ii) терминатором;

b) получение трансформированной растительной клетки из растительной клетки этапа (a), где указанная трансформированная растительная клетка содержит указанный кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1; и

c) получение трансгенного растения из указанной трансформированной растительной клетки этапа (b), где указанное трансгенное растение содержит указанный кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1.

11. Трансгенное растение, устойчивое к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, полученное способом по п. 10, содержащее кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1.

12. Трансгенное растение, устойчивое к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, содержащее кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1.

13. Трансгенное растение по п. 11 или 12, выбранное из группы, состоящей из риса, пшеницы, кукурузы, сорго, овса, проса, бобовых растений, хлопчатника, томата, баклажана, капусты, цветной капусты, брокколи, видов Brassica, фасоли, гороха, голубиного гороха, картофеля, перца, тыквенных, салата, сладкого картофеля, канолы, сои, люцерны, арахиса, подсолнечника, сафлора, табака, сахарного тростника, маниоки, кофе, ананаса, цитрусовых, какао, чая, банана и дыни.

14. Ткань, устойчивая к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, полученная от трансгенного растения по п. 11 или 12, где указанная ткань содержит кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1.

15. Семя, устойчивое к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, полученное от трансгенного растения по п. 11 или 12, где указанное семя содержит кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1.

16. Биологический образец, устойчивый к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, полученный из ткани по п. 14 или семени по п. 15, который содержит поддающееся обнаружению количество указанного кодон-оптимизированного синтетического полинуклеотида по п. 1.

17. Товарный продукт, устойчивый к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, полученный из трансгенного растения по п. 11 или 12, который содержит поддающееся обнаружению количество указанного кодон-оптимизированного синтетического полинуклеотида по п. 1.

18. Инсектицидная композиция против насекомых Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, содержащая эффективное количество Bacillus thuringiensis, содержащего кодон-оптимизированный синтетический полинуклеотид по п. 1, кодирующий белок Cry2Ai, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1.

19. Композиция по п. 18, которая, необязательно, содержит дополнительное инсектицидное средство, токсичное для того же насекомого-вредителя, но имеющее механизм его инсектицидного действия, отличный от механизма действия указанного инсектицидного белка.

20. Композиция по п. 19, где указанное инсектицидное средство выбрано из группы, состоящей из токсина Bacillus, токсина Xenorhabdus, токсина Photorhabdus и дцРНК, специфически подавляющей один или более важных генов у указанного насекомого-вредителя.

21. Способ борьбы с насекомыми Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, поражающими сельскохозяйственные растения, и обеспечения устойчивости сельскохозяйственных растений к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera, включающий создание контакта указанного сельскохозяйственного растения с эффективным для инсектицидного действия количеством композиции по п. 18.

22. Применение кодон-оптимизированного синтетического полинуклеотида по п. 1, конструкции ДНК по п. 5 или плазмидного вектора по п. 6 для производства устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые устойчивы к насекомым Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera.

23. Применение кодон-оптимизированного синтетического полинуклеотида по п. 1 для производства инсектицидной композиции, которая содержит клетки Bacillus thuringiensis, содержащие указанный полинуклеотид, и где инсектицидная композиция эффективна против насекомых Scirpophaga incertulas, Spodoptera Mauritia и H. Armigera.