БИОЧИП, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ПРАЙМЕР СЕКВЕНИРОВАНИЯ И НЕСЕКВЕНИРУЮЩУЮ ЕДИНИЦУ Российский патент 2022 года по МПК B01J19/00 C12Q1/68 G01N33/48 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на полезный эффект предварительной патентной заявки US 62/438294, поданной 22 декабря 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, представленный в настоящей заявке через EFS-Web, полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. Название файла - "ILI102BPCT_IP-1486-PCT_sequence_listing_ST25.txt", размер файла - 647 байт, дата создания файла - 20 декабря 2017 г.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биологическая матрица (также называемая биочипом или биологическим блоком) - это один из огромного множества инструментов, применяемых для обнаружения и анализа молекул, включающих дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Биочипы для указанного применения конструируют таким образом, чтобы они включали зонды для нуклеотидных последовательностей, находящихся в генах человека и других организмов. Например, в некоторых вариантах применения отдельные зонды для ДНК и РНК могут быть присоединены к небольшим участкам, располагаемым на подложке биочипа в виде геометрической сетки (или неупорядоченным образом). Например, испытуемый образец, полученный из организма определенного человека или другого организма, может быть нанесен на сетку таким образом, чтобы комплементарные фрагменты гибридизовались с зондами на индивидуальных сайтах биочипа. Затем биочип может быть исследован сканированием сайтов при определенных частотах света, и по флуоресценции тех сайтов, с которыми гибридизованы фрагменты, может быть установлено, какие именно фрагменты присутствуют в образце.

Биологические матрицы (биочипы) могут быть применены для проведения генетического секвенирования. В общем, генетическое секвенирование включает определение порядка нуклеотидов или нуклеиновых кислот по протяженности генетического материала, такого как фрагмент ДНК или РНК. Постепенно удлиняющиеся последовательности пар оснований анализируют, и полученная информация о последовательности может быть применена в различных биоинформационных методиках для логического расположения фрагментов относительно друг друга с целью надежного определения последовательности генетического материала большой длины, из которого были получены фрагменты. Были разработаны методики автоматизированного компьютеризированного исследования характеристических фрагментов, которые применяют для картирования генома, идентификации генов и их функций, оценки риска развития некоторых состояний и заболеваний и т.д. Кроме указанных применений биологические матрицы (биочипы) могут быть применены для обнаружения и исследования разнообразных молекул, семейств молекул, уровней экспрессии генов, однонуклеотидных полиморфизмов и для проведения генотипирования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из примеров биочипа включает подложку (основу), включающую совокупность дискретных лунок, гелеобразный материал, размещенный в каждой из дискретных лунок, праймер секвенирования, привитый на гелеобразный материал, и несеквенирующую единицу, привитую на гелеобразный материал. И праймер секвенирования, и несеквенирующая единица находятся в той форме, в которой они были привиты.

Другой пример биочипа включает подложку, включающую совокупность дискретных лунок, гелеобразный материал, размещенный в каждой из дискретных лунок, праймер секвенирования, привитый на гелеобразный материал, и спейсер, привитый на гелеобразный материал. Спейсер выбран из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, поли-N-изопропилакриламида, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты, сложного полиэфира тролокса и комбинаций перечисленных веществ.

В одном из примеров способа гель расположен в каждой лунке совокупности дискретных лунок подложки, праймер секвенирования привит на гелеобразный материал, и несеквенирующая единица привита на гелеобразный материал.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Признаки и полезные эффекты примеров осуществления настоящего изобретения станут более понятными при их более подробном рассмотрении с учетом фигур, в которых подобные обозначения позиций на чертежах относятся к подобным, но не обязательно идентичным, компонентам. Для краткости позиции на чертежах или признаки, имеющие функции, описанные ранее, могут быть описаны или могут не быть описаны в комбинации с другими фигурами, на которых они изображены.

На Фиг. 1 схематично представлен пример биочипа согласно настоящему изобретению, на котором показан общий вид биочипа и более детализированное расположение индивидуальных сайтов;

На Фиг. 2A-2D представлены виды поперечных сечений, которые иллюстрируют один из примеров способа, рассмотренного в настоящей работе;

На Фиг. 3 представлен частично вырезанный и увеличенный вид в перспективе одного из индивидуальных сайтов, показанных на Фиг. 1 и Фиг. 2D;

На Фиг. 4 представлена диаграмма, на которой показаны результаты контроля качества (КК), полученные в одном из примеров измерения интенсивности с использованием тетрахлорфлуоресцеина (англ. обозначение ТЕТ, от tetrachloro fluorescein) на дорожках, включающих различные молярные отношения несеквенирующего праймера к праймеру секвенирования;

На Фиг. 5 представлена диаграмма, на которой показан полученная в одном из примеров интенсивность Прочтения2 С1А при различных молярных отношениях несеквенирующего праймера к праймеру секвенирования;

На Фиг. 6А и 6В представлены диаграммы, на которых показано полученное в одном из примеров процентное содержание кластеров, проходящих через фильтр при различных молярных отношениях несеквенирующей единицы с полимерной цепочкой к праймеру секвенирования; и

На Фиг. 7А и 7В представлены диаграммы, на которых показано полученное в одном из примеров значение процента проскока подложки при различных молярных отношениях несеквенирующей единицы с полимерной цепочкой к праймеру секвенирования.

Введение

Согласно первому аспекту биочипа, рассмотренного в настоящей работе, биочип включает подложку, включающую совокупность дискретных лунок, гелеобразный материал, размещенный в каждой из дискретных лунок, праймер секвенирования, привитый на гелеобразный материал, и несеквенирующую единицу, привитую на гелеобразный материал, где и праймер секвенирования, и несеквенирующая единица находятся в той форме, в которой они были привиты.

Согласно первому аспекту биочипа, молярное отношение несеквенирующей единицы к праймеру секвенирования составляет от приблизительно 0,25:1 до приблизительно 5:1.

В одном из примеров первого аспекта биочипа несеквенирующая единица выбрана из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, поли-N-изопропилакриламида, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты, сложного полиэфира тролокса, пептида и нефункционального праймера. Несеквенирующая единица привита на гелеобразный материал через терминальную функциональную группу. В некоторых примерах функциональная группа выбрана из группы, состоящей из алкина, норборнила, частицы клик-химии, не содержащей меди, и тиола. Например, в этом первом аспекте несеквенирующая единица представляет собой нефункциональный праймер, и нефункциональный праймер представляет собой PolyT или PolyA. В другом примере этого первого аспекта несеквенирующая единица представляет собой полиэтиленгликоль, молекулярная масса которого составляет от приблизительно 0,5 кДа до менее, чем приблизительно 10 кДа.

В другом примере первого аспекта биочипа, несеквенирующая единица включает линкер и гаситель триплетного состояния или антиоксидант, присоединенный к линкеру. В некоторых примерах линкер выбран из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, поли-N-изопропилакриламида, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты и сложного полиэфира тролокса. В некоторых примерах этого аспекта гаситель триплетного состояния выбран из группы, состоящей из циклооктилтетраена (сокращенно ЦОТ, англ. аббревиатура СОТ, от cyclo-octyltetraene), Тролокса и нитробензилового спирта (сокращенно НБС, англ. аббревиатура NBA, от nitrobenzyl alcohol); и в некоторых примерах антиоксидант выбран из группы, состоящей из аскорбата, глутатиона, галловой (3,4,5-триоксибензойной) кислоты, катехина, Тролокса и витамина Е.

В другом примере первого аспекта биочипа несеквенирующая единица включает линкер и донора для резонансного переноса энергии флуоресценции (англ. fluorescence resonance energy transfer, сокращенно FRET), присоединенный к линкеру. В некоторых примерах линкер выбран из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты и сложного полиэфира тролокса. В некоторых примерах этого аспекта донор для FRET выбран из группы, состоящей из донорного красителя для FRET с красителем зеленого свечения и донорного красителя для FRET с красителем красного свечения.

Следует понимать, что любые признаки первого аспекта биочипа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом и/или с образованием любой требуемой конфигурации.

Согласно второму аспекту биочипа, рассмотренного в настоящей работе, биочип включает подложку, включающую совокупность дискретных лунок, гелеобразный материал, размещенный в каждой из дискретных лунок, праймер секвенирования, привитый на гелеобразный материал, и спейсер, привитый на гелеобразный материал. В некоторых примерах спейсер выбран из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты, сложного полиэфира тролокса и комбинаций перечисленных веществ.

Согласно второму аспекту биочипа 10, молярное отношение спейсер/праймер секвенирования составляет от приблизительно 0,25:1 до приблизительно 5:1.

Один из примеров второго аспекта биочипа дополнительно включает гаситель триплетного состояния, антиоксидант или донор для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), присоединенный к спейсеру. В некоторых примерах этого аспекта гаситель триплетного состояния выбран из группы, состоящей из циклооктилтетраена (ЦОТ), Тролокса и нитробензилового спирта (НБС). В некоторых примерах этого аспекта антиоксидант выбран из группы, состоящей из аскорбата, глутатиона, галловой кислоты, катехина, Тролокса и витамина Е. В некоторых примерах этого аспекта донор для FRET выбран из группы, состоящей из донорного красителя для FRET с красителем зеленого свечения и донорного красителя для FRET с красителем красного свечения.

В одном из примеров второго аспекта биочипа, спейсер привит на гелеобразный материал через терминальную функциональную группу. В некоторых примерах функциональная группа выбрана из группы, состоящей из алкина, норборнила, частицы клик-химии, не содержащей меди, и тиола.

Следует понимать, что любые признаки второго аспекта биочипа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что совместно могут быть применены любые комбинации признаков первого аспекта и/или второго аспекта, и/или любые признаки любого или обоих этих аспектов могут быть скомбинированы с любыми примерами, рассмотренными в настоящей работе.

Один из аспектов способа включает размещение гелеобразного материала в каждой лунке совокупности дискретных лунок подложки, прививку праймера секвенирования к гелеобразному материалу и прививку несеквенирующей единицы к гелеобразному материалу.

В одном из примеров этого аспекта способа праймер секвенирования привит на гелеобразный материал до или после прививки несеквенирующей единицы на гелеобразный материал.

В другом примере этого аспекта способа, праймер секвенирования и несеквенирующая единица совместно привиты на гелеобразный материал. Совместную прививку выполняют нанесением смеси праймера секвенирования и несеквенирующей единицы на подложку, на которую нанесен гелеобразный материал, и инкубацией подложки при заданной температуре.

В этом аспекте способа несеквенирующая единица выбрана из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты, сложного полиэфира тролокса, пептида и нефункционального праймера; и несеквенирующая единица привита на гелеобразный материал через терминальную функциональную группу. В некоторых примерах терминальная функциональная группа выбрана из группы, состоящей из алкина, норборнила, частицы клик-химии, не содержащей меди, и тиола.

В некоторых аспектах способа несеквенирующая единица дополнительно включает гаситель триплетного состояния, присоединенный к нему антиоксидант или донор для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

Следует понимать, что любые признаки этого аспекта способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого аспекта способа может быть скомбинирована с любым из аспектов биочипа и/или любым примером, рассмотренным в настоящей работе.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Примеры биочипов, рассмотренных в настоящей работе, включают совокупность сайтов, на каждом из которых имеется праймер секвенирования и несеквенирующая единица, присоединенные к гелеобразному материалу. Праймер секвенирования может быть применен для связывания и амплификации дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) или рибонуклеиновых кислот (РНК); при этом несеквенирующая единица не участвует в связывании или амплификации. Напротив, несеквенирующая единица служит спейсером, расположенным между праймерами секвенирования. Пространственное разделение праймеров секвенирования может улучшать амплификацию за счет ограничения стерических затруднений в белках, задействованных в процессе амплификации.

Кроме использования в качестве спейсера, несеквенирующая единица также может придавать биочипу другие функциональные свойства. Например, несеквенирующая единица может i) ограничивать неспецифическое связывание ферментов, белков и/или других небольших молекул с гелеобразным материалом при проведении амплификации и секвенирования; ii) повышать гидрофильность гелеобразного материала, которая может предотвращать разрушение гелеобразного материала в условиях сухости; iii) усиливать флуоресценцию красителей, связанных с гелеобразным материалом; и/или iv) оказывать комбинацию действий i, ii и/или iii. Дополнительно несеквенирующая единица может улучшать пространственное отделение функциональной поверхности праймеров от поверхности.

Следует понимать, что, если не указано иное, то используемые в настоящем описании термины имеют свои обычные значения, известные в соответствующей области техники. Некоторые используемые в настоящем описании термины и их значения приведены ниже.

Формы единственного числа включают множественное число, если из контекста не ясно иное.

Используемый в настоящем описании термин "алкил" относится к полностью насыщенной (т.е. не содержащей двойных или тройных связей) неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке. Алкильная группа может содержать от 1 до 20 атомов углерода. Примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил, гексил и подобные группы. Например, обозначение "С1-4 алкил" указывает на то, что в алкильной цепочке содержится от одного до четырех атомов углерода, т.е. алкильная цепочка выбрана из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила.

Используемый в настоящем описании термин, "алкенил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более двойных связей. Алкенильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода. Примеры алкенильных групп включают этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил и подобные группы. Алкенильная группа может быть обозначена, например, "С_2-4 алкенил", что означает, что в алкенильной цепочке содержится от двух до четырех атомов углерода.

Используемый в настоящем описании термин, "алкинил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более тройных связей. Алкинильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода. Алкинильная группа может быть обозначена, например, "С_2-4 алкинил", что означает, что в алкинильной цепочке содержится от двух до четырех атомов углерода.

Термин функциональная "аминная" группа (аминогруппа) относится к группе -NR_aR_b, в которой каждый из R_a и R_b независимо выбран из водорода, С_1-6-алкила, С_2-6-алкенила, С_2-6-алкинила, С_3-7-карбоциклила, С_6-10-арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, определения которых представлены в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин "арил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (т.е. двух или более сконденсированных циклов, которые имеют два общих соседних атома углерода), которые содержат в основной цепи цикла только атомы углерода. Если арил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе представляет собой ароматический цикл. Арильная группа может содержать от 6 до 18 атомов углерода, и такая группа может быть обозначена С_6-18. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил, азуленил и антраценил.

Фраза "в той форме, в которой он (она) был привит" относится к состоянию праймера и/или несеквенирующей единицы, которая была присоединена к гелеобразному материалу в результате прививки без изменений. В одном из примеров, рассмотренных в настоящей работе, несеквенирующая единица находится в той форме, в которой она была привита и не способна поддерживать секвенирование ДНК или РНК. Другими словами, от той точки, в которой несеквенирующая единица привита на гелеобразный материал, она не может быть секвенирована. Это позволяет не применять дополнительных этапов обработки для того, чтобы несеквенирующая единица была нереакционноспособной во время секвенирования. Напротив, после прививки несеквенирующая единица не может подвергаться секвенированию.

Используемый в настоящем описании термин "присоединенный" означает состояние двух предметов, которые объединены, скреплены, склеены, соединены или связаны друг с другом. Например, нуклеиновая кислота может быть присоединена к материалу, такому как гелеобразный материал, ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется обобществлением пары электронов атомами. Нековалентная связь представляет собой химическую связь, которая не включает обобществление пар электронов и может включать, например, водородные связи, ионные связи, ванн-дер-Ваальсовы силы, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия.

Термин "азид" или функциональная "азидогруппа" означает -N₃.

Используемый в настоящем описании термин, "карбоциклил" означает неароматическое циклическое кольцо (цикл) или циклическую систему, содержащую в основной цепи циклической системы только атомы углерода. Если карбоциклил представляет собой систему циклов, то два или более цикла могут быть соединены друг с другом в сконденсированную систему, соединены мостиком или в виде спиро-кольцевой системы. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. Таким образом, карбоциклилы включают циклоалкилы, циклоалкенилы и циклоалкинилы. Карбоциклильная группа может содержать от 3 до 20 атомов углерода (т.е. С_3-20). Пример карбоциклильных колец включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, 2,3-дигидроинден, бицикло[2,2,2]октанил, адамантил и спиро[4,4]нонанил.

Используемый в настоящем описании термин "карбоновая кислота" или "карбоксил" означает -С(O)ОН.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкил" означает полностью насыщенное карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов. Примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкилен" означает полностью насыщенное карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, которая присоединена к остатку молекулы в двух точках присоединения.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкенил" или "циклоалкен" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере одну двойную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов. Примеры включают циклогексенил или циклогексен и норборнен или норборненил. Также используемый в настоящем описании термин "гетероциклоалкенил" или "гетероциклоалкен" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую в основной цепи цикла по меньшей мере один гетероатом и содержащую по меньшей мере одну двойную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкинил" или "циклоалкин" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере одну тройную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов. Примером является циклооктин. Другим примером является бициклононин. Также используемый в настоящем описании термин "гетероциклоалкинил" или "гетероциклоалкин" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую в основной цепи цикла по меньшей мере один гетероатом и содержащую по меньшей мере одну тройную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов.

Используемый в настоящем описании термин "осаждение" относится к любой подходящей методике нанесения, которая может быть выполнена вручную или может быть автоматизированной. Обычно осаждение может быть выполнено с применением методик осаждения из газовой фазы, методик нанесения покрытия, методик прививки или подобных методик. Некоторые конкретные примеры включают химическое осаждение из газовой фазы (ХОГФ, англ. аббревиатура CVD - chemical vapor deposition), нанесение покрытия распылением, нанесение покрытия центрифугированием, нанесение покрытия маканием или погружением, распределением раствора или подобную методику.

Термин "каждый", используемый в сочетании с набором предметов, предназначен для идентификации индивидуального предмета набора, но не обязательно относится к каждому предмету в наборе. Исключениями могут быть прямые контекстные указания или, если из контекста ясно следует иное.

"Усилитель флуоресценции" представляет собой любую молекулу, которая может улучшить способность к флуоресценции или может уменьшить фотоповреждения. Например, усилителем флуоресценции может быть антиоксидант, который повышает фотостабильность флуоресцентного красителя (или полнофункционального нуклеотида (англ. fully functional nucleotide, сокращенно FFN), включаемого в секвенирование синтезом (англ. sequencing by synthesis, сокращенно SBS)). В другом примере усилитель флуоресценции может представлять собой донор для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), который поглощает энергию в одной области спектра поглощения и выделяет энергию для возбуждения красителей (например, тех, которые могут быть присоединены к нуклеотиду (нуклеотидам)) в другой области спектра. Донор для FRET может представлять собой донорный краситель для FRET, в который включен краситель, который может быть обнаружен в соответствии с протоколом секвенирования синтезом (SBS). В другом примере усилитель флуоресценции может представлять собой гаситель триплетного состояния, который может снижать фотоиндуцированное повреждение (например, нуклеиновых кислот), которое могут вызывать высоко реакционноспособные флуорофоры триплетного состояния. Гаситель триплетного состояния может сокращать продолжительность пребывания возбужденного соединения в триплетном состоянии, снижая, таким образом, продолжительность времени, в течение которого соединение в триплетном состоянии может вызывать фотоиндуцированные повреждения в другом компоненте, присоединенном к гелеобразному материалу.

Используемый в настоящем описании термин "гелеобразный материал" означает полужесткий материал, проницаемый для жидкостей и газов. Обычно гелеобразный материал представляет собой гидрогель, который может набухать при впитывании жидкости и может сжиматься при удалении жидкости сушкой.

Используемый в настоящем описании термин "гетероарил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (т.е. двум или более сконденсированным циклам, имеющим два общих соседних атома), которые содержат один или более гетероатомов, то есть элемент, отличный от углерода, и неограничивающие примеры гетероарилов включают в основной цепи цикла азот, кислород и серу. Если гетероарил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе является ароматическим. Гетероарильная группа может содержать от 5 до 18 членов цикла.

Используемый в настоящем описании термин "гетероциклил" означает неароматическое циклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере один гетероатом в основной цепи цикла. Гетероциклилы могут быть соединены друг с другом в сконденсированную систему, соединены мостиком или в виде спиро-кольцевой системы. Гетероциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. В системе циклов гетероатом (гетероатомы) может присутствовать в неароматическом или ароматическом цикле. Гетероциклильная группа может содержать от 3 до 20 членов цикла (т.е. количество атомов, составляющих основную цепь цикла, включая атомы углерода и гетероатомы). Гетероциклильная группа может быть обозначена как "3-6-членный гетероциклил" или аналогичными обозначениями. В некоторых примерах гетероатом (гетероатомы) представляет собой О, N или S.

Используемый в настоящем описании термин "гидразин" или "гидразинил" относится к группе -NHNH₂.

Используемый в настоящем описании термин "гидразон" или "гидразонил" относится к группе в которой R_a и R_b имеют значения, приведенные выше в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин или "гидроксил" означает группу -ОН.

Используемый в настоящем описании термин "промежуточная область" относится к области на основе/подложке или на поверхности, которая разделяет другие области подложки или поверхности. Например, промежуточная область может отделять один элемент биочипа от другого элемента биочипа. Два отделенных друг от друга элемента могут быть дискретными, т.е. не имеющими контакта друг с другом. В другом примере промежуточная область может отделять первую часть элемента от второй части элемента. В различных примерах промежуточная область непрерывна, в то время как элементы дискретны, например, как в случае совокупности лунок, ограниченных в остальном непрерывной поверхностью. Разделение, обеспечиваемое промежуточными областями, может быть частичным или полным разделением. Промежуточные области могут иметь поверхностный материал, который отличается от поверхностного материала элементов, сформированных в поверхности. Например, элементы биочипа могут включать такое количество или концентрацию гелеобразного материала, праймера (праймеров) секвенирования и несеквенирующих единиц, которая превышает их количество или концентрацию в промежуточных областях. В некоторых примерах в промежуточных областях гелеобразный материал, праймер (праймеры) секвенирования и несеквенирующие единицы могут отсутствовать.

Используемый в настоящем описании термин "нитрилоксид" означает группу "R_aC≡N⁺O^-", в которой R_a имеет определение, рассмотренное в настоящем описании выше. Примеры получения нитрилоксида включают генерацию in situ из альдоксимов под действием хлорамида-Т или при действии основания на имидоилхлориды [RC(Cl)=NOH].

Используемый в настоящем описании термин "нитрон" означает группу "R_aR_bC=NR_c⁺O^-", в которой R_a и R_b имеют значения, рассмотренные в настоящем описании, и R_c выбран из С_1-6-алкила, С_2-6-алкенила, С_2-6-алкинила, С_3-7-карбоциклила, С_6-10-арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, которые имеют значения, рассмотренные в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин "нуклеотид" включает азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более фосфатных групп. Нуклеотиды представляют собой мономерные единицы последовательности нуклеиновой кислоты. В РНК сахар представляет собой рибозу, а в ДНК - дезоксирибозу, т.е. сахар, не имеющий гидроксильной группы, которая присутствует в положении 2' рибозы. Азотсодержащее гетероциклическое основание может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G) и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидна или N-9 пурина.

"Несеквенирующая единица" согласно изобретению может представлять собой любую молекулу-наблюдатель, которая не принимает активного участия в синтезе ДНК или РНК. Несеквенирующая единица может быть применена для создания пространства между привитыми праймерами секвенирования. Несеквенирующая единица также может иметь другую функцию (функции), такие как ограничение неспецифического связывания, повышение гидрофильности гелеобразного материала, усиление способности к флуоресценции или обеспечивать комбинации указанных свойств. Таким образом, несеквенирующая единица может быть монофункциональной, бифункциональной или мультифункциональной. Примеры несеквенирующих единиц включают нефункциональный праймер, полимерную цепочку (нить), пептид и/или усилитель флуоресценции.

"Нефункциональный праймер" представляет собой любую одноцепочечную последовательность нуклеиновых кислот, которая не участвует в синтезе ДНК или РНК. Примеры нефункциональных праймеров включают последовательность PolyT или последовательность PolyA. Длина нефункционального праймера может быть выбрана таким образом, чтобы не происходила неспецифическая гибридизация. Например, длина нефункционального праймера может составлять от 3 до 10. В некоторых примерах длина нефункционального праймера составляет менее 10 оснований.

"Полимерная цепочка (нить)" представляет собой молекулу, состоящую из нескольких повторяющихся мономерных звеньев (олигомер) или множества повторяющихся мономерных звеньев (полимер). Полимерная цепочка может быть неразветвленной, разветвленной или гиперразветвленной. Примеры разветвленных полимеров включают звездно-разветвленные полимеры, гребнеобразные полимеры, "полимеры-щетки", дендронизированные полимеры, полимеры с лестничной структурой и дендримеры. В примерах, рассмотренных в настоящей работе, полимерная цепочка имеет на одном конце терминальную функциональную группу, которая может реагировать с гелеобразным материалом. В некоторых примерах другой конец полимерной цепочки может включать терминальную функциональную группу, которая присоединяет гаситель триплетного состояния, антиоксидант или краситель. В таких примерах полимерная цепочка может служить линкером, который связывает (присоединяет) гаситель триплетного состояния, антиоксидант или краситель с гелеобразным материалом.

"Пептид" представляет собой короткую цепочку из аминокислотных мономеров, соединенных пептидными (амидными) связями.

Используемый в настоящем описании термин "праймер секвенирования" означает одноцепочечную последовательность нуклеиновых кислот (например, одноцепочечную ДНК или одноцепочечную РНК), которая служит отправной точкой для синтеза ДНК или РНК. Терминальная группа 5' праймера секвенирования может быть модифицирована для того, чтобы она могла вступать в реакцию присоединения с гелеобразным материалом. Длина праймера секвенирования может составлять любое количество оснований и может включать различные не встречающиеся в природе нуклеотиды. В одном из примеров праймер секвенирования представляет собой короткую цепочку, включающую от 20 оснований до 40 оснований.

Используемый в настоящем описании термин "сайт" означает участок, ограниченный на или в подложке, на котором может быть закреплен гелеобразный материал, праймер секвенирования и несеквенирующая единица.

В настоящем описании термины "основа" и "подложка" используются взаимозаменяемо и означают поверхность, в которой или на которой находится сайт. Подложка обычно отличается жесткостью и нерастворима в водной жидкости. Подложка может быть инертна по отношению к химическому веществу, которое применяют для модификации гелеобразного материала. Например, твердая подложка может быть инертна по отношению к химическому веществу, применяемому для присоединения праймеров секвенирования и несеквенирующей единицы к гелеобразному материалу в способе согласно изобретению. Примеры подходящих материалов подложек включают стекло и модифицированное или функционализированное стекло, полимеры (включающие акриловые полимеры, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (ПТФЭ) (такой как TEFLON®, поставляемый Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (англ. cycloolefin polymer, сокращенно СОР) (такие как ZEONOR®, поставляемый Zeon), полиимиды и т.д.), нейлон, керамические материалы, оксид кремния или материалы на основе оксида кремния, кремний и модифицированный кремний, углерод, металлы, неорганические стекла и пучки оптоволокна.

Используемые в настоящем описании термины "тетразин" и "тетразинил" означают шестичленную гетероарильную группу, включающую четыре атома азота. Тетразин может быть необязательно замещен.

Используемый в настоящем описании термин "тетразол" означает пятичленную гетероциклическую группу, включающую четыре атома азота. Тетразол может быть необязательно замещен.

Термин "терминальная функциональная группа" относится к висячей функциональной группе несеквенирующей единицы, которая благодаря этому свойству доступна для реакции с гелеобразным материалом.

Функциональная группа "тиола" означает -SH.

Используемый в настоящем описании термин "лунка" означает дискретный вогнутый элемент подложки, имеющий на поверхности отверстие, полностью окруженное промежуточной областью (областями) поверхности подложки. Находящиеся на поверхности отверстия лунок могут иметь разнообразные формы, включающие например, круглую, эллиптическую, квадратную, многоугольную, звездчатую форму (с любым количеством лучей) и т.д. Поперечное сечение лунки в плоскости, перпендикулярной поверхности, может быть искривленным, квадратным, многоугольным, гиперболическим, коническим, имеющим углы и т.д.

Аспекты и примеры, представленные в настоящем описании и раскрытые в пунктах формулы изобретения, следует рассматривать в свете приведенных выше определений.

На Фиг. 1 представлен пример биочипа 10. В общем, биочип 10 включает основу или подложку 12 и линии или проточные каналы 14, проходящие по подложке 12. Каждый из проточных каналов 14 включает совокупность сайтов 16, которые отделены друг от друга промежуточными областями 18. На каждый сайт 16 нанесен праймер (праймеры) секвенирования 20 и несеквенирующая единица/единицы 22, которые присоединены к гелеобразному материалу (24, 24', например, см. Фиг. 2D).

Биочип 10, представленный на Фиг. 1 и раскрытый в настоящей работе, может быть расположен в проточной ячейке или сформирован в виде проточной ячейки, которая представляет собой камеру, имеющую твердую поверхность, по которой могут протекать текучие среды-носители, реагенты и т.д. В одном из примеров проточная ячейка может включать биочип 10, присоединенный к верхнему слою подложки через герметизирующий материал (например, черный полиимид или другой подходящий связующий материал). Присоединение выполняют в участках для присоединения подложки 12, в герметизирующем материале и верхнем слое подложки. Участки для присоединения могут быть расположены между проточными каналами, так что герметизирующий материал физически отделяет один проточный канал 14 от соседнего проточного канала 14 (для предотвращения перекрестного загрязнения) и могут быть расположены на периферии проточной ячейки (для герметизации проточной ячейки от внешнего загрязнения). Однако следует понимать, что в зависимости от воплощения устройства участки для присоединения и герметизирующий материал могут быть расположены в любой требуемой области. Присоединение может быть осуществлено посредством лазерной сварки, диффузионного соединения, анодной сварки, пайки эвтектическим сплавом, плазмоактивируемой сварки, пайки стеклокристаллическим припоем или другими способами, известными в данной области техники.

Другие примеры проточных ячеек и связанных с ними флюидных систем и аналитических платформ, которые могут быть интегрированы с биочипом 10 и/или успешно применены в способах согласно настоящему изобретению, рассмотрены, например, в публикации Bentley с соавт., Nature 456: 53-59 (2008) и в документах WO 04/018497, US 7057026, WO 91/06678, WO 07/123744, US 7329492, US 7211414, US 7315019, US 7405281 и US 2008/0108082, содержания которых полностью включены в настоящую работу посредством ссылки.

В некоторых вариантах применения проточную ячейку применяют для проведения контролируемых химических или биохимических реакций в автоматизированном реакционном устройстве, таком как секвенатор нуклеотидов. В подложке 12 могут быть проделаны сквозные отверстия 26. При подсоединении через сквозные отверстия 26, автоматизированное реакционное устройство может регулировать поток реагента (реагентов) и продукта (продуктов) в герметичных проточных каналах 14. В некоторых вариантах применения с помощью автоматизированного реакционного устройства можно регулировать величины давления, температуры, состава газа и другие условия в проточной ячейке. Дополнительно в некоторых вариантах применения в верхнем слое подложки или и в подложке 12, и в верхнем слое подложки могут быть проделаны сквозные отверстия 26. В некоторых вариантах применения реакции, протекающие в герметичных проточных каналах 14, можно отслеживать через верхний слой подложки и/или подложку 12 с помощью методик визуализации или измерения количества тепла, испускаемого света и/или флуоресценции.

Следует понимать, что конкретная ориентация проточных каналов 14, сайтов 16 и т.д. может отличаться от их ориентации, представленной на Фиг. 1. В некоторых примерах сайты 16 соприкасаются и, таким образом, не обязательно должны быть разделены промежуточными областями 18.

Показанный на Фиг. 1 биочип 10 и примеры конструкции биочипа 10 более подробно рассмотрены ниже с помощью Фиг. 2A-2D.

На Фиг. 2А представлена подложка 12, на которой имеются сайты 16, разделенные промежуточными областями 18. Эта подложка 12 имеет структурированную поверхность. "Структурированная поверхность" означает определенное расположение различных участков (т.е. сайтов 16) в или на открытом слое твердой подложки 12. Например, один или более сайтов 16 могут представлять собой элементы, на которых присутствуют один или более праймеров 20 секвенирования (амплификации) и несеквенирующих единиц 22. Элементы могут быть разделены промежуточными областями 18, в которых отсутствуют праймеры 20 секвенирования и несеквенирующие единицы 22. Изобретение включает применение различных схем расположения сайтов 16, которые включают упорядоченные, повторяющиеся и неупорядоченные схемы. В одном из примеров сайты 16 расположены в виде гексагональной сетки с целью получения плотной упаковки и достижения повышенной плотности. Другие схемы расположения могут включать, например, прямолинейные (т.е. прямоугольные) схемы расположения, треугольные схемы расположения и т.д. Например, схема или шаблон расположения сайтов 16 может находиться в х-у формате, то есть включать ряды и колонки. В некоторых других примерах схема или шаблон расположения сайтов 16 и/или промежуточных областей 18 может представлять собой повторяющийся рисунок. В других примерах схема или шаблон расположения может представлять собой размещение сайтов 16 и/или промежуточных областей 18 в случайном порядке. Шаблон может включать участки, плоскости, лунки, столбики, полосы, изгибы, линии, треугольники, прямоугольники, круги, арки, шахматные схемы, перекрещивающиеся полосы, диагонали, стрелки, квадраты и/или перекрещивающиеся штрихи. Другие примеры структурированных поверхностей, которые могут быть применены в одном из примеров, рассмотренных в настоящей работе, рассмотрены в патентах US 8778849, US 9079148, US 8778848 и в патентной заявке US 2014/0243224, содержания которых полностью включены в настоящую работу посредством ссылки.

Схема или шаблон расположения может быть охарактеризована плотностью сайтов 16 (т.е. количеством сайтов 16) в ограниченной области. Например, плотность расположения сайтов 16 может составлять приблизительно 2 миллиона на мм². Могут быть достигнуты различные значения плотности, включающие, например, плотность, составляющую по меньшей мере приблизительно 100 на мм², приблизительно 1000 на мм², приблизительно 0,1 миллиона на мм², приблизительно 1 миллион на мм², приблизительно 2 миллиона на мм², приблизительно 5 миллионом на мм², приблизительно 10 миллионов на мм², приблизительно 50 миллионов на мм² или более. В альтернативном варианте или дополнительно может выбрана величина плотности, не превышающая приблизительно 50 миллионов на мм², приблизительно 10 миллионов на мм², приблизительно 5 миллионов на мм², приблизительно 2 миллиона на мм², приблизительно 1 миллион на мм², приблизительно 0,1 миллиона на мм², приблизительно 1000 на мм², приблизительно 100 на мм² или менее. Также следует понимать, что плотность размещения сайтов 16 на подложке 12 может быть величиной, составляющей от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов. Например, биочип с высокой плотностью может быть охарактеризован как биочип, содержащий сайты 16, разделенные областью размером менее приблизительно 15 мкм, биочип со средней плотностью может быть охарактеризован как биочип, содержащий сайты 16, разделенные областью размером от приблизительно 15 мкм до приблизительно 30 мкм, и биочип с низкой плотностью может быть охарактеризован как биочип, содержащий сайты 16, разделенные областью, размер которой превышает приблизительно 30 мкм.

Также или в альтернативном варианте схема или шаблон расположения может быть охарактеризован величиной среднего шага, т.е. т.е. расстояния от центра сайта 16 до центра соседней промежуточной области 18 (расстояние от центра до центра). Шаблон может быть упорядоченным, то есть с малым коэффициентом отклонения среднего шага, или шаблон может быть неупорядоченным, и в этом случае коэффициент отклонения может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, по меньшей мере приблизительно 10 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм, или более. В альтернативном варианте или дополнительно наибольшее значение среднего шага может составлять, например, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм приблизительно 0,1 мкм или менее. Величина среднего шага конкретного шаблона расположения сайтов 16 может составлять от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов. В одном из примеров шаг между сайтами 16 (расстояние от центра до центра) составляет приблизительно 1,5 мкм.

В некоторых примерах сайты 16 представляют собой лунки 16', и, таким образом, на поверхности подложки 12 имеется массив лунок 16'. Лунки 16' (или другие сайты 16, имеющие отличающиеся конфигурации, такие как форма, поперечное сечение и т.д.) могут быть изготовлены с помощью множества различных методик, примеры которых включают фотолитографию, наноимпринтную литографию, методики штампования, методики тиснения, методики формования, методики микротравления, методики печати и т.д. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что тип применяемой методики зависит от состава и формы подложки 12.

Лунки 16' могут представлять собой микролунки (имеющие по меньшей мере один размер в микронном диапазоне, например, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 1000 мкм) или нанолунки (имеющие по меньшей мере один размер в нанодиапазоне, например, от приблизительно 1 нм до приблизительно 1000 нм). Характеристики каждой лунки 16' могут включать объем, площадь отверстия лунки, глубину и/или диаметр.

Каждая лунка 16' может иметь любой объем, достаточный для удержания жидкости. Минимальный или максимальный объем может быть выбран, например, для достижения требуемой производительности (например, мультиплексности) и разрешения, для соответствия составу анализируемого вещества или реакционной способности анализируемого вещества, ожидаемой при применении биочипа 10 в качестве единицы последующей обработки. Например, объем может составлять по меньшей мере приблизительно 1×10^-3 мкм³, приблизительно 1×10^-2 мкм³, приблизительно 0,1 мкм³, приблизительно 1 мкм³, приблизительно 10 мкм³, приблизительно 100 мкм³ или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальный объем может составлять приблизительно 1×10⁴ мкм³, приблизительно 1×10³ мкм³, приблизительно 100 мкм³, приблизительно 10 мкм³, приблизительно 1 мкм³, приблизительно 0,1 мкм³ или менее. Следует понимать, что гелеобразный материал 24 заполнять весь объем или часть объема лунки 16'. Объем гелеобразного материала 24 в индивидуальной лунке 16' может превышать указанные выше величины, быть меньше указанных выше величин или иметь промежуточное значение.

Площадь, занимаемая каждым отверстием лунки на поверхности, может быть выбрана с учетом критериев, аналогичных указанным выше для объема лунки. Например, площадь, занимаемая каждым отверстием лунки на поверхности, может составлять по меньшей мере приблизительно 1×10^-3 мкм², приблизительно 1×10^-2 мкм², приблизительно 0,1 мкм², приблизительно 1 мкм², приблизительно 10 мкм², приблизительно 100 мкм² или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальная площадь может составлять приблизительно 1×10³ мкм², приблизительно 100 мкм², приблизительно 10 мкм², приблизительно 1 мкм², приблизительно 0,1 мкм², приблизительно 1×10^-2 мкм² или менее.

Глубина каждой лунки 16' может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм, или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальная глубина может составлять приблизительно 1×10³ мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее.

В некоторых примерах диаметр каждой лунки 16' может составлять по меньшей мере приблизительно 50 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм, или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальный диаметр может составлять приблизительно 1×10³ мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 50 нм или менее.

В получаемом биочипе 10 гелеобразный материал 24 размещен в каждой из дискретных лунок 16'. Размещение гелеобразного материала 24 в каждой лунке 16' может быть выполнено нанесением на структурированную поверхность подложки 12 покрытия из гелеобразного материала 24, как показано на Фиг. 2В, и последующим удалением гелеобразного материала 24, например химической или механической шлифовкой, с по меньшей мере промежуточных областей 18, расположенных на поверхности структурированной подложки 12 между лунками 16'. В некоторых примерах гелеобразный материал может быть удален с промежуточных областей промывкой, которая не требует химической или механической шлифовки. После такой обработки по меньшей мере некоторая часть гелеобразного материала 24 остается в лунках 16', но по меньшей мере по существу весь гелеобразный материал 24, находящийся на промежуточных областях 18 на поверхности структурированной подложки 12 между лунками 16', удаляется или инактивируется. С помощью таких способов получают гелевые подушечки 24' (Фиг. 2D), применяемые для секвенирования, которые могут быть устойчивыми при проведении секвенирования с большим количеством циклов. В других примерах гелеобразный материал 24 располагают в каждой лунке 16', применяя методики селективного осаждения, в которых также не требуется проведение этапов химической или механической шлифовки для удаления гелеобразного материала с промежуточных областей.

Особенно подходящие гелеобразные материалы 24 будут принимать форму сайта 16, на котором их располагают. Некоторые подходящие гелеобразные материалы 24 могут (а) принимать форму сайта 16 (например, лунки 16' или другого вогнутого элемента), на котором их располагают, и (b) иметь объем, который по меньшей мере по существу не превышает объем сайта 16, на котором их располагают.

Один из примеров подходящего гелеобразного материала 24 включает полимер, включающий повторяющееся звено, имеющее Формулу (I):

где:

R¹ представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;

R^A выбран из группы, состоящей из азидогруупы, необязательно замещенной аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидроксигруппы, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона и тиола;

R⁵ выбран из группы, состоящей из Н и необязательно замещенного алкила;

каждый из -(СН₂)_p- может быть необязательно замещенным;

р представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50;

n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50000; и

m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

Подходящие полимеры, соответствующие Формуле (I), рассмотрены, например, в патентных заявках US 2014/0079923 А1 или US 2015/0005447 А1, содержание каждой из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что в структуре Формулы (I) субъединицы "n" и "m" представляют собой повторяющиеся субъединицы, которые присутствуют в случайном порядке во всей структуре полимера.

Конкретным примером материала полимерного покрытия, такого как соединение, представленное Формулой (I), является сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (англ. poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide, сокращенно PAZAM),

рассмотренный, например, в опубликованных патентных заявках US 2014/0079923 А1 или US 2015/0005447 А1, который включает структуру, показанную ниже:

где n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 20000, и m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что, как и в Формуле (I), субъединицы "n" и "m" являются повторяющимися звеньями, которые присутствуют в случайном порядке во всей структуре полимера.

Молекулярная масса полимера, имеющего Формулу (I), или полимера PAZAM может составлять от приблизительно 10 кДа до приблизительно 1500 кДа, или в одном из конкретных примеров она может составлять приблизительно 312 кДа.

В некоторых примерах полимер, имеющий Формулу (I), или PAZAM представляет собой линейный (неразветвленный) полимер. В некоторых других примерах полимер, имеющий Формулу (I), или PAZAM представляет собой полимер, включающий небольшое количество поперечных сшивок. В других примерах полимер, имеющий Формулу (I), или PAZAM имеет разветвления. Другими подходящими полимерами являются сополимеры SFA (не содержащий силана акриламид, от англ. silane free acrylamide) и SFA, функционализированного группами бромацетамида (например, BRA РА (от англ. N-[5-(2-bromoacetyl)aminopentyl]acrylamide, русс. N-[5-(2-бромацетил)аминопентил]-акриламид)), или сополимеры SFA и SFA, функционализированного группами азидоацетамида.

Другие примеры подходящих гелеобразных материалов 24 включают материалы, имеющие коллоидную структуру, такие как агароза, или полимерную сетчатую структуру, такие как желатин, или поперечно-сшитую полимерную структуру, такие как полиакриламидные полимеры и сополимеры, не содержащий силана акриламид (англ. silane free acrylamide, сокращенно SFA, см., например, опубликованную патентную заявку US 2011/0059865, содержание которой полностью включено в настоящую работу посредством ссылки) или азидолизированый вариант SFA. Примеры подходящих полиакриламидных полимеров могут быть получены из акриламида и акриловой кислоты или акриловой кислоты, содержащей винильную группу, как указано, например, в документе WO 2000/031148 (содержание которого полностью включено в настоящую работу посредством ссылки), или из мономеров, которые вступают в реакции [2+2] фотоциклоприсоединения, которые рассмотрены, например, в документах WO 2001/001143 или WO 2003/0014392 (содержание каждого из которых полностью включено в настоящую работу посредством ссылки).

Гелеобразный материал 24 может представлять собой предварительно сформованный гелеобразный материал. Предварительно сформованные гелеобразные материалы могут быть нанесены в виде покрытия центрифугированием или маканием, или растеканием геля под действием положительного или отрицательного давления, или с помощью методик, рассмотренных в патенте US 9012022, содержание которого полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Нанесение покрытия маканием может представлять собой методику селективного осаждения, которую выбирают в зависимости от типа применяемых подложки 12 и гелеобразного материала 24. Например, структурированную подложку 12 макают в предварительно сформованный гелеобразный материал 24, и гелеобразный материал 24 может селективно заполнять сайты 16 (т.е. гелеобразный материал 24 не осаждается на промежуточных областях 18), в результате чего шлифовка (или другой способ удаления) может оказаться ненужной.

Предварительно сформованный полимер или PAZAM может быть нанесен в виде покрытия на структурированную подложку 12, например, нанесением покрытия центрифугированием или маканием, или растеканием геля под действием положительного или отрицательного давления, или с помощью методик, рассмотренных в патенте US 9012022. Присоединение полимера или PAZAM также может происходить в результате поверхностной радикальной полимеризации с переносом атома (англ. surface initiated atom transfer radical polymerization, сокращенно SI-ATRP) на силанизированной поверхности. В этом примере поверхность подложки 12 может быть предварительно обработана APTS (метокси- или этоксисиланом) для образования ковалентной связи между кремнием и одним или более атомами кислорода, находящимися на поверхности (не придерживаясь какого-либо механизма, можно предположить, что каждый атом кремния может связываться с одним, двумя или тремя атомами кислорода). Такую обработанную химическим способом поверхность подвергают тепловой обработке для образования монослоя из аминогрупп. Затем аминогруппы вводят в реакцию с Сульфо-HSAB (англ. N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate, т.е. с N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоатом) с образованием азидопроизводного. Активация УФ излучением с энергией в диапазоне от 1 Дж/см² до 30 Дж/см² при 21°С приводит к генерации активных нитреновых частиц, которые могут с легкостью вступать в различные реакции включения с PAZAM.

Другие примеры нанесения покрытий из PAZAM на подложку 12 рассмотрены в патентной заявке US 2014/0200158 (содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки) и включают связывание мономеров PAZAM с функционализированной аминогруппами поверхностью под действием ультрафиолетового (УФ) излучения или протекающие под действием повышенных температур реакции активной группы (акрилоилхлоридной или другой молекулы, содержащей алкен или алкин) с последующим осаждением PAZAM и нагреванием. В некоторых примерах поверхность модифицирована алкенильными или циклоалкенильными группами, которые затем могут реагировать с азидо-функционализированными полимерами, такими как PAZAM, или с полимерами, включающими SFA, функционал изированный азидогруппами, в подходящих условиях, таких как условия клик-химии, с образованием ковалентных связей между модифицированной поверхностью и полимером.

В других примерах PAZAM может быть нанесен на подложку 12, поверхность которой включает силан или производное силана, которое может присоединяться к функциональной группе PAZAM. Например, силан или производное силана могут содержать ненасыщенный фрагмент (например, циклоалкены, циклоалкины, гетероциклоалкены, гетероциклоалкины, их замещенные варианты и комбинации перечисленных веществ), который может ковалентно связываться с функциональной группой PAZAM. Примеры ненасыщенных циклоалкеновых фрагментов включают норборнен, производное норборнена (например, (гетеро)норборнен, включающий атомы кислорода или азота вместо одного из атомов углерода), трансциклооктен, производные трансциклооктена, трансциклопентен, трансциклогептен, транс-циклононен, бицикло[3,3,1]нон-1-ен, бицикло[4,3,1]дец-1(9)-ен, бицикло[4,2,1]нон-1(8)-ен и бицикло[4,2,1]нон-1-ен. Любые из этих циклоалкенов могут быть замещены, как рассмотрено в патентной заявке US 2015/0005447, содержание которой полностью включено в настоящую работу посредством ссылки. Пример производного норборнена включает [(5-бицикло[2,2,1]гепт-2-енил)этил]триметоксисилан. Примеры ненасыщенных циклоалкиновых фрагментов включают циклооктин, производное циклооктина или бициклононины (например, бицикло[6,1,0]нон-4-ин или его производные, бицикло[6,1,0]нон-2-ин или бицикло[6,1,0]нон-3-ин). Эти циклоалкины также могут быть замещены, как указано в патентной заявке US 2015/0005447.

В этих примерах PAZAM может быть нанесен на поверхность силанизированной подложки 12 с помощью нанесения центрифугированием или маканием, или растеканием функционализированной молекулы под действием положительного или отрицательного давления, или с помощью методик, рассмотренных в патенте US 9012022. Для нанесения PAZAM может находиться в растворе (например, в смеси этанола и воды). После нанесения раствор PAZAM может быть подвергнут отверждению, приводящему к образованию гелеобразного материала 24.

Гелеобразный материал 24 может представлять собой жидкость, которая затем образует гелеобразный материал 24. Примеры нанесения жидкости, которая затем образует гелеобразный материал 24, включают нанесение на сайты 16 биочипа покрытия из акриламида, не содержащего силана, и N-[5-(2-бромацетил)аминопентил]акриламида (BRAPA) в жидком виде, после чего реагенты образуют гель в результате полимеризации на поверхности. Другой пример включает нанесение на сайты 16 биочипа покрытия из мономеров PAZAM, находящихся в жидком виде, после чего реагенты образуют гель в результате полимеризации на поверхности. Для такого получения покрытия на биочипе могут быть применены химические реагенты и процедуры, рассмотренные в опубликованной патентной заявке US 2011/0059865.

Гелеобразный материал 24 может быть связан ковалентной связью с подложкой 12 (на сайтах 16) или может не быть связана ковалентной связью с подложкой 12. Ковалентная связь гелеобразного материала 24 с сайтами 16 позволяет фиксировать гель в структурированных сайтах 16 в течение всего срока службы биочипа 10 в различных вариантах его применения. Ниже представлены некоторые примеры реакций, которые могут протекать между PAZAM и силаном или производным силана в некоторых примерах подложки 12 и которые приводят к образованию ковалентных связей.

Если силан или производное силана, находящееся на подложке 12, включает в качестве ненасыщенного фрагмента норборнен или производное норборнена, то норборнен или производное норборнена может: i) вступать в реакцию 1,3-биполярного циклоприсоединения с азидом/азидогруппой PAZAM; ii) вступать в реакцию сочетания с группой тетразина, присоединенной к PAZAM; вступать в реакцию циклоприсоединения с группой гидразона, присоединенной к PAZAM; вступать в фото-клик реакцию с группой тетразола, присоединенной к PAZAM; или вступать в реакцию циклоприсоединения с группой нитрилоксида, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное силана, находящееся на подложке 12, в качестве ненасыщенного фрагмента включает циклооктин или производное циклооктина, то циклооктин или производное циклооктина могут: i) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию азид-алкинного 1,3-циклоприсоединения (англ. strain-promoted azide-alkyne 1,3-cycloaddition, сокращенно SPAAC) с азидом/азидогруппой PAZAM или ii) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию алкин-нитрилоксидного циклоприсоединения с нитрилоксидной группой, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное силана, находящееся на подложке 12, в качестве ненасыщенного фрагмента включает бициклононин, то бициклононин может вступать в аналогичную реакцию циклоприсоединенияа алкина в соответствии с механизмом SPAAC с азидами или нитрилоксидами, присоединенными к PAZAM, под воздействием напряжения в бициклической кольцевой системе.

Несмотря на то, что выше и во многих примерах было представлено несколько примеров образования ковалентных связей между подложкой 12 и гелеобразным материалом 24, гелеобразный материал 24 не обязательно должен быть ковалентно связан с сайтами 16. В одном из примеров не содержащий силана акриламид SFA не присоединен ковалентно к какой-либо части подложки 12.

Как было отмечено выше, на Фиг. 2С представлено удаление гелеобразного материала 24 с промежуточных областей 18. Удаление может быть выполнено шлифовкой. Шлифовка может представлять собой механическую и/или химическую обработку.

Механическая шлифовка может быть проведена приложением истирающих сил к поверхности твердой подложки 12 (на которую нанесен гелеобразный материал 24). Примеры способов включают шлифование суспензией, содержащей гранулы, протирание листом или тканью, шабрение или подобные операции. Следует понимать, что применяемые для шлифовки гранулы могут быть сферическими или несферическими и могут иметь неправильную форму, многоугольную форму, овоидную форму, удлиненную форму, цилиндрическую форму и т.д. Поверхность гранул может быть гладкой или шероховатой. В качестве гранул для шлифовки могут быть применены любые виды частиц. Один из примеров шлифовки для удаления гелеобразного материала 24 с промежуточных областей 18 включает применение безлинтового (сорта, пригодного для использования в стерильных условиях) материала с покрытием из суспензии, содержащей гранулы оксида кремния размером 3 мкм (10% масс./об. в воде). Для работы с этой суспензией или суспензией другого вида также может быть применен полировальный круг/шлифовальная машина.

В другом примере механическая шлифовка для удаления геля с промежуточных областей 18 также может быть произведена с помощью струи текучей среды или струи газа (например, воздуха или инертного газа, такого как аргон или азот).

Также могут быть применены химические методики шлифовки, такие как гидролиз или разрушение акриламида под действием радикалов (например, под действием бензоилпероксида или разбавленного пероксида водорода). При таком способе шлифовки химические вещества могут быть предоставлены в твердом, жидком, газообразном состоянии или в виде плазмы. Соответственно, в некоторых примерах может быть применена плазменная шлифовка.

Шлифовка также может включать комбинацию химической и механической шлифовки, в которой для механического истирания применяют химическую суспензию, содержащую суспензию коллоидных частиц, и затем снятые с промежуточных областей 18 части гелеобразного материала 24 подвергают химическому растворению. В одном из примеров для удаления гелеобразного материала 24 с промежуточных областей 18, не оказывая негативного влияния на нижележащую подложку 12 в этих областях 18, может быть применена система химико-механической шлифовки, например, шлифовальная машина для многослойных пластин, включающая Strasbaugh ViPRR II или другую подходящую шлифовальную головку. Шлифовальная система такого типа может быть применена в комбинации с рассмотренной выше суспензией гранул оксида кремния или с более мягкой химической суспензией. В одном из примеров мягкая химическая суспензия представляет собой щелочную водную суспензию, включающую абразивные частицы, выбранные из группы, состоящей из карбоната кальция (СаСО₃) и полиметилметакрилата (ПММА). Средний размер частиц CaCO₃ может составлять от приблизительно 15 нм до приблизительно 5 мкм, и в одном из примеров составляет приблизительно 700 нм. Кроме CaCO₃, щелочная водная суспензия также может включать буфер, хелатирующий агент, поверхностно-активное вещество и/или диспергирующее средство. Пример буфера включает основание Tris (т.е. трис(гидроксиметил)аминометан), который может присутствовать в растворе с рН, составляющим приблизительно 9. Пример хелатирующего агента - этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), которая может присутствовать в растворе с рН, составляющим приблизительно 8. Примером поверхностно-активного вещества является додецилсульфат натрия. Могут быть применены полиакрилатные диспергирующие средства, имеющие различные молекулярные массы. Примером диспергирующего средства является натриевая соль полиакриловой кислоты.

Другие способы шлифовки или очистки промежуточных областей 18 включают методики с использованием клеящих веществ, например, методики, в которых применяют жесткую плоскую клеящую пленку, имеющую сродство к гелеобразному материалу 24, которую приводят в тесный контакт (например, через химическую связь) с гелеобразным материалом 24 в промежуточных областях 18. Механическое удаление/отрыв этой клеящей пленки приводит к механическому удалению гелеобразного материала 24 с промежуточных областей 18, но при этом на сайтах 16 остается гелеобразный материал 24.

В одном из примеров привитый тиофосфатом SFA может быть удален с промежуточных областей 18, находящихся на поверхности подложки 12, следующим образом: намоченная в воде промокательная ватмановская бумага может быть окунута в массу гранул из оксида алюминия (~100 мг, 0,3 ультрамоль) или стали, и полученная суспензия может быть втерта в поверхность подложки (на которой находится привитый тиофосфатом SFA) небольшими концентрическими кругами с равномерным приложением давления, и затем для удаления суспензии и привитого тиофосфатом SFA с поверхности может быть применена чистая смоченная водой промокательная ватмановская бумага.

Приведенные примеры способов механической и химической шлифовки для удаления гелеобразного материала 24 с промежуточных областей 18 также могут быть применены для инактивации гелеобразного материала, находящегося в промежуточных областях 18, независимо оттого, удален гелеобразный материал 24 или нет. Например, может быть произведено устранение способности гелеобразного материала 24 присоединять праймер секвенирования 20 и несеквенирующую единицу 22.

После размещения гелеобразного материала 24 в каждой лунке 16', на гелеобразный материал 24 прививают праймер (праймеры) 20 секвенирования и несеквенирующую единицу/единицы 22. В некоторых примерах праймер (праймеры) 20 может быть привит до или после прививки несеквенирующей единицы/единиц 22 на гелеобразный материал 24. В других примерах праймер (праймеры) 20 и несеквенирующая единица/единицы 22 прививают на гелеобразный материал 24 совместно.

Последовательная прививка может быть выполнена посредством воздействия на подложку 12 (на сайтах 16 которой расположен гелеобразный материал 24) раствора или смеси, содержащей праймер (праймеры) 20 секвенирования, проведения инкубации и последующего воздействия раствора или смеси, содержащей несеквенирующую единицу 22, и проведения инкубации. В альтернативном варианте последовательная прививка может быть выполнена посредством воздействия на подложку 12 (на сайтах 16 которой расположен гелеобразный материал 24) раствора или смеси, содержащей несеквенирующую единицу 22, и инкубации и последующего воздействия раствора или смеси, содержащей праймер (праймеры) 20 секвенирования, и инкубации.

Совместная прививка может быть выполнена посредством воздействия на подложку 12 (на сайтах 16 которой расположен гелеобразный материал 24) раствора или смеси, содержащей праймер (праймеры) 20 секвенирования и несеквенирующую единицу 22, и последующей инкубации. Воздействие на подложку 12 такого раствора или смеси может быть выполнено нанесением смеси праймера (праймеров) 20 секвенирования и несеквенирующей единицы 22 на подложку 12. В одном из примеров раствор или смесь может быть пропущена по подложке 12 с покрытием из гелеобразного материала 24 (показанной на Фиг. 2С).

В любом из примеров прививки инкубацию проводят при заданной температуре, которая частично зависит от типа применяемых праймера (праймеров) 20 секвенирования и несеквенирующей единицы 22. Например, инкубация может быть проведена при температуре, составляющей от комнатной температуры (т.е. приблизительно 25°С) до приблизительно 60°С.

Также, в любом из примеров прививки раствор может включать праймер (праймеры) 20 секвенирования и/или несеквенирующую единицу 22, воду, буфер и катализатор. Молярное отношение количества несеквенирующей единицы 22 к количеству праймера 20 секвенирования, независимо от того, находятся они в одном растворе/смеси или разных растворах/смесях, составляет от приблизительно 0,25:1 до приблизительно 5:1.

Примеры подходящих праймеров 20 секвенирования включают праймеры прямой амплификации или праймеры обратной амплификации. Примеры подходящих праймеров 20 секвенирования включают праймеры Р5 или Р7. Праймеры Р5 и Р7 нанесены на поверхность коммерчески доступных проточных ячеек, поставляемых Illumina Inc. для секвенирования на инструментальных платформах HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq®, NextSeq® и Genome Analyzer®. Последовательности праймеров P5 и P7 включают следующие последовательности:

Р5: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA(dU)CTACAC (SEQ. ID NO. 1)

Р7: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ. ID NO. 2)

где G* представляет собой 8-оксогуанин.

Необязательно, один или оба праймера Р5 и Р7 могут включать хвостовую часть PolyT. Хвостовая часть PolyT обычно расположена на 5'-конце последовательности, но в некоторых случаях она может быть расположена на 3'-конце. Последовательность PolyT может включать любое количество Т-нуклеотидов, например, от 2 до 20.

Праймеры Р5 и Р7, а также другие праймеры 20 секвенирования, могут быть модифицированы по 5'-концу группой, которая способна реагировать с функциональной группой гелеобразного материала 24. Одним из примеров подходящей функциональной группы является бицикло[6,1,0]нон-4-ин (сокращенно BCN, от англ. bicyclo[6.1.0] non-4-yne), который может реагировать с азидогруппой гелеобразного материала 24. Другие примеры праймеров с концевыми группами включают праймер с концевой группой тетразина, праймер с концевой группой норборнена, праймер с концевой группой алкина, праймер с концевой аминогруппой, праймер с концевой эпоксидной или глицидильной группой, праймер с концевой тиофосфатной группой и праймер с концевой группой триазолиндиона. В некоторых примерах осуществления праймеры с концевой группой включают праймеры с концевой группой алкина. В других примерах осуществления праймеры с концевой группой включают праймеры с концевой тиофосфатной группой. Специалисту в данной области техники должен быть известен способ создания и применения праймеров 20 секвенирования, подходящих для захвата и амплификации нуклеиновых кислот, представленных в настоящем описании.

Примеры подходящих несеквенирующих единиц 22 включают нефункциональный праймер, полимерную цепочку, пептид и/или усилитель флуоресценции.

Как было отмечено выше, нефункциональный праймер представляет собой одноцепочечную последовательность нуклеиновых кислот, которая в той форме, в которой она был привита, не участвует в синтезе ДНК или РНК. Их примеры включают последовательность PolyT или последовательность PolyA.

Примеры полимерной цепочки включают дендример (например, полиамидоамин (англ. poly(amido)amine, сокращенно РАМАМ)), полидекстран, метакрилоилоксиэтил фосфорилхолин (РСА от англ phosphorylcholine), полиэтиленгликоль (ПЭГ, англ. poly(ethylene glycol), сокращенно PEG), полиэтиленоксид (ПЭО, англ. poly(ethylene oxide), сокращенно РЕО), полиэтиленимин (ПЭИ, англ. poly(ethylene imine), сокращенно PEI), поли-L-лизин (англ. poly-L-lysine, сокращенно PLL), пропаргилметакрилат (ПМА, англ. propargyl methacrylate, сокращенно РМА), полиметилметакрилат (ПММА, англ. poly(methyl methacrylate), сокращенно РММА), поли-N-изопропилакриламид (англ. poly-N-isopropylacrylamide, сокращенно PNIPAM), полиэтиленгликоль акрилат (англ. polyethyleneglycol acrylate, сокращенно POEGA), полипропиленимин (ППИ, англ. poly(propylene imine), сокращенно PPI), который представляет собой основу дендримера), поливиниловый спирт (ПВС, англ. polyvinyl alcohol), сокращенно PVA), поли-2-этил-2-оксазолин, полиакриловую кислоту (ПАК, англ. polyacrylic acid, сокращенно РАА) и сложный полиэфир тролокса.

Каждый из материалов этих полимерных цепочек может функционировать как спейсер, создавая дополнительное расстояние между праймерами 20 секвенирования, которые присоединены к гелеобразному материалу 24. Некоторые из материалов этих полимерных цепочек также имеют свойства, которые могут повышать гидрофильность гелеобразного материала 24 и ограничивать неспецифическое связывание на гелеобразном материале 24. Пример материала полимерной цепочки включает ПЭГ. В одном из примеров, рассмотренных в настоящей работе, молекулярная масса ПЭГ составляет от приблизительно 0,5 кДа до приблизительно 10 кДа. Другие материалы полимерных цепочек также многофункциональны, например, сложный полиэфир тролокса может служить спейсером и антиоксидантом.

Полимерная цепочка либо включает функциональную группу, которая может реагировать с группой (группами) гелеобразного материала 24, либо модифицирована, так, чтобы она включала функциональную группу, которая может реагировать с группой (группами) гелеобразного материала 24. Примеры таких функциональных групп включают алкин, норборнил, частицу клик-химии, не содержащую меди (например, дибензоциклооктин (англ. dibenzocyclooctyne, сокращенно DIBO) или другие) и тиол. Алкины, норборнилы и частицы клик-химии, не содержащие меди, могут реагировать с азидами PAZAM, вступая с ними в клик-реакции. Тиолы могут реагировать с SFA. Примером материала полимерной цепочки, который включает одну из перечисленных функциональных групп, является ПМА, который включает алкин. Примеры модифицированных полимерных цепочек включают ПЭГ с концевой группой алкина, ПММА с концевой группой алкина, ПММА с концевой группой норборнила, PNIPAM с концевой тиольной группой, ПВС с концевой группой алкина, ПВС с концевой тиольной группой, ПАК с концевой группой алкина и ПАК с концевой тиольной группой.

В некоторых примерах рассмотренные полимерные цепочки могут быть привиты на гелеобразный материал 24 в качестве несеквенирующей единицы 22.

В других примерах рассмотренные полимерные цепочки могут представлять собой линкерные молекулы, которые присоединяют усилители флуоресценции, такие как гаситель триплетного состояния, антиоксидант или донор для FRET, к гелеобразному материалу 24. Например, полимерная цепочка может иметь на одном конце концевую группу алкина для присоединения к гелеобразному материалу 24, а на другом конце функциональную группу (например, тиола, амина, альдегида или карбоновой кислоты) для присоединения к гасителю триплетного состояния, антиоксиданту или донору для FRET.

Примеры подходящих гасителей триплетного состояния выбраны из группы, состоящей из циклооктилтетраена (ЦОТ), Тролокса (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты (Hoffmann - La Roche AG)) и нитробензилового спирта (НБС, англ. nitrobenzyl alcohol, сокращенно NBA). Примеры подходящих антиоксидантов выбраны из группы, состоящей из аскорбата, глутатиона, галловой кислоты, катехина, Тролокса и витамина Е. Присоединенный донор для FRET создают или выбирают таким образом, чтобы он имел оптимальное спектральное перекрывание и эффективность при FRET с полнофункциональными нуклеотидами (FFN) (краситель, обнаруживаемый при секвенировании, применяемый в секвенировании синтезом (SBS)). Примеры доноров для FRET выбраны из группы, состоящей из донорного красителя для FRET с красителем зеленого свечения (включенного в нуклеотиды для протокола секвенирования) и донорного красителя для FRET с красителем красного свечения (включенного в нуклеотиды для протокола секвенирования). Конкретные примеры донорных красителей для FRET с полнофункциональными нуклеотидами (FFN) зеленого свечения включают Су2® (цианиновый краситель, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), красители Alexa Fluor® (например, 488) (ThermoFisher Scientific) и красители Atto (например, 465, 488 и 490) (Atto-Tec); и конкретные примеры донорных красителей для FRET с FFN красного свечения включают Су3® (цианиновый краситель, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), красители Alexa Fluor® (например, 546, 555, 568 и 594) (ThermoFisher Scientific) и красители Atto (например, 532) (Atto-Tec). Доноры для FRET могут подходить для применения в одной или двух конфигурациях секвенирования синтезом с красителем при измерениях при длинах волн 542 нм, 550 нм, 565 нм (длина волны поглощения) и/или с использованием Rhodamine 6G.

В других примерах указанного применения полимерные цепочки с присоединенным усилителем флуоресценции составляют несеквенирующую единицу 22. В других примерах указанного применения другой конец полимерной цепочки (например, конец, противоположный концу, присоединенному к гелеобразному материалу 24) либо включает функциональную группу, которая может объединяться или реагировать с группой (группами) усилителя флуоресценции, либо модифицирован с целью введения в него функциональной группы, которая может объединяться или реагировать с группой (группами) усилителя флуоресценции. Примеры таких функциональных групп включают тиол, амин, альдегид и карбоновую кислоту. Также могут быть применены другие функциональные группы, которые могут присоединять усилитель флуоресценции к полимерной цепочке.

Например, с ПАК может быть сопряжен витамин Е, а глутатион, аскорбиновая кислота, галловая кислота или катехин могут быть сопряжены с ПЭГ или ПММА.

В других примерах донор для FRET может быть сопряжен с любыми полимерными цепочками, имеющими алкинную группу или модифицированными алкинной группой.

В другом примере несеквенирующая единица представляет собой пептид.

В том виде, в котором они были привиты, праймер (праймеры) 20 секвенирования и несеквенирующая единица/единицы 22 представлены на Фиг. 2D и 3. Молярное отношение количества привитой несеквенирующей единицы 22 к количеству привитого праймера 20 секвенирования составляет от приблизительно 0,25:1 до приблизительно 5:1. В другом примере молярное отношение количества привитой несеквенирующей единицы 22 к количеству привитого праймера 20 секвенирования составляет от приблизительно 0,5:1 до приблизительно 2:1. В том виде, в котором она была привита, несеквенирующая единица/единицы 22 не участвует в последующем проведении методик секвенирования, но обеспечивает пространственное отделение праймера (праймеров) 20 секвенирования на сайте 16 и может придавать сайту 16 дополнительную функциональность.

Биочип 10, рассмотренный в настоящей работе, может быть применен в ряде подходов или методик секвенирования, которые включают методики, часто называемые секвенированием синтезом (SBS), секвенированием лигированием, пиросеквенированием и т.д. Поскольку гелеобразный материал 24 и присоединенные к нему праймеры 20 секвенирования находятся на сайтах 16, а не в промежуточных областях 18, при применении любой из указанных методик амплификация будет ограничена лишь площадью различных сайтов 16.

Коротко говоря, реакция секвенирования синтезом (SBS) может быть проведена в такой системе, как системы-секвенаторы HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq® или NextSeq®, поставляемые Illumina (San Diego, CA). Совокупность целевых молекул ДНК, подвергаемых секвенированию, гибридизуется, связываясь с праймерами 20 секвенирования (но не с несеквенирующими единицами 22), и затем подвергается мостиковой амплификации или амплификации с кинетическим исключением. После денатурации одноцепочечные матрицы остаются закрепленными на гелеобразном материале 24, и генерируются несколько миллионов плотных кластеров двухцепочечной ДНК (т.е. происходит генерация кластеров). Проводят реакции секвенирования, и в некоторых примерах праймеры 20 секвенирования и несеквенирующие единицы 22 (и ампликоны, включающие праймеры, надстроенные в процессе амплификации, которые включают копии целевой ДНК) отделяют от гелеобразного материала 24, в результате чего его поверхность может быть повторно использована для последующих реакций секвенирования. Таким образом, могут быть повторены один или более этапов присоединения праймеров 20 секвенирования и несеквенирующих единиц 22 к гелеобразному материалу 24, гибридизации целевых молекул ДНК с праймерами 20 секвенирования, мостиковой амплификации, секвенирования целевой ДНК и удаления праймеров 20 секвенирования и несеквенирующих единиц 22 и ампликонов. Может быть выполнено одно или более повторений.

Для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения ниже приведены примеры. Следует понимать, что эти примеры приведены для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Праймеры секвенирования (например, Р5/Р7 с хвостовой частью PolyT) были привиты с помощью несеквенирующего праймера (т.е. 5'-гексин-ТТТ, называемого NSP) в лунки проточной ячейки, поставляемой Illumina, Inc. В различных образцах молярное отношение несеквенирующего праймера к праймеру секвенирования было различным. В двух контрольных образцах праймер секвенирования применяли без несеквенирующего праймера.

Для каждого образца готовили смесь. Смесь включала ультрачистую воду, буфер и избыток катализаторов (например, CuSO₄ (20 мМ - 200 мМ), аскорбата (20 мМ - 200 мМ) и пентаметилдиэтилентриамина (англ. Pentamethyldiethylenetriamine, сокращенно PMDTA) (105 мМ - 1050 мМ)). Концентрация праймера (праймеров) секвенирования составляла приблизительно 1 мкМ. Общее количество катализатора было одинаково во всех образцах. Молярные отношения несеквенирующего праймера (NSP) к праймеру секвенирования (Р5/Р7) представлены в Таблице 1.

Каждую смесь наносили на соответствующую дорожку проточной ячейки и инкубировали приблизительно при 60°С. Проточную ячейку промывали для удаления несвязанных праймеров.

Смесь, включающую тетрахлорофлуоресцеин (ТЕТ), буфер и олигомеры ТЕТ (т.е. меченные красителем олигонуклеотиды, содержащие последовательности, комплементарные праймерам Р5/Р7) наносили на дорожки проточной ячейки для окрашивания поверхностных праймеров секвенирования. ТЕТ может быть гибридизован с находящимися на поверхности праймерами Р5/Р7; избыток ТЕТ может быть удален промывкой, и концентрация присоединенного красителя (в единицах интенсивности) может быть измерена определением флуоресценции с помощью сканирующего устройства, такого как устройство Typhoon Scanner (General Electric). Из данных интенсивности может быть определено пространственное распределение и плотность праймера. Результаты представлены на Фиг. 4. Результаты показывают, что при молярных отношениях менее 10:1 прививка праймеров секвенирования с несеквенирующим праймером сравнима с прививкой праймеров секвенирования без несеквенирующего праймера.

Пример 2

Праймеры секвенирования (например, Р5/Р7 с хвостовой частью PolyT) были привиты несеквенирующим праймером (т.е. 5'-гексин-ТТТ) в лунки проточной ячейки, поставляемой Illumina, Inc. В различных образцах молярное отношение несеквенирующего праймера к праймеру секвенирования было различным. В одном контрольном образце праймер секвенирования применяли без несеквенирующего праймера.

Для каждого образца готовили смесь. Смесь включала ультрачистую воду, буфер и избыток катализаторов (например, CuSO₄ (20 мМ - 200 мМ), аскорбата (20 мМ - 200 мМ) и пентаметилдиэтилентриамина (PMDTA) (105 мМ - 1050 мМ)). Концентрация праймеров секвенирования Р5/Р7 составляла приблизительно 1 мкМ. Общее количество катализатора в некоторых смесях варьировали. Молярные отношения несеквенирующего праймера к праймеру секвенирования и различные количества катализатора представлены в Таблице 2.

Каждую смесь наносили на соответствующую дорожку проточной ячейки и инкубировали приблизительно при 60°С. Проточную ячейку промывали для удаления несвязанных праймеров.

В проточной ячейке проводили гибридизацию с целью визуализации, получения кластеров и секвенирования. Определяли интенсивности Прочтения2 С1А, и полученные результаты представлены на Фиг. 5. Полученные результаты показывают, что прививка праймера секвенирования несеквенирующим праймером в отсутствие избытка катализатора может повышать интенсивность секвенирования.

Пример 3

Праймеры секвенирования Р5/Р7 с хвостовой частью PolyT были привиты с помощью полимерной цепочки, представляющей собой несеквенирующую единицу (называемую несеквенирующей полимерной цепочкой или NSPS (от англ. non-sequencing polymer strand)), к двум проточным ячейкам, предоставляемым Illumina Inc. Полимерная цепочка представляла собой ПЭГ-алкин, и молекулярная масса ПЭГ-алкина в разных образцах была различной. Молярное отношение количества несеквенирующей полимерной цепочки к количеству праймера секвенирования также было различным в разных образцах. В четырех контрольных образцах праймер секвенирования применяли без несеквенирующей полимерной цепочки.

Были приготовлены две смеси. Смесь праймера секвенирования включала ультрачистую воду, буфер и избыток катализаторов (например, CuSO₄ (20 мМ - 200 мМ), аскорбата (20 мМ - 200 мМ) и пентаметилдиэтилентриамина (PMDTA) (105 мМ - 1050 мМ)). Концентрация праймеров секвенирования Р5/Р7 составляла приблизительно 1 мкМ. В опыте применяли свежеприготовленные растворы ПЭГ-алкина (например, в воде растворяли ПЭГ-алкины с различными молекулярными массами).

Смесь праймера секвенирования наносили на соответствующую дорожку проточной ячейки в присутствии или в отсутствие одного из растворов, содержащих несеквенирующую полимерную цепочку в требуемом молярном отношении, указанном в Таблице 3. В Таблице 3 также указана молекулярная масса ПЭГ-алкина, наносимого на каждую дорожку. Проточные ячейки инкубировали приблизительно при 60°С, и промывали для удаления несвязанных материалов.

В проточных ячейках проводили гибридизацию с целью визуализации, получения кластеров и секвенирования. Собирали данные секвенирования, и полученные величины процентного содержания кластеров, проходящих через фильтр (процентное пропускание фильтра (англ. passing filter, сокращенно PF)), представлены на Фиг. 6А (проточная ячейка 1) и 6В (проточная ячейка 2), и результаты проскока подложки (англ. pad hopping, сокращенно РН) представлены на Фиг. 7А (проточная ячейка 1) и 7В (проточная ячейка 2). Процентное пропускание фильтра (PF) представляет собой величину, применяемую для описания кластеров, имеющих чистоту выше пороговой чистоты, которые используют для последующей обработки и анализа данных секвенирования. Процентный проскок подложки представляет собой величину, применяемую для описания количества дупликатных кластеров, расположенных в окрестности уникального кластера. Более высокое значение процентного пропускания фильтра и более низко значение процентного проскока приводит к повышению выхода уникальных кластеров, используемых для обработки данных секвенирования. Полученные результаты показывают, что прививка праймеров секвенирования, содержащих ПЭГ-алкин с более низкой молекулярной массой (т.е. кДа > 10), сравнима с прививкой праймеров секвенирования, не содержащих ПЭГ-алкин. Таким образом, введение несеквенирующей единицы, содержащей полимерную цепочку, не оказывает негативного влияния на результаты секвенирования и может повышать гидрофильность гелеобразного материала, находящегося в лунках проточной ячейки, ограничивать неспецифическое связывание и т.д.

Дополнительные замечания

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше признаков (при условии, что эти признаки не являются взаимоисключающими) составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящей работе. В частности, все комбинации раскрытых предметов изобретения, очевидные после прочтения предлагаемого описания, составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящей работе. Также следует понимать, что применяемая в настоящем описании терминология, которая также может употребляться в любом документе, включенном в настоящее описание посредством ссылки, должна иметь значение, в наибольшей мере соответствующее конкретным признакам, рассмотренным в настоящей работе.

Содержания всех публикаций, патентов и патентных заявок, упоминаемых в настоящем описании, полностью включены в настоящую работу посредством ссылки.

Упоминание в настоящем описании "одного примера", "другого примера", "примера" и т.д. означает, что конкретный элемент (например, элемент, структура и/или характеристика), раскрытый при описании этого примера, включен в по меньшей мере один пример, рассмотренный в настоящем описании, и может присутствовать или может отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что, если из контекста не ясно иное, то рассмотренные элементы любого примера могут быть скомбинированы в различных примерах любым подходящим образом.

Следует понимать, что приведенные в настоящем описании диапазоны включают указанные диапазоны и любые величины или поддиапазоны, находящиеся в пределах указанного диапазона. Например, следует понимать, что диапазон от приблизительно 0,5 кДа до менее чем приблизительно 10 кДа включат не только явно указанные граничные значения, от приблизительно 0,5 кДа до менее чем приблизительно 10 кДа, но также включает отдельные величины, такие как приблизительно 0,8 кДа, приблизительно 3,25 кДа, приблизительно 5 кДа, приблизительно 7,5 кДа и т.д., и поддиапазоны, такие как от приблизительно 4,25 кДа до приблизительно 9 кДа, от приблизительно 5,4 кДа до приблизительно 7,75 кДа и т.д. Кроме того, если для описания величины используют модификаторы "приблизительно" и/или "по существу", то они составляют небольшие вариации (до +/- 10%) от означенной величины.

Несмотря на то, что некоторые примеры были описаны подробно, следует понимать, что рассмотренные примеры могут быть модифицированы. Таким образом, приведенное выше описание не является ограничивающим.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Illumina, Inc.

ИЛЛЮМИНА, ИНК.

<120> БИОЧИП, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ПРАЙМЕР СЕКВЕНИРОВАНИЯ И НЕСЕКВЕНИРУЮЩУЮ ЕДИНИЦУ

<130> IP-1486-PCT

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> primer_bind

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gaductacac 30

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> primer_bind

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> 8-оксогуанин

<400> 2

caagcagaag acggcatacg anat 24

<---

Группа изобретений относится к области биохимии. Раскрыт биочип для секвенирования нуклеиновых кислот ДНК или РНК, включающий: подложку, включающую совокупность дискретных лунок; гелеобразный материал, размещенный в каждой из дискретных лунок; праймер секвенирования, привитый на гелеобразный материал; и несеквенирующую единицу, привитую на гелеобразный материал и соединенную посредством линкера с гасителем триплетного состояния, антиоксидантом или донором для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET); где и праймер секвенирования, и несеквенирующая единица находятся в той форме, в которой они были привиты, где несеквенирующая единица представляет собой полиэтиленгликоль или PolyT, и где праймер секвенирования и несеквенирующая единица привиты воздействием на подложку раствором или растворами, в которых молярное отношение несеквенирующей единицы к праймеру секвенирования составляет от 0,25:1 до 10:1. Также раскрыт способ получения указанного биочипа. Группа изобретений, за счет того, что несеквенирующая единица служит спейсером между праймерами секвенирования, обеспечивает пространственное разделение праймеров секвенирования, что улучшает амплификацию за счет ограничения стерических затруднений в белках, задействованных в процессе амплификации. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 12 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Биочип для секвенирования нуклеиновых кислот ДНК или РНК, включающий:

подложку, включающую совокупность дискретных лунок;

гелеобразный материал, размещенный в каждой из дискретных лунок;

праймер секвенирования, привитый на гелеобразный материал; и

несеквенирующую единицу, привитую на гелеобразный материал и соединенную посредством линкера с гасителем триплетного состояния, антиоксидантом или донором для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET);

где и праймер секвенирования, и несеквенирующая единица находятся в той форме, в которой они были привиты,

где несеквенирующая единица представляет собой полиэтиленгликоль или PolyT, и

где праймер секвенирования и несеквенирующая единица привиты воздействием на подложку раствором или растворами, в которых молярное отношение несеквенирующей единицы к праймеру секвенирования составляет от 0,25:1 до 10:1.

2. Биочип по п. 1, в котором несеквенирующая единица представляет собой полиэтиленгликоль, молекулярная масса которого составляет от 0,5 до 10 кДа.

3. Биочип по п. 1, в котором несеквенирующая единица привита на гелеобразный материал через терминальную функциональную группу, которая представляет собой алкин.

4. Биочип по любому из пп. 1 или 3, в котором несеквенирующая единица включает линкер и гаситель триплетного состояния или антиоксидант, присоединенный к линкеру.

5. Биочип по п. 4, в котором

линкер выбран из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, поли-N-изопропилакриламида, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты и сложного полиэфира тролокса; и

одно из следующих:

гаситель триплетного состояния выбран из группы, состоящей из циклооктилтетраена (ЦОТ), Тролокса (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты) и нитробензилового спирта (НБС); или

антиоксидант выбран из группы, состоящей из аскорбата, глутатиона, галловой кислоты, катехина, Тролокса (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты) и витамина E.

6. Биочип по любому из пп. 1 или 3, в котором несеквенирующая единица включает линкер и донор для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), присоединенный к линкеру.

7. Биочип по п. 6, в котором:

линкер выбран из группы, состоящей из дендримера, полидекстрана, метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, поли-L-лизина, пропаргилметакрилата, полиметилметакрилата, поли-N-изопропилакриламида, полиэтиленгликоль акрилата, полипропиленимина, поливинилового спирта, поли-2-этил-2-оксазолина, полиакриловой кислоты и сложного полиэфира тролокса; и

донор для FRET выбран из группы, состоящей из донорного красителя для FRET с красителем зеленого свечения и донорного красителя для FRET с красителем красного свечения.

8. Биочип по любому из предшествующих пунктов, где праймер секвенирования и несеквенирующая единица привиты воздействием на подложку раствором или растворами, в которых молярное отношение несеквенирующей единицы к праймеру секвенирования составляет от 0,25:1 до 5:1.

9. Биочип по любому из предшествующих пунктов, в котором:

гелеобразный материал включает повторяющееся звено, имеющее Формулу (I)

где

R¹ представляет собой H или необязательно замещенный алкил;

R^A выбран из группы, состоящей из азидогруппы, необязательно замещенной аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидроксигруппы, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона и тиола;

R⁵ выбран из группы, состоящей из H и необязательно замещенного алкила;

p представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50;

n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50000; и

m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

10. Способ получения биочипа по любому из предшествующих пунктов, включающий:

размещение гелеобразного материала в каждой лунке совокупности дискретных лунок подложки;

прививку праймера секвенирования к гелеобразному материалу; и

прививку несеквенирующей единицы к гелеобразному материалу и присоединение указанной несеквенирующей единицы посредством линкера к гасителю триплетного состояния, антиоксиданту или донору для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET),

где несеквенирующая единица представляет собой полиэтиленгликоль или PolyT, и

где праймер секвенирования и несеквенирующая единица привиты воздействием на подложку раствором или растворами, в которых молярное отношение несеквенирующей единицы к праймеру секвенирования составляет от 0,25:1 до 10:1.

11. Способ по п. 10, в котором праймер секвенирования привит на гелеобразный материал до или после прививки несеквенирующей единицы на гелеобразный материал.

12. Способ по п. 10, в котором праймер секвенирования и несеквенирующая единица совместно привиты на гелеобразный материал.

13. Способ по п. 12, в котором совместную прививку выполняют посредством:

нанесения смеси праймера секвенирования и несеквенирующей единицы на подложку, на которую нанесен гелеобразный материал; и

инкубации подложки при заданной температуре.

14. Способ по любому из пп. 10-13, в котором:

несеквенирующая единица привита на гелеобразный материал через терминальную функциональную группу, которая представляет собой алкин.

15. Способ по любому из пп. 10-14, в котором:

гелеобразный материал включает повторяющееся звено, имеющее Формулу (I)

где

R¹ представляет собой H или необязательно замещенный алкил;

R^A выбран из группы, состоящей из азидогруппы, необязательно замещенной аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидроксигруппы, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона и тиола;

R⁵ выбран из группы, состоящей из H и необязательно замещенного алкила;

p представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50;

n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50000; и

m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000.