ПРОТОЧНЫЕ ЯЧЕЙКИ С ПОКРЫТИЕМ ИЗ ГИДРОГЕЛЯ Российский патент 2021 года по МПК B01J19/00 C08F220/58 C09D105/12 C09D133/26 C12Q1/68 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на полезный эффект предварительной патентной заявки US 62/609105, поданной 21 декабря 2017 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биологическая матрица (англ. biological array, также называемая биочипом или биологическим блоком) - это один из огромного множества инструментов, применяемых для обнаружения и анализа молекул, включающих дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Матрицы для указанного применения конструируют таким образом, чтобы они включали зонды для нуклеотидных последовательностей, находящихся в генах человека и других организмов. Например, в некоторых вариантах применения отдельные зонды для ДНК и РНК могут быть присоединены к участкам, создаваемым на подложке матрицы (чипа) в виде геометрической сетки (или неупорядоченным образом). Например, испытуемый образец, полученный из организма человека или другого организма, может быть нанесен на сетку таким образом, чтобы комплементарные фрагменты гибридизовались с зондами на индивидуальных сайтах матрицы. Затем матрица может быть исследована сканированием сайтов при определенных частотах света, и по флуоресценции тех сайтов, с которыми гибридизованы фрагменты, может быть установлено, какие именно фрагменты присутствуют в образце.

Биологические матрицы могут быть применены для проведения генетического секвенирования. В общем, генетическое секвенирование включает определение порядка нуклеотидов или нуклеиновых кислот по протяженности генетического материала, такого как фрагмент ДНК или РНК. Постепенно удлиняющиеся последовательности пар оснований анализируют, и полученная информация о последовательности может быть применена в различных биоинформатических методиках для логического расположения фрагментов относительно друг друга с целью надежного определения последовательности генетического материала большой длины, из которого были получены фрагменты. Были разработаны методики автоматизированного компьютеризированного исследования характеристических фрагментов, которые применяют для картирования генома, идентификации генов и их функций, оценки риска развития некоторых состояний и заболеваний и т.д. Кроме указанных применений биологические матрицы могут быть применены для обнаружения и исследования разнообразных молекул, семейств молекул, уровней экспрессии генов, однонуклеотидных полиморфизмов и для проведения генотипирования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект изобретения относится к способу, который включает нанесение слоя функционализированного покрытия на углубления структурированной подложки (подложки, англ. substrate) проточной ячейки, где углубления отделены друг от друга промежуточными участками; прививку праймера к слою функционализированного покрытия с образованием привитого слоя функционализированного покрытия, находящегося в углублениях; и нанесение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия.

В одном из примеров первого аспекта способа гидрогель выбран из группы, состоящей из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, сшитого полиакриламида, агарозного геля и сшитого полиэтиленгликоля.

В одном из примеров первого аспекта способа гидрогель расположен на привитом слое функционализированного покрытия. В одном из примеров гидрогель нанесен на слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях, и на по меньшей мере некоторые промежуточные участки. Согласно другому примеру, нанесение гидрогеля включает селективное осаждение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях.

В одном из примеров первого аспекта способа перед нанесением слоя функционализированного покрытия способ дополнительно включает обработку поверхности структурированной подложки проточной ячейки для присоединения к поверхности функциональной группы, что приводит к образованию обработанных углублений и обработанных промежуточных участков. В этом примере нанесение слоя функционализированного покрытия на углубления включает: нанесение слоя функционализированного покрытия на обработанные углубления и на обработанные промежуточные участки; и удаление слоя функционализированного покрытия шлифовкой с обработанных промежуточных участков.

В одном из примеров первого аспекта способа нанесение гидрогеля включает нанесение водной смеси, включающей от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (мас./об.) материала гидрогеля. В одном из примеров, материал гидрогеля выбран из группы, состоящей из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, сшитого полиакриламида, агарозного геля и сшитого полиэтиленгликоля.

В одном из примеров первого аспекта способа по периметру структурированной подложки проточной ячейки присоединен разделительный слой, и после нанесения гидрогеля способ дополнительно включает прикрепление крышки к разделительному слою.

В одном из примеров первого аспекта способа после нанесения слоя функционализированного покрытия и до выполнения прививки праймера способ дополнительно включает прикрепление крышки к по меньшей мере некоторым промежуточным участкам.

В одном из примеров первого аспекта способа нанесение гидрогеля включает селективное осаждение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия. Следует понимать, что любые признаки первого аспекта способа могут быть скомбинированы любым требуемым образом и/или в виде любой требуемой конфигурации.

Согласно второму аспекту, способ включает присоединение силана или производного силана к поверхности структурированной подложки, включающей проточный канал, в котором заданы углубления, где углубления отделены друг от друга промежуточными участками, что приводит к образованию силанизированных углублений и силанизированных промежуточных участков; нанесение слоя функционализированного покрытия на силанизированные углубления и на силанизированные промежуточные участки; удаление слоя функционализированного покрытия с силанизированных промежуточных участков шлифовкой; прививку праймера к слою функционализированного покрытия, находящемуся в силанизированных углублениях, в результате чего образуется привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях; и нанесение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях.

В одном из примеров второго аспекта нанесение гидрогеля включает нанесение водной смеси, включающей от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (мас./об.) материала гидрогеля. В этом примере материал гидрогеля выбран из группы, состоящей из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, -сшитого полиакриламида, агарозного геля и сшитого полиэтиленгликоля.

В одном из примеров второго аспекта, разделительный слой прикреплен к структурированной подложке и ограничивает периметр проточного канала, и после нанесения гидрогеля способ дополнительно включает прикрепление крышки к разделительному слою.

В одном из примеров второго аспекта после выполнения шлифовки слоя функционализированного покрытия и до выполнения прививки праймера способ дополнительно включает прикрепление крышки к по меньшей мере некоторым промежуточным участкам.

В одном из примеров второго аспекта способа нанесение гидрогеля включает нанесение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях. В одном из примеров гидрогель нанесен на слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях, и на по меньшей мере некоторые промежуточные участки. Согласно другому примеру, нанесение гидрогеля включает селективное осаждение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия.

Следует понимать, что любые признаки второго аспекта способа могут быть скомбинированы любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любые комбинации признаков этого аспекта способа и/или первого аспекта способа могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого или обоих указанных аспектов могут быть скомбинированы с любым из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

Согласно другому аспекту, проточная ячейка включает структурированную подложку, включающую углубления, разделенные промежуточными участками; поверхностный химический состав для секвенирования, закрепленное в каждом из углублений, где поверхностный химический состав для секвенирования включает: слой функционализированного покрытия, праймер, привитой к слою функционализированного покрытия; и гидрогель, расположенный на поверхностном химическом составе для секвенирования, и необязательно на некоторых промежуточных участках.

В одном из примеров проточной ячейки гидрогель также нанесен на по меньшей мере некоторые промежуточные участки.

В одном из примеров проточной ячейки слой функционализированного покрытия состоит из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида.

В одном из примеров проточной ячейки гидрогель выбран из группы, состоящей из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, сшитого полиакриламида, агарозного геля и сшитого полиэтиленгликоля.

В одном из примеров проточной ячейки гидрогель не привит к поверхностному химическому составу.

В одном из примеров проточной ячейки структурированная подложка включает по меньшей мере один проточный канал; в по меньшей мере одном проточном канале заданы углубления; и проточная ячейка дополнительно включает разделительный слой, присоединенный к другим промежуточным участкам структурированной подложки таким образом, что разделительный слой ограничивает периметр по меньшей мере одного проточного канала. В этом примере проточная ячейка может дополнительно включать крышку, присоединенную к разделительному слою.

Следует понимать, что любые признаки этого аспекта проточной ячейки могут быть скомбинированы любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого аспекта проточной ячейки и/или первого и/или второго аспектов способа могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого из аспектов могут быть скомбинированы с любым из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Признаки примеров осуществления настоящего изобретения станут более очевидными при более подробном их рассмотрении с учетом фигур, в которых подобные числовые обозначения относятся к подобным, но не обязательно идентичным, компонентам. Для краткости числовые обозначения или признаки, имеющие функции, описанные ранее, могут быть описаны или могут не быть описаны в комбинации с другими фигурами, на которых они изображены.

На Фиг. 1 представлена блок-схема, на которой показан один из примеров способа, рассмотренного в настоящей работе;

На Фиг. 2 представлена блок-схема, на которой показан другой пример способа, рассмотренного в настоящей работе;

На Фиг. 3A-3G и Фиг. 3A-3D, 3Н и 3I схематично представлены виды в разрезе соответствующих примеров осуществления способа, рассмотренного в настоящей работе;

На Фиг. 4 представлен вид в разрезе одного из примеров проточной ячейки, полученной способами, показанными на Фиг. 3A-3G и Фиг. 3A-3D, 3Н и 3I;

На Фиг. 5 представлено процентное содержание кластеров, прошедших через фильтр (англ. clusters passing filter, сокращенно обозначаемое %PF), и процентное содержание углублений/лунок, занятых матричной ДНК (% занятых) для блоков (tile) сравнительной проточной ячейки, не имеющей покрытия из гидрогеля (1-384 по оси X), и блоков проточной ячейки согласно примеру осуществления, имеющей покрытие из гидрогеля (385-768 по оси X);

На Фиг. 6 представлена зависимость процентного содержания кластеров, прошедших через фильтр (%PF), от концентрации матрицы (пикомоль) в сравнительном примере проточной ячейки и примере проточной ячейки, имеющей покрытие из гидрогеля;

На Фиг. 7 представлена зависимость чистого процентного содержания кластеров, прошедших через фильтр (%PF), после удаления дупликатных матриц от концентрации матрицы (пикомоль), полученная в сравнительном примере проточной ячейки и примере проточной ячейки, имеющей покрытие из гидрогеля; и

На Фиг. 8А и 8В представлены частоты несовпадений для прочтения 1 (R1) (Фиг. 8А) и прочтения 2 (R2) (Фиг. 8В) после проведения 150 циклов секвенирования в сравнительном примере проточной ячейки и примере проточной ячейки, имеющей покрытие из гидрогеля.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проточные ячейки часто применяют в операциях секвенирования, анализах и других биологических исследованиях. Структурированные проточные ячейки могут включать подложку или подложку, в которой или на которой заданы углубления, и в областях, ограниченных углублениями, может находиться химически и/или биологически активный химический состав, наносимый на поверхность. Например, поверхностный химический состав включает слой функционализированного покрытия и праймер. В некоторых операциях секвенирования после иммобилизации праймера в углублениях подложки проточной ячейки в углубления может быть введена матрица секвенирования (включающая часть, комплементарную праймеру), и затем матрица секвенирования может быть подвергнута амплификации с целью получения идентичных копий матрицы секвенирования (в настоящей работе этот процесс называется генерацией кластеров).

В примерах, рассмотренных в настоящей работе, гидрогель (также называемый покрытием из гидрогеля) нанесен непосредственно на поверхностный химический состав, т.е. на слой функционализированного покрытия и праймер. Было обнаружено, что покрытие из гидрогеля может замедлять скорость посева матрицы секвенирования во время генерации кластеров. Вследствие этого, после посева одной матрицы секвенирования в углубление, имеется больше времени (по сравнению со случаем отсутствия гидрогеля) для амплификации этой матрицы с образованием более крупных кластеров до того, как для следующей матрицы секвенирования представится возможность диффундировать через гидрогель в углубление. Это увеличивает популяцию углублений, в которых засевается одна матрица секвенирования. Другими словами, это повышает вероятность образования моноклональных кластеров (т.е. создания множества копий одной матрицы секвенирования) в одном конкретном углублении и снижает вероятность образования поликлональных кластеров (т.е. создания множества копий различных типов матриц секвенирования) в одном конкретном углублении. Количество кластеров, проходящих через фильтр после удаления дупликатов, может указывать на увеличение образования моноклональных кластеров. В одном из примеров величина чистого PF% для примеров согласно изобретению, включающих покрытие из гидрогеля, на величину, составляющую от приблизительно 2% до приблизительно 17%, превышает величину чистого PF% для сравнительных примеров, которые не имеют покрытия из гидрогеля.

Способ (способы), рассмотренный в настоящей работе, может быть полностью выполнен на уровне многослойной пластины, полностью на уровне площадки, частично на уровне многослойной пластины и/или частично на уровне площадки. В примере выполнения способа частично на уровнях многослойной пластины и площадки способ может быть начат на многослойной пластине, которую затем нарезают на несколько площадок, и способ может быть продолжен на каждой из площадок. Возможность выполнения обработки открытой многослойной пластины по меньшей мере в некоторых примерах позволяет применять для контроля качества и получения характеристик ряд различных метрологических/аналитических методик. До скрепления с образованием проточной ячейки структурированная многослойная пластина/подложка с модифицированной поверхностью может быть исследована, например, с помощью методик атомно-силовой микроскопии (АСМ), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), эллипсометрии, гониометрии, скатерометрии и/или флуоресцентных методик. В альтернативном варианте скрепленная проточная ячейка может быть исследована с помощью указанных методик. На уровне площадки способ (способы) может быть выполнен на площадке с открытой поверхностью или на сборной проточной ячейке (с закрытым проточным каналом).

Следует понимать, что, если не указано иное, то используемые в настоящем описании термины имеют свои обычные значения, известные в соответствующей области техники. Некоторые используемые в настоящем описании термины и их значения приведены ниже.

Формы единственного числа включают множественное число, если из контекста не ясно иное.

Термины "включающий", "содержащий" и различные формы этих терминов синонимичны по отношению друг к другу и имеют одинаково широкое значение.

Термины "верх", "низ", "верхний", "нижний", "на" и т.д. используются в настоящей работе для описания модуля проточной ячейки и/или различных компонентов проточной ячейки. Следует понимать, что такие обозначения направления не относятся к специальной ориентации, а применяются для обозначения ориентации компонентов относительно друг друга. Применение обозначений направления не должно рассматриваться как ограничение примеров, рассмотренных в настоящем описании, какой-либо конкретной ориентацией (ориентациями).

Используемый в настоящем описании термин "алкил" относится к полностью насыщенной (т.е. не содержащей двойных или тройных связей) неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке. Алкильная группа может содержать от 1 до 20 атомов углерода. Примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил, гексил и подобные группы. Например, обозначение "С1-4 алкил" указывает на то, что в алкильной цепочке содержится от одного до четырех атомов углерода, т.е. алкильная цепочка выбрана из группы, состоящей из метила, этил, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила.

Используемый в настоящем описании термин "алкенил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более двойных связей. Алкенильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода. Примеры алкенильных групп включают этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил и подобные группы.

Используемый в настоящем описании термин "алкин" или "алкинил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более тройных связей. Алкинильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода.

Используемый в настоящем описании термин "арил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (т.е. двух или более сконденсированных циклов, которые имеют два общих соседних атома углерода), которые содержат в основной цепи цикла только атомы углерода. Если арил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе представляет собой ароматический цикл. Арильная группа может содержать от 6 до 18 атомов углерода. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил, азуленил и антраценил.

Используемый в настоящем описании термин "присоединенный" означает состояние двух предметов, которые объединены, скреплены, склеены, соединены или прикреплены друг к другу. Присоединение (соединение) может быть как механическим, так и химическим. Например, нуклеиновая кислота может быть химически присоединена к слою функционализированного покрытия ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется обобществлением пары электронов совокупностью атомов. Нековалентная связь представляет собой физическую связь, которая не включает обобществление пар электронов и может включать, например, водородные связи, ионные связи, ван дер Ваальсовы силы, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия.

Термин "азид" или функциональная "азидогруппа" означает -N₃.

Используемый в настоящем описании термин "соединительная область" означает участок, расположенный на подложке, который должен быть скреплен с другим материалом, который может представлять собой, например, разделительный слой, крышку, другую подложку и т.д. или комбинации таких материалов (например, разделительный слой и крышку). Связь, образующаяся в соединительной области, может представлять собой химическую связь (рассмотренную выше) или механическую связь (например, с помощью крепежного элемента и т.д.).

Используемый в настоящем описании термин "карбоциклил" означает неароматическое циклическое кольцо (цикл) или циклическую систему, содержащую в основной цепи циклической системы только атомы углерода. Если карбоциклил представляет собой систему циклов, то два или более цикла могут быть соединены друг с другом в сконденсированную систему, соединены мостиком или в виде спироциклической системы. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. Таким образом, карбоциклилы включают циклоалкилы, циклоалкенилы и циклоалкинилы. Карбоциклильная группа может содержать от 3 до 20 атомов углерода. Примеры карбоциклильных колец включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, 2,3-дигидроинден, бицикло[2,2,2]октанил, адамантил и спиро[4,4]нонанил.

Используемый в настоящем описании термин "карбоновая кислота" или "карбоксил" означает -С(O)ОН.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкилен" означает полностью насыщенное карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, которая присоединена к остатку молекулы в двух точках присоединения.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкенил" или "циклоалкен" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере одну двойную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов. Примеры включают циклогексенил или циклогексен и норборненил или норборнен. Также используемый в настоящем описании термин "гетероциклоалкенил" или "гетероциклоалкен" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую в основной цепи цикла по меньшей мере один гетероатом и содержащую по меньшей мере одну двойную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкинил" или "циклоалкин" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере одну тройную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов. Примером является циклооктин. Другим примером является бициклононин. Также используемый в настоящем описании термин "гетероциклоалкинил" или "гетероциклоалкин" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую в основной цепи цикла по меньшей мере один гетероатом и содержащую по меньшей мере одну тройную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов.

Используемый в настоящем описании термин "осаждение" относится к любой подходящей методике нанесения, которая может быть выполнена вручную или может быть автоматизированной, и ее применение приводит к модификации свойств поверхности. Обычно осаждение может быть выполнено с применением методик осаждения из газовой фазы, методик нанесения покрытия, методик прививки или подобных методик. Некоторые конкретные примеры включают химическое осаждение из газовой фазы (ХОГФ), нанесение покрытия распылением (например, нанесение покрытия ультразвуковым распылением), нанесение покрытия центрифугированием, нанесение покрытия маканием или погружением, нанесение покрытия ножевым устройством, нанесение покрытия распределением раствора нанесение покрытия непрерывным потоком, аэрозольной печатью, струйной печатью или подобными способами.

Используемый в настоящем описании термин "углубление" относится к дискретному (отдельному) вогнутому элементу структурированной подложки, который имеет на поверхности отверстие, полностью окруженное промежуточным участком (участками) поверхности структурированной подложки. Углубления могут иметь множество различных форм находящегося на поверхности отверстия, примеры которых включают круглую, эллиптическую, квадратную, многоугольную, звездчатую форму (с любым количеством лучей) и т.д. Поперечное сечение углубления в плоскости, перпендикулярной плоскости поверхности, может быть искривленным, квадратным, многоугольным, гиперболическим, коническим, имеющим углы и т.д. Одним из примеров углубления может быть лунка.

Термин "каждый", используемый в сочетании с совокупностью предметов, предназначен для идентификации индивидуального предмета набора, но не обязательно относится к каждому предмету в наборе. Исключениями могут быть прямые контекстные указания или, если из контекста ясно вытекает иное.

Используемый в настоящем описании термин "проточная ячейка" означает емкость, включающую камеру (т.е. проточный канал), в которой может быть проведена реакция, впускное отверстие для подачи реагента (реагентов) в камеру и выпускное отверстие для удаления реагента (реагентов) из камеры. В некоторых примерах камера позволяет наблюдать протекание реакции в камере. Например, камера может включать одну или более прозрачных поверхностей, через которые может быть произведено оптическое обнаружение массивов, оптически меченых молекул или подобных элементов, находящихся в камере.

Используемый в настоящем описании термин "проточный канал" может относиться к области, ограниченной двумя соединенными компонентами, в которую может быть селективно помещен жидкий образец. В некоторых примерах проточный канал может быть заключен между структурированной подложкой и крышкой и, таким образом, может находиться в гидравлическом соединении с одним или более углублениями, имеющимися в структурированной подложке.

Согласно изобретению, "слоем функционализированного покрытия" называется полужесткий материал, проницаемый для жидкостей и газов. Слой функционализированного покрытия может состоять из гидрогеля, который может набухать при впитывании жидкости и сжиматься при удалении жидкости в процессе сушки. В примерах, рассмотренных в настоящей работе, слой функционализированного покрытия включает азид/функциональную азидогруппу, которая может реагировать с алкинной функциональной группой. В одном из примеров слой функционализированного покрытия состоит из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (англ. poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide, сокращенно PAZAM).

Используемый в настоящем описании термин "гетероарил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (например, двум или более сконденсированным циклам, имеющим два общих соседних атома), которые содержат один или более гетероатомов, то есть элемент, отличный от углерода, и неограничивающие примеры гетероарилов включают в основной цепи цикла азот, кислород и серу. Если гетероарил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе является ароматическим. Гетероарильная группа может содержать от 5 до 18 членов цикла.

Используемый в настоящем описании термин "гетероциклил" означает неароматическое циклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере один гетероатом в основной цепи цикла. Гетероциклилы могут быть соединены друг с другом в сконденсированную систему, соединены мостиком или в виде спироциклической системы. Гетероциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. В системе циклов гетероатом (гетероатомы) может присутствовать в неароматическом или ароматическом цикле. Гетероциклильная группа может содержать от 3 до 20 членов цикла (т.е. количество атомов, составляющих основную цепь цикла, включая атомы углерода и гетероатомы). В некоторых примерах гетероатом (гетероатомы) представляет собой О, N или S.

Используемый в настоящем описании термин "гидразин" или "гидразинил" относится к группе -NHNH₂.

Используемый в настоящем описании термин "гидразон" или "гидразонил" относится к группе , в которой R_a и R_b имеют значения, приведенные в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин "гидрогель" относится к трехмерной полимерной сетчатой структуре, состоящей из сшитых цепочек полимера. Гидрогель не растворим в воде или не разрушается в жидкостях, которые воздействуют на него во время секвенирования.

Используемый в настоящем описании термин "гидрокси" или "гидроксил" относится к группе -ОН.

Используемый в настоящем описании термин "промежуточный участок" относится к области, находящейся в основе или на поверхности, которая разделяет углубления. Например, промежуточный участок может отделять один элемент массива (биочипа) от другого элемента массива. Два разделенных элемента могут быть дискретными, т.е. не имеющими физического контакта друг с другом. В другом примере промежуточный участок может отделять первую часть элемента от второй части элемента. Во многих примерах промежуточный участок непрерывен, в то время как элементы дискретны, например, как в случае совокупности лунок, ограниченных в остальном непрерывной поверхностью. Разделение, обеспечиваемое промежуточным участком, может быть частичным или полным разделением. Поверхностный материал промежуточных участков может отличаться от поверхностного материала элементов, сформированных в поверхности. Например, элементы биочипа могут включать количество или концентрацию слоя покрытия и праймера (праймеров), которая превышает их количество или концентрацию в промежуточных участках. В некоторых примерах в промежуточных участках слой покрытия и праймер (праймеры) могут отсутствовать.

Используемый в настоящем описании термин "нитрилоксид" означает группу "R_aC≡N⁺O^-", в которой R_a имеет определение, рассмотренное в настоящем описании. Примеры получения нитрилоксида включают генерацию in situ из альдоксимов под действием хлорамида-Т или при действии основания на имидоилхлориды [RC(Cl)=NOH].

Используемый в настоящем описании термин "нитрон" означает группу в которой R₁, R₂ и R₃ могут представлять собой любые из групп R_a и R_b, рассмотренных в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин "нуклеотид" включает азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более фосфатных групп. Нуклеотиды представляют собой мономерные единицы последовательности нуклеиновой кислоты. В РНК сахар представляет собой рибозу, и в ДНК сахар представляет собой дезоксирибозу, т.е. сахар, не имеющий гидроксильной группы, которая присутствует в положении 2' рибозы. Азотсодержащее гетероциклическое основание (т.е. нуклеиновое основание) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G) и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидна или N-9 пурина.

Термин "подложка проточной ячейки" или "подложка" означает основу, на поверхности которой может находиться нанесенный химический состав. Термин "структурированная подложка" означает основу, в которой или на которой имеются углубления. Подложка может представлять собой многослойную пластину, панель, прямоугольный лист, площадку или иметь любую другую подходящую конфигурацию. Подложка обычно изготовлена из жесткого материала и нерастворима в водной жидкости. Подложка может быть инертна по отношению к химическому составу, который применяют для модификации углублений. Например, подложка может быть инертна по отношению к химическому составу, применяемому для нанесения слоя функционализированного покрытия, для присоединения праймера (праймеров) к слою функционализированного покрытия, для нанесения гидрогеля и т.д. Примеры подходящих материалов для основ включают эпоксисилоксан, полиэдральные олигомерные силсесквиоксаны (англ. polyhedral oligomeric silsesquioxane, сокращенно POSS) или их производные, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, полимеры (включающие акриловые полимеры, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (такой как TEFLON®, поставляемый Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (англ. cycloolefin polymer, сокращенно СОР) (такие как ZEONOR®, поставляемый Zeon), полиимиды и т.д.), нейлон, керамические материалы/керамические оксиды, оксид кремния, плавленый оксид кремния или материалы на основе оксида кремния (например, включающие по меньшей мере 10% оксида кремния), силикат алюминия, кремний и модифицированный кремний (например, бор, легированный р+ кремнием), нитрид кремния (Si₃N₄), оксид кремния (SiO₂), пентоксид тантала (ТаО₅) или другой оксид (оксиды) тантала (ТаО_х), оксид гафния (HaO₂), углерод, металлы, неорганические стекла или подобные материалы. Подложка также может быть изготовлена из стекла или кремния или POSS или производных указанных материалов и иметь на поверхности слой покрытия из оксида титана или другого керамического оксида.

Используемый в настоящем описании термин "плазменное травление" относится к способу удаления органического вещества с подложки кислородной плазмой. Продукты, получаемые при плазменном травлении, могут быть удалены с помощью вакуумного насоса/вакуумной системы. Плазменное травление может активировать подложку посредством введения реакционноспособных гидроксильных групп или карбоксильных групп.

Используемый в настоящем описании термин "праймер" означает одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты (например, одноцепочечную ДНК или одноцепочечную РНК), которая служит начальной точкой для синтеза ДНК или РНК. Конец 5' праймера может быть модифицирован для проведения реакции присоединения к слою функционализированного покрытия. Длина праймера может составлять любое количество оснований, и праймер может включать различные не встречающиеся в природе нуклеотиды. В одном из примеров праймер секвенирования представляет собой короткую цепочку, включающую от 20 до 40 оснований.

Используемые в настоящем описании термины "силан" и "производное силана" относятся к органическому или неорганическому соединению, содержащему один или более атомов кремния. Примером неорганического силана является SiH₄ или галогенированный SiH₄, в котором водород замещен одним или более атомами галогена. Примером органического силана является соединение X-R^B-Si(OR^C)₃, в котором X представляет собой органическую группу, такую как аминогруппа, винил, метакрилат, эпоксигруппа (), сера, алкил, алкенил или алкинил; R^B представляет собой спейсер, например -(СН₂)_n-, где n составляет от 0 до 1000; R^C выбран из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкинила, необязательно замещенного карбоциклила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного 5-10-членного гетероарила и необязательно замещенного 5-10-членного гетероциклила, определения которых представлены в настоящем описании. Используемые в настоящем описании термины "силан" и "производное силана" могут относиться к смесям различных силанов и/или производных силана.

В некоторых примерах силан или производное силана включает ненасыщенный фрагмент, который может реагировать с функциональной группой слоя функционализированного полимера. Используемый в настоящем описании термин "ненасыщенный фрагмент" относится к химической группе, которая включает алкены, алкины, циклоалкены, циклоалкины, гетероциклоалкены, гетероциклоалкины или их необязательно замещенные варианты, включающие по меньшей мере одну двойную связь или одну тройную связь. Ненасыщенные фрагменты могут быть одновалентными или двухвалентными. Если ненасыщенный фрагмент одновалентен, то циклоалкены, циклоалкины, гетероциклоалкены и гетероциклоалкины применяют взаимозаменяемо с циклоалкенилами, циклоалкинилами, гетероциклоалкенилами и гетероциклоалкинилами, соответственно. Если ненасыщенный фрагмент двухвалентен, то циклоалкен, циклоалкин, гетероциклоалкен и гетероциклоалкин применяют взаимозаменяемо с циклоалкениленом, циклоалкиниленом, гетероциклоалкениленом и гетероциклоалкиниленом, соответственно.

Ненасыщенный фрагмент может быть ковалентно присоединен либо непосредственно к атомам кремния силана или производного силана, либо присоединен опосредованно через линкеры. Примеры подходящих линкеров включают необязательно замещенные алкилены (например, двухвалентные насыщенные алифатические радикалы (такие как этилен), которые можно рассматривать как радикалы, полученные из алкена при раскрытии двойной связи или из алкана удалением двух атомов водорода у разных атомов углерода), замещенные полиэтиленгликоли или подобные соединения.

Используемый в настоящем описании термин "разделительный слой" относится к материалу, который связывает друг с другом два компонента. В некоторых примерах разделительный слой может состоять из материала, способного поглощать излучение, который способствует образованию связи, или слой может контактировать с материалом, способным поглощать излучение, который способствует образованию связи.

Используемый в настоящем описании термин "поверхностный химический состав" означает химически и/или биологически активный компонент (компоненты), который помещен в углубления структурированной подложки. Примеры поверхностного химического состава, рассмотренного в настоящей работе, включают слой функционализированного полимера, присоединенный к по меньшей мере части поверхности подложки, и/или и праймер, присоединенный к по меньшей мере части слоя функционализированного полимера.

Функциональная "тиольная" группа означает -SH.

Используемые в настоящем описании термины "тетразин" и "тетразинил" означают шестичленную гетероарильную группу, включающую четыре атома азота. Тетразин может быть необязательно замещен.

Используемый в настоящем описании термин "тетразол" означает пятичленную гетероциклическую группу, включающую четыре атома азота. Тетразол может быть необязательно замещен.

Пример способа 100 представлен на Фиг. 1. Способ 100 включает нанесение слоя функционализированного покрытия на углубления структурированной подложки проточной ячейки, где углубления отделены друг от друга промежуточными участками (показано условным обозначением 102), прививку праймера к слою функционализированного покрытия в результате чего образуется привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях (показано условным обозначением 104), и нанесение гидрогеля на по меньшей мере привитой слой функционализированного покрытия (показано условным обозначением 106).

Структурированная подложка проточной ячейки может представлять собой структурированную многослойную пластину или структурированную площадку или любую другую структурированную основу согласно изобретению. Может быть применен любой пример подложки, рассмотренной в настоящей работе. Структурированная подложка(показана условным обозначением 12 на Фиг. 3А и 4) включает углубления, созданные на или в открытом слое или поверхности подложки, и промежуточные участки, разделяющие соседние углубления. Углубления могут быть созданы в или на основе с помощью различных методик, примеры которых включают фотолитографию, наноимпринтную литографию, методики штампования, методики тиснения, методики формования, методики микротравления, методики печати и т.д. Специалистам в данной области техники должно быть известно, что тип применяемой методики зависит от состава и формы подложки. Изобретение включает применение множества различных систем расположения углублений, что рассмотрено более подробно при описании Фиг. 4А.

Несмотря на то, что это не показано на Фиг. 1, перед нанесением слоя функционализированного покрытия и прививкой праймера (т.е. до нанесения поверхностного химического состава) способ может включать обработку поверхности, которая состоит в очистке структурированной подложки и/или в ее обработке другим способом для подготовки поверхности (например, углублений и в некоторых примерах прилегающих промежуточных участков) структурированной подложки для последующего нанесения поверхностного химического состава. Например, способ может включать обработку поверхности структурированной подложки проточной ячейки для присоединения к поверхности функциональной группы с целью образования обработанных углублений и в некоторых примерах обработанных промежуточных участков. Более подробно примеры способов обработки (например, способа очистки и способа (способов) подготовки поверхности) рассмотрены ниже при описании Фиг. 3А-3I.

В примере, показанном на Фиг. 1, добавление поверхностного химического состава включает размещение слоя функционализированного покрытия в углублении (углублениях) (условное обозначение 102) и прививку праймера к слою функционализированного покрытия (условное обозначение 104).

Пример материала слоя функционализированного покрытия включает акриламидный сополимер, такой как сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, обозначаемый PAZAM. PAZAM и некоторые другие виды акриламидных сополимеров могут быть представлены Формулой (I):

где:

R^A выбран из группы, состоящей из азидогруппы, необязательно замещенной аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидроксигруппы, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона и тиола;

R^B представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;

R^C, R^D и R^E независимо выбраны из группы, состоящей из Н и необязательно замещенного алкила;

каждая из групп -(СН₂)_p- может быть необязательно замещенной;

р представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50;

n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50000; и

m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что расположение повторяющихся элементов "n" и "m" в Формуле (I) является неограничивающим примером, и мономерные субъединицы могут присутствовать в структуре полимера в любом порядке (например, в виде неупорядоченного полимера, блок-полимера, структурированного полимера или комбинации таких полимеров).

Один из конкретных примеров PAZAM имеет следующую формулу:

где n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 20000, и m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

Молекулярная масса PAZAM может составлять от приблизительно 10 кДа до приблизительно 1500 кДа или в одном из конкретных примеров может составлять приблизительно 312 кДа.

В некоторых примерах PAZAM представляет собой линейный (неразветвленный) полимер. В некоторых других примерах PAZAM представляет собой сшитый до некоторой степени полимер.

В других примерах слой функционализированного покрытия может состоять из соединения, имеющего вариант Формулы (I). В одном из примеров акриламидное звено может быть заменено N,N-диметилакриламидом (). В этом примере акриламидное звено в Формуле (I) может быть заменено звеном , где каждый из R^D, R^E и R^F представляет собой Н, и каждый из R^G и R^H представляет собой метильную группу (вместо Н в случае акриламида). В этом примере q может представлять собой целое число, составляющее от 1 до 100000. Согласно другому примеру, N,N-диметилакриламидное звено может быть применено в дополнение к акриламидному звену. В этом примере наряду с повторяющимися элементами "n" и "m" Формула (I) может включать звено, где каждый из R^D, R^E и R^F представляет собой Н, и каждый из R^G и R^H представляет собой метильную группу. В этом примере q может представлять собой целое число, составляющее от 1 до 100000.

Следует понимать, что для получения слоя функционализированного покрытия могут быть применены другие функционализированные молекулы, при условии, что их функциональные группы способны взаимодействовать со структурированной подложкой и наносимым впоследствии праймером (праймерами). Другие примеры подходящих молекул для образования слоя функционализированного покрытия включают материалы, имеющие коллоидную структуру, такие как агароза, или полимерную сетчатую структуру, такие как желатин, или сшитую полимерную структуру, такие как полиакриламидные полимеры и сополимеры, не содержащий силана акриламид (англ. silane free acrylamide, сокращенно SFA) или азидолизированый вариант SFA. Примеры подходящих полиакриламидных полимеров могут быть получены из акриламида и акриловой кислоты или акриловой кислоты, содержащей винильную группу, или из мономеров, которые вступают в реакции [2+2] фотоциклоприсоединения.

Функционализированная молекула (например, PAZAM) может быть нанесена на поверхность структурированной подложки нанесением покрытия центрифугированием или нанесением покрытия погружением или маканием или пропускание функционализированной молекулы в потоке при положительном или отрицательном давлении или с помощью другой подходящей методики. Функционализированная молекула может присутствовать в смеси. В одном из примеров смесь включает PAZAM в воде или в смеси этанола и воды.

После нанесения покрытия функционализированная молекула также может быть подвергнута отверждению, которое приводит к образованию слоя функционализированного покрытия на всей структурированной подложке (т.е. на углублении (углублениях) и промежуточном участке (участках)). В одном из примеров отверждение функционализированной молекулы может быть проведено при температуре, составляющей от комнатной температуры (например, приблизительно 25°С) до приблизительно 60°С, в течение времени, составляющего от приблизительно 5 минут до приблизительно 2 часов.

Для образования слоя функционализированного покрытия в углублении (углублениях), но не на промежуточном участке (участках) структурированной подложки, слой функционализированного покрытия может быть удален шлифовкой с промежуточных участков с помощью i) щелочной водной суспензии, имеющей рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 11 и включающей абразивную частицу, или ii) шлифовальной подушки и раствора, не содержащего абразивных частиц.

В этом примере способа 100 праймер затем прививают к слою функционализированного покрытия, оставшемуся в углублении (углублениях), что отмечено условным обозначением 104, в результате чего образуется привитой слой функционализированного покрытия. Примеры подходящих праймеров включают праймеры прямой амплификации или праймеры обратной амплификации. Конкретные примеры подходящих праймеров включают праймеры Р5 или Р7, которые имеются на поверхности коммерчески доступных проточных ячеек, поставляемых Illumina Inc. для секвенирования на платформах HISEQ®, HISEQX®, MISEQ™, MISEQX™, NEXTSEQ™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™ и других инструментальных платформах.

Прививка может быть произведена нанесением покрытия маканием, нанесением покрытия распылением, нанесением покрытия распределением раствора или другим подходящим способом, который позволяет прикреплять праймер (праймеры) к слою функционализированного покрытия в по меньшей мере некоторых углублениях. В каждом из перечисленных примеров методик может быть использован раствор праймера или смесь праймера, которая может включать праймер (праймеры), воду, буфер и катализатор.

Нанесение покрытия маканием может включать погружение структурированной подложки (в углублении (углублениях) которой имеется слой функционализированного покрытия) в серию ванн с регулируемой температурой. В ваннах также может иметься регулировка потока и/или они могут находиться в атмосфере азота. Ванны могут содержать раствор или смесь праймера. При пропускании через различные ванны происходит присоединение праймера (праймеров) к слою функционализированного покрытия, находящемуся в по меньшей мере некотором углублении (углублениях). В одном из примеров структурированную подложку с покрытием, полученным после шлифовки вводят в первую ванну, содержащую раствор или смесь праймера, в которой протекает реакция присоединения праймера (праймеров), после чего структурированную подложку перемещают в следующие ванны для промывки. Структурированная подложка может быть перемещена из одной ванны в другую с помощью автоматического манипулятора или вручную. При нанесении покрытия маканием также может быть применена система сушки.

Нанесение покрытия распылением может быть выполнено распылением раствора или смеси праймера непосредственно на структурированную подложку с покрытием, полученным после шлифовки. Многослойная пластина с покрытием, нанесенным распылением, может быть подвергнута инкубации в течение времени, составляющего от приблизительно 4 минут до приблизительно 60 минут, при температуре, составляющей от приблизительно 0°С до приблизительно 70°С. После инкубации раствор или смесь праймера могут быть разбавлены и удалены с помощью, например, устройства для нанесения покрытия центрифугированием.

Нанесение покрытия распределением раствора может быть выполнено способом, включающим налив и центрифугирование, и, таким образом, оно может быть выполнено с помощью устройства для нанесения центрифугированием. Раствор или смесь праймера может быть нанесена (вручную или автоматизированным способом) на структурированную подложку с покрытием, полученным после шлифовки. Наносимый раствор или смесь праймера могут быть нанесены на или распределены по всей поверхности структурированной подложки с покрытием, полученным после шлифовки. Структурированная подложка с покрытием, содержащим праймер, может быть подвергнута инкубации в течение времени, составляющего от приблизительно 2 минут до приблизительно 60 минут, при температуре, составляющей от приблизительно 0°С до приблизительно 80°С. После инкубации раствор или смесь праймера могут быть разбавлены и удалены с помощью, например, устройства для нанесения покрытия центрифугированием.

В одном из примеров после прививки праймера к слою функционализированного покрытия в углублении (углублениях) с образованием привитого слоя функционализированного покрытия этот пример способа 100 дополнительно включает нанесение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия (показано условным обозначением 106).

Гидрогель может представлять собой любой гидрофильный полимер, который служит фильтром для матриц секвенирования, которые поступают в проточную ячейку. Осаждение гидрогеля частично контролируют регулированием концентрации полимера в растворе, наносимом на проточную ячейку. Гидрогель замедляет диффузию матриц секвенирования в углубления, создавая тем самым достаточно времени для посева единичной матрицы секвенирования, в результате чего находящийся в углублении кластер успевает диффундировать через гидрогель до момента внедрения другой матрицы секвенирования. Гидрогель также остается на проточной ячейке во время посева матрицы секвенирования и во время проведения других этапов секвенирования, и, таким образом, нерастворим в воде или не может быть удален под действием жидкостей, которые воздействуют на него в процессе секвенирования. Некоторые примеры гидрогелей включают PAZAM (или его варианты, указанные в настоящей работе), сшитый полиакриламид, агарозный гель, сшитый полиэтиленгликоль (ПЭГ) или подобные вещества. Гидрогель может представлять собой другой сополимер на основе акриламида, сополимер на основе агарозы или сополимер на основе ПЭГ. Следует понимать, что сополимер на основе X (например, на основе акриламида, на основе агарозы, на основе ПЭГ и т.д.) включает компонент X в количестве, приблизительно составляющем 10 мас.% или более от молекулярного состава (англ. molecular mass composition). В некоторых примерах сополимер на основе X включает приблизительно 10% группового молекулярного состава или приблизительно 11% группового молекулярного состава, или приблизительно 12% группового молекулярного состава, или приблизительно 15% группового молекулярного состава, или приблизительно 20% группового молекулярного состава, или приблизительно 39% группового молекулярного состава или более процентов содержания компонента X. Кроме того, содержание компонента X может быть выше или ниже указанных значений при условии, что сополимер функционирует как гидрогель. Гидрогель из сшитого ПЭГ может быть синтезирован сшивкой с помощью ковалентных связей макромеров ПЭГ с реакционноспособными конечными группами цепей, так какими акрилатные, метакрилатные группы, группы простого аллилового эфира, малеимида, винилсульфона, сложного NHS эфира и простого винилового эфира. Гидрогели любого из примеров могут включать гидрофобные или гидрофильные боковые цепочки.

На гидрогель не прививают праймер (праймеры); напротив, гидрогель покрывает праймер (праймеры).

В некоторых примерах гидрогель может быть селективно осажден или осажден в виде схемы, закрывая поверхностный химический состав (который в этом примере представляет собой слой функционализированного покрытия и находящийся на нем праймер (праймеры)), так что при этом соединительная область структурированной подложки проточной ячейки остается открытой. Соединительная область структурированной подложки проточной ячейки обычно расположена на некотором промежуточном участке (участках) структурированной подложки проточной ячейки, там, где к структурированной подложке должна быть присоединена крышка. Если структурированная подложка представляет собой многослойную пластину, то соединительная область может определять границы (например, периметры) нескольких проточных ячеек, которые формируются на многослойной пластине. Если структурированная подложка представляет собой площадку, то соединительная область может определять наружные границы (например, периметр) одной образующейся проточной ячейки. Следует понимать, что другая часть (части) структурированной подложки проточной ячейки, которая не является частью соединительной области, может иметь покрытие из гидрогеля.

В этом примере способа 100 селективное осаждение гидрогеля или осаждение гидрогеля в виде схемы может быть выполнено инкубацией раствора, нанесением покрытия маканием, нанесением покрытия центрифугированием, нанесением покрытия распылением, нанесением покрытия ультразвуковым распылением, нанесением покрытия ножевым устройством, аэрозольной печатью или струйной печатью. Чтобы гидрогель не попадал на соединительную область, для укрывания соединительной области структурированной подложки может быть применен экран. Селективное осаждение гидрогеля может быть применено для нанесения гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия, расположенный в углублениях, а не на промежуточные участки.

В других примерах крышка может быть соединена с соединительной областью структурированной подложки проточной ячейки после образования слоя функционализированного покрытия, и праймеры и гидрогель могут быть нанесены проточным способом.

В каждом из примеров методик нанесения гидрогеля может быть применена водная смесь, которая может содержать воду и до приблизительно 0,1% (мас./об.) материала гидрогеля. В некоторых примерах материал гидрогеля составляет 0,1% или менее от массы водной смеси. В других примерах водная смесь включает от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% материала гидрогеля или от приблизительно 0,025% до приблизительно 0,005% материала гидрогеля. Следует понимать, что концентрация водной смеси может быть разной и зависеть от архитектуры проточной ячейки (например, размеров проточного канала, впускных и выпускных отверстий и т.д.). Например, если применяют проточное осаждение, то может быть выбрана такая концентрация, чтобы при протекании водной смеси через проточную ячейку не происходило закупоривание отверстия (отверстий), проточного канала и т.д. Таким образом, концентрация также может превышать приблизительно 0,1%. Материал гидрогеля (получаемого покрытия из гидрогеля) может представлять собой материал любого из примеров, рассмотренных в настоящей работе (т.е. представлять собой PAZAM или его варианты, сшитый полиакриламид, агарозный гель и т.д.).

В некоторых примерах водная смесь также может включать добавки, такие как сорастворители, антиоксиданты, красители, стабилизаторы по отношению к ультрафиолетовому излучению, технологические добавки или подобные добавки. Эти добавки могут быть включены в водную смесь в количествах, которые не оказывают негативного влияния на текучесть смеси или пленкообразующую способность гидрогеля.

После нанесения водной смеси, ее подвергали инкубации для образования гидрогеля. Продолжительность и температура инкубации раствора могут иметь любые величины, достаточные для образования гидрогеля. В некоторых примерах температура может составлять от комнатной температуры до приблизительно 65°С и продолжительность может составлять от приблизительно 5 минут до приблизительно 1 часа или более. В одном из примеров инкубацию раствора проводят при температуре, составляющей приблизительно 50°С, в течение приблизительно 10 минут.

В некоторых примерах водная смесь может быть частично высушена во время образования гидрогеля. Частичная сушка может быть произведена выдержкой на воздухе, выдержкой в атмосфере азота, в вакууме, при нагревании (например, в сушильном шкафу) или нанесением покрытия центрифугированием (т.е. центрифугированием досуха). В одном из примеров, в котором применяют нагревание, температура может составлять приблизительно 50°С, и гидрогель может быть выдержан при этой температуре в течение приблизительно 10 минут. Гидрогель также может быть промыт разбавленным буфером.

Другой пример способа 200 представлен на Фиг. 2. Способ 200 включает присоединение силана или производного силана к поверхности структурированной подложки, включающей проточный канал, в котором имеются углубления, где углубления отделены друг от друга промежуточными участками, что приводит к образованию силанизированных углублений и силанизированных промежуточных участков (обозначено цифрой 202), нанесение слоя функционализированного покрытия на силанизированные углубления и на силанизированные промежуточные участки (обозначено цифрой 204); удаление слоя функционализированного покрытия шлифовкой с силанизированных промежуточных участков (обозначено цифрой 206); прививку праймера к слою функционализированного покрытия, находящемуся в силанизированных углублениях, в результате чего образуется привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях (обозначено цифрой 208); и нанесение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях (обозначено цифрой 210). Примеры способа 200 дополнительно рассмотрены ниже со ссылками на Фиг. 3А-3Е и на Фиг. 3A-3D в комбинации с Фиг. 3Н и 3I.

На Фиг. 3А представлен вид в разрезе примера структурированной подложки 12. Структурированная подложка 12 может представлять собой структурированную многослойную пластину или структурированную площадку или любую другую структурированную подложку(например, панель, прямоугольный лист и т.д.). Может быть применен любой пример подложки 12, рассмотренный в настоящей работе. Структурированная многослойная пластина может быть применена для получения нескольких проточных ячеек, и структурированная площадка может быть применена для получения одной проточной ячейки. В одном из примеров диаметр подложки может составлять от приблизительно 2 мм до приблизительно 300 мм, или наибольший размер прямоугольного листа или панели может составлять до 10 футов (что приблизительно составляет 3 метра). В одном из примеров подложка в виде многослойной пластины имеет диаметр, составляющий от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм. Согласно другому примеру, площадка, представляющая собой основу, имеет ширину, составляющую от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 10 мм. Несмотря на то, что в настоящей работе приведены примеры размеров, следует понимать, что могут быть применены подложки, имеющие любые подходящие размеры.

Структурированная подложка 12 включает углубления 14, находящиеся на или в наружном открытом слое или поверхности подложки 12, и промежуточные участки 16, разделяющие соседние углубления 14. В примерах, рассмотренных в настоящей работе, углубления 14 подвергают функционализации нанесением поверхностного химического состава (например, 20, 22), в то время как промежуточные участки 16 могут быть применены для соединения, и праймер (праймеры) на них отсутствует (22, как показано на Фиг. 3E-3G и 3I).

Углубления 14 могут быть изготовлены в или на подложке 12 с помощью различных методик, включающих, например, фотолитографию, наноимпринтную литографию, методики штамповки, методики тиснения, методики формования, методики микротравления, методики печати и т.д. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что выбор применяемой методики зависит от состава и формы подложки 12.

Изобретение включает применение различных схем расположения углублений 14, которые включают упорядоченные, повторяющиеся и неупорядоченные схемы. В одном из примеров углубления 14 расположены в виде гексагональной сетки с целью плотной упаковки и достижения повышенной плотности. Другие схемы расположения могут включать, например, прямолинейные (т.е. прямоугольные) схемы расположения, треугольные схемы расположения и т.д. В некоторых примерах схема или шаблон расположения углублений 14 может находиться в х-у формате, то есть включать ряды и колонки. В некоторых других примерах схема или шаблон расположения углублений 14 и/или промежуточных участков 16 может представлять собой повторяющееся размещение. В других примерах схема или шаблон расположения углублений 14 и/или промежуточных участков 16 может представлять собой размещение в случайном порядке. Шаблон может включать участки, плоскости, лунки, столбики, полосы, изгибы, линии, треугольники, прямоугольники, круги, арки, шахматные схемы, перекрещивающиеся полосы, диагонали, стрелки, квадраты и/или перекрещивающиеся штрихи.

Схема или шаблон расположения углублений может быть охарактеризована плотностью углублений 14 (т.е. количеством углублений 14) в ограниченной области. Например, углубления 14 могут присутствовать с плотностью, составляющей приблизительно 2 миллиона на мм². Могут быть достигнуты различные значения плотности, включающие, например, плотность, составляющую по меньшей мере приблизительно 100 на мм², приблизительно 1000 на мм², приблизительно 0,1 миллиона на мм², приблизительно 1 миллион на мм², приблизительно 2 миллиона на мм², приблизительно 5 миллионов на мм², приблизительно 10 миллионов на мм², приблизительно 50 миллионов на мм² или более. В альтернативном варианте или дополнительно может выбрана величина плотности, не превышающая приблизительно 50 миллионов на мм², приблизительно 10 миллионов на мм², приблизительно 5 миллионов на мм², приблизительно 2 миллиона на мм², приблизительно 1 миллион на мм², приблизительно 0,1 миллиона на мм², приблизительно 1000 на мм², приблизительно 100 на мм² или менее. Также следует понимать, что плотность размещения углублений 14 на подложке 12 может составлять от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов. В некоторых примерах массив с высокой плотностью может быть охарактеризован как массив, содержащий углубления 14, разделенные областью, составляющей менее приблизительно 100 нм, массив со средней плотностью может быть охарактеризован как массив, содержащий углубления 14, разделенные областью, составляющей от приблизительно 400 нм до приблизительно 1 мкм, и массив с низкой плотностью может быть охарактеризован как массив, содержащий углубления 14, разделенные областью, составляющей более чем приблизительно 1 мкм. Несмотря на то, что выше были приведены примеры величин плотностей, следует понимать, что могут быть применены подложки, имеющие любые подходящие плотности.

Также или в альтернативном варианте характеристикой схемы или шаблона расположения может быть средний шаг, т.е. расстояние от центра углубления 14 до центра соседнего промежуточного участка (расстояние от центра до центра). Шаблон может быть упорядоченным, то есть иметь малый коэффициент отклонения среднего шага, или шаблон может быть неупорядоченным, и в этом случае коэффициент отклонения может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, по меньшей мере приблизительно 10 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно наибольшее значение среднего шага может составлять, например, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее. Величина среднего шага конкретного шаблона расположения сайтов 16 может составлять от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов. В одном из примеров шаг между углублениями 14 (расстояние от центра до центра) составляет приблизительно 1,5 мкм. Несмотря на то, что выше были приведены примеры величин среднего шага, следует понимать, что могут быть применены другие величины среднего шага.

В примерах, показанных на Фиг. 3A-3I, углубления 14 представляют собой лунки 14', и, таким образом, на поверхности структурированной подложки 12 имеется массив лунок 14'. Лунки 14' могут представлять собой микролунки или нанолунки. Характеристики каждой лунки 14' могут включать объем, площадь отверстия лунки, ее глубину и/или диаметр.

Каждая лунка 14' может иметь любой объем, достаточный для удержания жидкости. Минимальный или максимальный объем может быть выбран, например, для достижения требуемой производительности (например, мультиплексности) и разрешения, для соответствия составу анализируемого вещества или реакционной способности анализируемого вещества, ожидаемой при применении проточной ячейки в качестве единицы последующей обработки. Например, объем может составлять по меньшей мере приблизительно 1×10^-3 мкм³, приблизительно 1×10^-2 мкм³, приблизительно 0,1 мкм³, приблизительно 1 мкм³, приблизительно 10 мкм³, максимальный объем может составлять приблизительно 1×10⁴ мкм³, приблизительно 1×10³ мкм³, приблизительно 100 мкм³, приблизительно 10 мкм³, приблизительно 1 мкм³, приблизительно 0,1 мкм³ или менее. Следует понимать, что слой функционализированного покрытия может заполнять весь объем или часть объема лунки 14'. Объем слоя покрытия в индивидуальной лунке 14' может превышать указанные выше величины, быть меньше указанных выше величин или иметь промежуточное значение.

Площадь, занимаемая отверстием каждой лунки на поверхности, может быть выбрана с учетом критериев, аналогичных указанным выше для объема лунки. Например, площадь, занимаемая отверстием каждой лунки на поверхности, может составлять по меньшей мере приблизительно 1×10^-3 мкм², приблизительно 1×10^-2 мкм², приблизительно 0,1 мкм², приблизительно 1 мкм², приблизительно 10 мкм², приблизительно 100 мкм² или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальная площадь может составлять приблизительно 1×10³ мкм², приблизительно 100 мкм², приблизительно 10 мкм², приблизительно 1 мкм², приблизительно 0,1 мкм², приблизительно 1×10^-2 мкм² или менее. Площадь, занимаемая отверстием каждой лунки, может превышать указанные выше величины, быть меньше указанных выше величин или иметь промежуточное значение.

Глубина каждой лунки 14' может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальная глубина может составлять приблизительно 1×10³ мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее. Глубина каждой лунки 14' может превышать указанные выше величины, быть меньше указанных выше величин или иметь промежуточное значение.

В некоторых случаях диаметр каждой лунки 14' может составлять по меньшей мере приблизительно 50 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальный диаметр может составлять приблизительно 1×10³ мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее (например, приблизительно 50 нм). Диаметр каждой лунки 14' может превышать указанные выше величины, быть меньше указанных выше величин или иметь промежуточное значение.

Структурированная подложка 12 может быть подвергнута серии этапов обработки с целью нанесения на углубление (углубления) 14 поверхностного химического состава 20, 22.

Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что для очистки и активации поверхности структурированная подложка 12 может быть подвергнута плазменному травлению. Например, с помощью плазменного травления может быть удален органический материал и введены поверхностные гидроксильные группы. Для очистки подложки 12 могут быть применены другие подходящие способы очистки, выбор которых частично зависит от типа подложки 12. Например, может быть выполнена химическая очистка окислителями или щелочными растворами.

Затем структурированная подложка 12 (показанная на Фиг. 3А) может быть подвергнута обработке, состоящей в подготовке поверхности 12 для осаждения функционализированного полимера, который образует слой 20 функционализированного полимера (Фиг. 3С). В одном из примеров структурированная подложка 12 может быть подвергнута силанизации, которая состоит в присоединении силана или производного 18 силана (Фиг. 3В) к поверхности структурированной многослойной пластины. Силанизация позволяет вводить силан или производное 18 силана по всей площади поверхности, включая углубления 14, 14' (например, на нижнюю поверхность и вдоль боковых стенок), и на промежуточные участки 16. Согласно некоторым аспектам, силан или производное силана селективно вводят только в углубления структурированной подложки или в микроучастки (изолированные друг от друга) неструктурированной подложки.

Для силанизации может быть применен любой силан или производное 18 силана. Выбор силана или производного 18 силана может частично зависеть от типа функционализированной молекулы, которую применяют для образования слоя 20 функционализированного полимера (показанного на Фиг. 3С), поскольку может быть желательным образование ковалентной связи между силаном или производным 18 силана и слоем 20 функционализированного полимера. Способ, применяемый для присоединения силана или производного 18 силана к подложке 12, может зависеть от типа применяемого силана или производного 18 силана. Ниже представлены некоторые примеры.

В одном из примеров силаном или производным 18 силана является (3-аминопропил)триэтоксисилан (англ. (3-aminopropyl)triethoxysilane, сокращенно APTES) или (3-аминопропил)триметоксисилан (англ. (3-aminopropyl)trimethoxysilane, сокращенно APTMS) (т.е. X-R^B-Si(OR^C)₃, где X представляет собой аминогруппу, R^B представляет собой -(СН₂)₃-, и R^C представляет собой этил или метил). В этом примере поверхность подложки 12 может быть предварительно обработана (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES) или (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) с образованием ковалентной связи между кремнием и одним или более атомами кислорода, находящимися на поверхности (не придерживаясь какого-либо механизма, можно предположить, что каждый атом кремния может связываться с одним, двумя или тремя атомами кислорода). Такую обработанную химическим способом поверхность подвергают воздействию повышенных температур для образования монослоя из аминогрупп. Затем аминогруппы вводят в реакцию с Сульфо-HSAB (англ. N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate, что означает N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат) с образованием азидопроизводного. Активация УФ излучением энергией в диапазоне от 1 Дж/см² до 30 Дж/см² при 21°С приводит к генерации активных нитреновых частиц, которые могут с легкостью вступать в различные реакции включения с PAZAM (например, с функционализированной молекулой). В некоторых аспектах силан или производное силана селективно наносят на углубления, имеющиеся в структурированной подложке, или на микроучастки неструктурированной подложки.

Также могут быть применены другие способы силанизации. Примеры подходящих способов силанизации включают осаждение из газовой фазы, способ, разработанный Yield Engineering Systems ("способ YES"), нанесение покрытия центрифугированием или другие способы осаждения. Некоторые примеры способов и материалов, которые могут быть применены для силанизации подложки 12, рассмотрены в настоящей работе; тем не менее, следует понимать, что могут быть применены другие способы и материалы.

В одном из примеров, в котором для проведения способа YES применяют печь для проведения ХОГФ, структурированную многослойную подложку 12 помещают в печь ХОГФ. Камера может быть продута, после чего начинают цикл силанизации. При проведении циклов емкость с силаном или производным силана может быть выдержана при подходящей температуре (например, приблизительно 120°С для норборненсилана), подходящая температура может поддерживаться в трубопроводах для подачи паров силана или производного силана (например, приблизительно 125°С для норборненсилана), и подходящая температура (например, приблизительно 145°С) может поддерживаться в вакуумных трубопроводах.

В другом примере силан или производное 18 силана (например, жидкий норборненсилан) может быть осаждено внутри стеклянного флакона, и флакон может быть помещен в стеклянный вакуумный эксикатор, содержащий структурированную подложку 12. Затем из эксикатора может быть откачан воздух до достижения давления, составляющего от приблизительно 15 миллитор до приблизительно 30 миллитор (приблизительно от 2 до 4 Па), и эксикатор может быть помещен в печь, находящуюся при температуре, составляющей от приблизительно 60°С до приблизительно 125°С. По завершении силанизации эксикатор извлекают из печи, охлаждают и уравновешивают с атмосферой.

Осаждение из газовой фазы, способ YES и/или силанизация в вакуумном эксикаторе могут быть применены для обработки различными силанами или производными 18 силана, такими как силан или производные 18 силана, включающие примеры ненасыщенных фрагментов, рассмотренные в настоящей работе. Например, эти способы могут быть применены, если силан или производное 18 силана включает ненасыщенный алкеновый или циклоалкеновый фрагмент, такой как норборнен, производное норборнена (например, (гетеро)норборнен, включающий атом кислорода или азота вместо одного из атомов углерода), трансциклооктен, производные трансциклооктена, трансциклопентен, транс-циклогептен, транс-циклононен, бицикло[3,3,1]нон-1-ен, бицикло[4,3,1]дец-1(9)-ен, бицикло[4,2,1]нон-1(8)-ен и бицикло[4,2,1]нон-1-ен. Любой из упомянутых циклоалкенов может быть замещен, например, группой R, такой как водород, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкинил, арил, гетероарил, гетероалициклил, аралкил или (гетероалициклил)алкил. Пример производного норборнена включает [(5-бицикпо[2,2,1]гепт-2-енил)этил]триметоксисилан. В других примерах эти способы могут быть применены, если силан или производное 18 силана включает ненасыщенный алкиновый или циклоалкиновый фрагмент, такой как циклооктин, производное циклооктина или бициклононины (например, бицикло[6,1,0]нон-4-ин или его производные, бицикло[6,1,0]нон-2-ин или бицикло[6,1,0]нон-3-ин). Эти циклоалкины могут быть замещены любыми из групп R, рассмотренных в настоящей работе.

Как показано на Фиг. 3В, в результате присоединения силана или производного 18 силана образуется силанизированная структурированная основа, включающая силанизированные углубления и силанизированные промежуточные участки (это является одним из примеров обработанных углублений и обработанных промежуточных участков).

Затем силанизированная структурированная многослойная пластина может быть подвергнута обработке, в результате которой на силанизированных углублениях и силанизированных промежуточных участках образуется слой 20 функционализированного полимера.

Как указано в настоящей работе, примеры слоя 20 функционализированного полимера включают PAZAM или любую другую молекулу, имеющую функциональные группы, способные взаимодействовать со структурированной многослойной пластиной 12 и праймером (праймерам) 22, наносимым в последующих этапах. Функционализированная молекула может находиться в смеси. В одном из примеров смесь включает PAZAM в воде или в смеси этанола и воды. Слой 20 функционализированного полимера может быть образован на поверхности силанизированной структурированной многослойной пластины (т.е. на силанизированных углублениях и силанизированных промежуточных участках) с помощью любой подходящей методики. Функционализированная молекула может быть осаждена на поверхность структурированной подложки 12 способами нанесения покрытия центрифугированием или нанесения покрытия погружением или маканием, или пропусканием функционализированной молекулы под действием положительного или отрицательного давления или с помощью других подходящих методик. Получаемый слой 20 показан на Фиг. 3С.

Слой 20 функционализированного полимера может быть присоединен к силанизированным углублениям и силанизированным промежуточным участкам (т.е. 18) посредством ковалентной связи. Ковалентное присоединение слоя 20 функционализированного полимера к силанизированным углублениям позволяет удерживать слой 20 функционализированного полимера в углублениях 14, 14' в течение всего срока службы готовой проточной ячейки в различных вариантах ее эксплуатации. Ниже приведены некоторые примеры реакций, которые могут протекать между силаном или производным 18 силана и слоем 20 функционализированного полимера.

Если силан или производное 18 силана включает в качестве ненасыщенного фрагмента норборнен или производное норборнена, то норборнен или производное норборнена может: i) вступать в реакцию 1,3-биполярного циклоприсоединения с азидом/азидогруппой PAZAM; ii) вступать в реакцию сочетания с группой тетразина, присоединенной к PAZAM; iii) вступать в реакцию циклоприсоединения с группой гидразона, присоединенной к PAZAM; iv) вступать в фото-клик реакцию с группой тетразола, присоединенной к PAZAM; или v) вступать в реакцию циклоприсоединения с группой нитрилоксида, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное 18 силана в качестве ненасыщенного фрагмента включает циклооктин или производное циклооктина, то циклооктин или производное циклооктина могут: i) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию азид-алкинного 1,3-циклоприсоединения (англ. strain-promoted azide-alkyne 1,3-cycloaddition, сокращенно SPAAC) с азидом/азидогруппой PAZAM или ii) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию алкин-нитрилоксидного циклоприсоединения с нитрилоксидной группой, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное 18 силана в качестве ненасыщенного фрагмента включает бициклононин, то бициклононин под воздействием напряжения в бициклической кольцевой системе может вступать в аналогичную реакцию циклоприсоединенияа алкина согласно механизму SPAAC с азидами или нитрилоксидами, присоединенными к PAZAM.

Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что в некоторых примерах способа структурированная подложка 12 может не подвергаться силанизации. Напротив, структурированная подложка 12 может быть подвергнута плазменному травлению, после чего на протравленную плазмой структурированную подложку 12 может быть непосредственно нанесен центрифугированием (или осажден другим способом) слой 20 функционализированного полимера. В этом примере при плазменном травлении может образовываться вещество (вещества), активирующее поверхность (например, -ОН группы), с помощью которого слой 20 функционализированного покрытия может закрепляться на структурированной подложке 12. В этих примерах слой 20 функционализированного полимера выбран таким образом, что он реагирует с поверхностными группами, образующимися при плазменном травлении.

После нанесения функционализированная молекула также может быть подвергнута отверждению, в результате чего на всей структурированной подложке (т.е. на углублении (углублениях) 14 и промежуточном участке (участках) 16) образуется слой 20 функционализированного полимера. В одном из примеров отверждение функционализированной молекулы может быть проведено при температуре, составляющей от комнатной температуры (например, приблизительно 25°С) до приблизительно 95°С, в течение времени, составляющего от приблизительно 1 миллисекунд до приблизительно нескольких суток. Согласно другому примеру, продолжительность отверждения может составлять от 10 секунд до по меньшей мере 24 часов. В другом примере продолжительность может составлять от приблизительно 5 минут до приблизительно 2 часов.

Силанизированная структурированная подложка с покрытием (показанная на Фиг. 3С) может быть подвергнута очистке. Очистка может включать применение водяной бани и ультразвукового воздействия. Температура водяной бани может поддерживаться относительно низкой и составлять от приблизительно 22°С до приблизительно 45°С. В другом примере температура водяной бани составляет от приблизительно 25°С до приблизительно 30°С.

Затем силанизированную структурированную подложку с покрытием при необходимости подвергают шлифовке для удаления части (частей) слоя 20 функционализированного полимера с силанизированных промежуточных участков. Силанизированная структурированная подложка с покрытием, полученным после шлифовки, показана на Фиг. 3D. В результате шлифовки части силана или производного 18 силана, расположенные вблизи промежуточных участков 16, могут быть удалены или могут быть оставлены. Таким образом, на Фиг. 3D-3I, части силана или производного 18 силана, расположенные вблизи промежуточных участков 16, показаны в полуразрезе, поскольку они могут по меньшей мере частично оставаться после шлифовки или они могут быть удалены в результате шлифовки. Если эти силанизированные части полностью удаляют, то следует понимать, что это обнажает нижележащую подложку 12.

Шлифовка может быть выполнена с помощью мягкой химической суспензии (включающей, например, абразивное вещество, буфер, хелатирующий агент, поверхностно-активное вещество и/или диспергирующий агент), которая может удалять тонкий слой 20 функционализированного полимера и в некоторых примерах по меньшей мере часть силана или производного 18 силана с промежуточных участков 16, не оказывая негативного влияния на нижележащую подложку 12 на обрабатываемых участках. В альтернативном варианте шлифовка может быть выполнена с помощью раствора, который не включает абразивных частиц.

Химическая суспензия может быть применена в химической системе механического удаления шлифовкой для шлифовки поверхности силанизированной структурированной подложки с покрытием, показанной на Фиг. 3С. Шлифовальная головка (головки)/пластина (пластины) или другое шлифовальное устройство (устройства) способно снимать шлифовкой слой 20 функционализированного полимера с промежуточных участков 16, оставляя слой 20 функционализированного полимера в углублениях 14, 14' и оставляя нижележащую подложку 12 по меньшей мере по существу неповрежденной. Например, головка для удаления шлифовкой может представлять собой головку для удаления шлифовкой Strasbaugh ViPRR II.

Как было отмечено выше, удаление шлифовкой может быть выполнено с помощью шлифовальной пластины и раствора, не содержащего абразива. Например, шлифовальная пластина может быть применена в комбинации с раствором, не содержащим абразивных частиц (т.е. раствором, который не включает абразивных частиц).

Как показано на Фиг. 3D, при удалении шлифовкой удаляется часть (части) слоя 20 функционализированного полимера (и в некоторых примерах по меньшей мере часть силана или производного 18 силана) с промежуточных участков 16, а часть (части) слоя 20 функционализированного полимера остается в силанизированных углублениях. Кроме того, как указано выше, после завершения шлифовки промежуточный участок (участки) 16 может оставаться силанизированным. Другими словами, после шлифовки силанизированные промежуточные участки могут оставаться неповрежденными. В альтернативном варианте (как показано на видах деталей 18В полуразрезе) в результате шлифовки силан или производное 18 силана могут быть удалены с промежуточного участка (участков) 16.

Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что силанизированная структурированная подложка с покрытием, обработанным шлифовкой (показанная на Фиг. 3D), может быть подвергнута очистке. Очистка может включать применение водяной бани и ультразвукового воздействия.

Температура водяной бани может поддерживаться относительно низкой и составлять от приблизительно 22°С до приблизительно 30°С. Силанизированная структурированная подложка с покрытием, обработанным шлифовкой, также может быть высушена центрифугированием или с помощью любой подходящей методики.

Силанизированная структурированная подложка с покрытием, обработанным шлифовкой, показанная на Фиг. 3D, затем может быть подвергнута обработке, показанной на Фиг. 3E-3G, в результате которой образуется проточная ячейка 10, или обработке, показанной на Фиг. 3H-3I, в результате которой образуется проточная ячейка 10'. На Фиг. 3E-3G показан вариант, в котором прививку праймеров 22 и нанесение гидрогеля 24 производят до прикрепления крышки 26 к структурированной подложке 12 проточной ячейки. На Фиг. 3Н и 3I показан вариант, в котором крышку 26 прикрепляют к структурированной подложке 12 проточной ячейки до прививки праймеров 22 и нанесения гидрогеля 24.

На Фиг. 3Е показано, что прививку осуществляют для прикрепления праймера 22 к слою 20 функционализированного полимера, находящемуся в углублении (углублениях) 14, 14'. В этом примере прививка может быть выполнена нанесением покрытия маканием, нанесением покрытия распылением, нанесением покрытия распределением раствора или другим подходящим способом, который позволяет прикреплять праймер (праймеры) 22 к слою 20 функционализированного полимера, находящемуся в по меньшей мере некоторых углублениях 14, 14'. В каждом из примеров перечисленных методик может быть применен раствор или смесь праймера, рассмотренная в настоящей работе, которая может включать праймер (праймеры), воду, буфер и катализатор, и методика может быть выполнена в соответствии с указаниями, содержащимися в настоящей работе.

Как показано на Фиг. 3F, после прививки праймера 22 к слою 20 функционализированного покрытия, находящегося в углублениях 14, 14', на привитом слое 20, 22 функционализированного покрытия и на по меньшей мере части структурированной подложки 12 проточной ячейки формируют гидрогель 24. В этом примере гидрогель 24 может быть сформирован на открытой поверхности структурированной подложки 12, которая не является частью соединительной области 25. В этом примере гидрогель 24 селективно осаждают или наносят в виде схемы на промежуточные участки 16 между соседними углублениями 14, 14', но не на краевую/периферическую часть структурированной подложки 12, в которой расположена соединительная область 25. Селективное осаждение/осаждение гидрогеля 24 в виде схемы может быть выполнено с использованием водной смеси, как указано в настоящей работе. После осаждения водной смеси она может быть частично высушена с образованием гидрогеля 24.

Затем, как показано на Фиг. 3G, к соединительной области 25 может быть присоединена крышка 26. Если структурированная подложка 12 проточной ячейки представляет собой многослойную пластину, то различные области крышки 26 могут по меньшей мере частично ограничивать соответствующие проточные каналы 30, образующиеся на многослойной пластине. Если структурированная подложка 12 проточной ячейки представляет собой площадку, то крышка 26 может ограничивать один или более образующихся проточных каналов 30.

Крышка 26 может состоять из любого материала, который прозрачен для возбуждающего излучения, направленного на поверхностный химический состав 20, 22 в углублении (углублениях) 14. В различных примерах крышка 26 может быть изготовлена из стекла (например, боросиликатного стекла, плавленого оксида кремния и т.д.), полимера или подобного материала. Примером коммерчески доступного подходящего боросиликатного стекла является D 263®, поставляемое Schott North America, Inc. Коммерчески доступными примерами подходящих полимерных материалов, а именно, циклоолефиновых полимеров, являются продуты ZEONOR®, поставляемые Zeon Chemicals L.P.

В некоторых примерах крышка 26 может составлять одно целое с боковой стенкой (стенками) 29, которая соответствует форме соединительной области 25 и которую соединяют с соединительной областью 25. Например, в прозрачном блоке может быть вытравлен желобок, в результате чего образуется по существу плоская (например, верхняя) часть 27 и боковая стенка (стенки) 29, выступающая за пределы по существу плоской части 27. При установке блока с вытравленным желобком на соединительную область структурированной подложки 12 желобок может становиться проточным каналом 30.

В других примерах боковая стенка (стенки) 29 и крышка 26 могут быть отдельными компонентами, соединенными друг с другом. Например, крышка 26 может представлять собой по существу прямоугольный блок, имеющий по меньшей мере по существу плоскую наружную поверхность и по меньшей мере по существу плоскую внутреннюю поверхность, которая ограничивает часть (например, верхнюю часть) проточного канала 30 (после соединения со структурированной подложкой 12). Блок может быть установлен на (например, соединен с) боковую стенку (стенки) 29, которые соединены с соединительной областью 25 структурированной подложки 12 проточной ячейки и образуют боковую стенку (стенки) проточного канала 30. В этом примере боковая стенка (стенки) 29 может включать любой из материалов, которые, согласно настоящему изобретению, подходят для изготовления разделительного слоя (описанного ниже).

Крышка 26 может быть соединена с соединительной областью 25 структурированной подложки 12 проточной ячейки с помощью любой подходящей методики, такой как лазерная сварка, диффузионное соединение, анодная сварка, пайка эвтектическим сплавом, плазмоактивируемое соединение, пайка стеклокристаллическим припоем или другими способами, известными в данной области техники. В одном из примеров для соединения крышки 26 с соединительной областью 25 может быть применен разделительный слой 28. Разделительный слой 28 может состоять из любого материала, который может герметично соединять по меньшей мере некоторые промежуточные участки 16 (например, соединительную область 25) структурированной подложки 12 с крышкой 26.

В одном из примеров разделительный слой 28 может быть изготовлен из материала, поглощающего излучение с длиной волны, которую пропускает крышка 26 и/или структурированная подложка 12. В свою очередь, поглощенная энергия затрачивается на образование связи между разделительным слоем 28 и крышкой 26 и между разделительным слоем 28 и структурированной подложкой 12. Одним из примеров материала, поглощающего излучение, является черный KAPTON® (полиимид, содержащий углеродную сажу), поставляемый DuPont (США), полоса поглощения которого находится при приблизительно 1064 нм. Следует понимать, что может быть применен полиимид, не содержащий углеродной сажи, но при этом должна быть выбрана такая длина волны, при которой происходит существенное поглощение энергии натуральным полиимидным материалом (например, при длине волны 480 нм). В другом примере для соединения может быть применен полиимид CEN JP, который облучают светом с длиной волны 532 нм. Если разделительный слой 28 изготовлен из материала, поглощающего излучение, то разделительный слой 28 может быть расположен на границе раздела между крышкой 26 и структурированной подложкой 12 таким образом, чтобы разделительный слой 28 контактировал с целевыми соединительными областями 25. Может быть приложено сжимающее усилие (например, давление приблизительно 100 PSI (что приблизительно соответствует 6,20⋅10⁵ Па)) при одновременном воздействии на границу раздела энергии лазера с подходящей длиной волны (т.е. с облучением материала, поглощающего излучение). Для создания подходящего соединения энергия лазера может воздействовать на границу раздела как сверху, так и снизу.

В другом примере разделительный слой 28 может контактировать с материалом, поглощающим излучение. Материал, поглощающий излучение, может быть нанесен на границу раздела между разделительным слоем 28 и крышкой 26, а также на границу раздела между разделительным слоем 28 и структурированной подложкой 12 проточной ячейки. Например, разделительный слой 28 может состоять из полиимида, и отдельный материал, поглощающий излучение, может представлять собой углеродную сажу. В этом примере отдельный материал, поглощающий излучение, поглощает лазерную энергию, которая затрачивается на образование связей между разделительным слоем 28 и крышкой 26 и между разделительным слоем 28 и структурированной подложкой 12. В этом примере к соответствующим границам раздела может быть приложено сжимающее усилие и одновременно к границам раздела может быть подана энергия лазерного излучения с подходящей длиной волны (т.е. произведено одновременное облучение материала, поглощающего излучение).

Если подложка 12, предназначенная структурирования потока, представляет собой многослойную пластину, то разделительный слой 28 и боковые стенки 29 (соединенные или не соединенные с крышкой 26) могут физически отделять один проточный канал 30 от соседнего проточного канала 30 и могут быть расположены в периферической части многослойных пластин. Если структурированная подложка 12 представляет собой площадку, и формируемая проточная ячейка 10 должна включать единственный проточный канал 30 или дорожку, то разделительный слой 28 и боковые стенки 29 (соединенные или не соединенные с крышкой 26) могут быть расположены в периферической части площадки, ограничивая проточный канал 30 и герметизируя проточную ячейку 10. Если структурированная подложка 12 представляет собой площадку, и формируемая проточная ячейка 10 должна включать совокупность изолированных проточных каналов 30 (например, восемь или четыре проточных канала/дорожки), то разделительный слой 28 и боковые стенки 29 (соединенные или не соединенные с крышкой 26) могут физически отделять один проточный канал/дорожку 30 от соседнего проточного канала/дорожки 30 и могут быть расположены в периферической части площадки. Однако следует понимать, что в зависимости от воплощения разделительный слой 28 и боковые стенки 29 могут быть расположены в любой требуемой области.

Если структурированная подложка 12 представляет собой площадку, то сборка проточной ячейки 10 может включать прикрепление крышки 26. Если структурированная подложка представляет собой многослойную пластину, то после прикрепления крышки 26 сборка проточной ячейки 10 может включать дополнительную обработку, такую как нарезка. В одном из примеров крышка 26 может быть присоединена к структурированной многослойной пластине 12, и при нарезке образуются индивидуальные проточные ячейки 10. Как уже было отмечено, на многослойной пластине боковые стенки 29 могут физически отделять один проточный канал 30 от соседнего проточного канала 30, и, таким образом, резка может проходить через по меньшей мере некоторые из боковых стенок 29 так, чтобы каждая индивидуальная проточная ячейка 10 включала требуемое количество проточных каналов 30, каждый из которых содержит часть первоначальной боковой стенки 29, окружающей его периферическую часть. Согласно другому примеру, структурированная многослойная пластина может быть нарезана так, что происходит образование площадок, не имеющих крышек, к которым для получения индивидуальных проточных ячеек 10 могут быть прикреплены соответствующие крышки 26.

В примере, показанном на Фиг. 3G, крышка 26 включает верхнюю часть 27, составляющую единое целое с боковой стенкой (стенками) 29. Боковая стенка (стенки) 29 присоединена к соединительной области 25 структурированной подложки 12 посредством разделительного слоя 28.

Крышка 26 и структурированная подложка 12 проточной ячейки совместно ограничивают проточный канал 30, который находится в селективном гидравлическом соединении с углублениями 14, 14'. Проточный канал 30 может, например, служить для селективной подачи компонентов реакции или реагентов к гидрогелю 24 и находящемуся под ним поверхностному химическому составу 20, 22 для инициирования требуемых реакций в/на углублениях 14, 14'.

Пример проточной ячейки 10 показан на Фиг. 3G.

На Фиг. 3Н и 3I представлен другой пример способа 200, который включает прикрепление крышки 26 к структурированной подложке 12 проточной ячейки до прививки праймеров 22 и нанесения гидрогеля 24.

Как показано на Фиг. 3Н, слой 20 функционализированного покрытия нанесен (например, осажден и обработан шлифовкой) как показано на Фиг. 3D и в соответствии со схемой Фиг. 1. По меньшей мере некоторые из отшлифованных промежуточных участков 16 могут определять соединительную область 25, и к соединительной области 25 может быть присоединена крышка 26. Крышка 26 может состоять из любых материалов и может иметь любую из конфигураций, рассмотренных в настоящей работе. Крышка 26 может быть присоединена к соединительной области 25 с помощью любой из методик, рассмотренных в настоящей работе.

В примере, показанном на Фиг. 3Н, крышка 26 включает верхнюю часть 27, составляющую единое целое с боковой стенкой (стенками) 29. Боковая стенка (стенки) 29 присоединена к соединительной области 25 структурированной подложки 12 посредством разделительного слоя 28. После присоединения крышки 26 между крышкой 26 и структурированной подложкой 12 образуется проточный канал 30. Проточный канал 30 может служить для селективной подачи различных текучих сред в проточную ячейку 10' (Фиг. 3I).

В этом примере способа 200, как показано на Фиг. 3I, праймер 22 затем прививают к слою 20 функционализированного покрытия, находящегося в углублении (углублениях) 14. Может быть применен любой из праймеров, рассмотренных в настоящей работе. В этом примере прививка может быть выполнена проточным способом. В проточном способе раствор или смесь праймера, рассмотренная в настоящей работе, может быть введена в проточный канал (каналы) 30 через соответствующее впускное отверстие (отверстия) (не показаны), может удерживаться в проточном канале (каналах) 30 в течение времени, достаточного (т.е. в течение инкубационного периода) для присоединения праймера 22 к слою 20 функционализированного покрытия, находящегося в одном или более углублениях 14, и затем может быть удалена через соответствующее выпускное отверстие (отверстия) (не показаны). После присоединения праймера 22, через проточный канал (каналы) 30 может быть направлена дополнительная текучая среда (среды) для промывки готовых функционализированных углублений и проточного канала (каналов) 30.

После прививки праймера 22 к слою 20 функционализированного покрытия, находящегося в углублении (углублениях) 14, этот пример способа 200 дополнительно включает образование гидрогеля на привитом слое 20, 22 функционализированного покрытия и на по меньшей мере некоторых промежуточных участках 16 (например, на областях 16 между углублениями 14).

В этом примере покрытие из гидрогеля 14 может быть осаждено проточным способом. В проточном способе водная смесь (включающая воду и материал гидрогеля) может быть подана в проточный канал (каналы) 30 проточной ячейки (ячеек) через соответствующее впускное отверстие (отверстия) и может удерживаться в проточном канале (каналах) 30. Может быть введено такое количество водной смеси, которое достаточно для покрытия привитого слоя 20, 22 функционализированного покрытия и любых открытых поверхностей структурированной подложки 12 проточной ячейки, находящихся в проточном канале 30. Инкубация этого раствора приводит к образованию покрытия 24 из гидрогеля. В некоторых примерах во время нахождения смеси в проточном канале (каналах) 30, в проточном канале (каналах) 30 может быть проведена сушка посредством пропускания воздуха или азота через впускное отверстие или при приложении вакуума к впускному отверстию в течение установленного периода времени, что приводит к частичному высушиванию покрытия 24 из гидрогеля, образовавшегося на находящемся на поверхности химическом составе 20, 22 и любых открытых частях (например, на некоторых промежуточных участках 16) подложки 12. В этом примере покрытие 24 из гидрогеля может представлять собой покрытие любого из примеров, рассмотренных в настоящей работе.

Пример проточной ячейки 10'', получаемой способами 100, 200, рассмотренными в настоящей работе, показан на Фиг. 4. Проточная ячейка 10'' включает структурированную подложку 12, которая может представлять собой площадку, которую вводят в технологические этапы способа 100, 200, или многослойную пластину, которую вводят в технологические этапы способа 100, 200 и нарезают.

Обычно структурированная подложка 12 включает углубления 14, разделенные промежуточными участками 16, и поверхностный химический состав 20, 22, расположенный в углублениях 14. Поверхностный химический состав включает слой 20 функционализированного покрытия и праймеры 22. Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что углубления 14 также могут быть обработаны веществом для подготовки поверхности или химическим веществом (например, силаном или производным силана), которое располагают между подложкой 12 и слоем 20 функционализированного покрытия. Такое вещество для подготовки поверхности или химическое вещество для обработки также может быть расположено на промежуточных участках 16.

Проточная ячейка 10'' также включает крышку 26, присоединенную к соединительной области (областям) 25 структурированной подложки 12, где крышка 26 по меньшей мере частично ограничивает проточный канал 30А, 30В и т.д., который селективно сообщается с углублениями 14. В примере, показанном на Фиг. 4, крышка 26 включает верхнюю часть 27, которая соединена с несколькими боковыми стенками 29, и эти компонент 27, 29 ограничивают часть каждого из шести проточных каналов 30А, 30В, 30С, 30D, 30Е, 30F. Соответствующие боковые стенки 29 изолируют один проточный канал 30А, 30В, 30С, 30D, 30Е, 30F от каждого из соседних проточных каналов 30А, 30В, 30С, 30D, 30Е, 30F, причем каждый проточный канал 30А, 30В, 30С, 30D, 30Е, 30F находится в селективном гидравлическом соединении с соответствующим набором углублений 14.

Несмотря на то, что это не показано, крышка 26 или структурированная подложка 12 может включать впускные и выпускные отверстия, соединенные гидравлическим соединением с другими отверстиями (не показаны) для пропускания текучей среды (сред) по соответствующим проточным каналам 30А, 30В, 30С, 30D, 30Е, 30F (например, из картриджа для реагентов или другой системы хранения текучих сред) и наружу из проточного канала (например, в систему удаления отходов).

Гидрогель/покрытие 24 из гидрогеля закрывает поверхностный химический состав 20, 22 в углублениях 14 и по меньшей мере часть структурированной подложки 12 (например, те промежуточные участки 16, которые не являются одновременно соединительными областями 25). В проточной ячейке 10'' согласно примеру осуществления гидрогель/покрытие 24 из гидрогеля получено так, как было рассмотрено в настоящей работе. Таким образом, гидрогель/покрытие 24 из гидрогеля может состоять из материала любого из примеров, рассмотренных в настоящей работе (т.е. PAZAM, сшитого полиакриламида, агарозного геля и т.д.).

Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что некоторые примеры проточной ячейки 10, 10', 10'' могут быть непосредственно зафиксированы на устройстве обнаружения (не показано) с помощью одного или более фиксирующих механизмов (например, клея, связи, креплений и подобных механизмов) и, таким образом, находиться в физическом контакте с устройством обнаружения. Устройство обнаружения может включать устройство КМОП (комплементарный металл-оксидный полупроводник) (который включает совокупность расположенных один над другим слоев, включающих, например, слой (слои) кремния, слой (слои) диэлектрика, слой (слои) металл-диэлектрик, слой (слои) металла и т.д.) и оптические компоненты. Оптические компоненты могут быть установлены таким образом, что оптический датчик устройства обнаружения по меньшей мере по существу выставлен в одну линию и, таким образом, оперативно связан с одним оптическим волноводом устройства обнаружения и находящимся на поверхности одного углубления 14, 14' химическим составом 20, 22 или химическим составом 20, 22, находящимся на поверхности проточного канала 30 проточной ячейки.

Кроме того, несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что вместо присоединения к крышке 26 функционализированная подложка(содержащая поверхностный химический состав 20, 22 и гидрогель/покрытие 24 из гидрогеля) может быть присоединена к другой функционализированной подложке, содержащей поверхностный химический состав 20, 22 и гидрогель/покрытие 24 из гидрогеля. Две функционализированные поверхности могут быть обращены друг к другу, и между ними может образовываться проточный канал. Для соединения двух функционализированных основ друг с другом может быть применен разделительный слой и подходящий способ соединения.

Проточные ячейки 10, 10', 10'', рассмотренные в настоящей работе, могут быть применены для осуществления множества различных методик или способов секвенирования, включающих методики, часто называемые секвенированием синтезом (англ. sequencing-by-synthesis, сокращенно SBS), циклическим секвенированием массивов, секвенированием лигированием, пиросеквенированием и т.д. При применении любой из перечисленных методик в примерах, в которых применяют структурированную подложку, амплификация будет протекать только на функционализированных углублениях, поскольку слой 20 функционального полимера и присоединенный к нему праймер (праймеры) 22 секвенирования имеются лишь в функционализированных углублениях (т.е. 14, 14' с поверхностным химическим составом 20, 22), а не на промежуточных участках 16. Кроме того, присутствие гидрогеля 24 обеспечивает большее количество времени (по сравнению с отсутствием гидрогеля) для амплификации одной матриц секвенирования с образованием более крупных кластеров, что увеличивает заселение углублений 14, засеянных единственной матрицей секвенирования, по всей структурированной подложке 12 проточной ячейки.

В качестве примера можно указать, что реакция секвенирования синтезом (SBS) может быть проведена в такой системе, как системы секвенирования HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, NOVASEQ™ или NEXTSEQ™, поставляемые Illumina, Inc. (San Diego, CA). При проведении SBS для определения последовательности нуклеотидов в матрице, отслеживают удлинение (достройку) праймера нуклеиновой кислоты (например, праймера 22) вдоль матрицы нуклеиновой кислоты (т.е. матрицы секвенирования). Химическим процессом, лежащим в основе этого способа, может быть полимеризация (например, катализируемая полимеразным ферментом) или лигирование (например, катализируемое лигазным ферментом). В одном из конкретных SBS способов, в котором применяют полимеразу, флуоресцентно меченые нуклеотиды присоединяются к праймеру 22 (достраивая таким образом праймер 22) в соответствии с расположением нуклеотидов в матрице, и определение порядка и типа нуклеотидов, присоединяющихся к праймеру 22, может быть применено для определения последовательности матрицы. Например, для инициирования первого цикла SBS один или более меченых нуклеотидов, ДНК полимераза и т.д. могут быть направлены в/через проточный канал 30 и т.д., в котором находится массив праймеров 22, на который нанесен гидрогель 24. Функционализированные углубления (т.е. 14, 14' с поверхностным химическим составом 20, 22), в которых в результате удлинения праймера происходит встраивание меченого нуклеотида, могут быть обнаружены посредством визуализации события. Для визуализации события система освещения (не показана) может освещать функционализированные углубления (т.е. 14, 14' с поверхностным химическим составом 20, 22) возбуждающим излучением.

В некоторых примерах нуклеотиды могут дополнительно включать свойства обратимого терминатора, который прекращает последующее удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру 22. Например, к праймеру 22 может быть добавлен нуклеотидный аналог, содержащий фрагмент обратимого терминатора, в результате чего последующее удлинение не может произойти до тех пор, пока не будет добавлен деблокирующий агент, способный удалить этот фрагмент. Таким образом, в тех примерах, в которых применяют обратимые терминаторы, в проточный канал 30 и т.д. может быть направлен деблокирующий реагент (до или после обнаружения).

Между различными этапами подачи текучих сред может быть проведена промывка (промывки). Цикл SBS может быть повторен n раз для удлинения праймера 22 на n нуклеотидов, в результате чего может быть определена последовательность длины n.

Несмотря на то, что был подробно рассмотрен способ SBS, следует понимать, что проточные ячейки 10, 10', 10'', рассмотренные в настоящей работе, могут быть применены в других протоколах секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических анализах.

Для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения ниже приведены примеры. Следует понимать, что эти примеры приведены для иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Применяли проточную ячейку, включающую 8 проточных каналов/дорожек, сформированных на структурированной подложке из плавленого оксида кремния, где каждая дорожка включала 96 блоков (которые соответствовали участку визуализации), и где каждый блок находился в гидравлическом соединении с совокупностью лунок. В каждой лунке был сформирован слой PAZAM, и на слой PAZAM было привито 1 мкМ (μm) праймеров.

Дорожки 1-4 и, таким образом, блоки 1-384 представляли собой дорожки и блоки сравнительных примеров. Поэтому на слой PAZAM или праймеры, находящиеся на этих дорожках и блоках, не было нанесено покрытие из гидрогеля.

Дорожки 5-8 и, таким образом, блоки 385-768 представляли собой дорожки и блоки примеров. Поэтому на слой PAZAM или праймеры, находящиеся на этих дорожках и блоках, было нанесено покрытие из гидрогеля. Покрытие из гидрогеля представляло собой еще один слой PAZAM, который наносили проточным способом. Раствор PAZAM концентрацией 0,025% в воде направляли на дорожки 5-8, нагревали до 60°С и выдерживали при этой температуре в течение приблизительно 10 минут.

Все дорожки промывали буфером разбавления.

На каждой из дорожек 1-8 выполняли цикл секвенирования. Применяли раствор матрицы секвенирования Phi X с концентрацией 150 пикоМ.

На Фиг. 5 представлена процентная доля кластеров, проходящих через фильтр (процент прохождения через фильтр (%PF)) и процентная доля лунок, занятых ДНК матрицей секвенирования (% занятых). Процент прохождения через фильтр (%PF) представляет собой индикатор, применяемый для описания кластеров, которые имеют допустимый порог качества и которые используют в дальнейшей обработке и анализе данных секвенирования. Чем выше процент прохождения через фильтр, тем выше выход уникальных кластеров, применяемых для получения данных секвенирования.

Представленные на Фиг. 5 данные показывают, что процент прохождения через фильтр повышался (на величину от приблизительно 5% до приблизительно 10%) при использовании гидрогеля (сравнить данные для блоков 1-384 (в отсутствие гидрогеля) с данными для блоков 385-768 (при наличии гидрогеля)).

Разность между % занятых и %PF является приблизительной оценкой количества поликлональных кластеров. Разность между % занятых и %PF в блоках примеров 385-768 намного меньше разности между % занятых и %PF в блоках сравнительных примеров 1-384, что указывает на тот факт, что на блоках/дорожках с покрытием из гидрогеля PAZAM образуется намного меньше политональных кластеров, чем на блоках/дорожках сравнительных примеров.

В целом, данные, представленные на Фиг. 5, указывают на то, что наличие покрытия из гидрогеля улучшает образование моноклональных кластеров и чистоту основного компонента/кластера в лунках с поликлональными кластерами, что также повышает выход секвенирования и качество данных.

Пример 2

Применяли две проточные ячейки, каждая из которых включала 8 проточных каналов/дорожек, сформированных на структурированной подложке из плавленого оксида кремния, где каждая дорожка включала 96 блоков (и участков визуализации), и где каждый блок находился в гидравлическом соединении с совокупностью лунок. В каждой лунке был сформирован слой PAZAM, и на слой PAZAM было привито 1 мкМ праймеров.

В сравнительной проточной ячейке покрытие из гидрогеля не наносили ни на слой PAZAM, ни на праймеры любых дорожек и блоков.

В проточной ячейке примера покрытие из гидрогеля наносили на слой PAZAM и на праймеры каждой из дорожек и блоков. Покрытие из гидрогеля представляло собой еще один слой PAZAM, который наносили проточным способом. Смесь/раствор PAZAM в воде направляли на дорожки 1-8 проточной ячейки примера, нагревали до 60°С и выдерживали при этой температуре в течение приблизительно 10 минут.

Все дорожки сравнительной проточной ячейки и проточной ячейки примера промывали буфером разбавления.

На каждой из дорожек 1-8 сравнительной проточной ячейки и проточной ячейки примера выполняли циклы секвенирования. Прочтение 1 включало 151 цикл, и Прочтение 2 включало также 151 цикл. Для исключения влияния краевых эффектов количественные показатели секвенирования отбирали из центров блоков. На каждую из дорожек наносили различные растворы матриц секвенирования, имеющие различные концентрации, составляющие от 100 пикомоль до 800 пикомоль. В частности, на дорожку 1 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 100 пикомоль; на дорожку 2 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 200; на дорожку 3 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 300 пикомоль; на дорожку 4 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 400 пикомоль; на дорожку 5 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 500 пикомоль; на дорожку 6 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 600 пикомоль; на дорожку 7 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 700; и на дорожку 8 и сравнительной проточной ячейки, и проточной ячейки примера наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 800 пикомоль.

На Фиг. 6 представлена процентная доля кластеров, проходящих через фильтр (процент прохождения через фильтр (%PF)), на различных дорожках проточных ячеек сравнительного примера и примера. Как показано, %PF для дорожек проточной ячейки примера, включающих гидрогель, более устойчив в более широком диапазоне концентраций, чем для дорожек сравнительной проточной ячейки, содержащих гидрогель.

Дупликатные матрицы удаляли биоинформационным способом с дорожек проточной ячейки примера и дорожек сравнительной проточной ячейки в том случае, если прочтения одних и тех же геномных положений точно совпадали. Величина чистого %PF после удаления дупликатов показана на Фиг. 7. В целом, в проточной ячейке с покрытием из гидрогеля при использовании матриц секвенирования в концентрации, составляющей от 300 пикомоль до 800 пикомоль может быть получен более высокий выход по сравнению с выходом, получаемым в сравнительной проточной ячейке (повышение выхода на величину от приблизительно 2% до приблизительно 17%).

Максимальная величина %PF после удаления дупликатов в сравнительной проточной ячейке составила 76,13% и была получена на дорожке, на которую наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 300 пикомоль. Максимальная величина %PF после удаления дупликатов в проточной ячейке примера составила 83,42% и была получена на дорожке, на которую наносили раствор матрицы секвенирования концентрацией 600 пикомоль. Это указывает на увеличение содержания моноклональных кластеров на 9,6%.

На Фиг. 8А и 8В представлены частоты несовпадений (англ. mismatch rates, сокращено MMR) прочтения 1 и прочтения 2, полученные в проточной ячейке сравнительного примера и проточной ячейке примера после проведения 150 циклов секвенирования. Близкие частоты несовпадений, полученные в проточных ячейках сравнительного примера и примера, указывают на то, что покрытие из гидрогеля не оказывает негативного влияния на операцию секвенирования.

Дополнительные замечания

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше признаков и дополнительных признаков, более подробно рассмотренных ниже (при условии, что эти признаки не являются взаимоисключающими) составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящей работе. В частности, все комбинации раскрытых предметов изобретения, очевидные после прочтения предлагаемого описания, составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящей работе. Также следует понимать, что употребляемая в настоящем описании терминология, которая также может употребляться в любом документе, включенном в настоящее описание посредством ссылки, должна иметь значение, в наибольшей мере соответствующее конкретным признакам, рассмотренным в настоящей работе.

Упоминание в настоящем описании "одного примера", "другого примера", "примера" и т.д. означает, что конкретный элемент (например, элемент, структура и/или характеристика), раскрытый при описании этого примера, включен в по меньшей мере один пример, рассмотренный в настоящей работе, и может присутствовать или может отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что, если из контекста не ясно иное, то рассмотренные элементы любого примера могут быть скомбинированы в различных примерах любым подходящим образом.

Следует понимать, что приведенные в настоящем описании диапазоны включают указанные диапазоны и любые величины или поддиапазоны, находящиеся в пределах указанного диапазона. Например, следует понимать, что диапазон, составляющий от 1 до 50000, включает не только явным образом упомянутые пределы от приблизительно 1 до 50000, но также включает индивидуальные величины, такие как приблизительно 708, приблизительно 945, приблизительно 3500 и т.д., и поддиапазоны, такие как от приблизительно 825 до приблизительно 29000, от приблизительно 95 до приблизительно 40000 и т.д. Кроме того, если для описания величины используют модификаторы "приблизительно" и/или "по существу", то они составляют небольшие вариации (до +/- 10%) от означенной величины.

Несмотря на то, что некоторые примеры были описаны подробно, следует понимать, что рассмотренные примеры могут быть модифицированы. Таким образом, приведенное выше описание не является ограничивающим.

Изобретение относится к биологическим матрицам, которые могут быть применены для проведения генетического секвенирования, а также для обнаружения и исследования разнообразных молекул, семейств молекул, уровней экспрессии генов, однонуклеотидных полиморфизмов и для проведения генотипирования. Описана проточная ячейка, содержащая структуированную подложку, включающую углубления. Слой функционализированного покрытия наносят на углубления структурированной подложки проточной ячейки. Углубления отделены друг от друга промежуточными участками. Праймер привит к слою функционализированного покрытия, в результате чего образуется привитой слой функционализированного покрытия, находящегося в углублениях. Гидрогель наносят на по меньшей мере привитой слой функционализированного покрытия. Технический результат - улучшение образования моноклональных кластеров и чистоты основного компонента кластера в лунках с поликлональными кластерами, что также повышает выход секвенирования и качество данных. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.

1. Проточная ячейка, содержащая:

структурированную подложку, включающую углубления, разделенные промежуточными участками;

поверхностный химический состав для секвенирования, присоединенный к каждому из углублений, при этом указанный поверхностный химический состав для секвенирования включает: слой функционализированного покрытия; и

праймер, привитый к слою функционализированного покрытия; и

гидрогель на по меньшей мере привитом слое функционализированного покрытия, где гидрогель выбран из группы, состоящей из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, сшитого полиакриламида, агарозного геля и сшитого полиэтиленгликоля.

2. Проточная ячейка по п. 1, в которой гидрогель также присутствует по меньшей мере на некоторых промежуточных участках.

3. Проточная ячейка по любому из пп. 1 или 2, в которой слой функционализированного покрытия представляет собой сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида.

4. Проточная ячейка по любому из пп. 1-3, в которой гидрогель не является привитым.

5. Проточная ячейка по любому из пп. 1-4, в которой:

структурированная подложка включает по меньшей мере один проточный канал;

указанные углубления заданы в указанном по меньшей мере одном проточном канале; при этом

указанная проточная ячейка дополнительно содержит разделительный слой, присоединенный к другим промежуточным участкам структурированной подложки таким образом, что указанный разделительный слой ограничивает периметр по меньшей мере одного проточного канала.

6. Проточная ячейка по п. 5, дополнительно содержащая крышку, присоединенную к разделительному слою.

7. Способ получения проточной ячейки, включающий:

нанесение слоя функционализированного покрытия в углубления структурированной подложки проточной ячейки, где указанные углубления разделены промежуточными участками;

прививку праймера к слою функционализированного покрытия с образованием привитого слоя функционализированного покрытия в углублениях; и

нанесение гидрогеля на по меньшей мере указанный привитой слой функционализированного покрытия, где гидрогель выбран из группы, состоящей из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, сшитого полиакриламида, агарозного геля и сшитого полиэтиленгликоля.

8. Способ по п. 7, в котором гидрогель расположен на привитом слое функционализированного покрытия и на некоторых промежуточных участках.

9. Способ по любому из пп. 7-8, в котором перед нанесением слоя функционализированного покрытия указанный способ дополнительно включает обработку поверхности структурированной подложки проточной ячейки для присоединения к указанной поверхности функциональной группы с образованием обработанных углублений и обработанных промежуточных участков.

10. Способ по п. 9, в котором нанесение слоя функционализированного

покрытия в углубления включает:

нанесение слоя функционализированного покрытия в обработанные углубления и на обработанные промежуточные участки; и

удаление слоя функционализированного покрытия шлифовкой с обработанных промежуточных участков.

11. Способ по любому из пп. 7-10, в котором нанесение гидрогеля включает нанесение водной смеси, включающей от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (мас./об.) гидрогелевого материала.

12. Способ по любому из пп. 7-11, в котором периметр структурированной подложки проточной ячейки имеет соединенный c ним разделительный слой, причем после нанесения гидрогеля указанный способ дополнительно включает прикрепление крышки к разделительному слою.

13. Способ по любому из пп. 7-12, в котором после нанесения слоя функционализированного покрытия и перед прививкой праймера указанный способ дополнительно включает прикрепление крышки к по меньшей мере некоторым промежуточным участкам.

14. Способ по любому из пп. 7, 9-13, в котором нанесение гидрогеля включает селективное осаждение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия.

15. Способ получения проточной ячейки, включающий:

присоединение силана или производного силана к поверхности структурированной подложки, включающей проточный канал с заданными в нем углублениями, при этом указанные углубления разделены промежуточными участками, образуя тем самым силанизированные углубления и силанизированные промежуточные участки;

нанесение слоя функционализированного покрытия в силанизированные углубления и на силанизированные промежуточные участки;

удаление слоя функционализированного покрытия шлифовкой с силанизированных промежуточных участков;

прививку праймера к слою функционализированного покрытия в силанизированных углублениях с образованием привитого слоя функционализированного покрытия в указанных углублениях; и

нанесение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия в углублениях, где гидрогель выбран из группы, состоящей из сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида, сшитого полиакриламида, агарозного геля и сшитого полиэтиленгликоля.

16. Способ по п. 15, в котором нанесение гидрогеля включает нанесение

водной смеси, включающей от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (мас./об.) гидрогелевого материала.

17. Способ по любому из пп. 15-16, в котором:

дополнительно разделительный слой прикреплен к структурированной подложке и ограничивает периметр проточного канала; и после нанесения гидрогеля указанный способ дополнительно включает прикрепление крышки к разделительному слою.

18. Способ по любому из пп. 15-17, в котором после выполнения шлифовки слоя функционализированного покрытия и перед прививкой праймера указанный способ дополнительно включает прикрепление крышки к по меньшей мере некоторым промежуточным участкам.

19. Способ по любому из пп. 15-18, в котором нанесение гидрогеля включает селективное осаждение гидрогеля на привитой слой функционализированного покрытия в углублениях.