[01] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США № 62/406082, поданной 10 октября 2016 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
[02] Файл, названный «MONS426WO_ST25.txt», содержащий Перечень последовательностей в машиночитаемом формате, был создан 8 октября 2017 года. Данный файл имеет размер 77030 байт (как измерено в MS-Windows®), одновременно поданный электронно (с использованием системы регистрации EFS-Web в Патентном ведомстве США) и включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[03] Изобретение в целом, как правило, относится к области белков, ингибирующих насекомых. Раскрыт новый класс белков, проявляющих ингибирующую активность в отношении сельскохозяйственных вредителей культурных растений и семян. В частности, раскрытый класс белков обладает инсектицидной активностью в отношении сельскохозяйственных вредителей культурных растений и семян, особенно, чешуекрылых (Lepidopteran) видов насекомых-вредителей. Предлагаются растения, части растений и семена, содержащие рекомбинантную полинуклеотидную конструкцию, кодирующую один или большее количество раскрытых токсичных белков.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[04] Повышение урожайности значимых сельскохозяйственных культур, включая, в частности, кукурузу, сою, сахарный тростник, рис, пшеницу, овощи и хлопок, становится все более важным. В дополнение к растущей потребности в сельскохозяйственной продукции для кормления, одевания и обеспечения энергией растущего населения, прогнозируется, что связанные с климатом эффекты и принуждение со стороны растущего населения использовать земли в целях, отличных от сельскохозяйственных, сократят количество доступных для сельского хозяйства пахотных земель. Данные факторы обуславливают мрачные прогнозы относительно продовольственной безопасности, в частности из-за отсутствия серьезных улучшений в биотехнологии растений и агротехнике. В свете такого давления экологически устойчивые усовершенствования технологий, агротехники, и борьбы с вредителями являются жизненно важными инструментами для расширения производства сельскохозяйственных культур на ограниченном количестве пахотных земель, доступных для ведения сельского хозяйства.
[05] Насекомые, особенно насекомые отрядов Lepidoptera и Coleoptera, считаются основной причиной повреждения полевых культур, что приводит к снижению урожайности на зараженных участках. Чешуекрылые виды-вредители, которые негативно влияют на сельское хозяйство, включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: совка помидорная (Spodoptera exigua), совка хлопковая (Helicoverpa zea), совка хлопковая американская (Alabama argillacea), огневка кукурузная (Ostrinia nubilalis), кукурузная лиственная совка (Spodoptera frugiperda), совка хлопковая (Helicoverpa armigera), Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Cry1Ac устойчивый Pectinophora gossypiella, Chrysodeixis includens, Spodoptera eridania, Diatraea grandiosella, Earias vittella, Diatraea saccharalis, Heliothis virescens, и Anticarsia gemmatalis.
[06] Исторически сложилось так, что полагались на интенсивное применение синтетических химических инсектицидов, в качестве агента контроля сельскохозяйственных вредителей. Обеспокоенность об окружающей среде и здоровье человека, помимо возникающих проблем устойчивости, стимулировала исследования и разработку биологических пестицидов. Данные исследования привели к прогрессивному открытию и применению различных энтомопатогенных микробных видов, включая бактерии.
[07] Парадигма биологического контроля изменилась, когда потенциал энтомопатогенных бактерий, особенно бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, был раскрыт и реализован в качестве биологического агента для борьбы с вредителями. Штаммы бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) были использованы в качестве источника пестицидных белков, поскольку было обнаружено, что штаммы Bt проявляют высокую токсичность в отношении конкретных насекомых. Известно, что штаммы Bt продуцируют дельта-эндотоксины, которые локализуются в параспоральных кристаллических тельцах включениях в начале споруляции и во время стационарной фазы роста (например, белки Cry), а также, как известно, продуцируют секретируемый инсектицидный белок. При попадании в организм восприимчивого насекомого, дельта-эндотоксины, как и секретируемые токсины, оказывают свое воздействие на поверхность эпителия тонкого кишечника, разрушая клеточную мембрану, что приводит к разрушению и гибели клетки. Гены, кодирующие инсектицидные белки, также были идентифицированы у видов бактерий, отличных от Bt, включая другие Bacillus и различные дополнительные виды бактерий, такие как Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaericus («Ls» ранее известный как Bacillus sphaericus) и Paenibacillus popilliae.
[08] Кристаллические и секретируемые растворимые инсектицидные токсины очень специфичны для их организмов-мишеней, и получили всемирное признание в качестве альтернативы химическим инсектицидам. Например, инсектицидные белки-токсины применялись в различных сельскохозяйственных практиках для защиты важных для сельского хозяйства растений от поражения насекомыми, для уменьшения необходимости применения химических пестицидов и увеличения урожайности. Инсектицидные белки-токсины используются для борьбы с сельскохозяйственными вредителями культурных растений с помощью механических способов, таких как распыление для рассеивания микробных препаратов, содержащих различные штаммы бактерий, на поверхности растений, и с помощью методов генетической трансформации для получения трансгенных растений и семян, экспрессирующих инсектицидный белок-токсин.
[09] Применение трансгенных растений, экспрессирующих инсектицидные белки-токсины, было адаптировано повсеместно. Например, в 2012 году 26,1 млн. Га было засеяно трансгенными культурами, экспрессирующими токсины Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Brief No. 44). Глобальное применение трансгенных культур, защищенных от насекомых, и ограниченное количество инсектицидных белков-токсинов, используемых в данных культурах, создали селекционное давление на существующие аллели насекомых, которые наделяют устойчивостью к используемым в данное время инсектицидным белкам.
[010] Развитие устойчивости у вредителей-мишеней к инсектицидным белкам-токсинам вызывает постоянную потребность в обнаружении и разработке новых форм инсектицидных белков-токсинов, которые могут применяться для контроля увеличенной устойчивости насекомых к трансгенным культурам, экспрессирующим инсектицидные белки-токсины. Новые беловые токсины с улучшенной эффективностью, которые демонстрируют контроль над более широким спектром восприимчивых видов насекомых, уменьшат количество выживших насекомых, у которых могут возникнуть аллели устойчивости. Кроме того, использование в одном растении двух или большего количества трансгенных инсектицидных белков-токсинов, токсичных для одного и того же насекомого-вредителя и проявляющих разные способы действия, снижает вероятность появления устойчивости у любого отдельного вида насекомого-мишени.
[011] Таким образом, авторы изобретения раскрывают в данном документе новое семейство белковых токсинов из Bacillus thuringiensis вместе с похожими токсичными белками, вариантами белков и иллюстративными рекомбинантными белками, которые проявляют инсектицидную активность в отношение чешуекрылых видов-мишеней, в частности, против совки помидорной (Spodoptera exigua), Helicoverpa zea, совки хлопковой американской (Alabama argillacea), огневки кукурузной (Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda), совки хлопковой (Helicoverpa armigera), Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Cry1Ac устойчивого Pectinophora gossypiella, Chrysodeixis includens, Spodoptera eridania, Diatraea grandiosella, Earias vittella, Diatraea saccharalis, Heliothis virescens, и Anticarsia gemmatalis.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[012] В данном документе раскрыта новая группа пестицидных белков с ингибирующей активностью в отношении насекомых (токсичных белков), обозначенных в данном документе как TIC4472, TIC1425 и TIC2613, принадлежащих к классу белковых токсинов TIC4472, которые, как показано, проявляют ингибирующую активность в отношении одного или большего количества вредителей культурных растения. Белок TIC4472 и белки в классе TIC4472 белковых токсинов могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими инсектицидными белками и токсическими агентами в готовых формах и in planta, тем самым предлагая альтернативы инсектицидным белкам и химическим инсектицидам, которые в данное время применяются в сельскохозяйственных системах.
[013] В одном варианте осуществления, в данной заявке раскрыта рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая гетерологичный промоторный фрагмент, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, причем (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую: (i) по меньшей мере 93%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (ii) по меньшей мере 73%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизируется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:9; или (d) указанный полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, содержит полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:9; или (e) указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с вектором, и указанный вектор выбирают из группы, состоящей из плазмиды, фагмиды, бакмиды, космиды и бактериальной или дрожжевой искусственной хромосомы. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, которая функционирует для экспрессии пестицидного белка в растении; или экспрессируется в растительной клетке для продуцирования пестицидно эффективного количества пестицидного белка.
[014] В другом варианте осуществления данной заявки, предложены клетки-хозяева, содержащие рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты согласно данной заявке, причем клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из бактериальной и растительной клеток. Рассматриваемые бактериальные клетки-хозяева включают в себя Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoec, и Erwinia. В некоторых вариантах осуществления, указанный вид Bacillus представляет собой Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанный Brevibacillus представляет собой Brevibacillus laterosperous, или Escherichia представляет собой Escherichia coli. Рассматриваемые растительные клетки-хозяева включают в себя клетку двудольного растения и клетку однодольного растения. Рассматриваемые растительные клетки дополнительно включают в себя растительную клетку люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, капусты декоративной, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопка (Gossypium sp.), тыквенных, огурца, псевдотсуги Мензиса, баклажана, эвкалипта, лена, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливкового дерева, репчатого лука, декоративных растений, пальмовых, пастбищных трав, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосновых, картофеля, тополи, тыквы, сосны лучистой, редьки, рапса, риса, корневищ, ржи, дикого шафрана, кустарниковых, сорго, сосны южной, сои, шпината, тыквенных, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, кукурузы сахарной, амбрового дерева, батата, проса прутьевидного, чая, табака, помидора, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[015] В другом варианте осуществления, пестицидный белок проявляет активность против чешуекрылых насекомых, включая совку помидорную (Spodoptera exigua), Helicoverpa zea, совку хлопковую американскую (Alabama argillacea), огневку кукурузную (Ostrinia nubilalis), кукурузную лиственную совку (Spodoptera frugiperda), совку хлопковую (Helicoverpa armigera), Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Cry1Ac устойчивый Pectinophora gossypiella, Chrysodeixis includens, Spodoptera eridania, Diatraea grandiosella, Earias vittella, Diatraea saccharalis, Heliothis virescens, и Anticarsia gemmatalis.
[016] В данной заявке также рассматриваются растения, содержащие рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую гетерологичный промоторный фрагмент, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, причем: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую: (i) по меньшей мере 93%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (ii) по меньшей мере 73%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизируется в жестких условиях гибридизации с комлементарной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:9; или (d) указанное растение демонстрирует определенное количество указанного пестицидного белка. В некоторых вариантах осуществления, пестицидный белок содержит SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:10. В одном варианте осуществления, растение представляет собой либо двудольное растение, либо однодольное растение. В другом варианте осуществления, растение дополнительно выбирают из группы, состоящей из: люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, капусты декоративной, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопка (Gossypium sp.), тыквенных, огурца, псевдотсуги Мензиса, баклажана, эвкалипта, лена, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливкового дерева, репчатого лука, декоративных растений, пальмовых, пастбищных трав, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосновых, картофеля, тополи, тыквы, сосны лучистой, редьки, рапса, риса, корневищ, ржи, дикого шафрана, кустарниковых, сорго, сосны южной, сои, шпината, тыквенных, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, кукурузы сахарной, амбрового дерева, батата, проса прутьевидного, чая, табака, помидора, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[017] В дополнительных вариантах осуществления, раскрыты семена, содержащие рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот.
[018] В другом варианте осуществления, рассматривается ингибирующая насекомых композиция, содержащая рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в данной заявке. Ингибирующая насекомых композиция может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один другой пестицидный агент, который отличается от указанного пестицидного белка. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один другой пестицидный агент выбирают из группы, состоящей из ингибирующего насекомых белка, ингибирующей насекомых дцРНК молекулы, и вспомогательного белка. Также предполагается, что, по меньшей мере, один другой пестицидный агент в ингибирующей насекомых композиции, проявляет активность против одного или большего количества видов вредителей отрядов Lepidoptera, Coleoptera или Hemiptera. По меньшей мере, один другой пестицидный агент в композиции для ингибирования насекомых в одном варианте осуществления выбирают из группы, состоящей из белка Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, вариантов Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, химер Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, вариантов Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, и AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z и AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 и его вариантов, IP3 и его вариантов, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 и DIG-11.
[019] Также рассматриваются товарные продукты, содержащие определяемое количество рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, раскрытых в данной заявке. Такие товарные продукты включают в себя товарную кукурузу, упакованную устройством обработки зерна, кукурузные хлопья, кукурузные блинчики, кукурузную муку мелкого помола, кукурузную муку грубого помола, кукурузный сироп, кукурузное масло, кукурузный силос, кукурузный крахмал, кукурузные завтраки и тому подобное, а также аналогичные сою, рис, пшеницу, сорго, голубиный горох, арахис, фрукты, дыню, и овощные товарные продукты, включая, когда это применимо, соки, концентраты, джемы, желе, мармелад и другие съедобные формы таких товарных продуктов, содержащие обнаруживаемое количество таких полинуклеотидов и/или полипептидов согласно данной заявки, цельные или обработанные семена хлопка, хлопковое масло, пух, семена и части растения, переработанные для корма или пищи, волокна, бумаги, биомассы и топливных продуктов, таких как топливо, полученное из хлопкового масла или пеллет, полученных из отходов хлопкоочистительной машины, цельные или обработанные семена сои, соевое масло, соевый белок, соевый жмых, соевую муку, соевые хлопья, соевые отруби, соевое молоко, соевый сыр, соевое вино, содержащий сою корм для животных, содержащую сою бумагу, содержащий сою крем, соевую биомасса, и топливные продукты, произведенные с использованием растений сои и частей растений сои.
[020] В данной заявке также рассматриваются способы получения семян, содержащих рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, раскрытых в данной заявке. Способ включает в себя посадку по меньшей мере одного семени, содержащего рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в данной заявке; выращивание растения из семени; и сбор семян растений, причем собранные семена содержат рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот согласно данной заявке.
[021] В другом иллюстративном варианте осуществления, предложено растение, устойчивое к поражению насекомыми, причем клетки указанного растения содержат: (a) рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую инсектицидно эффективное количество пестицидного белка, как указано в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (b) инсектицидно эффективное количество белка, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую: (i) по меньшей мере 93%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (ii) по меньшей мере 73%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10.
[022] В данной заявке также раскрыты способы борьбы с чешуекрылыми видами-вредителями и борьбы с поражением растений чешуекрылыми видами-вредителями, в частности, культурных растений. Способ включает в себя, в одном варианте осуществления, (a) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством пестицидных белков, представленных в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (b) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или большего количества пестицидных белков, содержащих аминокислотную последовательность, имеющую: (i) по меньшей мере 93%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (ii) по меньшей мере 73%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10.
[023] Дополнительно в данном документе предложен способ обнаружения присутствия рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, причем: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую: (i) по меньшей мере 93%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (ii) по меньшей мере 73%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизируется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:10. В одном варианте осуществления изобретения, способ включает в себя приведение в контакт образца нуклеиновых кислот с нуклеотидным зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с геномной ДНК из растения, содержащего полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, предложенный в данном документе, и не гибридизируется в таких условиях гибридизации с геномной ДНК из другого изогенного растения, которое не содержит сегмент, при этом зонд гомологичен или комплементарен SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:9, или последовательности, которая кодирует пестицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую: (a) по меньшей мере 93%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (b) по меньшей мере 73%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10. Способ может дополнительно включать в себя (а) подвержение образца и зонда строгим условиям гибридизации; и (б) обнаружение гибридизации зонда с ДНК образца.
[024] Согласно изобретению также предложены способы обнаружения присутствия пестицидного белка или его фрагмента в образце, содержащем белок, причем указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:10; или указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую: (a) по меньшей мере 93%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:6; или (b) по меньшей мере 73%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10. В одном варианте осуществления, способ включает в себя: (а) приведение в контакт образца с иммунореактивным антителом; и (б) обнаружение присутствия белка. В некоторых вариантах осуществления, этап обнаружения включает в себя ИФА или вестерн-блоттинг.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[025] SEQ ID NO:1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пестицидный белок TIC4472, полученный из вида Bacillus thuringiensis EG10742.
[026] SEQ ID NO:2 представляет собой аминокислотную последовательность пестицидного белка TIC4472.
[027] SEQ ID NO:3 представляет собой синтетическую кодирующую последовательность, кодирующую пестицидный белок TIC4472PL, предназначенную для экспрессии в растительной клетке, причем дополнительный кодон аланина вставляют сразу после стартового кодона метионина.
[028] SEQ ID NO:4 представляет собой аминокислотную последовательность TIC4472PL, кодируемую синтетической кодирующей последовательностью, предназначенной для экспрессии в растительной клетке (SEQ ID NO:3), и при этом дополнительную аминокислоту аланина вставляют сразу же после стартового метионина.
[029] SEQ ID NO:5 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пестицидный белок TIC1425, полученный из вида Bacillus thuringiensis EG10731.
[030] SEQ ID NO:6 представляет собой аминокислотную последовательность пестицидного белка TIC1425.
[031] SEQ ID NO:7 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пестицидный белок TIC2613, полученный из вида Bacillus thuringiensis EG5408.
[032] SEQ ID NO:8 представляет собой аминокислотную последовательность пестицидного белка TIC2613.
[033] SEQ ID NO:9 представляет собой синтетическую кодирующую последовательность, кодирующую пестицидный белок TIC2613PL, предназначенную для экспрессии в растительной клетке, причем дополнительный кодон аланина вставляют сразу после стартового кодона метионина.
[034] SEQ ID NO:10 представляет собой аминокислотную последовательность TIC2613PL, кодируемую синтетической кодирующей последовательностью, предназначенной для экспрессии в растительной клетке (SEQ ID NO:9), и при этом дополнительную аминокислоту аланина вставляют сразу после стартового метионина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[035] Проблема области борьбы с сельскохозяйственными вредителями может быть охарактеризована как необходимость в новых белках-токсинах, которые эффективны против вредителей-мишеней, проявляют токсичность широкого спектра против видов-вредителей-мишеней, способных экспрессироваться в растениях без возникновения нежелательных агрономических последствий, и обеспечивающие альтернативный способ действия по сравнению с нынешними токсинами, которые коммерчески используются в растениях.
[036] Новые пестицидные белки, примерами которых являются TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL, раскрыты в данном документе, и решают каждую из данных проблем, в частности в отношении широкого спектра чешуекрылых насекомых-вредителей, и более конкретно в отношении совки помидорной (Spodoptera exigua), Helicoverpa zea, совки хлопковой американской (Alabama argillacea), огневки кукурузной (Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda), совки хлопковой (Helicoverpa armigera), Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Cry1Ac устойчивого Pectinophora gossypiella, Chrysodeixis includens, Spodoptera eridania, Diatraea grandiosella, Earias vittella, Diatraea saccharalis, Heliothis virescens, и Anticarsia gemmatalis.
[037] Отсылка в данной заявке к TIC4472, «белку TIC4472», «белковому токсину TIC4472», «токсичному белку TIC4472», «пестицидному белку TIC4472», «токсинам, родственным TIC4472», «токсичным белкам, родственным TIC4472», TIC4472PL, «белку TIC4472PL», «белковому токсину TIC4472PL», «токсичному белку TIC4472PL», «пестицидному белку TIC4472PL», «токсинам, родственным TIC4472PL», «токсичным белкам, родственным TIC4472PL», TIC1425, «белку TIC1425», «белковому токсину TIC1425», «токсичному белку TIC1425», «пестицидному белку TIC1425», «токсинам, родственным TIC1425», «токсичным белкам, родственным TIC1425», TIC2613, «белку TIC2613», «белковому токсину TIC2613», «токсичному белку TIC2613», «пестицидному белку TIC2613», «токсинам, родственным TIC2613», «токсичным белкам, родственным TIC2613», TIC2613PL, «белку TIC2613PL», «белковому токсину TIC2613PL», «токсичному белку TIC2613PL», «пестицидному белку TIC2613PL», «токсинам, родственным TIC2613PL», «токсичным белкам, родственным TIC2613PL», и т.п., относиться к любому новому пестицидному белку или ингибирующему насекомых белку, что содержит, состоит из, по существу является гомологом, похожий на, или получен из любой последовательности пестицидного белка или ингибирующего насекомых белка TIC4472 (SEQ ID NO:2), TIC4472PL (SEQ ID NO:4), TIC1425 (SEQ ID NO:6), TIC2613 (SEQ ID NO:8), или TIC2613PL (SEQ ID NO:10) и его пестицидного или ингибирующего насекомых сегмента, или их комбинаций, которые обеспечивают активность в отношение чешуекрылых вредителей, включая любой белок, проявляющий пестицидную или ингибирующую насекомых активность, если выравнивание такого белка с TIC4472, TIC4472PL, или TIC1425 дает в результате идентичность аминокислотной последовательности, составляющую любую процентную долю от около 93% до около 100% процентов; или если выравнивание такого белка с TIC2613 или TIC2613PL дает в результате идентичность аминокислотной последовательности, составляющую любую процентную долю от около 73% до около 100% процентов. Белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL включают в себя как нацеленные на пластиды, так и ненацеленные на пластиды формы белков.
[038] Термин «сегмент» или «фрагмент» используется в данной заявке для описания непрерывных аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, которые короче, чем полная аминокислотная или нуклеотидная последовательность, описывающая белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL. В данной заявке также раскрыт сегмент или фрагмент, проявляющий ингибирующую насекомых активность, если выравнивание такого сегмента или фрагмента с соответствующей частью белка TIC4472, представленного в SEQ ID NO:2, белка TIC4472PL, представленного в SEQ ID NO:4, белка TIC1425, представленного в SEQ ID NO:6, дает в результате идентичность аминокислотной последовательности, составляющую любую процентную долю от около 93 до около 100 процентов между сегментом, или фрагментом, и соответствующей частью белка TIC4472, TIC4472PL или TIC1425; или если выравнивание такого сегмента или фрагмента с соответствующей частью TIC2613, представленного в SEQ ID NO:8, или белка TIC2613PL, представленного в SEQ ID NO:10, дает в результате идентичность аминокислотной последовательности, составляющую любую процентную долю от около 73 до около 100 процентов между сегментом, или фрагментом, и соответствующей частью белка TIC2613 или TIC2613PL.
[039] В еще дополнительных конкретных вариантах осуществления, фрагмент белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL может быть определен как проявляющий пестицидную активность, которой обладает исходная молекула белка, из которой он получен. Фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, может быть определен как кодирующий белок, проявляющий пестицидную активность, которой обладает молекула белка, кодируемая исходной нуклеотидной последовательностью, из которой он получен. Описанный в данном документе фрагмент или вариант может дополнительно содержать идентифицированный в данном документе домен, который отвечает за пестицидную активность белка.
[040] В конкретных вариантах осуществления, предложены фрагменты белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, содержащие по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 125, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 175, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 225, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 275, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 750, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 1000, по меньшей мере около 1100, по меньшей мере около 1150, или по меньшей мере около 1175 подряд аминокислот, или больше, белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, обладающего пестицидной активностью, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложены фрагменты любой из SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 или 10, обладающие активностью полноразмерной последовательности. Способы получения таких фрагментов из исходной молекулы хорошо известны в данной области техники.
[041] Отсылка в данной заявке к терминам «активный» или «активность», «пестицидная активность» или «пестицидный» или «инсектицидная активность», «ингибирующая насекомых» или «инсектицидный» относятся к эффективности токсичного агента, такого как белковый токсин, в отношении ингибирования (ингибирования роста, питания, плодовитости или жизнеспособности), подавления (подавления роста, питания, плодовитости или жизнеспособности), контроля (контроль поражения вредителями, контроля пищевых активностей вредителя на конкретной культуре, содержащей эффективное количество белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL) или уничтожения (вызывая патологии, смертность или снижение плодовитости) вредителя. Предполагается, что данные термины включают в себя результат воздействия пестицидно эффективного количества токсичного белка на вредителя, когда воздействие токсичного белка на вредителя приводит к поражению, смертности, снижению плодовитости или остановке роста. Данные термины также включают в себя отпугивание вредителя от растения, ткани растения, части растения, семян, клеток растения или от конкретного географического местоположения, где может произрастать растение, в результате доставки пестицидно эффективного количества токсичного белка в растение или на растении. В целом, как правило, пестицидная активность относится к способности токсичного белка быть эффективным в отношении ингибирования роста, развития, жизнеспособности, пищевого поведения, поведения при спаривании, плодовитости, или любого измеримого уменьшения побочных эффектов, вызываемых поглощением насекомым данного белка, фрагмента белка, сегмента белка или полинуклеотида у конкретного вредителя-мишени, включая, но не ограничиваясь насекомыми отряда чешуекрылых. Токсичный белок может продуцироваться растением или может быть применен к растению или окружающей среде в том месте, где находится растение. Термины «биологическая активность», «эффективный», «действенный» или их вариации также являются терминами, используемыми взаимозаменяемо в данной заявке, для описания воздействия белков согласно данному изобретению на вредных насекомых-мишеней.
[042] Пестицидно эффективное количество токсичного агента, когда оно доставлено в рацион вредителя-мишени, проявляет пестицидную активность, когда токсичный агент вступает в контакт с вредителем. Токсичный агент может представлять собой пестицидный белок, или один или большее количество химических агентов, известных в данной области техники. Пестицидные или инсектицидные химические агенты и пестицидные или инсектицидные белковые агенты могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом. Химические агенты включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: молекулы дцРНК, нацеленные на специфические гены для подавления в вредителе-мишени, органохлориды, органофосфаты, карбаматы, пиретроиды, неоникотиноиды и рианоиды. Пестицидные или инсектицидные белковые агенты включают в себя белковые токсины, представленные в данной заявке, а также другие белковые токсичные агенты, включая те, которые нацелены на чешуекрылых, а также белковые токсины, которые используются для борьбы с другими вредителями растений, такие как белки Cry и Cyt, доступные в данной области техники для применения с целью контроля видов Coleopteran, Hemipteran и Homopteran.
[043] Предполагается, что ссылка на вредителя, в частности, вредителя культурного растения, имеет ввиду вредителей культурных растений, в частности тех чешуекрылых насекомых-вредителей, которые контролируются классом белковых токсинов TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL. Однако, отсылка к вредителю может также включать в себя насекомых-вредителей растений из Coleopteran, Hemipteran и Homopteran, а также нематод и грибы, когда токсичные агенты, нацеленные на данных вредителей, совместно локализуются или присутствуют вместе с белком TIC4472, TIC4472PL или TIC1425, или белком что на от 93 до около 100% идентичен TIC4472, TIC4472PL или TIC1425; или белком TIC2613, или TIC2613PL, или белком, который на от 73 до около 100% идентичен TIC2613, или TIC2613PL.
[044] Белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL похожи общей функцией и проявляют инсектицидную активность в отношении насекомых-вредителей из видов чешуекрылых насекомых, включая взрослых насекомых, куколок, личинок и вылупившихся личинок.
[045] Насекомые отряда чешуекрылых (Lepidoptera) включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: насекомых из семейства совок (Noctuidae) (armyworms, cutworms, loopers, heliothines), например кукурузную лиственную совку (Spodoptera frugiperda), совку помидорную (Spodoptera exigua), Spodoptera exempta, Spodoptera eridania, Mamestra configurata, совка-ипсилон (Agrotis ipsilon), Trichoplusia ni, Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Hypena scabra, Heliothis virescens, Agrotis subterranea, Pseudaletia unipuncta, Agrotis orthogonia; точильщиков, чехлоносиков и других насекомых из семейства огневок (Pyralidae), например огневку кукурузную (Ostrinia nubilalis), Amyelois transitella, Crambus caliginosellus, Herpetogramma licarsisalis, Homoeosoma electellum, Elasmopalpus lignosellus; насекомых из семейства листоверток (Tortricidae), например яблонную плодожорку (Cydia pomonella), Endopiza viteana, восточную плодожорку Grapholita molesta, Suleima helianthana; и многих других экономически важных чешуекрылых, например, капустную моль (Plutella xylostella), Pectinophora gossypiella, и непарного шелкопряда (Lymantria dispar). Другие насекомые-вредители отряда чешуекрылых (Lepidoptera) включают в себя, например, Alabama argillacea, Archips argyrospila, Archips rosana и другие виды Archips, (Chilo suppressalis, огневку желтую рисовую), Cnaphalocrocis medinalis, Crambus caliginosellus, Crambus teterrellus, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Earias insulana, Earias vittella, совку хлопковую (Helicoverpa armigera), Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Herpetogramma licarsisalis, Striacosta albicosta, гроздьевую листовертку (Lobesia botrana), Phyllocnistis citrella, капустницу (Pieris brassicae), репницу (Pieris rapae), Spodoptera exigua, Spodoptera litura, и томатную минирующую моль (Tuta absoluta).
[046] Отсылка в данной заявке к «выделенной молекуле ДНК», или эквивалентному термину или фразе, предназначена для обозначения того, что молекула ДНК представляет собой молекулу, которая присутствует отдельно или в комбинации с другими соединениями, но не в ее естественной среде. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, последовательность интрона, нетранслируемая лидерная последовательность, последовательность промотора, последовательность терминации транскрипции и т.п., которые природно обнаруживают в ДНК генома организма, не считаются «выделенными» до тех пор, пока элемент находится в геноме организма и в том месте в геноме, в котором его природно обнаруживают. Однако, каждый из данных элементов, и частей таких элементов, будут «выделены» в рамках данного раскрытия изобретения, если элемент находится не в геноме организма, и не месте в геноме, в котором его природно обнаруживают. Подобным образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант такого белка, будет представлять собой выделенную нуклеотидную последовательность, до тех пора пока нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой в природных условиях обнаруживают последовательность, кодирующую белок. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность встречающегося в природе инсектицидного белка, будет считаться выделенной для целей данного раскрытия изобретения. Для целей данного раскрытия изобретения, любая трансгенная нуклеотидная последовательность, то есть нуклеотидная последовательность ДНК, вставленная в геном клеток растения или бактерии, или присутствующая во внехромосомном векторе, будет рассматриваться как выделенная нуклеотидная последовательность, независимо от того, присутствует она в плазмиде или аналогичной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из растения или бактерии.
[047] Как дополнительно описано в данной заявке, открытая рамка считывания (ORF), кодирующая TIC4747 (SEQ ID NO:1), была обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG10742 Bacillus thuringiensis. Кодирующая последовательность была клонирована и экспрессирована в микробных клетках-хозяевах для получения рекомбинантных белков, используемых в биоанализах. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая TIC1425 (SEQ ID NO:5), была обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG10731 Bacillus thuringiensis. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая TIC2613 (SEQ ID NO:7), была обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG5408 Bacillus thuringiensis. Биоанализ с использованием белков TIC4472, полученных из микробных клеток-хозяев, продемонстрировал активность против видов чешуекрылых - совки помидорной (Spodoptera exigua), Helicoverpa zea, совки хлопковой американской (Alabama argillacea), огневки кукурузной (Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda), совки хлопковой (Helicoverpa armigera), Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Cry1Ac устойчивого Pectinophora gossypiella, Chrysodeixis includens, Spodoptera eridania, Diatraea grandiosella, Earias vittella, Diatraea saccharalis, Heliothis virescens, и Anticarsia gemmatalis. Кроме того, также наблюдали активность против желтолихорадочного комара (Aedes aegypti). Биоанализ с использованием белков TIC1425, полученных из микробных клеток-хозяев, продемонстрировал активность против видов чешуекрылых - совки хлопковой американской (Alabama argillacea), огневки кукурузной (Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda), Diatraea saccharalis, и Diatraea grandiosella. Биоанализ с использованием белков TIC2613, полученных из микробных клеток-хозяев, продемонстрировал активность против видов чешуекрылых - Helicoverpa zea, совки хлопковой американской Alabama argillacea, огневки кукурузной (Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda), Chrysodeixis includens, Diatraea grandiosella, и Heliothis virescens.
[048] Для экспрессии в растительных клетках белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL могут экспрессироваться с локализацией в цитозоле, или могут быть нацелены на различные органеллы растительной клетки. Например, нацеливание белка на хлоропласт может привести к повышенным уровням экспрессируемого белка в трансгенном растении, в то же время предотвращая появление нецелевых фенотипов. Нацеливание может также привести к повышению эффективности устойчивости к вредителям у трангенного трансформанта. Нацеливающий пептид или транзитный пептид представляет собой короткую (длиной 3-70 аминокислот) пептидную цепь, которая направляет транспорт белка в конкретную область клетки, включая ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), хлоропласт, апопласт, пероксисому и плазматическую мембрану. Некоторые нацеливающие пептиды отщепляются от белка сигнальными пептидазами после транспортировки белков. Для нацеливания на хлоропласт белки содержат транзитные пептиды, которые содержат около 40-50 аминокислот. Описание применения хлоропластных транзитных пептидов см. в патентах США № 5188642 и 5728925. Многие локализованные в хлоропластах белки экспрессируются из ядерных генов в качестве предшественников, и нацеливаются на хлоропласт транзитным пептидом хлоропласта (CTP). Примеры таких выделенных хлоропластных белков включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: белки, связанные с малой субъединицей (SSU) рибулозо-1,5,-бисфосфаткарбоксилазы, ферредоксин, ферредоксин оксидоредуктазу, белок I и белок II светоулавливающего комплекса, тиоредоксин F, енолпирувил шикимат фосфатсинтазу (EPSPS), и транзитные пептиды, описанные в патенте США № 7193133. In vivo и in vitro было продемонстрировано, что нехлоропластные белки могут быть нацелены на хлоропласт с использованием гибридных белков с гетерологичным CTP, и что CTP достаточно для нацеливания белка на хлоропласт. Было показано, что встраивание подходящего хлоропластного транзитного пептида, такого как Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (CTP2) (смотрите, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) или Petunia hybrida EPSPS CTP (CTP4) (смотрите, della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986) нацеливало гетерологичные EPSPS белковые последовательности на хлоропласты в трансгенных растениях (смотрите, патенты США № 5627061; 5633435; и 5312910; и EP 0218571; EP 189707; EP 508909; и EP 924299). Для нацеливания токсичного белка TIC6757 или TIC6757PL на хлоропласт, последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропласта, размещают в 5' в функциональной связи и в рамке считывания с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей токсичный белок TIC6757 или TIC6757PL, который был разработан для оптимальной экспрессии в клетках растений.
[049] Предполагается, что дополнительные последовательности токсичного белка, относящиеся к TIC4472, TIC1425 или TIC2613, могут быть созданы с использованием аминокислотной последовательности TIC4472, TIC1425 или TIC2613, для создания новых белков с новыми свойствами. Токсичные белки TIC4472, TIC1425 или TIC2613 могут быть выровнены для складывания различий, на уровне аминокислотной последовательности, в новые варианты аминокислотной последовательности, и делая соответствующие изменения в рекомбинантной нуклеотидной последовательности, кодирующей варианты.
[050] Согласно данному раскрытию дополнительно предполагается, что улучшенные варианты класса белкового токсина TIC4472 могут быть сконструированы in planta с использованием различных способов редактирования генов, известных в данной области техники. Такие технологии, используемые для редактирования генома, включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: ZFN (нуклеазу цинкового пальца), мегануклеазы, TALEN (эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции) и CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)/Cas (CRISPR-ассоциированный) системы. Данные способы редактирования генома могут быть использованы для изменения последовательности, кодирующей токсичный белок, трансформированной в растительной клетке, в другую последовательность, кодирующую токсин. В частности, с помощью данных способов один или большее количество кодонов в последовательности, кодирующей токсин, изменяют для конструирования новой аминокислотной последовательности белка. В альтернативном варианте, фрагмент внутри кодирующей последовательности заменяют или удаляют, или вставляют дополнительные фрагменты ДНК в кодирующую последовательность для конструирования новой последовательности, кодирующей токсин. Новая кодирующая последовательность может кодировать токсичный белок с новыми свойствами, такими как увеличенная активность или спектр против насекомых-вредителей, а также обеспечивать активность против видов насекомых-вредителей, у которых развивается устойчивость к исходному белку, токсичному для насекомых. Растительная клетка, содержащая отредактированную последовательность кодирующего токсин гена может быть использована способами, известными в данной области техники, для получения целых растений, экспрессирующих новый токсичный белок.
[051] Также предполагается, что фрагменты TIC4472, TIC1425 или TIC2613, или их белковые варианты могут быть усеченными формами, в которых одну или большее количество аминокислот удаляют из N-конца, С-конца, середины белка или их комбинаций, причем фрагменты и варианты сохраняют ингибирующую насекомых активность. Такие фрагменты могут встречаться в природе или быть синтетическими вариантами TIC4472, TIC1425 или TIC2613, или производными белковыми вариантами, но должны сохранять ингибирующую насекомых активность по меньшей TIC4472, TIC1425 или TIC2613. Описанный в данном документе фрагмент или вариант может дополнительно содержать идентифицированный в данном документе домен, который отвечает за пестицидную активность белка.
[052] Белки, которые напоминают белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL, можно идентифицировать и сравнивать друг с другом, используя различные компьютерные алгоритмы, известные в данной области техники (смотрите Таблицы 1 и 2). Идентичности аминокислотных последовательностей, о которых сообщается в данной заявке, являются результатом выравнивания с помощью Clustal W, с использованием таких параметров по умолчанию: Матрица весов: blosum, Штраф за открытие пробела: 10,0, Штраф за продление пробела: 0,05, Гидрофильные пробелы: Вкл., Гидрофильные остатки: GPSNDQERK, Штрафы за пробелы специфических остатков: Вкл. (Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Процент аминокислотной идентичности дополнительно рассчитывают по произведению, умноженному на 100% (идентичность аминокислот/длина рассматриваемого белка). Другие алгоритмы выравнивания также доступны в данной области техники и предоставляют результаты, аналогичные результатам, полученным с использованием выравнивания Clustal W, и рассматриваются в данном документе.
[053] Предполагается, что белок, проявляющий ингибирующую насекомых активность в отношении чешуекрылых видов насекомых, относится к TIC4472, TIC4472PL или TIC1425, если белок, используемый как запрос, например, в выравнивании Clustal W, и белки согласно данному изобретению, представленные в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:6, идентифицируют как совпадения в таком выравнивании, в котором белок-запрос показывает по меньшей мере от 93% до около 100% аминокислотной идентичности по длине белка-запроса, что составляет около 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, или любую процентную долю в данном диапазоне. Также предполагается, что белок, проявляющий ингибирующую насекомых активность в отношении чешуекрылых видов насекомых, относится к TIC2613 или TIC2613PL, если белок, используемый как запрос, например, в выравнивании Clustal W, и белки согласно данному изобретению, представленные в SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, идентифицируют как совпадения в таком выравнивании, в котором белок-запрос показывает по меньшей мере от 73% до около 100% аминокислотной идентичности по длине белка-запроса, что составляет около 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, или любую процентную долю в данном диапазоне.
[054] Иллюстративные белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL были выровнены друг с другом с использованием алгоритма Clustal W. Как сообщалось в Таблице 1, была создана попарная матрица процентной идентичности аминокислотных последовательностей для каждого из полноразмерных белков.
Таблица 1. Демонстрация попарной матрицы иллюстративных белков TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL.
Описание таблицы: Выравнивание Clustal W между (X) и (Y) описывается в попарной матрице. Расчитан процент аминокислотной идентичности между всеми парами, и он показан первым числом в каждой ячейке. Второе число (в скобках) в каждой ячейке показывает количество идентичных аминокислот для пары.
[055] В дополнение к проценту идентичности, связь между TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL и родственными белками также может быть выявлена по первичной структуре (консервативным аминокислотным мотивам), длине (около 1187 аминокислот), и другим характеристикам. Характеристики белковых токсинов TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL приведены в Таблице 2.
Таблица 2. Выбранные характеристики белков TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL.
[056] Как дополнительно описано в Примерах данной заявки, были сконструированы последовательности синтетических молекул нуклеиновых кислот, кодирующих вариант TIC4472, TIC4472PL, и вариант TIC2613, TIC2613PL, для использования в растениях. Иллюстративная последовательность рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, которая была разработана для использования в растениях, кодирующая белок TIC4472PL, представлена как SEQ ID NO:3. Иллюстративная последовательность рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, которая была разработана для использования в растениях, кодирующая белок TIC2613PL, представлена как SEQ ID NO:9. Белки TIC4472PL и TIC2613PL содержат дополнительную аминокислоту аланина сразу после стартового метионина, относительно белков TIC4472 и TIC2613 соответственно. Считается, что дополнительный остаток аланина, вставленный в аминокислотные последовательности TIC4472 и TIC2613, улучшает экспрессию белка in planta. Аналогично, последовательности синтетических молекул нуклеиновых кислот кодируют варианты TIC1425, и могут быть разработаны для использования в растениях.
[057] Анализ с листьевыми дисками, применяя ткань листка R0 хлопка, экспрессирующую белок TIC4472PL, продемонстрировал высокую активность в отношении Chrysodeixis includens и Heliothis virescens, и низкую активность в отношении Helicoverpa zea и кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda). Анализ с листьевыми дисками, применяя ткань листка R0 сои, экспрессирующую белок TIC4472PL, продемонстрировал активность в отношении Spodoptera eridania и Chrysodeixis includens.
[058] Образцы листьев R0 растений сои, экспрессирующих белки TIC4472PL и TIC2613PL, продемонстрировали активность в отношении Spodoptera eridania и Chrysodeixis includens.
[059] Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие последовательность рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть сконструированы и введены в клетки кукурузы, сои, хлопка или других растений в соответствии со способами и методами трансформации, известными в данной области техники. Например, Agrobacterium-опосредованная трансформация описана в публикациях патентных заявок США 2009/0138985A1 (соя), 2008/0280361A1 (соя), 2009/0142837A1 (кукуруза), 2008/0282432 (хлопок), 2008/0256667 (хлопок), 2003/0110531 (пшеница), 2001/0042257 A1 (сахарная свекла), патентах США № 5750871 (канола), 7026528 (пшеница), и 6365807 (рис), и в Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (сахарный тростник), каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Трансформированные клетки могут быть регенерированы в трансформированные растения, которые экспрессируют белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL и демонстрируют пестицидную активность посредством биоанализов, проводимых в присутствии личинок чешуекрылых вредителей, с использованием листьевых дисков растений, полученных из трансформированных растений. Растения могут быть получены из растительных клеток путем регенерации, методами трансформации семян, пыльцы или меристемы. Способы трансформации растений известны в данной области техники.
[060] В качестве альтернативы традиционным способам трансформации, последовательность ДНК, такая как трансген, кассета(ы) экспрессии и т.д., может быть вставлена или интегрирована в конкретный сайт или локус в геноме растения или клетки растения путем сайт-направленного встраивания. Конструкция(и) и молекула(ы) рекомбинантной ДНК согласно данному изобретению могут, таким образом, содержать донорную матричную последовательность, содержащую по меньшей мере один трансген, экспрессионную кассету или другую последовательность ДНК для встраивания в геном растения или растительную клетку. Такая донорная матрица для сайт-направленной интеграции может дополнительно содержать один или два гомологичных плеча, фланкирующих последовательность вставки (т.е. последовательность, трансген, кассету и т.д., которые встраивают в геном растения). Конструкция(и) рекомбинантной ДНК согласно данному изобретению может дополнительно содержать экспрессионную кассету(ы), кодирующую сайт-специфическую нуклеазу и/или любой родственный белок(-ы) для осуществления сайт-направленного встраивания. Такие кассеты, экспрессирующие нуклеазу, могут присутствовать в той же молекуле или векторе, что и донорная матрица (in cis), или в отдельной молекуле или векторе (in trans). В данной области техники известно несколько способов сайт-направленного встраивания, использующих различные белки (или комплексы белков и/или направляющую РНК), которые разрезают геномную ДНК для получения двухцепочечного разрыва (ДЦР) или одноцепочечного разрыва в нужном геномном сайте или локусе. Вкратце, как понятно в данной области техники, в процессе репарации ДЦР или одноцепочечного разрыва, внесенного ферментом-нуклеазой, донорная матричная ДНК может интегрироваться в геном в сайте ДЦР или одноцепочечного разрыва. Наличие гомологичного плеча(ей) в донорной матрице может способствовать проникновению и нацеливанию последовательности вставки в геноме растения во время процесса репарации посредством гомологичной рекомбинации, хотя событие встраивания может происходить посредством негомологичного соединения концов (NHEJ). Примеры сайт-специфических нуклеаз, которые могут быть использованы, включают в себя нуклеазы с цинковыми пальцами, сконструированные или нативные мегануклеазы, TALE-эндонуклеазы и эндонуклеазы, направляемые РНК (например, Cas9 или Cpf1). Для способов с применением сайт-специфических нуклеаз, направляемых РНК (например, Cas9 или Cpf1), конструкция(и) рекомбинантной ДНК также будет содержать последовательность, кодирующую одну или большее количество направляющих РНК для нацеливания нуклеазы на нужный сайт в геноме растения.
[061] Как применяется в данном документе, термин «рекомбинантная молекула ДНК» представляет собой молекулу ДНК, содержащую комбинацию молекул ДНК, которые б не встречались в природе вместе без вмешательства человека. Например, рекомбинантная молекула ДНК может представлять собой молекулу ДНК, которая состоит по меньшей мере из двух молекул ДНК, гетерологичных по отношению друг к другу, молекулу ДНК, которая содержит последовательность ДНК, которая отличается от последовательностей ДНК, существующих в природе, или молекулу ДНК, которая была включена в ДНК клетки-хозяина путем генетической трансформации или редактирования генов. Аналогичным образом, «рекомбинантная молекула белка» представляет собой молекулу белка, содержащую комбинацию аминокислот, которые б не встречались в природе вместе без вмешательства человека. Например, рекомбинантная молекула белка может быть молекулой белка, которая состоит по меньшей мере из двух аминокислотных молекул, гетерологичных по отношению друг к другу, молекулой белка, которая содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотных последовательностей, существующих в природе, или молекулой белка, которая экспрессируется в клетке-хозяине в результате генетической трансформации клетки-хозяина или из-за редактирования генов генома клетки-хозяина.
[062] Рассматриваются композиции рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL. Например, белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL могут быть экспрессированы с помощью рекомбинантных конструкций ДНК, в которых полинуклеотидная молекула с ORF, кодирующей белок, функционально связана с генетическими элементами экспрессии, такими как промотор и любым другим регуляторным элементом, необходимым для экспрессии в системе, для которой предназначена конструкция. Неограничивающие примеры включают в себя функциональный в растении промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, для экспрессии белка в растениях, или Bt-функциональный промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, для экспрессии белка в бактерии Bt или других видах Bacillus. Другие элементы могут быть функционально связаны с последовательностью, кодирующей белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, включая в себя, но не ограничиваясь лишь этими: энхансеры, интроны, нетранслируемые лидерные последовательности, кодируемые метки иммобилизации белка (HIS-тэг), транслокационные пептиды (т.е. транзитные пептиды пластидов, сигнальные пептиды), полипептидные последовательности для посттрансляционных модифицирующих ферментов, сайты связывания рибосом и сайты-мишени РНКи. Иллюстративные рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, представленные в данном документе, включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, таким как SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9, который кодирует соответствующие полипептиды или белки, имеющие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:10. Гетерологичный промотор также может быть функционально связан синтетическими ДНК последовательностями, кодирующими нацеленный на пластид TIC4472PL или TIC2613PL; или ненацеленный TIC4472PL или TIC2613PL. Кодоны рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белки, раскрытые в данном документе, могут быть заменены синонимичными кодонами (известными в данной области техники как молчащая замена).
[063] Рекомбинантная конструкция ДНК, содержащая последовательности, кодирующие белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, может дополнительно содержать область ДНК, которая кодирует один или большее количество агентов, ингибирующих насекомых, которые могут быть скомпонованы для одновременной экспрессии или совместной экспрессии с последовательностью ДНК, кодирующей белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, белок, отличный от белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, молекулу дцРНК, ингибирующую насекомых, или вспомогательный белок. Вспомогательные белки включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: кофакторы, ферменты, партнеры по связыванию или другие агенты, которые действуют, чтобы способствовать эффективности ингибирующего насекомых агента, например, помогая его экспрессии, влияя на его стабильность в растениях, оптимизируя свободную энергии для олигомеризации, увеличивая его токсичность и увеличивая его спектр активности. Вспомогательный белок может облегчать поглощение, например, одного или большего количества агентов, ингибирующих насекомых, или усиливать токсическое действие токсичного агента.
[064] Рекомбинантная конструкция ДНК может быть собрана таким образом, что все белки или молекулы дцРНК экспрессируются из одного промотора, или каждый белок или молекула дцРНК находится под контролем отдельного промотора или какой-либо их комбинации. Белки согласно данному изобретению могут быть экспрессированы из мультигенной системы экспрессии, в которой один или большее количество белков TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL экспрессируются из общего нуклеотидного сегмента, который также содержит другие открытые рамки считывания и промоторы, в зависимости от типа выбранной системы экспрессии. Например, бактериальная мультигенная система экспрессии может использовать один промотор для управления экспрессией множественно-связанных/тандемных открытых рамок считывания в пределах одного оперона (т.е. полицистронная экспрессия). В другом примере, растительная мультигенная система экспрессии может использовать множественно-несвязанные или связанные экспрессионные кассеты, причем каждая кассета экспрессирует разный белок или разный агент, например, одну или большее количество молекул дцРНК.
[065] Рекомбинантные полинуклеотиды или рекомбинантные конструкции ДНК, содержащие последовательность, кодирующую белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, могут доставляться в клетки-хозяева с помощью векторов, например, плазмиды, бакуловируса, синтетической хромосомы, вириона, космиды, фагмиды, фага или вирусного вектора. Такие векторы могут быть использованы для достижения стабильной или временной экспрессии последовательности, кодирующей белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, в клетке-хозяине, или последующей экспрессии кодируемого полипептида. Экзогенный рекомбинантный полинуклеотид или рекомбинантная конструкция ДНК, которая содержит последовательность, кодирующую белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, и которая вводится в клетку-хозяина, называется в данной заявке «трансгеном».
[066] В данном документе предложены трансгенные бактерии, трансгенные клетки растений, трансгенные растения и части трансгенных растений, которые содержат рекомбинантный полинуклеотид, который экспрессирует любую одну или большее количество TIC4472 или последовательность, кодирующую токсичный белок родственного семейства. Термин «бактериальная клетка» или «бактерия» может включать в себя, но не ограничивается лишь этими: клетку Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Brevibacillus, Klebsiella, Erwinia, Rhizobium. Термин «растительная клетка» или «растение» может включать в себя, но не ограничивается лишь двудольным или однодольным растением. Термин «растительная клетка» или «растение» также может включать в себя, но не ограничивается лишь этими: клетку растения или растение люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, капусты декоративной, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопка, тыквенных, огурца, псевдотсуги Мензиса, баклажана, эвкалипта, лена, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливкового дерева, репчатого лука, декоративных растений, пальмовых, пастбищных трав, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосновых, картофеля, тополи, тыквы, сосны лучистой, редьки, рапса, риса, корневищ, ржи, дикого шафрана, кустарниковых, сорго, сосны южной, сои, шпината, тыквенных, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, кукурузы сахарной, амбрового дерева, батата, проса прутьевидного, чая, табака, помидора, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы. В некоторых вариантах осуществления, предложены трансгенные растения и части трансгенных растений, регенерированные из трансгенной растительной клетки. В некоторых вариантах осуществления, трансгенные растения могут быть получены из трансгенного семени, путем отрезания, отламывания, дробления или иным образом отделения части от растения. В некоторых вариантах осуществления, часть растения может быть семенем, семенной коробочкой, листком, цветком, стеблем, корнем или любой их частью или нерегенерируемой частью трансгенной части растения. Как используется в данном контексте, «нерегенерируемая» часть трансгенной части растения представляет собой часть, которая не может быть стимулирована для образования целого растения, или которая не может быть стимулирована для образования целого растения, способного к половому и/или бесполому размножению. В некоторых вариантах осуществления, нерегенерируемая часть части растения представляет собой часть трансгенного семени, семенной коробочки, листка, цветка, стебля или корня.
[067] Предложены способы получения трансгенных растений, которые содержат количество белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, ингибирующего чешуекрылых насекомых. Такие растения могут быть получены путем введения рекомбинантного полинуклеотида, который кодирует любой из белков, предложенных в данной заявке, в клетку растения, и отбор растения, полученного из указанной растительной клетки, которое экспрессирует количество белков, ингибирующие чешуекрылых насекомых. Растения могут быть получены из растительных клеток путем регенерации, методами трансформации семян, пыльцы или меристемы. Способы трансформации растений известны в данной области техники.
[068] Также в данном документе раскрыты обработанные растительные продукты, причем обработанный продукт содержит определяемое количество белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, сегмента, ингибирующего насекомых, или его фрагмента, или любую его отличительную часть. В определенных вариантах осуществления, обработанный продукт выбирают из группы, состоящей из частей растения, растительной биомассы, масла, муки, сахара, корма для животных, муки, хлопьев, отрубей, пуха, шелухи, обработанных семян, и семян. В определенных вариантах осуществления, обработанный продукт является не регенерируемым. Растительный продукт может включать в себя товарные или другие коммерческие продукты, полученные из трансгенного растения или части трансгенного растения, причем товарный или другие продукты могут отслеживаться посредством торговых связей, путем обнаружения нуклеотидных сегментов или экспрессированной РНК или белков, которые кодируют или содержат отличительные части белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL.
[069] Растения, экспрессирующие белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, можно скрещивать путем селекции с трансгенными трансформантами, экспрессирующими другие токсичные белки и/или экспрессирующие другие трансгенные признаки, такие как гены устойчивости к гербицидам, гены, обеспечивающие признаки урожайности или стрессоустойчивости, и т.п., или такие признаки могут быть объединены в один вектор, так что все признаки сцеплены.
[070] Отсылка в данной заявке к «выделенной» молекуле ДНК или аминокислотной молекуле, или эквивалентному термину или фразе, предназначена для обозначения того, что молекула ДНК или аминокислотная молекула присутствует одна или в комбинации с другими соединениями, но не в ее естественной среде. Например, молекула ДНК или аминокислотная молекула будет «выделенной» в рамках данного раскрытия изобретения, если элемент находится не в геноме организма и не в локусе генома, в котором он находится в природе. Для целей данного раскрытия изобретения, любая трансгенная нуклеотидная последовательность, то есть нуклеотидная последовательность ДНК, вставленная в геном клеток растения или бактерии, или присутствующая во внехромосомном векторе, будет рассматриваться как выделенная нуклеотидная последовательность, независимо от того, присутствует она в плазмиде или аналогичной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из растения или бактерии.
[071] Как дополнительно описано в Примерах, последовательности, кодирующие белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, и последовательности, имеющие существенный процент идентичности с TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, могут быть идентифицированы с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, например, полимеразной цепной реакцией (ПЦР), термической амплификацией и гибридизацией. Например, белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL могут использоваться для получения антител, которые специфически связываются с родственными белками, и могут использоваться для скрининга и поиска других членов белкового класса, которые являются родственными.
[072] Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие токсичные белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL, могут использовать в качестве зондов и праймеров для скрининга с целью идентификации других членов класса, применяя способы термоциклирования, или изотермической амплификации и гибридизации. Например, олигонуклеотиды, полученные из последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, могут быть использованы для определения наличия или отсутствия трансгена TIC4472PL в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученном из товарного продукта. Олигонуклеотиды, полученные из последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, можно использовать для определения наличия или отсутствия трансгена TIC2613PL в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученном из товарного продукта. Учитывая чувствительность некоторых способов обнаружения нуклеиновых кислот, в которых применяются олигонуклеотиды, ожидается, что олигонуклеотиды, полученные из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:9, могут быть использованы для обнаружения трансгена TIC4472PL или TIC2613PL в товарных продуктах, полученных из объединенных источников, где только часть товарного продукта получена из трансгенного растения, содержащего любой из трансгенов. Дополнительно признается, что такие олигонуклеотиды могут быть использованы для внесения вариаций в нуклеотидную последовательность каждой SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:9. Такие «мутационные» олигонуклеотиды полезны для идентификации вариантов аминокислотной последовательности TIC4472PL и TIC2613PL, проявляющих диапазон ингибирующей насекомых активности или разнообразную экспрессию в трансгенных растительных клетках-хозяевах.
[073] Гомологи нуклеотидных последовательностей, например, инсектицидные белки, кодируемые нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются с каждой или любой из последовательностей, раскрытых в данной заявке, в строгих условиях гибридизации, также являются вариантом осуществления данного изобретения. Изобретение также относится к способу обнаружения первой нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью, причем первая нуклеотидная последовательность (или ее обратная комплементарная последовательность) кодирует пестицидный белок или его пестицидный фрагмент, и гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью. В таком случае, вторая нуклеотидная последовательность может быть любой из нуклеотидных последовательностей, представленных как SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9 в строгих условиях гибиридизации. Нуклеотидные кодирующие последовательности гибридизуются друг с другом в соответствующих условиях гибридизации, таких как жесткие условия гибридизации, и белки, кодируемые данными нуклеотидными последовательностями, перекрестно реагируют с антисывороткой, созданной против любого из таких белков. Строгие условия гибридизации, как определено в данном документе, включают в себя, по меньшей мере, гибридизацию при 42°C с последующими двумя промывками в течение пяти минут, каждая при комнатной температуре, с 2X SSC, 0,1% SDS, с последующими двумя промывками в течение тридцати минут, каждая при 65°C в 0,5X SSC, 0,1% SDS. Промывки при еще более высоких температурах устанавливают еще более жесткие условия, например, условия гибридизации при 68 °С с последующей промывкой при 68 °С в 2xSSC, содержащей 0,1% SDS.
[074] Специалист в данной области техники поймет, что из-за избыточности генетического кода многие другие последовательности способны кодировать такие родственные белки, и такие последовательности в той степени, в которой они функционируют для экспрессии пестицидных белков либо в штаммах Bacillus, либо в растительной клетке, являются вариантами осуществления данного изобретения, признавая, конечно, что многие такие избыточные кодирующие последовательности не будут гибридизоваться при данных условиях с нативными последовательностями Bacillus, кодирующими TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL. В данной заявке рассматривается использование таких и других способов идентификации, известных специалистам в данной области техники, для идентификации последовательностей, кодирующих белки TIC4472, TIC1425 и TIC2613, и последовательностей, имеющих существенный процент идентичности с последовательностями, кодирующими белки TIC4472, TIC1425 и TIC2613.
[075] Данное раскрытие изобретения также предусматривает использование молекулярных способов, известных в данной области техники, для конструирования и клонирования коммерчески полезных белков, включающих в себя химеры белков из пестицидных белков; например, химеры могут быть собраны из сегментов белков TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 или TIC2613PL, чтобы получить дополнительные полезные варианты осуществления, включая объединение сегментов белков TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL с сегментами различных белков, отличных от TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL, и родственных белков. Белки TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL могут быть подвергнуты выравниванию друг с другом, и с другими из Bacillus thuringiensis или другими пестицидными белками (независимо от того, являются ли они тесно или отдаленно родственными филогенетически), и могут быть идентифицированы сегменты каждого такого белка, что удобно для обмена между выровненными белками, что приводит к конструированию химерных белков. Такие химерные белки могут быть подвергнуты анализу - биоанализу с вредителем, и охарактеризованы на наличие или отсутствие повышенной биологической активности или расширения спектра вредителей-мишеней, по сравнению с исходными белками, из которых был получен каждый такой сегмент химеры. Пестицидную активность полипептидов можно дополнительно спроектировать для активности в отношении конкретного вредителя, или более широкого спектра вредителей, путем замены доменов или сегментов другими белками, или с использованием способов направленной эволюции, известных в данной области техники.
[076] Также в данной заявке раскрыты способы борьбы с насекомыми, в частности, заражением чешуекрылыми культурных растений, с помощью белков TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL. Такие способы могут включать в себя выращивание растения, содержащего ингибирующее насекомых или чешуекрылых количество токсичного белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL. В определенных вариантах осуществления, такие способы могут дополнительно включать в себя любое одно или большее количество из: (i) применение любой композиции, содержащей или кодирующей токсичный белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL, к растению или семени, которое дает начало растению; и (ii) трансформацию растения или растительной клетки, которая дает растение с полинуклеотидом, кодирующим токсичный белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL. В целом, как правило, предполагается, что токсичный белок TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL может быть предоставлен в композиции, предоставлен в микроорганизме, или предоставлен в трансгенном растении, для наделения ингибирующей насекомых активностью в отношении чешуекрылых насекомых.
[077] В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты токсичных белков TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL является инсектицидно активным ингредиентом композиции, ингибирующей насекомых, полученной культивированием рекомбинантной Bacillus или любой другой рекомбинантной бактериальной клетки, трансформированной для экспрессии токсичного белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL, в условиях, подходящих для экспрессии токсичного белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613, и TIC2613PL. Такая композиция может быть получена путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, седиментации или концентрирования культуры таких рекомбинантных клеток, экспрессирующих/продуцирующих указанный рекомбинантный полипептид. Такой процесс может привести к получению Bacillus или другого энтомопатогенного бактериального клеточного экстракта, клеточной суспензии, клеточного гомогената, клеточного лизата, клеточного супернатанта, клеточного фильтрата или клеточного осадка. Благодаря получению рекомбинантных полипептидов, произведенных таким образом, композиция, которая содержит рекомбинантные полипептиды, может содержать бактериальные клетки, бактериальные споры и параспоральные тельца включения, и может быть приготовлена для различного применения, в том числе в качестве сельскохозяйственных аэрозолей, ингибирующих насекомых, или в качестве готовых форм, ингибирующих насекомых в пищевых биоанализах.
[078] В одном варианте осуществления, для уменьшения вероятности развития устойчивости, композиция, ингибирующая насекомых, содержащая TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL, может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую насекомых активность в отношении тех же чешуекрылых видов насекомых, но который отличается от токсичного белка TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL. Возможные дополнительные полипептиды для такой композиции включают в себя ингибирующий насекомых белок и ингибирующую насекомых молекулу дцРНК. Один пример использования таких рибонуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми-вредителями описан в Baum et al. (публикация патента США 2006/0021087 А1). Такой дополнительный полипептид для борьбы с чешуекрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, ингибирующего насекомых, такого как, но не ограниченного лишь Cry1A (патент США № 5880275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (публикация патента США № 10/525318), Cry1C (патент США № 6033874), Cry1D, Cry1Da и его производные, Cry1E, Cry1F, и химеры Cry1A/F (патент США № 7070982; 6962705; и 6713063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, химеры Cry1-типа, такой как, но не ограниченной лишь TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, и TIC1100 (публикация международной заявки WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (публикация международной заявки WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (патент США № 7064249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, и AXMI-045 (публикация патента США 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (публикация патента США 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (публикация патента США 2013-0104259 A1), AXMI-134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-150 (публикация патента США 2010-0160231 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, axmi209 (публикация патента США 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-238 (публикация патента США 2014-0033363 A1), AXMI-270 (публикация патента США 2014-0223598 A1), AXMI-345 (публикация патента США 2014-0373195 A1), AXMI-335 (публикация международной заявки WO2013/134523(A2)), DIG-3 (публикация патента США 2013-0219570 A1), DIG-5 публикация патента США 2010-0317569 A1), DIG-11 (публикация патента США 2010-0319093 A1), AfIP-1A и его производных (публикация патента США 2014-0033361 A1), AfIP-1B и его производных (публикация патента США 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (публикация патента США 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (публикация патента США 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (публикация патента США 2014-0007292 A1), Pput_1063 (публикация патента США 2014-0007292 A1), DIG-657 (публикация международной заявки WO2015/195594(A2)), Pput_1064 (публикация патента США 2014-0007292 A1), GS-135 и его производных (публикация патента США 2012-0233726 A1), GS153 и его производных (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS154 и его производных (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS155 и его производных (публикация патента США 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в публикации патента США 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в публикации патента США 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в публикации патента США 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в публикации патента США 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 и 4, и их производных, как описано в публикации патента США 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в публикации патента США 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в публикации патента США 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в публикации патента США 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 или 4, и их производных, как описано в публикации патента США 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в патенте США № 7772465 (B2), CF161_0085 и его производных, как описано в WO2014/008054 A2, токсичных для чешуекрылых белков и их производных, как описано в публикациях патентов США US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1, и US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в US7510878(B2), SEQ ID NO:2 и его производных, как описано в патенте США № 7812129(B1); и т.п.
[079] В других вариантах осуществления, такая композиция/готовая форма может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую насекомых активность в отношении насекомых, которые не ингибируются другим ингибирующим насекомых белком согласно данному изобретению, чтобы расширить полученный спектр ингибирования насекомых. Например, для борьбы с членистохоботными вредителями, комбинации ингибирующих насекомых белков согласно данному изобретению могут быть использованы с активными против членистохоботных белками, такими как TIC1415 (публикация патента США 2013-0097735 A1), TIC807 (патент США № 8609936), TIC834 (публикация патента США 2013-0269060 A1), AXMI-036 (публикация патента США 2010-0137216 A1), и AXMI-171 (публикация патента США 2013-0055469 A1). Дополнительно, полипептид для борьбы с жесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, ингибирующего насекомых, такого как, но не ограничиваясь лишь этими: Cry3Bb (патент США № 6501009), вариантов Cry1C, вариантов Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (публикация патента США 2013-0167264 A1) AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-205 (публикация патента США 2014-0298538 A1), axmi207 (публикация патента США 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-279 (публикация патента США 2014-0223599 A1), AXMI-R1 и его вариантов (публикация патента США 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (публикация патента США 2010-0319092 A1), eHIPs (публикация заявки на патент США № 2010/0017914), IP3 и его варианты (публикация патента США 2012-0210462 A1), и ϖ-Hexatoxin-Hv1a (публикация заявки на патент США US2014-0366227 A1).
[080] Дополнительные полипептиды для борьбы с насекомыми-вредителями из жесткокрылых, чешуекрылых, членистохоботных можно найти на веб-сайте классификации токсинов Bacillus thuringiensis, поддерживаемом Neil Crickmore (во всемирной паутине по адресу btnomenclature.info).
[081] В данной области техники задокументирована вероятность развития устойчивости у насекомых к определенным инсектицидам. Одна из стратегий управления устойчивостью к насекомым заключается в использовании трансгенных культур, которые экспрессируют два различных агента, ингибирующих насекомых, которые действуют различными способами. Следовательно, любое насекомое, обладающее устойчивостью к одному из агентов, ингибирующих насекомых, может контролироваться другим агентом, ингибирующим насекомых. Другая стратегия управления устойчивостью к насекомым предусматривает применение растений, которые не защищены от целевых чешуекрылых видов-вредителей, обеспечивая защищенное место для таких незащищенных растений. Один конкретный пример описан в патенте США № 6551962, который включен в полном объеме посредством ссылки.
[082] Другие варианты осуществления, такие как пестицидные химические агенты местного применения, которые предназначены для борьбы с вредителями, которых также контролируют с помощью белков, раскрытых в данном документе, следует использовать вместе с белками при обработке семян, готовые формы для опрыскивания, полива или смачивания могут применяться непосредственно к почве (грунтовое орошение), применяться для выращивания растений, экспрессирующих белки, раскрытые в данном документе, или готовятся для применения к семенам, содержащим один или большее количество трансгенов, кодирующих один или большее количество раскрытых белков. Такие готовые формы для применения при обработке семян можно наносить с помощью различных клейких веществ и усилителей клейкости, известных в данной области техники. Такие готовые формы могут содержать пестициды, которые являются синергетическими по способу действия с раскрытыми белками, при условии что готовая форма пестицидов действует по другому принципу для борьбы с теми же или аналогичными вредителями, которых можно контролировать с помощью раскрытых белков, или при условии что пестициды действуют для борьбы с вредителями в пределах более широкого круга хозяев или видов вредителей растений, которые не контролируются эффективно пестицидными белками TIC4472, TIC4472PL, TIC1425, TIC2613 и TIC2613PL.
[083] Вышеупомянутая композиция/готовая форма может дополнительно содержать приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель, например корм, порошок, пыль, пеллеты, гранулы, спрей, эмульсию, коллоидную суспензию, водный раствор, препарат спор/кристаллов Bacillus, удобрение для семян, рекомбинантную растительную клетку/растительную ткань/семя/растение, трансформированные для экспрессии одного или большего количества белков, или бактерию, трансформированную для экспрессии одного или большего количества белков. В зависимости от уровня ингибирования насекомых или инсектицидного ингибирования, присущего рекомбинантному полипептиду, и количества препарата, применяемого к растению, или пищевого анализа, композиция/ готовая форма могут содержать различные массовые количества рекомбинантного полипептида, например, от 0,0001% до 0,001% до 0,01% до 1% до 99% по массе рекомбинантного полипептида.
[084] Принимая во внимание вышеизложенное, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть внесены изменения в конкретные аспекты, которые раскрыты, и все же получить аналогичный или похожий результат без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, раскрытые в данном документе, не должны интерпретироваться как ограничивающие. Следует понимать, что полное раскрытие каждого источника, цитируемого в данном документе, включено в раскрытие данной заявки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Обнаружение, клонирование и экспрессия TIC4472, TIC1425 и TIC2613
[085] Последовательности, кодирующие три новых пестицидных белка Bacillus thuringiensis, были идентифицированы, клонированы, подтверждены и протестированы в биоанализе c насекомыми. Пестицидные белки TIC4472, TIC1425 и TIC2613, выделенные из штаммов Bacillus thuringiensis EG10742, EG10731 и EG5408 соответственно, представляют новые Cry1Ca-подобные белки.
[086] Праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были разработаны для амплификации полной копии кодирующей области для TIC4472, TIC1425 и TIC2613 из общей геномной ДНК, выделенной из штаммов Bacillus thuringiensis EG10742, EG10731 и EG5408, соответственно. Ампликоны ПЦР также содержали кодоны инициации и терминации трансляции каждой кодирующей последовательности.
[087] Каждый из ампликонов клонировали с использованием способов, известных в данной области техники, в экспрессирующие векторы Bt (Bacillus thuringiensis), функционально связанные с экспрессируемым промотором Bt.
Пример 2
TIC4472, TIC1425 и TIC2613 демонстрируют активность против чешуекрылых в биоанализе с насекомыми
[088] Биологическую активность пестицидных белков TIC4472, TIC1425 и TIC2613 оценивали путем продуцирования белка в Bt-экспрессирующем хозяине. Штамм Bt, экспрессирующий TIC4472, TIC1425 и TIC2613, выращивали в течение двадцати четырех (24) часов, а затем в пищу насекомых добавляли либо препарат спор кристаллов, либо препарат солюбилизированного белка. Смертность и задержку роста оценивали путем сравнения роста и развития насекомых на рационе с культурой из штамма Bt, экспрессирующего TIC4472, TIC1425 и TIC2613, с насекомыми на рационе с необработанной контрольной культурой.
[089] Препараты TIC4472 были проанализированы в отношении видов чешуекрылых - Helicoverpa zea (две колонии (CEW и CEWUC)), совки хлопковой американской (CLW, Alabama argillacea), огневки кукурузной (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (FAW, Spodoptera frugiperda), Chrysodeixis includens (SBL), Spodoptera eridania (SAW), Diatraea grandiosella (SWCB), Diatraea saccharalis (SCB), Cry2Ab устойчивой колонии Diatraea saccharalis (SCB2R), Heliothis virescens (TBW), и Anticarsia gemmatalis (VBW); видов жесткокрылых - колорадского жука (CPB, Leptinotarsa decemlineata) и Diabrotica virgifera virgifera (WCB); вида членистохоботных - Lygus lineolaris (TPB), Lygus hesperus (WTP); и видов двукрылых - комара желтолихорадочного (Aedes aegypti). Препараты TIC1425 были проанализированы против видов чешуекрылых - совки-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), совки хлопковой американской (CLW, Alabama argillacea), огневки кукурузной (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (FAW, Spodoptera frugiperda), Agrotis ipsilon (BCW), Diatraea grandiosella (SWCB), и Diatraea saccharalis (SCB); и видов жесткокрылых - Diabrotica virgifera virgifera (WCB) и Diabrotica undecimpunctata howardi. Препараты TIC2613 были проанализированы против видов чешуекрылых - Helicoverpa zea (две колонии (CEW и CEWUC)), совки хлопковой американской (CLW, Alabama argillacea), огневки кукурузной (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (FAW, Spodoptera frugiperda), Chrysodeixis includens (SBL), Spodoptera eridania (SAW), совки-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), Diatraea grandiosella (SWCB), Heliothis virescens (TBW), и Anticarsia gemmatalis (VBW); видов жесткокрылых - колорадского жука (CPB, Leptinotarsa decemlineata), Diabrotica virgifera virgifera (WCB) и Diabrotica undecimpunctata howardi; и видов членистохоботных - Lygus lineolaris (TPB), Lygus hesperus (WTP).
[090] Активность при биоанализе, наблюдаемая для каждого белка, выращенного в хозяине Bt, представлена ниже в Таблицах 3 и 4, причем «+» обозначает активность, «NT» указывает, что токсин не был проанализирован против данного конкретного насекомого-вредителя, «S» обозначает задержку роста, и «М» обозначает смертность. Препараты TIC4472, TIC1425 и TIC2613 не продемонстрировали активности в отношении жесткокрылых и членистохоботных насекомых-вредителей, проанализированных для каждого белка. TIC4472 также продемонстрировал активность против комара желтолихорадочного (Aedes aegypti). Все три токсина продемонстрировали устойчивость к многочисленным чешуекрылым насекомым-вредителям, как показано в Таблицах 3 и 4.
Таблица 3. Биоанализ активности TIC4472, TIC1425 и TIC2613 в отношении насекомых-вредителей.
Таблица 4. Биоанализ активности TIC4472, TIC1425 и TIC2613 в отношении насекомых-вредителей.
[091] Как видно из приведенных выше Таблиц 3 и 4, инсектицид TIC4472 продемонстрировал активность против всех проанализированных чешуекрылых насекомых-вредителей (CEW, CEWUC, CLW, ECB, FAW, SBL, SAW, SCB, SCB2R, SWCB, TBW и VBC); а также YFM. Инсектицид TIC1425 продемонстрировал активность против CLW, ECB, FAW, SCB и SWCB. Инсектицид TIC2613 продемонстрировал активность против CEW, CLW, ECB, FAW, SBL, SAW, SCB, SWCB, TBW и VBC. Не наблюдали активности для TIC1425 и TIC2613 при анализе против BCW.
[092] В отдельной серии экспериментов, белковые препараты TIC4472 были проанализированы, с использованием перекрывающегося пищевого анализа, против чешуекрылых насекомых-вредителей - Spodoptera exigua (BAW), Pectinophora gossypiella (PBW), Cry1Ac устойчивого Pectinophora gossypiella (PBW_Cry1Acr), совки хлопковой (OWB, Helicoverpa armigera), Spodoptera litura (OLW), и Earias vittella (SBW, Earias vittella). В Таблице 5 показана активность, наблюдаемая в отношении каждого из данных чешуекрылых насекомых-вредителей, проанализированных в перекрывающемся пищевом биоанализе, где «+» обозначает активность.
Таблица 5. Биоанализ активности TIC4472 против чешуекрылых насекомых-вредителей.
[093] Как видно из приведенной выше Таблицы 5, TIC4472 продемонстрировал активность в отношении всех чешуекрылых насекомых-вредителей, проанализированных в биоанализе с перекрывающимся рационом, включая устойчивую к Cry1Ac колонию Pectinophora gossypiella.
[094] Как показано в Таблицах 3-5, TIC4472, TIC1425 и TIC2613 демонстрируют активность в отношении широкого спектра видов чешуекрылых насекомых-вредителей.
Пример 3
Разработка синтетических кодирующих последовательностей, кодирующих TIC4472PL и TIC2613PL для экспрессии в клетках растений
[095] Синтетические кодирующие последовательности конструировали для использования в экспрессии кодируемого белка в растениях, клонировали в бинарные векторы для трансформации растений, и использовали для трансформации растительных клеток. Синтетические последовательности синтезировали в соответствии со способами, в целом, как правило, описанными в патенте США 5500365, избегая определенных проблемных последовательностей, таких как растительные последовательности, богатые ATTTA и A/T. Синтетические кодирующие последовательности кодируют белки TIC4472PL и TIC2613PL, которые содержат дополнительный аланиновый остаток, непосредственно следующий за стартовым метионином, относительно белков TIC4472 и TIC2613, соответственно. Дополнительный остаток аланина включен в синтетическую кодирующую последовательность для улучшения экспрессии токсичного для насекомых белка.
[096] Синтетическая кодирующая последовательность, кодирующая TIC4472PL (SEQ ID NO:4), представлена в данном документе как SEQ ID NO:3. Синтетическая кодирующая последовательность, кодирующая TIC2613PL (SEQ ID NO:10), представлена как SEQ ID NO:9. Синтетические кодирующие последовательности использовали в бинарных векторах для трансформации растений для создания трансгенных растений, экспрессирующих белки TIC4472PL и TIC2613PL, и анализировали на активность против чешуекрылых насекомых-вредителей.
Пример 4
Анализ активности TIC4472PL против чешуекрылых вредителей в стабильно трансформированных растениях хлопка
[097] Бинарные векторы для трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, предназначенные для экспрессии ненацеленного пестицидного белка TIC4472PL, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы были использованы для стабильной трансформации растений хлопка. Ткани собирали с трансформантов и использовали в биоанализе с насекомыми против различных чешуекрылых насекомых-вредителей.
[098] Синтетические кодирующие последовательности конструировали для использования в экспрессии кодируемого белка в растениях, клонировали в бинарный вектор для трансформации растений, и использовали для трансформации клеток растений хлопка. Полученные векторы для трансформации растений содержали первую трансгенную кассету для экспрессии пестицидного белка TIC4472PL, которая содержала конститутивный промотор, функционально связанный в 5' с лидерной последовательностью, функционально связанной в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей ненацеленный белок TIC4472PL, который, в свою очередь, был функционально связан в 5' с 3' UTR; и вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием селектиномицина.
[099] Три бинарных вектора для трансформации растений конструировали, как описано выше, и они содержали разные конститутивные промоторы. Две конструкции, Конструкция 1 и Конструкция 3, также содержали интронную последовательность, которая была функционально связана в 3' с лидерной последовательностью и в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей ненацеленный белок TIC4472PL. Конструкция 2 был без интронов. Растения хлопка трансформировали тремя различными бинарными векторами для трансформации, используя Agrobacterium-опосредованный способ трансформации. Трансформированные клетки индуцировали для формирования растений с помощью способов, известных в данной области техники. Биоанализы с использованием листьевых дисков растений проводили аналогично тем, которые описаны в патенте США № 8344207. На каждый образец листьевого диска помещали по одной свежевылупленной личинке в возрасте до одного дня, и позволяли питаться в течение примерно четырех дней. Нетрансформированное растение хлопка использовали для получения ткани, которую использовали в качестве отрицательного контроля. Трансформанты R0 с множественной трансформацией одной копией вставки каждого бинарного вектора оценивали против Helicoverpa zea (CBW), кукурузной лиственной совки (FAW, Spodoptera frugiperda), Chrysodeixis includens (SBL), и Heliothis virescens (TBW). Трансформант оценивали с помощью баллов рейтинга повреждения листа (LDR) в диапазоне от одного (1) до четырех (4). Баллы LDR основаны на проценте повреждения, наблюдаемого для каждого листьевого диска. В приведенной ниже Таблице 6 показаны оценки LDR и соответствующий диапазон ущерба в процентах, связанного с каждой оценкой. Для баллов LDR, равных одному (1), также оценивают пенетрантность признака. Высокая пенетрантность (как обозначено «(H)») определяется как больше чем пятьдесят (50) процентов оцененных трансформантов для каждой конструкции, имеющих повреждение листа меньшее чем или равное десяти (10) процентам. Низкая пенетрантность (как обозначено «(L)») определяется как не больше чем пятьдесят (50) процентов оцененных трансформантов для каждой конструкции, имеющих повреждение листа меньшее чем или равное десяти (10) процентам. Пенетрантность не применяется к баллам LDR, превышающим единицу (1).
Таблица 6. Баллы рейтинга повреждения листьев (LDR) для хлопка, и соответствующий процент повреждения, и пенетрантность.
[0100] Баллы рейтинга повреждения листьев для трансформированных растений R0хлопка, экспрессирующих TIC4472PL, представлены в Таблице 7 ниже. Количество трансформантов, демонстрирующих балл LDR, из всего количества проанализированных трансформантов, показано в скобках, за которым следует пенетрантность для тех баллов LDR, что равны единице (1).
Таблица 7. Баллы рейтинга повреждения листьев (LDR), число трансформантов, демонстрирующих LDR, и пенетрантность для трансформированных растений R0 хлопка, экспрессирующих TIC4472PL.
[0101] Трансформированные растения R0 хлопка, экспрессирующие TIC4472PL, были высокоэффективными (оприделяли, как имеющие меньше чем или ровно десять процентов повреждение листьев) против SBL и TBW, как показано в Таблице 7. В нескольких трансформантах также наблюдали активность против CBW и FAW.
[0102] Трансформанты R1 хлопка были отобраны из трансформированных растений R0 хлопка, оцененных выше, и они были использованы в анализе с листьевыми дисками против FAW, SBL и TBW. В Таблице 8 показаны баллы рейтинга повреждения листьев для трансформированных растений R1 хлопка, экспрессирующих TIC4472PL.
Таблица 8. Баллы рейтинга повреждения листьев (LDR), количество трансформантов, демонстрирующих LDR, и пенетрантность для трансформированных растений R1 хлопка, экспрессирующих TIC4472PL.
[0103] Как видно из Таблицы 8 выше, выбранные трансформанты показали высокую эффективность в отношении FAW, SBL и TBW. Пенетрантность была высокой для трансформантов, трансформированных Конструкцией 1, для всех трех видов насекомых-вредителей. Что касается трансформантов, трансформированных Конструкцией 2, для SBL уровень пенетрантности был высоким.
[0104] Вышесказанное демонстрирует, что трансформированные растения хлопка, экспрессирующие белок TIC4472PL, проявляют устойчивость к кукурузной лиственной совке (FAW, Spodoptera frugiperda), Chrysodeixis includens (SBL) и Heliothis virescens (TBW).
Пример 5
Анализ активности TIC4472PL и TIC2613PL в отношении чешуекрылых вредителей в стабильно трансформированных растениях сои
[0105] Бинарные векторы для трансформации растений, содержащие трансгенную кассету, спроектированную для экспрессии нацеленного на пластиды пестицидного белка TIC4472PL или ненацеленного TIC2613PL, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученный вектор использовали для стабильной трансформации растений сои. У трансформантов собирали ткани и использовали в биоанализе с насекомыми против различных чешуекрылых насекомых-вредителей.
[0106] Синтетические кодирующие последовательности, разработанные для экспрессии в растениях, описанные в Примере 3, были клонированы в конструкции бинарных векторов для трансформации растений, и использованы для трансформации клеток растений сои. Три бинарные векторные конструкции были сконструированы с использованием способов, известных в данной области техники, для экспрессии нацеленного на пластиды и ненацеленного TIC4472PL. Конструкция 4 содержала первую трансгенную кассету для экспрессии ненацеленного TIC4472PL, которая содержала конститутивный промотор, функционально связанный в 5' с лидерной последовательностью, функционально связанной в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей ненацеленный белок TIC4472PL, который в свою очередь был функционально связан в 5' с 3' UTR и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием селектиномицина. Конструкция 5 содержала первую трансгенную кассету для экспрессии нацеленного TIC4472PL, которая содержала конститутивный промотор, функционально связанный в 5' с лидерной последовательностью, функционально связанной в 5' с интроном, функционально связанным в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей нацеленный на пластиды белок TIC4472PL, который в свою очередь был функционально связан в 5' с 3' UTR и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием селектиномицина. Конструкция 6 содержала первую трансгенную кассету для экспрессии ненацеленного TIC4472PL, которая содержала конститутивный промотор, функционально связанный в 5' с лидерной последовательностью, функционально связанной в 5' с интроном, функционально связанным в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей ненацеленный белок TIC4472PL, который в свою очередь был функционально связан в 5' с 3' UTR и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием селектиномицина.
[0107] Две бинарные векторные конструкции были сконструированы с использованием способов, известных в данной области техники, для экспрессии ненацеленного TIC2613PL. Конструкция 7 содержала первую трансгенную кассету для экспрессии ненацеленного TIC2613PL, которая содержала конститутивный промотор, функционально связанный в 5' с лидерной последовательностью, функционально связанной в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей ненацеленный белок TIC2613PL, который в свою очередь был функционально связан в 5' с 3' UTR и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием селектиномицина. Конструкция 8 содержала первую трансгенную кассету для экспрессии ненацеленного TIC2613PL, которая содержала конститутивный промотор, функционально связанный в 5' с лидерной последовательностью, функционально связанной в 5' с интроном, функционально связанным в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей ненацеленный белок TIC2613PL, который в свою очередь был функционально связан в 5' с 3' UTR и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием селектиномицина.
[0108] Полученные конструкции бинарного вектора для трансформации использовали для трансформации клеток сои с использованием Agrobacterium-опосредованного способа трансформации. Трансформированные клетки сои индуцировали для формирования растений с помощью способов, известных в данной области техники. Биоанализы с использованием листьевых дисков растений проводили аналогично тем, которые описаны в патенте США № 8344207. Не трансформированное растение сои использовали для получения ткани, которую использовали в качестве отрицательного контроля. Трансформанты R0 сои с множественной трансформацией, полученные с помощью бинарных векторов, оценивали против Spodoptera eridania (SAW), Chrysodeixis includens (SBL), Helicoverpa zea (SPW). Баллы рейтинга повреждения листьев (LDR) были аналогичны таковым для хлопка, но отличались диапазоном повреждения в процентах, используемого для определения балла. Баллы рейтинга повреждения листьев и соответствующие им диапазоны рейтинга повреждения листьев в процентах представлены в Таблице 9 ниже.
Таблица 9. Баллы рейтинга повреждения листьев (LDR) для сои, и соответствующий процентный диапазон повреждения.
[0109] Баллы рейтинга повреждения листьев для трансформированных растений R0 хлопка, экспрессирующих TIC4472PL и TIC2613PL, представлены в Таблице 10 ниже. Количество трансформантов, демонстрирующих балл LDR из всего количества оцененных трансформантов, показано в скобках.
Таблица 10. Баллы рейтинга повреждения листьев (LDR) и количество трансформантов, демонстрирующих LDR для трансформрованных растений R0 сои, экспрессирующих TIC4472PL и TIC2613PL.
[0110] Как видно из Таблицы 10 выше, экспрессия как TIC4472PL, так и TIC2613PL продемонстрировала высокую эффективность против SAW и SBL. Активность была ниже для обоих белков в отношении SPW.
[0111] Трансформанты R1 сои были выбраны из трансформированных растений R0 сои, экспрессирующих TIC4472PL и TIC2613PL, оцененных выше, и они были использованы в анализе с листьевыми дисками против SAW, SBL, и SPW. Трансформанты сои R1, экспрессирующее TIC4472PL, также оценивали против Anticarsia gemmatalis (VBW). В Таблице 11 показаны баллы рейтинга повреждения листьев для трансформированных растений R1 сои, экспрессирующих TIC4472PL и TIC2613PL.
Таблица 11. Баллы рейтинга повреждения листьев (LDR) и количество трансформантов, демонстрирующих LDR для трансформрованных растений R1 сои, экспрессирующих TIC4472PL и TIC2613PL.
[0112] Как видно из Таблицы 11, некоторое количество трансформантов R1 сои, трансформированных TIC4472PL, продемонстрировало высокую эффективность против SAW и SBL. Кроме того, несколько трансформантов R1 сои, трансформированных с использованием Конструкции 6, продемонстрировали высокую эффективность против VBC. Трансформанты R1 сои, трансформированные TIC2613PL, продемонстрировали высокую эффективность против SBL.
[0113] Вышесказанное демонстрирует, что трансформированные растения сои, экспрессирующие TIC4472PL или TIC2613PL, показывают устойчивость к чешуекрылым насекомым, в частности Spodoptera eridania и Chrysodeixis includens, и Anticarsia gemmatalis.
Пример 6
Анализ активности TIC4472PL и TIC2613PL в отношении чешуекрылых вредителей в стабильно трансформированных растениях кукурузы
[0114] Бинарные векторы для трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, разработанные для экспрессии нацеленного на пластиды и ненацеленного пестицидного белка TIC4472PL или TIC2613PL, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы используют для стабильной трансформации растений кукурузы. Ткани собирают из трансформантов и используют в биоанализе с насекомыми против различных чешуекрылых насекомых-вредителей.
[0115] Синтетическую кодирующую последовательность, кодирующую белок TIC4472PL (SEQ ID NO:3) или TIC2613 (SEQ ID NO:9), клонируют в бинарные векторы для трансформации. Для нацеленного на пластиды белка, синтетическая последовательность, кодирующая пестицидный белок TIC4472PL или TIC2613PL, является функционально связанной в рамке считывания с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, нацеленный на хлоропласт. Полученные векторы для трансформации растений содержат первую трансгенную кассету для экспрессии пестицидного белка TIC4472PL или TIC2613PL, которая содержит конститутивный промотор, функционально связанный в 5' с лидерной последовательностью, функционально связанной в 5' с интроном, функционально связанным в 5' с синтетической кодирующей последовательностью, кодирующей нацеленный на пластиды и ненацеленный белок TIC4472PL или TIC2613PL, который, в свою очередь, функционально связан в 5' с 3' UTR; и вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием селектиномицина.
[0116] Растения кукурузы трансформируют бинарными векторами для трансформации, описанными выше, используя Agrobacterium-опосредованный способ трансформации. Трансформированные клетки индуцируют для формирования растений с помощью способов, известных в данной области техники. Биоанализы с использованием листьевых дисков растений проводили аналогично тем, которые описаны в патенте США № 8344207. Нетрансформированное растение кукурузы используют для получения ткани, которая будет использоваться в качестве отрицательного контроля. Трансформанты с множественной трансформацией каждым бинарным вектором оценивают против Spodoptera exigua (BAW), совки-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), Helicoverpa zea (CEW), совки хлопковой американской (CLW, Alabama argillacea), огневки кукурузной (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (FAW, Spodoptera frugiperda), совки хлопковой (OWB, Helicoverpa armigera), Spodoptera litura (OLW), Pectinophora gossypiella (PBW), Chrysodeixis includens (SBL), Earias vittella (SBW), Diatraea grandiosella (SWCB), Diatraea saccharalis (SCB), Heliothis virescens (TBW), и Anticarsia gemmatalis (VBW), а также других чешуекрылых насекомых-вредителей.
[0117] Отмечают гибель и задержку роста для насекомых-вредителей, вызванные поглощением предоставленных листьевых дисков, экспрессирующих TIC4472PL или TIC2613PL, и сравнивают с листьевыми дисками, полученными из нетрансформированных растений кукурузы.
[0118] Все композиции, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть получены и применены без излишних экспериментов в виду данного раскрытия изобретения. Хотя композиции согласно данному изобретению были описаны в терминах вышеизложенных иллюстративных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что в описанную в данном документе композицию могут вноситься вариации, изменения, модификации, и правки, не выходя за рамки истинной концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены агентами, описанными в данном документе, но при этом будут достигаться такие же или похожие результаты. Все такие аналогичные заместители и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
[0119] Все публикации и опубликованные патентные документы, процитированные в описании, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была специально и индивидуально указана для включения посредством ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Monsanto Technology LLC
Bowen, David J
Chay, Catherine A
Howe, Arlene R
Kesanapalli, Uma
<120> NOVEL INSECT INHIBITORY PROTEINS
<130> MONS:426WO
<140> US 62/406082
<141> 2016-10-10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3564
<212> DNA
<213> Bacillus thuringienses
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3564)
<223> Nucleic acid sequence encoding a TIC4472 pesticidal protein
obtained from Bacillus thuringiensis species EG10742.
<400> 1
atgaataata atattgaaaa ccaatgcgta ccttacaatt gtttaagtaa tcctgaagaa 60
gtaattttgg atggagaacg gatatcaact ggtaattcat caattgatat ttctctgtca 120
cttgttcaac ttctggtatc taactttgta ccaggcggag gatttttagt agggttaata 180
gattttgtat ggggaatagt aggcccttct ccatgggatg catttctagt gcaaattgaa 240
caattaattc agcaaagaat agaagcatat gctagggctg cagcaatttc taatttagaa 300
ggaataggaa acaatttcaa tatatatgtg gaagcatttc aagaatggga agaagatcct 360
aataatccag caaccaggaa tagagtagtt gatcgctttc gtatacttga tgggctactt 420
gaaagggaca ttccttcgtt tcgaatttct ggatttgaag tccccctttt atccgtttat 480
gctcaagcgg ccaatctgca tctagctata ttaagagatt ctgtaatttt tggagaaaga 540
tggggattga caacaacaaa tgtcaatgaa aactataata gacaaatcag gcatattgat 600
gaatatgctg atcactgtgc aaatacgtat aatcggggat taaataattt accgaaatct 660
acgtatcaag attggataac atataatcga ttacggagag aattaacatt gactgtatta 720
gatatcgctg ctttctttcc aaactatgac aataggcggt atccaattca gccagttggt 780
caactaacaa gggaagttta tacggaccca ttaattactt ttaatcccca gttacagtct 840
gtagctcaat tacctacttt taacgttatg gaaagcaacg caattagaaa tcctcatttg 900
tttgatatat tgaataatct tacaattttt acggattggt ttagtgttgg acgcaacttt 960
tattggggag gacatcgagt aacttctaac tatataggag gaggcaacat aacatctcct 1020
atatatggaa gagaggcgaa ccaggagcct ccaagatctt ttacttttaa tggacctgtt 1080
tttaggactt tatcaaatcc tactttacga ttattacagc aaccttggcc agcaccacca 1140
tttaatttac gtggtgttga aggagtagaa ttttctacac ctacaaatag ctttacgtat 1200
cgaggaagag gtacagttga ttctttaacc gaattaccgc ctgaggataa tagtgtgcta 1260
cctcgcgagg gatatagtca tcgtttatgt catgcaactt ttgttcaaag atctggaaca 1320
ccatttttaa caacgggtgt agtattttct tggacgcatc gcagtgcaac tcttacaaat 1380
acaattgatc cagacaaaat tactcagata cctttagtga aaggatttag agtttggagt 1440
ggcgcctctg tcgttacagg accaggtttt acaggagggg atatccttcg aagaactaac 1500
tttggggatt ttgtatctat gcaagttaat attaattcac caataacaca aagataccgt 1560
ttaagatttc gttatgcttc cagtagagat gcacgactta cagtagcgac aggagcagca 1620
aacacaggag ttggagggca aattagtgtg gacatggctc ttcagaaaac tatggaaatt 1680
ggagagagct taacatctag aacatttaga tataccgatt ttagtaatcc tttttcattt 1740
agagctaatc cagatataat tcgtataaat gaacaaccac tattcggtgc aggctctatt 1800
agtagtggtg aactttatat agataaaatt gaaattattc tagcagatgc aacatttgaa 1860
gcagaatatg atttggaaag agcacagaag gcggtgaatg cgctgtttac ttctacaaac 1920
caaagaggat taaaaacaga tgtgacggat tatcatattg atcaagtatc caatttagtt 1980
gagtgtttat cggatgaatt ttgtctggat gaaaaacgag aattgtccga gaaagtcaaa 2040
catgcgaagc gactcagtga tgagcgaaat ttactccagg atcgaaattt cacatccatt 2100
aatgggcaac tagaccgtgg ctggagagga agtacggata ttaccatcca aggaggagat 2160
gacgtattca aagagaatta cgtcacacta ctgggtacct ttgatgagtg ctatccaacg 2220
tatttatatc aaaaaataga tgagtcgaaa ttaaaagcct atacccgcta tgaattaaga 2280
gggtatatcg aggatagtca agacttagaa atctatttaa ttcgctacaa tgcaaaacac 2340
gaaacagtaa atgtgccagg tacaggttcc ttatggccgc tttcagtcga aagtccaatc 2400
ggaaagtgtg gagaaccgaa tcgatgcaca ccacaccttg aatggaatcc taatctagat 2460
tgttcctgca gagacgggaa aacatgtgca catcattctc atcatttctc cttggacatt 2520
gatgttggat gtacagactt aaatgaagat ctaggtgtat gggtgatatt caagattaag 2580
acgcaagatg gtcatgcaag actaggaaat ctagagtttc tcgaagagaa accattagta 2640
ggagaagcgt tagctcgtgt gaaaagagcg gagaaaaaat ggagagacaa acgcgaaaaa 2700
ttgcaattag aaacaaatat cgtttacaaa gaggcaaaag aagctgtgga tgctttattt 2760
gtaaactctc aatatgatag attacaagtg gatacgaaca ttgccatgat tcatgcggca 2820
gataaacgcg ttcatagaat ccgagaagcg tatcttccag agttatctgt gattccgggt 2880
gtcaatgcgg ctattttcga agaattagaa gggtgtgttt tcactgcatt ctccctatat 2940
gatgcgagaa atgtcattaa aaatggcgat tttaataatg gcttatcatg ctggaacgtg 3000
aaagggcatg tagaagaaca aaacgaccat cgttcggtcc ttgttgtccc ggaatgggaa 3060
gcagaagtgt cacaagaggt tcgtgtctgt ccaggtcgtg gctatatcct tcgtgttaca 3120
gcatacaaag agggatatgg agaaggctgt gtaaccattc atgggatcga gaacaataca 3180
gacgaactga agtttagcaa ctgcgtagaa gaggaagtct atccaaacaa cacggtaacg 3240
tgtaatgatt atcctgcaaa tcaagaagaa tacgggggtg cgtacacttc tcgtaatcgt 3300
ggatatgacg aaacttatgg aagcaattct tccgtatcag ctgattatgc gtcagtttat 3360
gaagaaaaag cgtatacaga tggacgaaga gacaatccat gtgaatttaa cagagggtat 3420
ggggattata cgccactacc agctggctat gtaacaaaag aattagaata cttcccagaa 3480
accgataagg tatggattga gattggagaa acggaaggaa cattcatcgt ggacagtgtg 3540
gaattactcc ttatggagga atag 3564
<210> 2
<211> 1187
<212> PRT
<213> Bacillus thuringienses
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1187)
<223> The amino acid sequence of the TIC4472 pesticidal protein.
<400> 2
Met Asn Asn Asn Ile Glu Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Glu Glu Val Ile Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn
20 25 30
Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Asn
35 40 45
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp
50 55 60
Gly Ile Val Gly Pro Ser Pro Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu
65 70 75 80
Gln Leu Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gly Ile Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala
100 105 110
Phe Gln Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Asn Arg
115 120 125
Val Val Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile
130 135 140
Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile
165 170 175
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Thr Asn Val Asn Glu Asn Tyr
180 185 190
Asn Arg Gln Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn
195 200 205
Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp
210 215 220
Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile
245 250 255
Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile
260 265 270
Thr Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe Asn
275 280 285
Val Met Glu Ser Asn Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe
305 310 315 320
Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Thr Ser Asn Tyr Ile Gly Gly Gly Asn
325 330 335
Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg
340 345 350
Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr
355 360 365
Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg
370 375 380
Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp
405 410 415
Asn Ser Val Leu Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala
420 425 430
Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val
435 440 445
Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro
450 455 460
Asp Lys Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Ser
465 470 475 480
Gly Ala Ser Val Val Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu
485 490 495
Arg Arg Thr Asn Phe Gly Asp Phe Val Ser Met Gln Val Asn Ile Asn
500 505 510
Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser
515 520 525
Arg Asp Ala Arg Leu Thr Val Ala Thr Gly Ala Ala Asn Thr Gly Val
530 535 540
Gly Gly Gln Ile Ser Val Asp Met Ala Leu Gln Lys Thr Met Glu Ile
545 550 555 560
Gly Glu Ser Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser Asn
565 570 575
Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Arg Ile Asn Glu Gln
580 585 590
Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp
595 600 605
Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp
610 615 620
Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn
625 630 635 640
Gln Arg Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val
645 650 655
Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys
660 665 670
Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu
675 680 685
Arg Asn Leu Leu Gln Asp Arg Asn Phe Thr Ser Ile Asn Gly Gln Leu
690 695 700
Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp
705 710 715 720
Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu
725 730 735
Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys
740 745 750
Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp
755 760 765
Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn
770 775 780
Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser Pro Ile
785 790 795 800
Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Thr Pro His Leu Glu Trp Asn
805 810 815
Pro Asn Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Lys Thr Cys Ala His His
820 825 830
Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn
835 840 845
Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly
850 855 860
His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val
865 870 875 880
Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp
885 890 895
Lys Arg Glu Lys Leu Gln Leu Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala
900 905 910
Lys Glu Ala Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu
915 920 925
Gln Val Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val
930 935 940
His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly
945 950 955 960
Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Cys Val Phe Thr Ala
965 970 975
Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn
980 985 990
Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Glu Glu Gln Asn
995 1000 1005
Asp His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val
1010 1015 1020
Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg
1025 1030 1035
Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile
1040 1045 1050
His Gly Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys
1055 1060 1065
Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp
1070 1075 1080
Tyr Pro Ala Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg
1085 1090 1095
Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Ser Val Ser
1100 1105 1110
Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly
1115 1120 1125
Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr
1130 1135 1140
Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe
1145 1150 1155
Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly
1160 1165 1170
Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1175 1180 1185
<210> 3
<211> 3567
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A synthetic coding sequence encoding a TIC4472PL pesticidal
protein designed for expression in a plant cell wherein an
additional alanine codon is inserted immediately following the
initiating methionine codon.
<400> 3
atggctaata acaacatcga gaaccagtgc gtgccctaca actgcctttc gaacccggag 60
gaagtgatcc tggacggcga aaggatctcg accgggaata gcagcatcga catctcgctt 120
tcgctcgtgc agcttctagt cagtaacttc gttccgggcg gagggtttct cgtgggcctt 180
attgacttcg tttggggcat cgtgggccca tctccttggg acgcattcct cgtgcagatc 240
gagcaactga tccagcagcg tatcgaggcg tacgctaggg ctgccgctat ctccaacctg 300
gagggcatcg gcaacaactt caacatctac gttgaagcct tccaagaatg ggaggaagat 360
cctaataacc cagctacgcg gaacagagtg gtggatcgct ttagaatcct cgacggcctc 420
ctggaaaggg acatcccgag cttccgtatt tccggcttcg aggtgccgct gctgagcgtg 480
tacgcgcaag cggccaatct gcacctggcg attctccggg actctgtgat cttcggcgag 540
cggtggggcc tcaccaccac taacgtgaac gagaactaca accgccagat ccgccacatc 600
gacgagtacg cggaccactg cgccaacaca tacaatcgcg ggctgaacaa cctccctaag 660
agcacttacc aagattggat cacctacaac aggctccgcc gggaactcac tctcacagtc 720
ctcgacatcg ctgccttctt cccgaactac gacaaccgcc gctacccgat tcagccagtc 780
ggccagctca cccgtgaggt gtacaccgat ccactgataa ctttcaatcc gcagctccag 840
tctgtcgcac agttgcccac cttcaacgtc atggaaagca acgccatcag gaacccacac 900
ttgttcgaca tccttaacaa cctgactatc ttcaccgact ggttcagcgt cggacggaac 960
ttctactggg gcggacaccg cgtcacctca aactacatcg gcggcggcaa cattacttcg 1020
cccatctacg gccgggaggc gaatcaggag ccgccacgca gctttacatt caacggtcct 1080
gtgtttcgca cgttatcgaa cccgacactc aggctgctcc agcagccctg gcctgcgccg 1140
ccgtttaatt tgcgcggcgt cgaaggcgtc gagttcagta cgccgaccaa cagcttcacc 1200
tatcgcggac gcgggactgt tgactccctg acagagctgc cgccggagga caactcggtt 1260
ctgccgcgtg agggctacag ccataggctt tgtcacgcga cctttgtgca gcgatccggg 1320
acaccgttcc ttacaaccgg cgtggtgttc tcctggacac accgcagtgc aactctgacg 1380
aacacgattg acccagacaa gatcacgcag atcccgttag tgaagggctt ccgggtttgg 1440
tctggtgcct ctgtagtcac tgggcctggc tttacgggtg gcgacatcct ccgtcgcacg 1500
aactttggcg acttcgtgtc catgcaagtg aacattaaca gccctattac gcaacgctac 1560
cggctgaggt tcagatacgc ttcctcgcgg gacgcccgtc ttacggtggc gacgggcgca 1620
gcgaacactg gagttggcgg ccaaatctcc gtggacatgg ctttgcagaa gactatggag 1680
atcggtgagt ctctcacatc tcgcacgttc cgctacacgg atttctccaa ccctttctcc 1740
ttccgcgcca atccggacat cattcggatc aacgaacagc cgctcttcgg cgcgggctcc 1800
atctcatccg gtgagcttta cattgataag attgagataa ttctggccga cgcgaccttt 1860
gaggcagagt atgatctgga gcgcgcacag aaggccgtga acgcgctgtt tacgtccacg 1920
aaccagcgcg ggctcaagac agacgtcaca gactaccaca tcgaccaagt ctccaacctt 1980
gtcgagtgtc tctccgacga gttctgcctg gacgagaagc gggagcttag tgagaaggtg 2040
aagcacgcaa agcgcctgtc tgacgagcgg aaccttctac aagaccgtaa cttcacctcc 2100
attaacgggc agctagaccg tggctggcgc gggtccaccg acatcactat ccaaggtggc 2160
gacgacgtct tcaaggagaa ctacgtgacg ctgctcggca cctttgacga gtgctacccg 2220
acatacctct atcagaagat tgacgagtct aagctcaagg cttacacccg ttacgagctg 2280
cgtggctaca tcgaggactc ccaggatctg gaaatctatc tcatcagata caacgcgaag 2340
cacgagacag tcaacgtacc tgggacaggc tctctctggc ctctgtctgt ggagagtccc 2400
atcggcaaat gtggcgagcc gaacagatgt actccgcacc tggagtggaa tcccaacttg 2460
gactgtagtt gccgcgacgg caagacctgc gcgcaccact cccaccactt ctccctggac 2520
attgacgtcg gctgcacgga tctcaacgag gatctgggcg tttgggtcat cttcaagata 2580
aagacccagg acggacacgc cagactggga aacctagagt tccttgagga gaagccgctg 2640
gtcggcgaag cactggcgcg ggtcaagagg gccgagaaga agtggcggga caaacgggag 2700
aaacttcaac tcgaaacgaa catcgtttac aaggaggcaa aggaggccgt ggacgcactg 2760
ttcgtgaact cgcagtacga ccgcctccaa gtggacacca acatcgccat gatccatgca 2820
gcggacaagc gcgtgcaccg aatcagggaa gcgtacttgc ccgagttgtc cgttatccct 2880
ggcgtgaacg ctgccatctt cgaggaactg gagggctgcg tgttcaccgc attctccctg 2940
tacgacgcac gaaacgtcat caagaatggc gacttcaaca acggcctgag ctgctggaac 3000
gtgaagggcc acgtggagga gcagaacgac caccgctccg tgttagtggt cccggaatgg 3060
gaagccgaag tgagccagga ggtcagggtg tgtcccggtc gcggttacat cctccgcgtg 3120
accgcctaca aggagggcta tggcgagggc tgcgtgacga tacacggtat cgagaacaac 3180
accgatgagc ttaagttctc gaactgcgtg gaggaggagg tgtacccgaa taacacagtg 3240
acgtgcaatg actacccggc caaccaggag gagtacggcg gtgcctacac gagccgaaac 3300
cgtggctatg acgaaactta cggctcgaac agcagcgtgt ctgcggatta tgccagtgtg 3360
tacgaggaga aggcgtacac ggacgggcgg cgcgacaacc cttgcgagtt caatagaggc 3420
tatggcgact acacgccgct gcccgccggt tatgtgacga aggagttgga atacttccca 3480
gagacggaca aggtgtggat cgagattggc gagaccgagg gcacgttcat tgtggacagc 3540
gttgagctgc tactgatgga ggagtga 3567
<210> 4
<211> 1188
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The amino acid sequence of TIC4472PL encoded by a synthetic
coding sequence designed for expression in a plant cell (SEQ ID
NO:3), and wherein an additional alanine amino acid is inserted
immediately following the initiating methionine.
<400> 4
Met Ala Asn Asn Asn Ile Glu Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Glu Val Ile Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly
20 25 30
Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Leu Leu Val Ser
35 40 45
Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val
50 55 60
Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Pro Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Ala Ala
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gly Ile Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu
100 105 110
Ala Phe Gln Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Asn
115 120 125
Arg Val Val Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp
130 135 140
Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val
165 170 175
Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Thr Asn Val Asn Glu Asn
180 185 190
Tyr Asn Arg Gln Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala
195 200 205
Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln
210 215 220
Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro
245 250 255
Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu
260 265 270
Ile Thr Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe
275 280 285
Asn Val Met Glu Ser Asn Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile
290 295 300
Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn
305 310 315 320
Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Thr Ser Asn Tyr Ile Gly Gly Gly
325 330 335
Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro
340 345 350
Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro
355 360 365
Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu
370 375 380
Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr
385 390 395 400
Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu
405 410 415
Asp Asn Ser Val Leu Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His
420 425 430
Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val
435 440 445
Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp
450 455 460
Pro Asp Lys Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp
465 470 475 480
Ser Gly Ala Ser Val Val Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile
485 490 495
Leu Arg Arg Thr Asn Phe Gly Asp Phe Val Ser Met Gln Val Asn Ile
500 505 510
Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser
515 520 525
Ser Arg Asp Ala Arg Leu Thr Val Ala Thr Gly Ala Ala Asn Thr Gly
530 535 540
Val Gly Gly Gln Ile Ser Val Asp Met Ala Leu Gln Lys Thr Met Glu
545 550 555 560
Ile Gly Glu Ser Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser
565 570 575
Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Arg Ile Asn Glu
580 585 590
Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile
595 600 605
Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr
610 615 620
Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr
625 630 635 640
Asn Gln Arg Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln
645 650 655
Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu
660 665 670
Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp
675 680 685
Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Arg Asn Phe Thr Ser Ile Asn Gly Gln
690 695 700
Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly
705 710 715 720
Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp
725 730 735
Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu
740 745 750
Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln
755 760 765
Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val
770 775 780
Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser Pro
785 790 795 800
Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Thr Pro His Leu Glu Trp
805 810 815
Asn Pro Asn Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Lys Thr Cys Ala His
820 825 830
His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu
835 840 845
Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp
850 855 860
Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu
865 870 875 880
Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg
885 890 895
Asp Lys Arg Glu Lys Leu Gln Leu Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu
900 905 910
Ala Lys Glu Ala Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg
915 920 925
Leu Gln Val Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg
930 935 940
Val His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro
945 950 955 960
Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Cys Val Phe Thr
965 970 975
Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe
980 985 990
Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Glu Glu Gln
995 1000 1005
Asn Asp His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu
1010 1015 1020
Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu
1025 1030 1035
Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr
1040 1045 1050
Ile His Gly Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn
1055 1060 1065
Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn
1070 1075 1080
Asp Tyr Pro Ala Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser
1085 1090 1095
Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Ser Val
1100 1105 1110
Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp
1115 1120 1125
Gly Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Gly Asp
1130 1135 1140
Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr
1145 1150 1155
Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu
1160 1165 1170
Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1175 1180 1185
<210> 5
<211> 3564
<212> DNA
<213> Bacillus thuringienses
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3564)
<223> Nucleic acid sequence encoding a TIC1425 pesticidal protein
obtained from Bacillus thuringiensis species EG10731.
<400> 5
atgaataata atattgaaaa ccaatgcgta ccttacaatt gtttaagtaa tcctgaagaa 60
gtaattttgg atggagaacg gatatcaact ggtaattcat caattgatat ttctctgtca 120
cttgttcaac ttctggtatc taactttgta ccaggcggag gatttttagt agggttaata 180
gattttgtat ggggaatagt aggcccttct ccatgggatg catttctagt gcaaattgaa 240
caattaattc agcaaagaat agaagcatat gctagggctg cagcaatttc taatttagaa 300
ggaataggaa acaatttcaa tatatatgtg gaagcatttc aagaatggga agaagatcct 360
aataatccag caaccaggaa tagagtagtt gatcgctttc gtatacttga tgggctactt 420
gaaagggaca ttccttcgtt tcgaatttct ggatttgaag tccccctttt atccgtttat 480
gctcaagcgg ccaatctgca tctagctata ttaagagatt ctgtaatttt tggagaaaga 540
tggggattga caacaacaaa tgtcaatgaa aactataata gacaaatcag gcatattgat 600
gaatatgctg atcactgtgc aaatacgtat aatcggggat taaataattt accgaaatct 660
acgtatcaag attggataac atataatcga ttacggagag aattaacatt gactgtatta 720
gatatcgctg ctttctttcc aaactatgac aataggcggt atccaattca gccagttggt 780
caactaacaa gggaagttta tacggaccca ttaattactt ttaatcccca gttacagtct 840
gtagctcaat tacctacttt taacgttatg gaaagcaacg caattagaaa tcctcatttg 900
tttgatatat tgaataatct tacaattttt acggattggt ttagtgttgg acgcaacttt 960
tattggggag gacatcgagt aacttctaac tatataggag gaggcaacat aacatctcct 1020
atatatggaa gagaggcgaa ccaggagcct ccaagatctt ttacttttaa tggacctgtt 1080
tttaggactt tatcaaatcc tactttacga ttattacagc aaccttggcc agcaccacca 1140
tttaatttac gtggtgttga aggagtagaa ttttctacac ctacaaatag ctttacgtat 1200
cgaggaagag gtacagttga ttctttaacc gaattaccgc ctgaggataa tagtgtgcta 1260
cctcgcgagg gatatagtca tcgtttatgt catgcaactt ttgttcaaag atctggaaca 1320
ccatttttaa caacgggtgt agtattttct tggacgcatc gcagtgcaac tcttacaaat 1380
acaattgatc cagacaaaat tactcagata cctttagtga aaggatttag agtttggagt 1440
ggcgcctctg tcgttacagg accaggtttt acaggagggg atatccttcg aagaactaac 1500
tttggggatt ttgtatctat gcaagttaat attaattcac caataacaca aagataccgt 1560
ttaagatttc gttatgcttc cagtagagat gcacgactta cagtagcgac aggagcagca 1620
aacacaggag ttggagggca aattagtgtg gacatggctc ttcagaaaac tatggaaatt 1680
ggagagagct taacatctag aacatttaga tataccgatt ttagtaatcc tttttcattt 1740
agagctaatc cagatataat tcgtataaat gaacaaccac tattcggtgc aggctctatt 1800
agtagtggtg aactttatat agataaaatt gaaattattc tagcagatgc aacatttgaa 1860
gcagaatatg atttggaaag agcacagaag gcggtgaatg cgctgtttac ttctacaaac 1920
caaagaggat taaaaacaga tgtgacggat tatcatattg atcaagtatc caatttagtt 1980
gagtgtttat cggatgaatt ttgtctggat gaaaaacgag aattgtccga gaaagtcaaa 2040
catgcgaagc gactcagtga tgagcgaaat ttactccagg atcgaaattt cacatccatt 2100
aatgggcaac tagaccgtgg ctggagagga agtacggata ttaccatcca aggaggagat 2160
gacgtattca aagagaatta cgtcacacta ctgggtacct ttgatgagtg ctatccaacg 2220
tatttatatc aaaaaataga tgagtcgaaa ttaaaagcct atacccgcta tgaattaaga 2280
gggtatatcg aggatagtca agacttagaa atctatttaa ttcgctacaa tgcaaaacac 2340
gaaacagtaa atgtgccagg tacaggttcc ttatggccgc tttcagtcga aagtccaatc 2400
ggaaagtgtg gagaaccgaa tcgatgcaca ccacaccttg aatggaatcc taatctagat 2460
tgttcctgca gagacgggaa aacatgtgca catcattctc atcatttctc cttggacatt 2520
gatgttggat gtacagactt aaatgaagat ctaggtgtat gggtgatatt caagattaag 2580
acgcaagatg gtcatgcaag actaggaaat ctagagtttc tcgaagagaa accattagta 2640
ggagaagcgt tagctcgtgt gaaaagagcg gagaaaaaat ggagagacaa acgcgaaaaa 2700
ttgcaattag aaacaaatat cgtttacaaa gaggcaaaag aagctgtgga tgctttattt 2760
gtaaactctc aatatgatag attacaagtg gatacgaaca ttgccatgat tcatgcggca 2820
gataaacgcg ttcatagaat ccgagaagcg tatcttccag agttatctgt gattccgggt 2880
gtcaatgcgg ctattttcga agaattagaa gggtgtattt tcactgcatt ctccctatat 2940
gatgcgagaa atgtcattaa aaatggcgat tttaataatg gcttatcatg ctggaacgtg 3000
aaagggcatg tagaagaaca aaacgaccat cgttcggtcc ttgttgtccc ggaatgggaa 3060
gcagaagtgt cacaagaggt tcgtgtctgt ccaggtcgtg gctatatcct tcgtgttaca 3120
gcatacaaag agggatatgg agaaggctgt gtaaccattc atgggatcga gaacaataca 3180
gacgaactga agtttagcaa ctgcgtagaa gaggaagtct atccaaacaa cacggtaacg 3240
tgtaatgatt atcctgcaaa tcaagaagaa tacgggggtg cgtacacttc tcgtaatcgt 3300
ggatatgacg aaacttatgg aagcaattct tccgtatcag ctgattatgc gtcagtttat 3360
gaagaaaaag cgtatacaga tggacgaaga gacaatccat gtgaatttaa cagagggtat 3420
ggggattata cgccactacc agctggctat gtaacaaaag aattagaata cttcccagaa 3480
accgataagg tatggattga gattggagaa acggaaggaa cattcatcgt ggacagtgtg 3540
gaattactcc ttatggagga ataa 3564
<210> 6
<211> 1187
<212> PRT
<213> Bacillus thuringienses
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1187)
<223> The amino acid sequence of the TIC1425 pesticidal protein.
<400> 6
Met Asn Asn Asn Ile Glu Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Glu Glu Val Ile Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn
20 25 30
Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Asn
35 40 45
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp
50 55 60
Gly Ile Val Gly Pro Ser Pro Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu
65 70 75 80
Gln Leu Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gly Ile Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala
100 105 110
Phe Gln Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Asn Arg
115 120 125
Val Val Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile
130 135 140
Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile
165 170 175
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Thr Asn Val Asn Glu Asn Tyr
180 185 190
Asn Arg Gln Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn
195 200 205
Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp
210 215 220
Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile
245 250 255
Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile
260 265 270
Thr Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe Asn
275 280 285
Val Met Glu Ser Asn Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe
305 310 315 320
Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Thr Ser Asn Tyr Ile Gly Gly Gly Asn
325 330 335
Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg
340 345 350
Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr
355 360 365
Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg
370 375 380
Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp
405 410 415
Asn Ser Val Leu Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala
420 425 430
Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val
435 440 445
Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro
450 455 460
Asp Lys Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Ser
465 470 475 480
Gly Ala Ser Val Val Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu
485 490 495
Arg Arg Thr Asn Phe Gly Asp Phe Val Ser Met Gln Val Asn Ile Asn
500 505 510
Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser
515 520 525
Arg Asp Ala Arg Leu Thr Val Ala Thr Gly Ala Ala Asn Thr Gly Val
530 535 540
Gly Gly Gln Ile Ser Val Asp Met Ala Leu Gln Lys Thr Met Glu Ile
545 550 555 560
Gly Glu Ser Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser Asn
565 570 575
Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Arg Ile Asn Glu Gln
580 585 590
Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp
595 600 605
Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp
610 615 620
Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn
625 630 635 640
Gln Arg Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val
645 650 655
Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys
660 665 670
Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu
675 680 685
Arg Asn Leu Leu Gln Asp Arg Asn Phe Thr Ser Ile Asn Gly Gln Leu
690 695 700
Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp
705 710 715 720
Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu
725 730 735
Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys
740 745 750
Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp
755 760 765
Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn
770 775 780
Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser Pro Ile
785 790 795 800
Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Thr Pro His Leu Glu Trp Asn
805 810 815
Pro Asn Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Lys Thr Cys Ala His His
820 825 830
Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn
835 840 845
Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly
850 855 860
His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val
865 870 875 880
Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp
885 890 895
Lys Arg Glu Lys Leu Gln Leu Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala
900 905 910
Lys Glu Ala Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu
915 920 925
Gln Val Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val
930 935 940
His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly
945 950 955 960
Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Cys Ile Phe Thr Ala
965 970 975
Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn
980 985 990
Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Glu Glu Gln Asn
995 1000 1005
Asp His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val
1010 1015 1020
Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg
1025 1030 1035
Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile
1040 1045 1050
His Gly Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys
1055 1060 1065
Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp
1070 1075 1080
Tyr Pro Ala Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg
1085 1090 1095
Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Ser Val Ser
1100 1105 1110
Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly
1115 1120 1125
Arg Arg Asp Asn Pro Cys Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr
1130 1135 1140
Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe
1145 1150 1155
Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly
1160 1165 1170
Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1175 1180 1185
<210> 7
<211> 3537
<212> DNA
<213> Bacillus thuringienses
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3537)
<223> Nucleic acid sequence encoding a TIC2613 pesticidal protein
obtained from Bacillus thuringiensis species EG5408.
<400> 7
atggataaca atatcaagaa ccaatgcatt ccttacaatt gtttaaatga tcctgaggta 60
gaaatattag gtgaagaggg gataactact agtaatgaaa atctcgaatt tttcttatcg 120
ctaacgaaat ttgtcttgaa taggtttgtc cctggtggag catatgtagc tggcctattt 180
gatgtattct ggggatggtt aaaaccttct gattggtctg caatccttga acaaattgaa 240
gaattaatta accaaaaaat tgagacgttt gctagaaatc aagcaattag tagattggaa 300
gggttaagca acctttatga aatttacgca gatactttta aagaatggga aaaagatccg 360
actaatccag cattaagaga agaaatgcgt acacaattta atgacatgaa cagctctttt 420
gtaacagcta tgcctctttt ttcagttcaa aattttgaag ttcctctttt agcagtatac 480
gctcaagctg caaatttaca tctatcagtt ttaagggatg tctcagtttt tggtcaaaat 540
tggggatttg attcagccac tgtcaatagt cgttataatg atttagtaag aaatattcgt 600
acctatacaa attatgtcgt acgttggtat aacacaggat tagcaaggtt acgaggtact 660
acgtaccaag attggttaaa ttatcatcgc tttagaagag aattaacaat aactgcattg 720
gatatcatta ccatattccc acactacgat aataaaatgt atccaattca accccatttt 780
caattaacaa gagagattta tacggatcca ctaattaatt tcaatccggc gttacagtct 840
gtagcacaat tacctctatt taatgagatg gaaaatagta caattagaag ccctcattta 900
gttgattttt taaataggct tacaatttat acagattggt atagtctcgg aagacactat 960
tattggggag gacatcaaat agtctctaga caaacaggat caacttccac tattacattc 1020
cctatatatg gaagagaggc gaatcaagag gcccctagaa catataattt tagtcaacct 1080
gtctttagaa cactgtcaaa tcctacttta acacgtttaa tgcaaccttg gccagcccca 1140
gcatttcagt tgcgtcgtct tgagggagtt gaatttcaaa caactacagg taattttacg 1200
tatcgaggaa gaggtacggt agattccttt gatgaattac caccagatga tacaagcgta 1260
ccagcgcgtg aaggatatag tcatcgttta tgtcatgcaa catttatcag aaaatctggg 1320
acgccgtatt taacaacggg tgtaacacta tcttggacac acaatagcaa tacacctacg 1380
aatataattt atcctgataa aatcactcaa gtaccattgg tgaaagcatc taaccttcat 1440
tctagtgctt tcgttttaaa aggaccagga tttacaggag gggacatact tggaagaact 1500
agtgtgggca acatagcaga tatccaaatg aatattactg caccgttatc acaaagatat 1560
cgcgtacgaa ttcggtatgc ctctactaca aacttacaat ttcatacgac aattaacggc 1620
agggccgtaa atcaggctaa tttcccagca actatgaata gagtagaaga cttagaatat 1680
aattccttta gaacgataag tttcggtact ccttttaact ttttagatgc tcaaagtacc 1740
ttcaggttag gtgtatggag cttttcttca ggtaccgttt taatagatag aattgaagtt 1800
gtaccaatgg aagtaacatt tgaagcagaa tctgatttag aaagagcaca aaaggcggtg 1860
aacgctctgt ttacttctat aaatcaaaaa ggactaaaaa cagatgtaac agattatcac 1920
attgatcaag tatccaattt ggtcgaatgt ctatccgatg aattttgtct agatgaaaag 1980
agagaactat ttgagaaagt caaatatgcg aaacgactca gtgacgaacg gaatttactt 2040
gcagatccaa atttcacatc tattaatggg caactagatc gtggatggag aggaagtacg 2100
gatattacca ttcaaggggg cgatgacgta ttcaaagaaa actacgtcac actatcaggt 2160
acccttgatg agtgttatcc aacctattta tatcaaaaaa tagacgaatc gaaattaaaa 2220
gcgtataccc gttacgagtt acgaggatat atcgaagata gtcaagattt agaagtatac 2280
ttgattcgtt acaataccaa acatgaaaca ttgaatgtac caggtacagg gggcctatgg 2340
ccgcttgcag tagaaagttc aatcggaggg tgtggcgaac caaaccgatg cgcaccacaa 2400
atggaatggg atccaaatct agaatgttct tgtagcgacg aggagaaatg tgcgcatcat 2460
tcccatcatt tctctctcga tattgatgtt ggatgtactg atttaaatga aaatctaggt 2520
atatgggtta tatttaaaat taaaacgcag aacggttatg caaaattagg aaatttagag 2580
tttctcgaag agaaaccatt aataggggaa gcgttagctc gtgttaagcg agtggagaaa 2640
aaatggaaag acaaacgtga aaaattagaa tttgaaacga atatagtcta caacgaggca 2700
aaagaagctg tggatgcact attcgtaaat tcacaatatg atagattgca agctgataca 2760
aatatcgcaa tgattcatgc ggcggataac aaagttcata aaattcgcga ggcgtacctc 2820
ccagagttat ctgtgatacc aggtgtaaat gcgaccgttt ttgaagaatt agaagagcgt 2880
atttttacag cattctccct ttacgatgca agaaatgtga taaaaaatgg ggatttcaat 2940
aatggattat cttgttggaa tgtgaagggc caagtagatg tagaccaaaa tgaccatcgt 3000
tctgtccttg ttattccagg atgggaatcg gaagtatcac aagaagttca tgtatgtcca 3060
gatcgtggat acattcttcg tgttacggcg tacaaagaag gatatggaga aggctgcgta 3120
acaatccatg agattgataa tcatacagac gaactgaaat ttaaaaactg ctttgaagag 3180
gaagtatctc taaataatgc ggtgacatgt gatgagtata ctacaaatca agaagtagga 3240
gggtatgcgg atgtacgtca atccaataat cgtggatcta atgaggccta tgtaaatcct 3300
acttccacat caactgatta tgcatcgctc tacgaggaag agtcgtatac gaatgaacag 3360
acatataatt cttgtgaatc taacagaggg tatggtaatc aaatgccatt accgtctggc 3420
tatgtgacaa aagaattaga atattttcca gagacagata aagtatggat tgagattgga 3480
gaaacagaag gaacattcat cgtagacagt gtggaattac tccttatgga ggaataa 3537
<210> 8
<211> 1178
<212> PRT
<213> Bacillus thuringienses
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1178)
<223> The amino acid sequence of the TIC2613 pesticidal protein.
<400> 8
Met Asp Asn Asn Ile Lys Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Asn
1 5 10 15
Asp Pro Glu Val Glu Ile Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr Thr Ser Asn
20 25 30
Glu Asn Leu Glu Phe Phe Leu Ser Leu Thr Lys Phe Val Leu Asn Arg
35 40 45
Phe Val Pro Gly Gly Ala Tyr Val Ala Gly Leu Phe Asp Val Phe Trp
50 55 60
Gly Trp Leu Lys Pro Ser Asp Trp Ser Ala Ile Leu Glu Gln Ile Glu
65 70 75 80
Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Glu Thr Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Ile Tyr Ala Asp Thr
100 105 110
Phe Lys Glu Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu
115 120 125
Met Arg Thr Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ser Phe Val Thr Ala Met
130 135 140
Pro Leu Phe Ser Val Gln Asn Phe Glu Val Pro Leu Leu Ala Val Tyr
145 150 155 160
Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val
165 170 175
Phe Gly Gln Asn Trp Gly Phe Asp Ser Ala Thr Val Asn Ser Arg Tyr
180 185 190
Asn Asp Leu Val Arg Asn Ile Arg Thr Tyr Thr Asn Tyr Val Val Arg
195 200 205
Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Ala Arg Leu Arg Gly Thr Thr Tyr Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Tyr His Arg Phe Arg Arg Glu Leu Thr Ile Thr Ala Leu
225 230 235 240
Asp Ile Ile Thr Ile Phe Pro His Tyr Asp Asn Lys Met Tyr Pro Ile
245 250 255
Gln Pro His Phe Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Ile
260 265 270
Asn Phe Asn Pro Ala Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Leu Phe Asn
275 280 285
Glu Met Glu Asn Ser Thr Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu
290 295 300
Asn Arg Leu Thr Ile Tyr Thr Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg His Tyr
305 310 315 320
Tyr Trp Gly Gly His Gln Ile Val Ser Arg Gln Thr Gly Ser Thr Ser
325 330 335
Thr Ile Thr Phe Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Ala Pro
340 345 350
Arg Thr Tyr Asn Phe Ser Gln Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro
355 360 365
Thr Leu Thr Arg Leu Met Gln Pro Trp Pro Ala Pro Ala Phe Gln Leu
370 375 380
Arg Arg Leu Glu Gly Val Glu Phe Gln Thr Thr Thr Gly Asn Phe Thr
385 390 395 400
Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Phe Asp Glu Leu Pro Pro Asp
405 410 415
Asp Thr Ser Val Pro Ala Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His
420 425 430
Ala Thr Phe Ile Arg Lys Ser Gly Thr Pro Tyr Leu Thr Thr Gly Val
435 440 445
Thr Leu Ser Trp Thr His Asn Ser Asn Thr Pro Thr Asn Ile Ile Tyr
450 455 460
Pro Asp Lys Ile Thr Gln Val Pro Leu Val Lys Ala Ser Asn Leu His
465 470 475 480
Ser Ser Ala Phe Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile
485 490 495
Leu Gly Arg Thr Ser Val Gly Asn Ile Ala Asp Ile Gln Met Asn Ile
500 505 510
Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser
515 520 525
Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Thr Ile Asn Gly Arg Ala Val Asn
530 535 540
Gln Ala Asn Phe Pro Ala Thr Met Asn Arg Val Glu Asp Leu Glu Tyr
545 550 555 560
Asn Ser Phe Arg Thr Ile Ser Phe Gly Thr Pro Phe Asn Phe Leu Asp
565 570 575
Ala Gln Ser Thr Phe Arg Leu Gly Val Trp Ser Phe Ser Ser Gly Thr
580 585 590
Val Leu Ile Asp Arg Ile Glu Val Val Pro Met Glu Val Thr Phe Glu
595 600 605
Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe
610 615 620
Thr Ser Ile Asn Gln Lys Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His
625 630 635 640
Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys
645 650 655
Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe Glu Lys Val Lys Tyr Ala Lys Arg
660 665 670
Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Ala Asp Pro Asn Phe Thr Ser Ile
675 680 685
Asn Gly Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile
690 695 700
Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Ser Gly
705 710 715 720
Thr Leu Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu
725 730 735
Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu
740 745 750
Asp Ser Gln Asp Leu Glu Val Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Thr Lys His
755 760 765
Glu Thr Leu Asn Val Pro Gly Thr Gly Gly Leu Trp Pro Leu Ala Val
770 775 780
Glu Ser Ser Ile Gly Gly Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro Gln
785 790 795 800
Met Glu Trp Asp Pro Asn Leu Glu Cys Ser Cys Ser Asp Glu Glu Lys
805 810 815
Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys
820 825 830
Thr Asp Leu Asn Glu Asn Leu Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys
835 840 845
Thr Gln Asn Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu
850 855 860
Lys Pro Leu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Val Glu Lys
865 870 875 880
Lys Trp Lys Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Phe Glu Thr Asn Ile Val
885 890 895
Tyr Asn Glu Ala Lys Glu Ala Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln
900 905 910
Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala
915 920 925
Asp Asn Lys Val His Lys Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser
930 935 940
Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Thr Val Phe Glu Glu Leu Glu Glu Arg
945 950 955 960
Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn
965 970 975
Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly Gln Val
980 985 990
Asp Val Asp Gln Asn Asp His Arg Ser Val Leu Val Ile Pro Gly Trp
995 1000 1005
Glu Ser Glu Val Ser Gln Glu Val His Val Cys Pro Asp Arg Gly
1010 1015 1020
Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly
1025 1030 1035
Cys Val Thr Ile His Glu Ile Asp Asn His Thr Asp Glu Leu Lys
1040 1045 1050
Phe Lys Asn Cys Phe Glu Glu Glu Val Ser Leu Asn Asn Ala Val
1055 1060 1065
Thr Cys Asp Glu Tyr Thr Thr Asn Gln Glu Val Gly Gly Tyr Ala
1070 1075 1080
Asp Val Arg Gln Ser Asn Asn Arg Gly Ser Asn Glu Ala Tyr Val
1085 1090 1095
Asn Pro Thr Ser Thr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Leu Tyr Glu Glu
1100 1105 1110
Glu Ser Tyr Thr Asn Glu Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Glu Ser Asn
1115 1120 1125
Arg Gly Tyr Gly Asn Gln Met Pro Leu Pro Ser Gly Tyr Val Thr
1130 1135 1140
Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu
1145 1150 1155
Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu
1160 1165 1170
Leu Leu Met Glu Glu
1175
<210> 9
<211> 3540
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A synthetic coding sequence encoding a TIC2613PL pesticidal
protein designed for expression in a plant cell wherein an
additional alanine codon is inserted immediately following the
initiating methionine codon.
<400> 9
atggctgaca acaacatcaa gaaccagtgc atcccgtaca actgcctcaa cgacccggag 60
gtcgagatcc tcggcgagga gggcataacg acgagcaacg agaaccttga gttcttcctc 120
agcctcacga agttcgtcct gaaccgcttc gtgccgggcg gagcctacgt ggctggcctg 180
ttcgatgtgt tctggggatg gctcaagcca agcgactggt ccgcgattct ggagcagatc 240
gaggaactca tcaaccagaa gatcgagaca ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300
gagggcctct cgaacctcta cgaaatctac gccgatacgt tcaaggagtg ggagaaggat 360
ccgacgaacc cggccttgcg cgaggagatg aggacgcaat tcaacgacat gaactccagc 420
ttcgtcaccg ccatgccgct gttctccgtc cagaacttcg aggtgccctt gctcgccgtg 480
tacgcgcaag ctgcgaactt acatcttagc gtcctccgcg acgtcagcgt cttcggccag 540
aactggggat tcgattccgc gacggtgaac tcacggtaca atgatctcgt gcggaacatc 600
cggacctaca ccaattacgt cgtgcgctgg tacaacacgg gattggcgcg tctgcgcggc 660
actacctacc aggactggct caactaccac cggttccgcc gcgaactcac aatcacagcg 720
ctggacatca ttaccatctt cccgcactac gacaacaaga tgtacccaat ccagcctcac 780
ttccagctta cccgtgagat ctacacggac ccgctcatca acttcaatcc cgcactgcaa 840
tcagtagccc aattgccact cttcaacgag atggagaact cgacaatccg aagccctcac 900
ctcgtggact tcctcaaccg cctgaccatc tacacggatt ggtactctct tggtcggcac 960
tactattggg gcgggcacca aatcgtgtcc aggcagaccg gctctacctc taccataacc 1020
ttcccgatct atggccggga ggccaaccag gaggctccga ggacttacaa cttcagtcag 1080
ccagtgttcc gcacactctc caacccgact ctcactcgtt tgatgcagcc ctggcccgct 1140
cccgcgtttc agctcagaag attggagggc gtggagttcc aaacaacgac gggcaacttc 1200
acctaccgtg gccgtgggac ggtggacagt ttcgacgagt tgcctccgga cgacaccagc 1260
gtgcctgcaa gggaaggcta ctcgcacagg ctgtgccacg cgacgttcat ccgcaagtct 1320
gggacaccct acctgacaac cggcgtcact ctctcctgga cccacaacag caacacaccc 1380
accaacataa tctaccctga caagataaca caagtgccgc tggtgaaggc ttcgaacctc 1440
cattcctccg ccttcgtcct caagggtccg ggcttcaccg gcggcgacat cctgggtcgc 1500
acgtcggtcg gcaacatcgc ggacattcag atgaacatta ccgcacctct gtcccagcgc 1560
tacagagtgc gtatccgcta cgcgagtacg accaacctcc aattccacac tacgatcaat 1620
gggagggcgg ttaatcaggc caacttcccg gccacgatga accgggtcga agacctggag 1680
tacaactcgt ttcggaccat ctctttcggc acgccgttca acttcctaga cgcccagtca 1740
acctttcggc tgggagtttg gagcttcagc agcggcacag tcctcatcga ccgaatagag 1800
gtggttccga tggaggtcac gttcgaggcg gagtcggacc tggagcgagc gcagaaggct 1860
gtaaatgcgt tgttcacgag cattaaccag aagggcctca agaccgatgt cacagactac 1920
cacatcgacc aagtgtcgaa cctggtggag tgtctgtcgg atgagttctg tcttgacgag 1980
aagcgggagc tgttcgagaa ggtgaagtat gctaagcggc tgagcgacga gcggaacttg 2040
ttggctgacc cgaacttcac cagcatcaac ggacagctcg accgtgggtg gcgaggttcc 2100
accgacatca cgatacaggg cggagacgat gtgttcaagg agaactatgt gaccctctca 2160
ggaacactgg atgagtgcta cccgacctat ctctaccaga agatcgacga gagcaagctc 2220
aaggcttaca cgcgctacga actccgtggc tacatcgaag actcccagga tcttgaggtg 2280
tacctcatac gctacaacac aaagcacgag acgctcaacg ttcctggcac cggtggtctt 2340
tggcccttgg ccgtggagag tagcatcggc gggtgcggtg agccaaaccg atgcgcgcca 2400
cagatggaat gggatccgaa cctagagtgc tcctgctcag acgaggagaa gtgcgcccac 2460
cactcccacc acttctcgct cgacattgac gttggctgca cggatctcaa cgagaaccta 2520
ggaatctggg tgatcttcaa gattaagacc cagaacggct acgccaagct cgggaatctg 2580
gagtttcttg aggagaagcc gctgatcggc gaggccctcg cgcgcgtgaa gcgagtcgag 2640
aagaagtgga aagacaagcg ggagaagcta gagtttgaaa cgaacattgt ttacaacgag 2700
gcaaaggaag ccgtggacgc tctgttcgta aacagtcagt acgaccgtct ccaggccgac 2760
acgaacatcg caatgataca cgcggcggat aacaaggtgc acaagattcg ggaggcttac 2820
ctgcccgagc tgtcggtcat cccaggcgta aacgctaccg tgttcgagga gctggaggaa 2880
cggatcttca ccgcgttctc cctctatgac gcaaggaacg tcatcaagaa cggcgacttc 2940
aacaacggcc tgagctgctg gaacgtgaag ggccaagtgg acgtcgatca gaacgatcac 3000
cgctccgttc tggtcattcc agggtgggag tccgaggtga gccaagaggt ccatgtgtgc 3060
ccggaccgtg gctacatcct tcgggtgacc gcgtacaagg agggctacgg cgaaggctgc 3120
gtgaccatac acgagatcga caaccacacc gacgagctta agttcaagaa ctgcttcgag 3180
gaggaggtgt cactgaacaa cgccgtgacc tgcgacgagt acacgaccaa tcaggaggtc 3240
ggcggctacg ccgacgtccg ccagtcgaac aatcgaggca gcaacgaggc gtacgtgaac 3300
ccaacctcca cctcgacgga ctacgccagc ctctacgagg aggagtccta cacaaacgag 3360
cagacctaca actcgtgcga gagcaaccga ggttacggga accagatgcc gctaccgtcc 3420
gggtacgtga cgaaggagct ggagtatttc ccagagaccg acaaggtgtg gatcgagatc 3480
ggcgagacag agggcacgtt catcgtggac agcgtcgagc tgctgttgat ggaggagtga 3540
<210> 10
<211> 1179
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The amino acid sequence of TIC2613PL encoded by a synthetic
coding sequence designed for expression in a plant cell (SEQ ID
NO:9), and wherein an additional alanine amino acid is inserted
immediately following the initiating methionine.
<400> 10
Met Ala Asp Asn Asn Ile Lys Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Asn Asp Pro Glu Val Glu Ile Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Glu Asn Leu Glu Phe Phe Leu Ser Leu Thr Lys Phe Val Leu Asn
35 40 45
Arg Phe Val Pro Gly Gly Ala Tyr Val Ala Gly Leu Phe Asp Val Phe
50 55 60
Trp Gly Trp Leu Lys Pro Ser Asp Trp Ser Ala Ile Leu Glu Gln Ile
65 70 75 80
Glu Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Glu Thr Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Ile Tyr Ala Asp
100 105 110
Thr Phe Lys Glu Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Thr Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ser Phe Val Thr Ala
130 135 140
Met Pro Leu Phe Ser Val Gln Asn Phe Glu Val Pro Leu Leu Ala Val
145 150 155 160
Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
Val Phe Gly Gln Asn Trp Gly Phe Asp Ser Ala Thr Val Asn Ser Arg
180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Val Arg Asn Ile Arg Thr Tyr Thr Asn Tyr Val Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Ala Arg Leu Arg Gly Thr Thr Tyr Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Tyr His Arg Phe Arg Arg Glu Leu Thr Ile Thr Ala
225 230 235 240
Leu Asp Ile Ile Thr Ile Phe Pro His Tyr Asp Asn Lys Met Tyr Pro
245 250 255
Ile Gln Pro His Phe Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Leu
260 265 270
Ile Asn Phe Asn Pro Ala Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Leu Phe
275 280 285
Asn Glu Met Glu Asn Ser Thr Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe
290 295 300
Leu Asn Arg Leu Thr Ile Tyr Thr Asp Trp Tyr Ser Leu Gly Arg His
305 310 315 320
Tyr Tyr Trp Gly Gly His Gln Ile Val Ser Arg Gln Thr Gly Ser Thr
325 330 335
Ser Thr Ile Thr Phe Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Ala
340 345 350
Pro Arg Thr Tyr Asn Phe Ser Gln Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn
355 360 365
Pro Thr Leu Thr Arg Leu Met Gln Pro Trp Pro Ala Pro Ala Phe Gln
370 375 380
Leu Arg Arg Leu Glu Gly Val Glu Phe Gln Thr Thr Thr Gly Asn Phe
385 390 395 400
Thr Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Phe Asp Glu Leu Pro Pro
405 410 415
Asp Asp Thr Ser Val Pro Ala Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys
420 425 430
His Ala Thr Phe Ile Arg Lys Ser Gly Thr Pro Tyr Leu Thr Thr Gly
435 440 445
Val Thr Leu Ser Trp Thr His Asn Ser Asn Thr Pro Thr Asn Ile Ile
450 455 460
Tyr Pro Asp Lys Ile Thr Gln Val Pro Leu Val Lys Ala Ser Asn Leu
465 470 475 480
His Ser Ser Ala Phe Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp
485 490 495
Ile Leu Gly Arg Thr Ser Val Gly Asn Ile Ala Asp Ile Gln Met Asn
500 505 510
Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala
515 520 525
Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Thr Ile Asn Gly Arg Ala Val
530 535 540
Asn Gln Ala Asn Phe Pro Ala Thr Met Asn Arg Val Glu Asp Leu Glu
545 550 555 560
Tyr Asn Ser Phe Arg Thr Ile Ser Phe Gly Thr Pro Phe Asn Phe Leu
565 570 575
Asp Ala Gln Ser Thr Phe Arg Leu Gly Val Trp Ser Phe Ser Ser Gly
580 585 590
Thr Val Leu Ile Asp Arg Ile Glu Val Val Pro Met Glu Val Thr Phe
595 600 605
Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu
610 615 620
Phe Thr Ser Ile Asn Gln Lys Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr
625 630 635 640
His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe
645 650 655
Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe Glu Lys Val Lys Tyr Ala Lys
660 665 670
Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Ala Asp Pro Asn Phe Thr Ser
675 680 685
Ile Asn Gly Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr
690 695 700
Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Ser
705 710 715 720
Gly Thr Leu Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp
725 730 735
Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile
740 745 750
Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Val Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Thr Lys
755 760 765
His Glu Thr Leu Asn Val Pro Gly Thr Gly Gly Leu Trp Pro Leu Ala
770 775 780
Val Glu Ser Ser Ile Gly Gly Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro
785 790 795 800
Gln Met Glu Trp Asp Pro Asn Leu Glu Cys Ser Cys Ser Asp Glu Glu
805 810 815
Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly
820 825 830
Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asn Leu Gly Ile Trp Val Ile Phe Lys Ile
835 840 845
Lys Thr Gln Asn Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu
850 855 860
Glu Lys Pro Leu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Val Glu
865 870 875 880
Lys Lys Trp Lys Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Phe Glu Thr Asn Ile
885 890 895
Val Tyr Asn Glu Ala Lys Glu Ala Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser
900 905 910
Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala
915 920 925
Ala Asp Asn Lys Val His Lys Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu
930 935 940
Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Thr Val Phe Glu Glu Leu Glu Glu
945 950 955 960
Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys
965 970 975
Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly Gln
980 985 990
Val Asp Val Asp Gln Asn Asp His Arg Ser Val Leu Val Ile Pro Gly
995 1000 1005
Trp Glu Ser Glu Val Ser Gln Glu Val His Val Cys Pro Asp Arg
1010 1015 1020
Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu
1025 1030 1035
Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Asp Asn His Thr Asp Glu Leu
1040 1045 1050
Lys Phe Lys Asn Cys Phe Glu Glu Glu Val Ser Leu Asn Asn Ala
1055 1060 1065
Val Thr Cys Asp Glu Tyr Thr Thr Asn Gln Glu Val Gly Gly Tyr
1070 1075 1080
Ala Asp Val Arg Gln Ser Asn Asn Arg Gly Ser Asn Glu Ala Tyr
1085 1090 1095
Val Asn Pro Thr Ser Thr Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Leu Tyr Glu
1100 1105 1110
Glu Glu Ser Tyr Thr Asn Glu Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Glu Ser
1115 1120 1125
Asn Arg Gly Tyr Gly Asn Gln Met Pro Leu Pro Ser Gly Tyr Val
1130 1135 1140
Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile
1145 1150 1155
Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu
1160 1165 1170
Leu Leu Leu Met Glu Glu
1175
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2740312C2 |
| НОВЫЕ ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2013 |
|
RU2666914C2 |
| НОВЫЕ БЕЛКИ, ОБЛАДАЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ НАСЕКОМЫХ | 2015 |
|
RU2740313C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2747978C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ | 2019 |
|
RU2810220C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ | 2018 |
|
RU2761666C2 |
| СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ПЕСТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2017 |
|
RU2817591C2 |
| СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ПЕСТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2017 |
|
RU2816526C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2015 |
|
RU2745322C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ С ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АКТИВНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2750459C2 |
Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты для придания устойчивости к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera. Также раскрыты трансгенное растение, часть растения и семя, содержащие указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты; композиция, кормовой, пищевой, косметический и промышленный продукт, содержащие указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты. Раскрыты способ борьбы с вредителем или поражением вредителем, где вредитель представляет собой насекомого-вредителя из отряда Lepidoptera, с помощью указанной нуклеиновой кислоты; способ обнаружения присутствия указанной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение позволяет эффективно бороться с насекомыми-вредителями из отряда Lepidoptera. 13 н. и 16 з.п. ф-лы, 11 табл., 6 пр.
1. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты для придания устойчивости к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera, содержащая гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его пестицидный фрагмент, причем:
a. указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10; или
b. указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую:
i. по меньшей мере 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:6 и проявляет пестицидную активность; или
ii. по меньшей мере 95% или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10 и проявляет пестицидную активность; или
c. указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется в строгих условиях гибридизации с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9.
2. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что
a. указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая функционирует для экспрессии пестицидного белка в растении; или
b. указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется в растительной клетке для продуцирования пестицидно эффективного количества пестицидного белка; или
c. указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с вектором, и указанный вектор выбирают из группы, состоящей из: плазмиды, фагмиды, бакмиды, космиды, и бактериальной или дрожжевой искусственной хромосомы.
3. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, определенная как присутствующая в клетке-хозяине, причем указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной и растительной клеток.
4. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что бактериальная клетка-хозяин принадлежит к роду бактерий, выбранных из группы, состоящей из: Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea и Erwinia.
5. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что вид Bacillus представляет собой Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанный Brevibacillus представляет собой Brevibacillus laterosperous и указанный Escherichia представляет собой Escherichia coli.
6. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п. 3, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка представляет собой клетку двудольного или однодольного растения.
7. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п. 6, отличающаяся тем, что указанную растительную клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из растительной клетки люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, капусты декоративной, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопка, тыквенных, огурца, псевдотсуги Мензиса, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливкового дерева, репчатого лука, декоративных растений, пальмовых, пастбищных трав, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосновых, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редьки, рапса, риса, корневищ, ржи, дикого шафрана, кустарниковых, сорго, сосны южной, сои, шпината, тыквенных, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, кукурузы сахарной, амбрового дерева, батата, проса прутьевидного, чая, табака, помидора, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
8. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что указанный белок проявляет активность против насекомого-вредителя из отряда Lepidoptera.
9. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, отличающаяся тем, что указанное насекомое выбирают из группы, состоящей из: совки помидорной (Spodoptera exigua), совки хлопковой (Helicoverpa zea), совки хлопковой американской (Alabama argillacea), огневки кукурузной (Ostrinia nubilalis), кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda), совки хлопковой (Helicoverpa armigera), Spodoptera litura, Pectinophora gossypiella, Cry1Ac устойчивого Pectinophora gossypiella, Chrysodeixis includens, Spodoptera eridania, Diatraea grandiosella, Earias vittella, Diatraea saccharalis, Heliothis virescens и Anticarsia gemmatalis.
10. Трансгенное растение, обладающее устойчивостью к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera, содержащее рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1.
11. Трансгенное растение по п. 10, отличающееся тем, что указанное растение представляет собой однодольное растение или двудольное растение.
12. Трансгенное растение по п. 10, отличающееся тем, что указанное растение выбирают из группы, состоящей из: люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, капусты декоративной, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопка, тыквенных, огурца, псевдотсуги Мензиса, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливкового дерева, репчатого лука, декоративных растений, пальмовых, пастбищных трав, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосновых, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редьки, рапса, риса, корневищ, ржи, дикого шафрана, кустарниковых, сорго, сосны южной, сои, шпината, тыквенных, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, кукурузы сахарной, амбрового дерева, батата, проса прутьевидного, чая, табака, помидора, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
13. Семя трансгенного растения по п. 10, отличающееся тем, что указанное семя предназначено для получения растения, обладающего устойчивостью к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera, и где указанное семя содержит указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты.
14. Композиция, проявляющая ингибирующее действие в отношении насекомых, для придания устойчивости к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera, содержащая приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель и рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1.
15. Композиция, проявляющая ингибирующее действие в отношении насекомых, по п. 14, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один другой пестицидный агент, который отличается от указанного пестицидного белка.
16. Композиция, проявляющая ингибирующее действие в отношении насекомых, по п. 15, отличающаяся тем, что указанный, по меньшей мере, один другой пестицидный агент выбирают из группы, состоящей из белка, проявляющего ингибирующее действие в отношении насекомых, дцРНК молекулы, проявляющей ингибирующее действие в отношении насекомых, и вспомогательного белка.
17. Композиция, проявляющая ингибирующее действие в отношении насекомых, по п. 16, отличающаяся тем, что указанный, по меньшей мере, один другой пестицидный агент проявляет активность против одного или большего количества видов вредителей из отрядов Lepidoptera, Coleoptera или Hemiptera.
18. Композиция, проявляющая ингибирующее действие в отношении насекомых, по п. 17, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один другой пестицидный белок выбирают из группы, состоящей из белков: Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, вариантов Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, химер Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, вариантов Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, и AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z и AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 и их вариантов, IP3 и его вариантов, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 и DIG-11.
19. Композиция, проявляющая ингибирующее действие в отношении насекомых-вредителей, для придания устойчивости к насекомому из отряда Lepidoptera по п. 14, где приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель представляет собой растительную клетку, которая экспрессирует указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты.
20. Кормовой продукт для коммерческого использования, полученный из трансгенного растения по п. 10, отличающийся тем, что указанный кормовой продукт содержит обработанный растительный продукт и определяемое количество указанной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты или указанного кодируемого пестицидного белка.
21. Пищевой продукт для коммерческого использования, полученный из трансгенного растения по п. 10, отличающийся тем, что указанный пищевой продукт содержит обработанный растительный продукт и определяемое количество указанной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты или указанного кодируемого пестицидного белка.
22. Косметический продукт для коммерческого использования, полученный из трансгенного растения по п. 10, отличающийся тем, что указанный косметический продукт содержит обработанный растительный продукт и определяемое количество указанной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты или указанного кодируемого пестицидного белка.
23. Промышленный продукт для коммерческого использования, полученный из трансгенного растения по п. 10, отличающийся тем, что указанный промышленный продукт содержит обработанный растительный продукт и определяемое количество указанной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты или указанного кодируемого пестицидного белка.
24. Трансгенное растение, устойчивое к поражению насекомыми-вредителями Lepidoptera, причем клетки указанного растения содержат рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1.
25. Способ борьбы с вредителем или поражением вредителем, где вредитель представляет собой насекомого-вредителя из отряда Lepidoptera, где способ включает:
a. приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством пестицидного белка, представленного в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10; или
b. приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или большего количества пестицидных белков, содержащих аминокислотную последовательность, имеющую:
i. по меньшей мере 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:6 и проявляет пестицидную активность; или
ii. по меньшей мере 95% или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10 и проявляет пестицидную активность.
26. Способ обнаружения присутствия рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты для придания устойчивости к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera по п. 1 в образце, содержащем геномную ДНК растения, включающий в себя:
a. приведение в контакт образца с нуклеотидным зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с геномной ДНК из растения, содержащего молекулу ДНК по п. 1, и не гибридизируется в таких условиях гибридизации с геномной ДНК из другого изогенного растения, которое не содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1, при этом указанный зонд гомологичен или комплементарен SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:9 или последовательности, которая кодирует пестицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую:
i. по меньшей мере 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:6 и проявляет пестицидную активность; или
ii. по меньшей мере 95% или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10 и проявляет пестицидную активность;
b. подвержение образца и зонда строгим условиям гибридизации; и
c. обнаружение гибридизации зонда с ДНК образца.
27. Способ обнаружения присутствия пестицидного белка или его фрагмента для придания устойчивости к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera в образце, содержащем указанный пестицидный белок, причем указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10 или указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую:
a. по меньшей мере 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:6 и проявляет пестицидную активность; или
b. по меньшей мере 95% или около 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10 и проявляет пестицидную активность;
включающий:
c. приведение в контакт образца с иммунореактивным антителом; и
d. обнаружение присутствия белка.
28. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанный этап обнаружения включает в себя ИФА или вестерн-блоттинг.
29. Часть трансгенного растения, обладающая устойчивостью к насекомому-вредителю из отряда Lepidoptera, содержащая молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1.
| ПЕСТИЦИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОИЗВОДНОЕ ТЕТРАЗОЛИЛОКСИМА И АКТИВНОЕ ФУНГИЦИДНОЕ ИЛИ ИНСЕКТИЦИДНОЕ ВЕЩЕСТВО (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ БОРЬБЫ С ФИТОПАТАГЕННЫМИ ГРИБАМИ ИЛИ ВРЕДОНОСНЫМИ НАСЕКОМЫМИ | 2009 |
|
RU2527024C2 |
| Лапка к швейным машинам с приспособлением для вдевания нити в ушко иглы | 1929 |
|
SU19029A1 |
| РЕКОМБИНАНТНАЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯ УНИКАЛЬНЫЙ ТРАНСФОРМАЦИОННЫЙ АКТ МЕЖДУ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ГЕН cryIIIa, И ГЕНОМНОЙ ДНК КАРТОФЕЛЯ СОРТА НЕВСКИЙ, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И СОДЕРЖАЩИЕ ЭТУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТКА, ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ И ЕГО ПОТОМСТВО | 2005 |
|
RU2286386C1 |
| РЕГУЛИРУЕМЫЙ ПО ВЫСОТЕ СТУЛ | 1995 |
|
RU2087119C1 |
