Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов Российский патент 2022 года по МПК C08B37/08 C12P19/04 B01D61/02 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано при очистке соли гиалуроната натрия от эндотоксинов для медицинских целей.

Эндотоксины - бактериальные токсические вещества, которые представляют собой структурные компоненты определенных бактерий и высвобождаются только при лизисе (распаде) бактериальной клетки. Это отличает эндотоксины от экзотоксинов, растворимых соединений, секретируемых живой бактериальной клеткой.

Бактериальные эндотоксины состоят из полисахаридного и липидного фрагментов. Полисахаридный фрагмент содержит О-специфическую цепь (O-антиген), включающую повторяющуюся последовательность олигосахаридных единиц на основе гликозильных остатков (до 50), а также ядро. Липид А и внутреннее ядро полисахаридной составляющей эндотоксинов частично фосфорилированы. Это приводит к тому, что в растворах с нейтральным или основным рН эндотоксины будут иметь выраженный отрицательный заряд (рКа 1,3).

Молекулярная масса мономеров различных липополисахаридов может варьировать в достаточно широких диапазонах, что объясняется вариабельностью О-специфической цепи. Известны эндотоксины с молекулярными массами от 2,5 кДа (с укороченной О-специфической цепью) до 70 кДа (с очень длинной О-специфической цепью). Большая же часть липополисахаридов имеет молекулярную массу от 10 до 20 кДа.

Однако необходимо отметить, что мономерные липополисахариды могут образовывать супрамолекулярные структуры за счет неполярных взаимодействий между липидными «хвостами», а также за счет образования «сшивок» фосфатных групп бивалентными катионами. Таким образом в водных растворах эндотоксины могут агрегировать в ламелярные, кубические или инвертированные гексагональные структуры, такие как мицеллы или везикулы. Диаметр подобных структур достигает 0,1 мкм, а молекулярная масса - 1000 кДа. Бивалентные катионы, такие как Ca²⁺и Mg²⁺, способствуют образованию супрамолекулярных структур, а детергенты, ЭДТА и белки, наоборот, смещают равновесие в сторону образования мономерных форм.

О-специфическая цепь уникальна для каждого прокариотического штамма; она вносит существенный вклад в серологическую специфичность, вызывая иммунный ответ в организмах человека и животных.

Основными составляющими ядра являются остатки гептозы (гексапиранозы во внешней части ядра и L-глицеро-D-манногептозы во внутренней части), а также группы 2-кето-3-деоксиоктоновой кислоты.

Липидный фрагмент эндотоксинов или липид А является наименее вариабельной и наиболее консервативной частью. Липид А отвечает за эндотоксическую активность. Она проявляется в стимулировании производства и высвобождения гранулоцитами и макрофагами эндогенных медиаторов, таких как биоактивные липиды, NO, цитокины (например, интерлейкин-1). Большие концентрации таких медиаторов в организме могут привести к множеству различных патофизиологических реакций, как-то повышение температуры тела, лейкопения, тахикардия, гипотония, рассеянная внутрисосудистая коагуляция и т.д.

Все выше сказанное подтверждает актуальную необходимость освобождения препаратов гиалуроната от эндотоксинов.

В совокупности существует целый ряд способов снижения содержания эндотоксинов в биологических растворах. Но в случае, в частности, белков к настоящему времени отсутствуют стандартные способы для широкого применения. Соответствующие используемые способы адаптированы к конкретным свойствам соответствующего белка и к соответствующим способам получения этого белка. Существуют различные возможности снижения содержания эндотоксинов, каждая из которых имеет конкретные преимущества и недостатки.

Ультрафильтрация (Petsch, D.&Anspach, F.В., 2000, J. Biotechnol. 76, 97-119 и ссылки) используется для снижения содержания эндотоксинов в воде и растворах с низкомолекулярными компонентами, такими как соли, сахара и антибиотики, но не подходит для высокомолекулярных белков или ДНК.

Двухфазная экстракция (например, WO 0166718, Merck) предназначена для отделения водорастворимых белков и ДНК от эндотоксина, но приводит к наличию остатков детергентов в очищенном продукте. Кроме того, этот метод требует много времени из-за многократного повторения процедуры очистки.

Для снижения содержания эндотоксинов в ДНК и основных белках используется также метод анионного обмена (диэтиламиноэтил (DEAE)-целлюлоза) (например, US 5990301, Qiagen; WO 9414837, Enzon), но он требует низкой ионной силы (менее 50 мМ NaCl) и приводит в случае кислых белков к совместной адсорбции белков.

Еще одним методом снижения содержания эндотоксинов в ДНК и белках (например, БСА (бычий сывороточный альбумин), миоглобине, гамма-глобулине, цитохроме С) является аффинная адсорбция (например, полимиксин В, гистамин, гистидин, полилизин) согласно, например, GB 2192633 (HammersmithHospital), которая, однако, является токсичной в случае полимиксина В и может приводить к совместной адсорбции белков в случае низких ионных сил.

Кроме того, используется иммуноаффинная хроматография, при которой специфичности в отношении конкретных эндотоксинов можно добиться только при помощи дорогостоящих антител (US 5179018, Centocor; WO 0008463, Bioserv) против коревого олигосахарида.

Кроме того, с белками (например БСА, химотрипсиногеном) используют S3-дельта-пептид (WO 0127289) фактора С (компонент ЛАЛ-теста) (WO 9915676 обе: Национальный университет Сингапура), причем этот метод имеет низкую эффективность в случае высоких ионных сил, а также требует высоких затрат на производство продукции.

В фармацевтической промышленности для растворов биополимеров нашли применение по существу три метода, адаптированные к свойствам целевых белков:

- анионообменная хроматография;

- обращенно-фазовая хроматография; ее недостатком является то, что она не одинаково подходит для всех белков, в частности, возникают проблемы в случае гидрофобных белков; этот метод, кроме того, требует очень больших затрат времени;

- RemTox (компания Millipore): недостатком этого метода является то, что помимо очень большой продолжительности инкубации высок компонент неспецифического связывания, и извлечение белка часто неадекватно.

Перечисленные выше способы очистки биологических препаратов от эндотоксинов предполагают использовать дорогостоящее оборудование и химические реагенты, а также имеют низкий выход целевого продукта.

Наиболее близким к предложенному является способ очистки соли гиалуроновой кислоты от примесей, в том числе, от эндотоксинов, включающий следующие стадии: получение частично очищенной соли гиалуроновой кислоты из культуры микроорганизма, способного продуцировать гиалуроновую кислоту; контактирование частично очищенной соли гиалуроновой кислоты с раствором, содержащим соль, в частности, хлорид натрия, и гидрофильный органический растворитель, для переноса примесей, содержащихся в частично очищенной гиалуроновой кислоте, в жидкую фазу; а также выделение очищенной соли гиалуроновой кислоты из смеси раствора и частично очищенного продукта соли гиалуроновой кислоты центрифугированием; при этом микроорганизм, способный продуцировать гиалуроновую кислоту, принадлежит к роду Streptococcus, а гидрофильный органический растворитель выбран из метанола, этанола, пропанола, изопропанола и ацетона (US 2009/0162905 A1, Hideki, Kazuo [JP], опубл. 25.06.2009).

Недостатком данного способа является невозможность сохранения молекулярной массы гиалуроновой кислоты в процессе очистки, молекулярная масса очищенной гиалуроновой кислоты уменьшается вдвое, что в значительной степени ухудшает характеристики конечного продукта.

Также недостатком данного способа является факт использования органических растворителей, таких как метанол, пропанол, изопропанол и ацетон, что затрудняет применение конечного продукта в медицинских целях без дополнительной стадии очистки от «следов» этих высокотоксичных соединений.

Предложенное изобретение решает техническую проблему, заключающуюся в получении гиалуроната с высокими характеристиками.

Техническим результатом, позволяющим решить данную проблему, является обеспечение сохранения в процессе очистки исходной молекулярной массы гиалуроновой кислоты (ее солей), реологических свойств, обеспечение чистоты конечного продукта вследствие исключения использования органических растворителей, а также повышение выхода конечного продукта.

Техническая проблема решается способом очистки гиалуроната от эндотоксинов, заключающимся в том, что готовят раствор, содержащий гиалуронат натрия и хлорид натрия, и осаждают гиалуронат центрифугированием, при этом способ отличается тем, что приготовление раствора осуществляют путем растворения гиалуроната натрия в 0,45-0,5%-ном растворе хлорида натрия с получением раствора с концентрацией гиалуроната 0,25-0,5%, добавляют в раствор при перемешивании 0,5-0,75%-ный раствор хлорида цетилпиридиния при количестве хлорида цетилпиридиния эквимолярном количеству гиалуроната по карбоксильным группам, оставляют полученный раствор до созревания и коагуляции осадка, после чего осуществляют осаждение гиалуроната путем центрифугирования смеси и собирают сырой осадок гиалуроната цетилпиридиния, после этого готовят 0,3-0,5%-ный раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде, предварительно охдажденном до температуры 5-7°С, при перемешивании, после полного растворения осадка на раствор действуют 1,25-1,5%-ным раствором хлорида натрия при количестве хлорида натрия эквимолярном количеству гиалуроната, образовавшийся осадок гиалуроната собирают и растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с получением раствора гиалуроната с концентрацией 0,1-0,15%, подают раствор гиалуроната натрия в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе исходного гиалуроната, при этом в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9%-ного раствора хлорида натрия по отношению к объему раствора гиалуроната, прошедший через систему раствор гиалуроната натрия в 0,9%-ном растворе хлорида натрия концентрируют до 1-2%, фильтруют через стерилизационную мембрану и получают очищенный гиалуронат.

В одном варианте очищенный гиалуронат получают в виде раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану.

В другом варианте очищенный гиалуронат получают путем осаждения его 96%-ным этанолом из раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану, и высушивания осадка.

Предлагается способ очистки от эндотоксинов препаратов гиалуроната с помощью нескольких процессов в технологической цепочке: осаждения, мицеллообразования, растворения в апротонных растворителях и ультрафильтрации на соответствующих молекулярной массе гиалуроната мембранах с последующей отмывкой растворами хлорида натрия.

В предложенном способе используются недорогие реактивы, он характеризуется небольшими временными затратами, большим выходом целевого продукта и высокой эффективностью очистки, а также в процессе очистки можно использовать исходный материал с различной степенью загрязненности эндотоксинами и белками и различной молекулярной массы. В процессе очистки показатели вязкости и молекулярная масса остаются неизменными.

Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов осуществляется следующим образом.

Навеску сухого препарата гиалуроната натрия определенной молекулярной массы, содержащий до 1⋅10³ EU/мг эндотоксинов, растворяют в растворе 0,45 - 0,5% хлорида натрия и получают раствор гиалуроната натрия с концентрацией 0,5% - 0,25%. Особенностью данного способа является то, что в процессе очистки можно использовать исходный материал с различной степенью загрязненности эндотоксинами и белками и различной молекулярной массы, а также стабилизированный сшивающими агентами материал. Затем при интенсивном перемешивании действуют 0,5-0,75% раствором соли четвертичного аммония, предпочтительно хлоридом цетилпиридиния. Гиалуронат осаждают эквимолярным количеством соли четвертичного аммония по карбоксильным группам (1 моль гиалуроната по карбоксильным группам и 1 моль соли четвертичного аммония).

Количество карбоксильных групп гиалуроната натрия может быть вычислено по известной формуле исходя из массы навески гиалуроната натрия. Количество n дисахаридных единиц рассчитывается по формуле

n=m/М,

где m - масса навески гиалуроната натрия, за вычетом примесей;

М - молярная масса дисахаридной единицы гиалуроната натрия (равна 401,22 г/моль).

Количество дисахаридных единиц гиалуроната натрия в навеске и будет равно количеству карбоксильных групп, что дает возможность рассчитать необходимое количество и массу цетилпиридиния хлорида. Например, в 1,00 грамме гиалуроната натрия, содержащего 97,5% целевого вещества, будет следующее количество карбоксильных групп:

масса непосредственно гиалуроната составит 0,9750 г;

n=0,975/401,22=0,00243 (моль).

Навеску хлорида цетилпиридиния рассчитывают по формуле:

m=M ⋅ n,

где m - масса навески хлорида цетилпиридиния;

M - молярная масса хлорида цетилпиридиния, которая составляет 358,01 г/моль.

Таким образом, из примера, если количество карбоксильных групп в 1 г навески гиалуроната составляет 0,00243 моль, то необходимо взять для полного осаждения гиалуроната цетилпиридиния следующую массу соли четвертичного аммония:

m=0,00243 ⋅ 358,01=0,8699 (г).

Раствор оставляют на 8-16 часов для созревания и коагуляции осадка. По истечении заданного времени смесь центрифугируют при 15 тыс. оборотах в минуту в течение 30 минут. Сырой осадок собирают и взвешивают.

Готовят 0,3% - 0,5% раствор гиалуроната цетилпиридиния в 100% диметилсульфоксиде. Так как процесс растворения соли гиалуроната с четвертичным аммонием экзотермичен, то диметилсульфоксид охлаждают до 5С° - 7°С. Растворение протекает медленно при перемешивании в течение 4-7 часов. После полного растворения осадка на раствор действуют 1,25% - 1,5% раствором хлорида натрия.

Для осаждения гиалуроната натрия из раствора диметилсульфоксида берут эквимолярное количество хлорида натрия в растворе. Осадок собирают и растворяют в 0,9% растворе хлорида натрия соблюдая концентрацию 0,1-0,15%. Раствор гиалуроната натрия вливают в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе первоначально поступающего на очистку гиалуроната. Для удаления остатков хлорида цетилпиридиния и диметилсульфоксида в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9% раствора хлорида натрия от объема 0,1% - 0,15% раствора. После промывки раствор гиалуроната натрия в 0,9% растворе хлорида натрия концентрируют до 1% - 2%, фильтруют через стерилизационную мембрану и используют непосредственно раствор, либо осаждают 96% этанолом, или лиофильно сушат. Выход гиалуроната натрия составляет 93,7% - 95,5%. Эндотоксины и белок в препарате после очистки не обнаруживаются. Также, если материал был стабилизирован BDDE, после процесса очистки не обнаруживается BDDE и продукты его гидролиза.

Пример 1.

Взяли 10,0 г сухого порошка гиалуроната натрия, бактериального происхождения, производство Китай, стабилизированного сшивающим агентом BDDE. Приготовили 0,3% раствор гиалуроната натрия в 0,45% растворе хлорида натрия, для чего в 3333 мл дистиллированной воды растворили 14,999 г хлорида натрия и затем порошок гиалуроната натрия и перемешивали в пакете на лопаточном гомогенизаторе в течение 2 часов.

Рассчитали массу хлорида цетилпиридиния для эквимолярного осаждения гиалуроната натрия по карбоксильным группам:

n (карбоксильных групп)=10,0/401,22=0,0249 (моль),

n (цетилпиридиния хлорида)=n (карбоксильных групп)=0,0249 моль,

m (цетилпиридиния хлорида)=M ⋅ n,

m (цетилпиридиния хлорида)=358,01 ⋅ 0,0249=8,9144 (г).

Приготовили 0,55% раствор цетилпиридиния хлорида, для чего 8,9144 г соли растворили в 1621 мл дистиллированной воды.

Раствор гиалуроната натрия объемом 3333 мл перелили в реактор с мешалкой. При интенсивном перемешивании влили 1621 мл раствора цетилпиридиния хлорида. Мешалку остановили и раствор оставили на 16 часов для созревания и коагуляции осадка.

По истечении заданного времени смесь центрифугировали при 15 тыс. оборотов в минуту в течение 30 минут. Сырой аморфный осадок собрали.

Приготовили 0,4% раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде для чего взяли 2500 мл диметилсульфоксида, охлажденного до 5°С. Растворяли в течение 5 часов при перемешивании до полного растворения осадка.

Рассчитали эквимолярное количество хлорида натрия для осаждения гиалуроната натрия из раствора диметилсульфоксида:

n (карбоксильных групп)=10,0/401,22=0,0249 (моль),

n (хлорида натрия)=n (карбоксильных групп)=0,0249 моль,

m (хлорида натрия)=M ⋅ n,

m (хлорида натрия)=58,44 ⋅ 0,0249=1,4552 (г).

Приготовили 1,3% раствор хлорида натрия, для чего соль растворили в 111,94 мл дистиллированной воды.

К 2500 мл раствора гиалуроната цетилпиридиния добавили при медленном перемешивании 111,94 мл раствора хлорида натрия. Выпавший волокнистый осадок собрали.

Из осадка приготовили 0,1% раствор в 0,9% растворе хлорида натрия, для чего взяли 10 л дистиллированной воды и растворили 90 г хлорида натрия.

Раствор 0,1% гиалуроната натрия влили в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, имеющей размер пор 5 ⋅ 10⁶ нм. Для удаления остатков соли четвертичного аммония и диметилсульфоксида в систему постепенно влили 25 л 0,9% раствора хлорида натрия. После промывки раствор гиалуроната натрия в 0,9% растворе хлорида натрия концентрировали до 1,5%, что по объему составило 632 мл.

Раствор слили из тангенцальной установки и профильтровали через стерилизационную мембрану 0,2 мкм.

Объем раствора после фильтрации составил 625 мл.

Раствор гиалуроната натрия осадили 5 объемами охлажденного до 4°С 96% этанола. Волокнистый осадок собрали, отжали, измельчили и высушили до постоянной массы при 60°С.

Масса осадка составила 9,375 г.

В таблице 1 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.

Таблица 1

Показатель Образец гиалуроната до очистки (бактериальный препарат, стабилизированный BDDE) Образец гиалуроната после очистки Содержание гиалуроната натрия (%) 99,40 99,75 Молекулярная масса 1,45 ⋅ 10⁶ Да 1,45 ⋅ 10⁶ Да Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) 930 930 Содержание эндотоксинов (EU/мг) 15 Не обнаруживаются

Пример 2.

Взяли 10,0 г сухого порошка нативного (без модификаций и стабилизации) гиалуроната натрия бактериального происхождения, производство Китай.

Процесс проводили как описано в примере 1.

В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 25 ⋅ 10⁶ нм.

Раствор сконцентрировали до 1%, что по объему составило 952 мл.

Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 945 мл. Выход целевого продукта составил 94,5%.

В таблице №2 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.

Таблица 2

Показатель Образец гиалуроната до очистки
(бактериальный препарат без стабилизации и модификаций) Образец гиалуроната после очистки Содержание гиалуроната натрия 99,37 99,80 Молекулярная масса 5,25 ⋅ 10⁶ Да 5,25 ⋅ 10⁶ Да Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) 2870 2870 Содержание эндотоксинов(EU/мг) 23 Не обнаруживаются

Пример 3.

Взяли 10,0 г сухого порошка нативного (без модификаций и стабилизации) гиалуроната натрия животного происхождения.

Процесс проводили как описано в примере 1.

В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 50 ⋅ 10⁶ нм.

Раствор сконцентрировали до 0,5%, что по объему составило 1880 мл.

Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 1874 мл. Выход целевого продукта составил 93,7%.

В таблице 3 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.

Таблица 3

Показатель Образец гиалуроната до очистки
(препарат животного происхождения, без стабилизации и модификаций) Образец гиалуроната после очистки Содержание гиалуроната натрия 99,40 99,80 Молекулярная масса 10,84 ⋅10⁶ Да 10,84 ⋅ 10⁶ Да Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) 4320 4320 Содержание эндотоксинов(EU/мг) 18 Не обнаруживаются

Пример 4.

Взяли 10,0 г сухого порошка нативного (без модификаций и стабилизации) гиалуроната натрия бактериального происхождения, производство Китай.

Процесс проводили как описано в примере 1.

В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 2,5 ⋅ 10⁵ нм.

Раствор сконцентрировали до 1,5%, что по объему составило 645 мл.

Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 637 мл. Выход целевого продукта составил 95,5%.

В таблице 4 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.

Таблица 4

Показатель Образец гиалуроната до очистки
(бактериальный препарат, стабилизированный BDDE) Образец гиалуроната после очистки Содержание гиалуроната натрия 98,20 99,77 Молекулярная масса 2,5 ⋅ 10⁵ Да 2,5 ⋅ 10⁵ Да Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) 320 325 Содержание эндотоксинов(EU/мг) 950 Не обнаруживаются

Пример 5.

Взяли 10,0 г сухого порошка стабилизированного BDDE гиалуроната натрия животного происхождения.

Процесс проводили как описано в примере 1.

В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 25 ⋅ 10⁶ нм.

Раствор сконцентрировали до 0,5%, что по объему составило 1880 мл.

Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 1874 мл. Выход целевого продукта составил 93,7%.

В таблице 5 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.

Таблица 5

Показатель Образец гиалуроната до очистки
(препарат животного происхождения, стабилизированный BDDE) Образец гиалуроната после очистки Содержание гиалуроната натрия 99,40 99,80 Молекулярная масса 12,63 ⋅ 10⁶ Да 12,63 ⋅ 10⁶ Да Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) 5320 5320 Содержание эндотоксинов (EU/мг) 17 Не обнаруживаются

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу очистки гиалуроната от эндотоксинов, заключающемуся в том, что готовят раствор, содержащий гиалуронат натрия и хлорид натрия, и осаждают гиалуронат центрифугированием, отличающемуся тем, что приготовление раствора осуществляют путем растворения гиалуроната натрия в 0,45-0,5 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора с концентрацией гиалуроната 0,25-0,5 %, добавляют в раствор при перемешивании 0,5-0,75 %-ный раствор хлорида цетилпиридиния при количестве хлорида цетилпиридиния эквимолярном количеству гиалуроната по карбоксильным группам, оставляют полученный раствор до созревания и коагуляции осадка, после чего осуществляют осаждение гиалуроната путем центрифугирования смеси и собирают сырой осадок гиалуроната цетилпиридиния, после этого готовят 0,3-0,5 %-ный раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде, предварительно охлажденном до температуры 5-7 °С, при перемешивании, после полного растворения осадка на раствор действуют 1,25-1,5 %-ным раствором хлорида натрия при количестве хлорида натрия эквимолярном количеству гиалуроната, образовавшийся осадок гиалуроната собирают и растворяют в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора гиалуроната с концентрацией 0,1-0,15 %, подают раствор гиалуроната натрия в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе исходного гиалуроната, при этом в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9 %-ного раствора хлорида натрия по отношению к объему раствора гиалуроната, прошедший через систему раствор гиалуроната натрия в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия концентрируют до 1-2 %, фильтруют через стерилизационную мембрану и получают очищенный гиалуронат. Настоящее изобретение обеспечивает сохранение в процессе очистки исходной молекулярной массы гиалуроновой кислоты (ее солей), реологических свойств, обеспечивает чистоту конечного продукта вследствие исключения использования органических растворителей, а также обеспечивает повышение выхода конечного продукта. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

1. Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов, заключающийся в том, что готовят раствор, содержащий гиалуронат натрия и хлорид натрия, и осаждают гиалуронат центрифугированием, отличающийся тем, что приготовление раствора осуществляют путем растворения гиалуроната натрия в 0,45-0,5 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора с концентрацией гиалуроната 0,25-0,5 %, добавляют в раствор при перемешивании 0,5-0,75 %-ный раствор хлорида цетилпиридиния при количестве хлорида цетилпиридиния эквимолярном количеству гиалуроната по карбоксильным группам, оставляют полученный раствор до созревания и коагуляции осадка, после чего осуществляют осаждение гиалуроната путем центрифугирования смеси и собирают сырой осадок гиалуроната цетилпиридиния, после этого готовят 0,3-0,5 %-ный раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде, предварительно охдажденном до температуры 5-7 °С, при перемешивании, после полного растворения осадка на раствор действуют 1,25-1,5 %-ным раствором хлорида натрия при количестве хлорида натрия эквимолярном количеству гиалуроната, образовавшийся осадок гиалуроната собирают и растворяют в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора гиалуроната с концентрацией 0,1-0,15 %, подают раствор гиалуроната натрия в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе исходного гиалуроната, при этом в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9 %-ного раствора хлорида натрия по отношению к объему раствора гиалуроната, прошедший через систему раствор гиалуроната натрия в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия концентрируют до 1-2 %, фильтруют через стерилизационную мембрану и получают очищенный гиалуронат.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный гиалуронат получают в виде раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный гиалуронат получают путем осаждения его 96 %-ным этанолом из раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану, и высушивания осадка.