ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ДЕТСКАЯ СМЕСЬ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ МИЕЛИНИЗАЦИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА Российский патент 2022 года по МПК A23L33/115 A23L33/15 A23L33/16 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для применения с целью стимуляции, поддержания или оптимизации миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, и/или межнейронных связей головного мозга, и/или одной или более из когнитивных способностей, способностей к обучению и интеллектуальных способностей и/или когнитивного функционирования у субъекта.

Предпосылки создания изобретения

Грудное вскармливание рекомендовано всем младенцам. Тем не менее, в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным или невозможным по медицинским причинам. В этих ситуациях в качестве альтернативы материнскому молоку можно применять детскую смесь. Однако исследования показали, что детская смесь не всегда обеспечивает в отношении организма воздействия, идентичные тем, которые обеспечиваются материнским молоком.

В недавнем исследовании было продемонстрировано, что структура головного мозга, в частности количество и/или временно-пространственное распределение миелинизированного вещества во всем головном мозге детей, вскармливаемых исключительно грудным молоком, может отличаться от детей, вскармливаемых детской смесью, и что эти различия могут коррелировать с улучшенным интеллектом, обучением и/или когнитивным функционированием у детей, вскармливаемых грудным молоком, в частности на более поздних этапах жизни, даже с учетом искажающих факторов (“Breastfeeding and early white matter development: a cross sectional study”, Deoni et al., NeuroImage 82, (2013), 77-86). Указанное исследование также наглядно демонстрирует, что имеет место связь, в частности временная связь, между миелинизацией de novo, и в частности траекторией миелинизации de novo, и структурой головного мозга.

Лонгитюдные исследования структуры головного мозга вскармливаемых грудным молоком детей и вскармливаемых смесью детей ранее не были возможны, а выявленные различия в когнитивном функционировании и когнитивной способности зачастую объясняли лишь такими факторами, как социально-экономический статус и уровень образования матери. Возможные различия в структуре головного мозга у вскармливаемых грудным молоком и вскармливаемых смесью детей как не принимались в учет, так и не поддавались измерениям таким образом, как это стало возможно с тех пор, как МРТ детского головного мозга стала обычной практикой, ср. Deoni et al.

Хорошо задокументирована важность структуры головного мозга, в частности количества и/или пространственного распределения миелинизированного вещества во всем головном мозге, для когнитивного функционирования и интеллекта. Сам по себе миелин в головном мозге выступает в роли изолирующего слоя вдоль нейронов, обеспечивающего значительно более быстрое проведение нервных импульсов. Тем не менее, такая структура головного мозга, в частности количество и/или пространственное распределение миелина в головном мозге, влияет на межнейронные связи головного мозга, например, посредством того, через какой путь и как быстро и эффективно передаются сообщения в виде нервных импульсов в головном мозге и, в частности, между различными областями головного мозга. Это взаимодействие между отделами головного мозга может играть определенную роль в когнитивном функционировании и обучении, а также может затрагивать или даже выступать в роли физиологического предела, интеллектуальных, когнитивных способностей и/или способностей к обучению и регулятора когнитивного функционирования.

Соответственно, существует потребность в нахождении способов стимуляции, поддержания или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, в частности количества и/или пространственного распределения миелинизированного вещества во всем головном мозге и/или межнейронных связей головного мозга у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта.

Кроме того, существует потребность в нахождении способов оптимизации интеллектуальных способностей, и/или когнитивных способностей, и/или способностей к обучению, и/или когнитивного функционирования у субъекта, в частности у вскармливаемого смесью субъекта.

Неожиданно авторами настоящего изобретения было обнаружено, что содержащая жирные кислоты композиция может стимулировать, поддерживать или оптимизировать миелинизацию de novo, в частности траекторию миелинизации de novo, и/или структуру головного мозга, в частности количество и/или пространственное распределение миелинизированного вещества во всем головном мозге у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта.

Конкретнее, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что содержащая жирные кислоты композиция может стимулировать, поддерживать или оптимизировать миелинизацию de novo, в частности траекторию миелинизации de novo, и/или структуру головного мозга, в частности количество и/или пространственное распределение миелинизированного вещества во всем головном мозге у вскармливаемого смесью субъекта, и может приводить один или более из вышеперечисленных параметров в большее соответствие или ближе к параметрам, которые наблюдаются у вскармливаемого грудным молоком, конкретнее у вскармливаемого исключительно грудным молоком субъекта.

Данное открытие было сделано на основе анализа питательных композиций по результатам лонгитюдного исследования изображений головного мозга и когнитивных функций, в котором было произведено изучение и сравнение миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, в частности количества и пространственного распределения миелинизированного вещества во всем головном мозге, в частности по результатам определения миелинизации de novo и траектории миелинизации de novo, у вскармливаемых грудным молоком и детской смесью субъектов. Дополнительные детали настоящего исследования и результаты приведены во включенных в настоящий документ примерах.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение изложено в формуле изобретения и более подробно во включенном в настоящий документ подробном описании.

Настоящее изобретение охватывает синтетическую питательную композицию, содержащую производное жирной кислоты, которое можно применять для стимуляции, поддержания или оптимизации одного или более из следующего:

• миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo,

• структуры головного мозга, в частности количества и пространственного распределения миелинизированного вещества во всем головном мозге и/или в конкретных областях головного мозга,

• межнейронных связей головного мозга,

• интеллектуальных способностей,

• когнитивных способностей,

• способностей к обучению,

• когнитивного функционирования,

у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта. Конкретнее, указанный субъект может быть младенцем или ребенком, и еще конкретнее - вскармливаемым смесью младенцем или ребенком.

Указанная синтетическая питательная композиция может представлять собой композицию, выбранную из группы, состоящей из: детской смеси, молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, композиции для младенцев, которая предназначена для добавления или разведения человеческим грудным молоком, и пищевого продукта, предназначенного для потребления младенцем и/или ребенком либо отдельно, либо в комбинации с человеческим грудным молоком.

Указанная композиция может оптимизировать миелинизацию de novo, в частности траекторию миелинизации de novo, и/или структуру головного мозга, и/или межнейронные связи головного мозга у субъекта, в частности у вскармливаемого смесью субъекта, и приблизить их на любую величину к наблюдаемым или измеряемым у вскармливаемых грудным молоком субъектов, в частности вскармливаемых исключительно грудным молоком субъектов, в головном мозге в целом или в одной или более областях головного мозга по сравнению с композицией, в которой все остальные компоненты являются такими же, за исключением содержания производного жирной кислоты.

Производное жирной кислоты представляет собой соединение, содержащее отличную от фосфолипида жирную кислоту, при этом указанное производное жирной кислоты может быть выбрано из группы, состоящей из свободной жирной кислоты, моноацилглицерина, диацилглицерина, триацилглицерина, сложного эфира холестерина и их комбинации, и при этом указанная жирная кислота может включать докозагексановую кислоту, и/или арахидоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, и/или нервоновую кислоту.

Указанная композиция может дополнительно содержать любой один или более из следующих ингредиентов:

• фосфолипид, в частности фосфолипид с формулой (I), или смесь соединений с формулой (I), которая определена в настоящем документе, и конкретнее может представлять собой фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин или их смесь,

• минерал, в частности железо, и/или цинк, и/или медь, и/или кальций, и/или фосфор, и/или магний,

• холин,

• витамин, в частности витамин B12 и/или фолиевая кислота.

Если композиция дополнительно содержит один или более из этих ингредиентов, она может быть более эффективной.

Особенно полезные концентрации вышеупомянутых ингредиентов изложены в формуле изобретения и во включенном в данный документ подробном описании.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показаны средние траектории миелинизации всего головного мозга (всего белого вещества) у младенцев и детей младшего возраста, вскармливаемых грудным молоком по сравнению со вскармливаемыми двумя коммерческими смесями, содержащими различные уровни докозагексановой кислоты.

На фиг. 1а показаны средние региональные траектории миелинизации у младенцев и детей младшего возраста, вскармливаемых грудным молоком по сравнению со вскармливаемыми двумя коммерческими смесями, содержащими различные уровни докозагексановой кислоты.

На фиг. 1b представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с докозагексановой кислотой.

На фиг. 1c представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с арахидоновой кислотой.

На фиг. 1d представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с фолиевой кислотой.

На фиг. 1e представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с витамином В12.

На фиг. 1f представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с железом.

На фиг. 1g представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с цинком.

На фиг. 1h представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с кальцием.

На фиг. 1I представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с фосфором.

На фиг. 1J представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с магнием.

На фиг. 1k представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные со сфингомиелином.

На фиг. 1L представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с фосфатидилинозитолом.

На фиг. 1M представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с фосфатидилхолином.

На фиг. 1n представлено изображение головного мозга, на котором видны миелинизированные области головного мозга, связанные с фосфатидилхолином.

На фиг. 2 продемонстрировано влияние нервоновой кислоты на плотность нейронов и плотность астроцитов.

На фиг. 3 продемонстрировано влияние стеариновой кислоты на плотность нейронов и плотность астроцитов.

На фиг. 4 продемонстрировано влияние октановой кислоты на плотность нейронов и плотность астроцитов.

На фиг. 5 продемонстрировано влияние сфингомиелина на количество нейросфер и пролиферацию нейронов.

На фиг. 6 продемонстрировано относительное содержание основных разновидностей СМ (сфингомиелина) в ингредиенте, детской смеси, коровьем молоке и человеческом молоке (Величины ошибки представляют стандартное отклонение с n=3).

На фиг. 7 продемонстрировано относительное содержание ЖК во фракции СМ из ингредиента, детской смеси, коровьем молоке и человеческом молоке (Величины ошибки представляют стандартное отклонение с n=3).

На фиг. 8 продемонстрировано влияние ДГК на ОБМ, НФ и/или ОБМ/НФ на 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 9 продемонстрировано влияние стеариновой кислоты на A2B5, ОБМ, МАГ, НФ, ОБМ/НФ и/или МАГ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 10 продемонстрировано влияние витамина B12 на A2B5, НФ, ОБМ/НФ и/или МАГ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 11 продемонстрировано влияние фолиевой кислоты на A2B5, НФ, МАГ, МАГ/НФ и/или ОБМ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 12 продемонстрировано влияние холина на A2B5, МАГ и/или ОБМ на 12-й день, 18-й день или 30-й день.

На фиг. 13 продемонстрировано влияние железа на A2B5, ОБМ, МАГ, НФ и/или МАГ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 14 продемонстрировано влияние цинка на ОБМ, НФ и/или ОБМ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 15 продемонстрировано влияние фосфора на МАГ, НФ и/или МАГ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 16 продемонстрировано влияние магния на A2B5, ОБМ, НФ, МАГ, ОБМ/НФ и/или МАГ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 17 продемонстрировано влияние меди на A2BF, МАГ и/или МАГ/НФ на 12-й день и/или 18-й день.

На фиг. 18 продемонстрировано влияние фосфатидилхолина на A2B5 на 12-й день и на МАГ на 18-й день.

На фиг. 19 продемонстрировано влияние фосфатидилинозитола на A2B5, ОБМ, МАГ, НФ, МАГ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 20 продемонстрировано влияние фосфатидилсерина на A2B5, НФ и/или МАГ/НФ на 12-й день и/или D18.

На фиг. 21 продемонстрировано влияние сфингомиелина на A2B5, МАГ и/или ОБМ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 22 продемонстрировано влияние церамида на A2B5 на 12-й день и на МАГ на 18-й день.

На фиг. 23 продемонстрировано влияние галактоцерамида на A2B5, ОБМ, НФ и/или ОБМ/НФ на 12-й день и/или 30-й день.

На фиг. 24 продемонстрировано влияние глюкоцерамида на A2B5 на 12-й день и НФ на 12-й день и 18-й день.

На фиг. 25 продемонстрировано влияние D-эритроцерамида на A2B5 на 12-й день и на МАГ на 18-й день.

На фиг. 26 продемонстрировано влияние церамид-1-фосфата на A2B5 на 12-й день и на НФ и МАГ на 18-й день.

На фиг. 27 продемонстрировано влияние моносиалоганглиозида-3 (GM3) на A2B5, ОБМ, МАГ и/или ОБМ/НФ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 28 продемонстрировано влияние дисиалоганглиозидов 3 (GD3) на A2B5, ОБМ, НФ и/или МАГ на 12-й день, 18-й день и/или 30-й день.

На фиг. 29 продемонстрирован жирнокислотный профиль фосфатидилинозитола (ФИ), фосфатидилхолина, фосфатидила (ФХ), фосфатидилсерина (ФС) и сфингомиелина, использованных в примере 6.

На фиг. 30 продемонстрировано влияние витамина B12 на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 31 продемонстрировано влияние АРК на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 32 продемонстрировано влияние стеариновой кислоты на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 33 продемонстрировано влияние цинка на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 34 продемонстрировано влияние фосфатидилинозитола на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ.

На фиг. 35 продемонстрировано влияние GD3 на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 36 продемонстрировано влияние ДГК на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 37 продемонстрировано влияние нервоновой кислоты на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 38 продемонстрировано влияние железа на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 39 продемонстрировано влияние фосфатидилхолина на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 40 продемонстрировано влияние фосфатидилсерина на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 41 продемонстрировано влияние фолиевой кислоты на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 42 продемонстрировано влияние холина на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 43 продемонстрировано влияние церамида на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 44 продемонстрировано влияние галактоцерамида на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 45 продемонстрировано влияние глюкоцерамида на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 46 продемонстрировано влияние церамид-1-фосфата на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 47 продемонстрировано влияние D-эритроцерамида на экспрессию мРНК МАГ и ОБМ и на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 48 продемонстрировано влияние сфингомиелина на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

На фиг. 49 продемонстрировано влияние GM3 на совместную экспрессию ОБМ и BetaIII.

Осуществление изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения предложена синтетическая композиция, содержащая производное жирной кислоты, композиция может быть предназначена для стимуляции, поддержания или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, и/или межнейронных связей головного мозга, и/или интеллектуальных способностей, и/или когнитивных способностей, и/или способностей к обучению, и/или когнитивного функционирования у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта.

Путем стимуляции, поддержания и/или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, и/или интеллектуальных способностей, и/или когнитивных способностей, и/или способностей к обучению, и/или когнитивного функционирования у субъекта, в частности у вскармливаемого смесью субъекта, композиция согласно настоящему изобретению может предупреждать, снижать риск развития и/или минимизировать недостаточную миелинизацию de novo, в частности недостаточную траекторию миелинизации de novo, и/или недостаточное развитие структуры головного мозга, и/или недостаточные межнейронные связи головного мозга, и/или недостаточные интеллектуальные способности, и/или недостаточные когнитивные способности, и/или недостаточные способности к обучению, и/или недостаточное когнитивное функционирование у указанного субъекта. Оно может быть нетерапевтическим или терапевтическим.

Используемый в настоящем документе термин «стимулировать» относится к фактору или ряду факторов, вызывающих возникновение определенного процесса.

Используемый в настоящем документе термин «поддерживать» относится к фактору или ряду факторов, поддерживающих определенный процесс после его возникновения.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» относится к млекопитающему, в частности кошке, собаке или человеку, конкретнее этот термин относится к человеку, еще конкретнее - к младенцу или ребенку, и еще более конкретно - к младенцу или ребенку, вскармливаемому детской смесью и/или молочной смесью для детей от 1 до 3 лет.

Используемый в настоящем документе термин «младенец» относится к ребенку возрастом до 12 месяцев и включает недоношенных и очень недоношенных новорожденных младенцев, младенцев с низкой массой при рождении, т.е. новорожденного с массой тела ниже 2500 г (5,5 фунтов) либо из-за преждевременных родов, либо из-за ограниченного роста плода, и младенцев, рожденных маленькими для своего гестационного возраста (МГВ), т.е. детей с массой при рождении ниже 10-го процентиля относительно детей того же гестационного возраста.

Используемый в настоящем документе термин «ребенок» относится к человеку возрастом от 1 до 18 лет, конкретнее - к человеку возрастом от 1 до 10 лет, еще конкретнее - к человеку возрастом от 1 до 5 лет и еще конкретнее - к человеку возрастом от 1 до 2 лет.

Используемый в настоящем документе термин «вскармливаемый смесью младенец или ребенок» относится к младенцу или ребенку, вскармливаемому либо детской смесью, и/либо молочной смесью для детей от 1 до 3 лет.

Используемый в настоящем документе термин «вскармливаемый грудным молоком субъект» относится к млекопитающему, в частности кошке, собаке или человеку, конкретнее этот термин относится к человеку, еще конкретнее младенцу или ребенку и даже еще конкретнее младенцу или ребенку, вскармливаемому человеческим грудным молоком, в частности от матери, получающей полный набор питательных веществ.

Используемый в настоящем документе термин «миелинизация de novo» относится к развитию миелинизации и, в частности, к процессу, в ходе которого оголенные аксоны головного мозга субъекта миелинизируются во время роста и развития. Это процесс, который начинается, в частности, в определенных областях головного мозга внутриутробно и продолжается постнатально, и он наиболее продуктивен в первые 5 лет жизни субъекта-человека, в частности первые 2 и 3 года жизни человека, в частности первый год жизни человека.

Используемый в настоящем документе термин «траектория миелинизации de novo» относится к степени миелинизации de novo или накоплению нового миелина (по результатам измерения, например, водной фракции миелина) в зависимости от времени, и в частности в начале и в течение периода младенчества и детства, в частности в раннем детстве, и конкретнее первые 5 лет жизни человека-субъекта, конкретнее первые 2 и 3 года жизни человека, еще конкретнее первый год или первые 6 месяцев жизни человека, когда детская смесь может быть единственной формой питания для некоторых младенцев.

Используемый в настоящем документе термин «структура головного мозга» относится к структуре серого и белого вещества в головном мозге и конкретных областях головного мозга, и в частности к миелинизированному белому веществу в головном мозге и конкретных областях головного мозга, по результатам определения миелинизации de novo, и в частности траектории миелинизации de novo, т.е. по структурному отложению миелина de novo. Конкретнее, этот термин относится к количеству и/или пространственному распределению миелинизированного вещества во всем головном мозге и/или в конкретных областях головного мозга, и конкретнее - к количеству и/или временному пространственному распределению миелинизированного вещества во всем головном мозге и/или в конкретных областях головного мозга.

Используемый в настоящем документе термин «интеллектуальные способности» относится к вероятным интеллектуальным способностям или возможностям, которые могут быть достигнуты субъектом, что определяется физиологическими факторами. В частности, интеллектуальные способности могут относиться к подвижному интеллекту.

Используемый в настоящем документе термин «подвижный интеллект» относится к нейронным способностям субъекта и/или возможностям субъекта решать новые или абстрактные задачи, что определяется физиологическими факторами. Это отличается от кристаллизованного интеллекта, который определяется, по меньшей мере частично, знаниями, полученными в результате обучения или привития.

Используемый в настоящем документе термин «когнитивные способности» относится к вероятным когнитивным и/или умственным способностям или возможностям, которые вероятно могут быть достигнуты субъектом, что определяется физиологическими факторами. В частности, этот термин может относиться к одному или более из: способностей переработки информации, способностей восприятия, способностей сохранять внимание, способностей мыслительного процесса, способностей логического рассуждения, способностей понимания и запоминания, психомоторных способностей, в том числе способностей крупной моторики и мелкой моторики, способностей зрения, в том числе способностей зрительного восприятия, слуховых способностей, способностей речи, в том числе способностей экспрессивной и рецептивной речи, способностей запоминания и удержания в памяти, способностей концентрации, способностей исполнительных функций, в том числе способностей решения задач, принятия решений и сдерживания.

Используемый в настоящем документе термин «способности к обучению» относится к вероятной способности или возможности, которые имеет субъект к обучению, например, как легко и/или быстро субъект может получить знания или навыки посредством опыта, исследования или обучения, что определяется физиологическими факторами. Также и в случае с вероятной способностью, которую субъект имеет к адаптации в ответ на внешние факторы, что определяется физиологическими факторами.

Используемый в настоящем документе термин «обучение» относится к приобретению знаний или навыков посредством опыта, исследования или обучения.

Используемый в настоящем документе термин «когнитивность» относится к интеллектуальным процессам, посредством которых один индивидуум осознает, воспринимает или осмысляет идеи; а следовательно - к способности мыслить и понимать. Когнитивность включает в себя все аспекты способностей переработки информации, восприятия, сохранения внимания, мыслительного процесса, логического рассуждения, понимания и запоминания, а также психомоторных, речевых способностей, способностей запоминания, концентрации, исполнительных функций и способностей решения задач.

Используемый в настоящем документе термин «оптимизация» относится к усовершенствованию или улучшению.

Поскольку человеческое грудное молоко является золотым стандартом, когда речь заходит о вскармливании младенцев, оптимальной можно считать траекторию миелинизации de novo, измеренную или наблюдаемую у вскармливаемых грудным молоком, конкретнее вскармливаемых исключительно грудным молоком, в частности от имеющих полноценное питание или получающих полный набор питательных веществ матерей. Таким образом, композицию согласно настоящему изобретению можно рассматривать как оптимизирующую траекторию миелинизации у субъекта, если она приводит к траектории миелинизации de novo у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта, в соответствие или ближе к измеряемой или наблюдаемой у вскармливаемого грудным молоком, конкретнее вскармливаемого исключительно грудным молоком субъекта, в частности от имеющей полноценное питание или получающей полный набор питательных веществ матери.

Траекторию миелинизации de novo у субъекта можно рассматривать как соответствующую или приближенную к таковой, измеренной или наблюдаемой у вскармливаемого грудным молоком, конкретнее вскармливаемого исключительно грудным молоком, субъекта, в частности от имеющей полноценное питание или получающей полный набор питательных веществ матери, если расстояние между любыми эквивалентными/одинаковыми точками измерения на траектории субъекта и указанной траектории вскармливаемого грудным молоком субъекта достигает 50%, в частности 25%, конкретнее 20%. Неограничивающие примеры в пределах диапазона до 50% включают 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% и 0,01%. В частности, такие траектории будут считаться биоэквивалентными.

Траекторию миелинизации можно измерять на любой комбинации временных точек. В частности, временные точки лежат в пределах первых 5 лет жизни человека, конкретнее первых 2 и 3 лет жизни человека, еще конкретнее в первый год или первые 6 месяцев жизни человека.

Траекторию миелинизации de novo можно определить путем периодического измерения у субъекта любого маркера миелинизации с течением времени. В частности, траекторию миелинизации de novo можно измерить путем измерения ассоциированной с миелином водной фракции (водной фракции миелина) и/или ассоциированного с миелином водного пула (водного пула миелина) у субъекта в различных временных точках, в частности в различных временных точках на протяжении первых 5 лет жизни субъекта-человека, конкретнее первых 2 и 3 лет жизни человека, еще конкретнее 1-го года или первых 6 месяцев жизни человека. Ассоциированную с миелином водную фракцию и/или ассоциированный с миелином водный пул у субъекта можно измерить с помощью методики магнитно-резонансной томографии (МРТ) релаксации многокомпонентных структур (РМС) и, в частности, с помощью методики mcDESPOT (Deoni et al. 2008). В частности, траекторию миелинизации de novo можно определить путем измерения ассоциированного с миелином водного пула с помощью методики mcDESPOT (Magn.Reson.Med.2008 60:1372-1387, содержание которой включено, таким образом, в настоящий документ посредством ссылки).

Композицию согласно настоящему изобретению можно считать оптимизирующей когнитивное функционирование и/или интеллект субъекта, если она приводит один или более критериев субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта, в стандартизированном когнитивном тесте, включающем тест интеллекта, тест школьной успеваемости и/или тест в отношении неврологического развития, например по шкалам раннего развития Мюллена, в соответствие или ближе к таковым, измеряемым или наблюдаемым у вскармливаемого грудным молоком, конкретнее вскармливаемого исключительно грудным молоком субъекта, в частности от имеющей полноценное питание или получающей полный набор питательных веществ матери. Когнитивное и неврологическое функционирование субъекта можно считать соответствующим или приближенным к таковому, измеряемому у указанного вскармливаемого грудным молоком субъекта, если различие между одним или более критериев в стандартизированном тесте неврологического развития, например T-показателями Мюллена, и таковыми у указанного вскармливаемого грудным молоком субъекта составляет менее одного стандартного отклонения, конкретнее менее половины стандартного отклонения, от критерия в стандартизированном тесте, например менее 10 пунктов, конкретнее менее 5 пунктов для T-показателя Мюллена, в частности менее 2 пунктов. При этом указанные критерии в стандартизированном тесте неврологического развития, например Т-критерии Мюллена, измеряют в одной временной точке у указанного субъекта и указанного вскармливаемого грудным молоком субъекта.

Указанный критерий Мюллена можно измерить в любой подходящей временной точке, и в частности в пределах первых 5 лет, 3 лет жизни человека, конкретнее первых 2 лет жизни человека, еще конкретнее в первый год или первые 6 месяцев жизни человека.

При стимуляции, поддержании или оптимизации когнитивных способностей, способностей к обучению и/или интеллектуальных способностей композиции согласно настоящему изобретению могут иметь краткосрочный или долгосрочный эффект на когнитивное функционирование, включая развитие когнитивных функций и/или обучение, и на предупреждение или минимизацию каких-либо нейрокогнитивных недостатков, нарушения или задержки.

Указанный краткосрочный эффект может проявиться лишь спустя несколько дней, недель или месяцев.

Указанный долгосрочный эффект может проявиться лишь спустя годы, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 лет.

Композиция, содержащая производное жирной кислоты, например производное жирной кислоты содержащее ДГК и/или АК, может быть особенно эффективной при поддержании, стимуляции или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, в одной или более из следующих зон головного мозга: мозжечке, внутренней капсуле, теменной доле, двигательной и сенсорной зоне коры (в том числе отвечающей за координацию и выполнение движения), зрительной зоне коры, лобных отделах коры. Соответственно, композиция, содержащая жирную кислоту, может быть особенно эффективной при стимуляции, поддержании или оптимизации способностей зрительного восприятия, моторной функции и психомоторных способностей (в том числе способностей координации и выполнения движения) и/или способностей исполнительных функций, в том числе способностей решения задач, социального взаимодействия, способностей поведенческого взаимодействия и способностей социально-эмоционального функционирования.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения когнитивные способности выбраны из группы, состоящей из способностей зрительного восприятия, моторной функции и психомоторных способностей (в том числе способностей координации и выполнения движения) и/или способностей исполнительных функций, в том числе способностей решения задач, социального взаимодействия, способностей поведенческого взаимодействия и способностей социально-эмоционального функционирования.

При стимуляции, поддержании или оптимизации способностей зрительного восприятия, моторной функции и психомоторных способностей и/или способностей исполнительных функций, в том числе способностей решения задач, социального взаимодействия, способностей поведенческого взаимодействия и/или способностей социально-эмоционального функционирования. Композиции согласно настоящему изобретению могут иметь краткосрочный или долгосрочный эффект, например улучшающий эффект, на зрительное восприятие, моторную функцию и психомоторную функцию и/или исполнительные функции, в том числе решение задач, социальное взаимодействие, поведенческое взаимодействие и/или речь. Указанный краткосрочный эффект может проявиться лишь спустя несколько дней, недель или месяцев.

Указанный долгосрочный эффект может проявиться лишь спустя годы, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 лет.

Используемый в настоящем документе термин «производное жирной кислоты» относится к содержащему жирную кислоту соединению, отличному от фосфолипида, и, в частности, к свободной жирной кислоте, и/или моноацилглицерину (далее в настоящем документе МАГ), и/или диацилглицерину (далее в настоящем документе ДАГ), и/или триацилглицерину (далее в настоящем документе ТАГ), и/или сложному эфиру холестерина. Конкретнее, данный термин относится к МАГ, ДАГ, ТАГ и/или сложному эфиру холестерина. Еще конкретнее, данный термин относится к ТАГ.

Используемый в настоящем документе термин «МАГ» относится к молекуле глицерина, в которой одна из групп ОН образовала сложноэфирную связь с жирной кислотой. В частности, используемый в настоящем документе термин «МАГ» относится к соединению с формулой (X)

(X)

где:

два из R¹⁸ R¹⁹ или R²⁰ представляют собой H, и при этом один из R¹⁸ R¹⁹ или R²⁰ представляет собой насыщенную или ненасыщенную C4-C44 ацильную группу.

Конкретнее, два из R¹⁸ R¹⁹ или R²⁰ представляют собой H, а один из R¹⁸ R¹⁹ или R²⁰ представляет собой насыщенную или ненасыщенную C10-C24 ацильную группу, и еще конкретнее насыщенную или ненасыщенную C14-C24 ацильную группу.

Используемый в настоящем документе термин «ДАГ» относится к молекуле глицерина, в которой две из групп ОН образовали сложноэфирную связь с двумя жирными кислотами. В частности, используемый в настоящем документе термин «ДАГ» относится к соединению с формулой (X)

где:

один из R¹⁸ R¹⁹ или R²⁰ представляют собой H, и при этом два из R¹⁸ R¹⁹ или R²⁰ представляют собой насыщенные или ненасыщенные C4-C44 ацильные группы. Конкретнее, насыщенные или ненасыщенные C10-C24 ацильные группы, и еще конкретнее насыщенные или ненасыщенные C14-C24 ацильные группы. Две насыщенные или ненасыщенные C4-C44 ацильные группы могут быть одинаковыми или различаться.

Используемый в настоящем документе термин «ТАГ» относится к молекуле глицерина, в которой три из групп ОН образовали сложноэфирную связь с тремя жирными кислотами. В частности, используемый в настоящем документе термин «ТАГ» относится к соединению с формулой (X)

где:

где все R¹⁸ R¹⁹ или R²⁰ представляют собой насыщенные или ненасыщенные C4-C44 ацильные группы, конкретнее насыщенные или ненасыщенные C10-C24 ацильные группы, и еще конкретнее насыщенные или ненасыщенные C14-C24 ацильные группы. Все три насыщенные или ненасыщенные C4-C44 ацильные группы могут быть одинаковыми, или все они могут различаться, или две могут быть одинаковыми, а одна отличаться.

Используемый в настоящем документе термин «сложный эфир холестерина» относится к соединению с формулой (XI)

(XI)

где:

R²¹ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R²¹ представляет собой разветвленную или неразветвленную C9-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с соседней карбонильной группой соответствуют насыщенному или ненасыщенному C10-C44 жирнокислотному остатку, и еще конкретнее насыщенному или ненасыщенному C14-C24 жирнокислотному остатку.

Используемый в настоящем документе термин «жирная кислота» относится к соединению с формулой (XI)

(XII)

где

R²² представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R²² представляет собой разветвленную или неразветвленную C9-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, и еще конкретнее разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Неограничивающие примеры насыщенных или ненасыщенных C10-C44 жирных кислот, которые могут содержаться в производном жирной кислоты, т.е. которые могут представлять собой свободную жирную кислоту или жирную кислоту, от которой жирнокислотный остаток (остатки) в МАГ, ДАГ, ТАГ и/или сложном эфире холестерина могут включать; C10:0, C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-7, C18:1n-9, C18:2n-6, 18:3n-3, C20:0, C20:1n-9, C20:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, 20:5n-3, C21:0, C22:0, C22:1n-9, C22:6n-3 C23:0, C24:1, в частности 24:1n-9, C25:0, C28:1, C30:2, C30:1, C30:0, C32:3, C32:2, C32:1, C32:0, C33:1, C34:3, C34:2, C34:1, C34:0, C35:2, C35:0, C36:4, C36:3, C36:2, C36:1, C36:0, C37:1, C37:0, C38:4, C38:3, C38:1, C38:0, C39:1, C39:0, C40:2, C40:1, C40:0, C41:2, C41:1, C41:0, C42:47, C42:3, C42:2, C42:1, C42:0, C44:3, C44:1. В частности, указанные жирные кислоты будут выбраны из группы, состоящей из: C10:0, C12:0, C14:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-7, C18:1n-9, C18:2n-6, 18:3n-3, C20:0, C20:1n-9, C20:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, 20:5n-3, C22:0, C22:1n-9, C22:6n-3, C24:1, 24:1n-9.

В настоящем изобретении можно применять любое производное жирной кислоты, подходящее для потребления субъектом, которому данная композиция предназначена для употребления.

В частности, производное жирной кислоты будет происходить из природных источников, неограничивающие примеры которых включают яйца, водоросли, рыбий жир, грибок, дрожжи, семена, растения, например соя, и животные источники, например мозги крупного рогатого скота и/или молоко млекопитающих или их экстракты. Неограничивающие примеры соевых источников включают пищевую добавку соевый лецитин, неограничивающие примеры молока млекопитающих включают коровье, верблюжье, овечье, козье молоко, в том числе обезжиренное молоко. Неограничивающие экстракты молока включают белковые экстракты, мембраны жировых глобул молока (МЖГМ) и содержащие их экстракты. Производные жирных кислот могут также происходить из пальмового масла, таллового жира, полутвердого жира, хлопкового масла, арахисового масла.

Особенно может быть полезно, если производное жирной кислоты содержит насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту, выбранную из группы, состоящей из: C20:4n-6, C22:6n-3, C24:1n-9, C16:0, C18:1n-9 и C18.0. В частности, C20:4n-6, и/или C22:6n-3, и/или C18:0. Конкретнее, 22:6n-3 и/или C18:0.

C20:4n-6 является арахидоновой кислотой (далее в настоящем документе АРК или АК). C22:6n-3 является докозагексаеновой кислотой (далее в настоящем документе ДГК). 24:1n-9 является нервоновой кислотой. C18.0 является стеариновой кислотой. C16:0 является пальмитиновой кислотой. C18:1n-9 является олеиновой кислотой.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или, стеариновую кислоту. В наиболее частном случае - производное жирной кислоты, содержащее ДГК и/или стеариновую кислоту.

Производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или, АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве, составляющем до 99,999% композиции.

В частности, производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве от 15 до 350 мг/100 г сухой массы композиции, конкретнее от 30 до 300 мг/100 г сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 15 мг/100 г, выше 30 мг/100 г, выше 50 мг/100 г, выше 55 мг/100 г, в диапазоне от 30 до 300 мг/100 г, в диапазоне от 30 до 200 мг/100 г или от 30 до 150 мг/100 г, в диапазоне от 50 до 300 мг/100 г, в диапазоне от 50 до 200 мг/100 г, в диапазоне от 50 до 150 мг/100 г, в диапазоне от 150 до 350, в диапазоне от 60 до 350 мг/100 г, в диапазоне от 60 до 120 мг/100 г, в диапазоне от 100 до 110 мг/100 г. Все концентрации приведены по сухой массе композиции.

Производные жирной кислоты, содержащие стеариновую кислоту, присутствуют в природных источниках, например пальмовом масле, талловом жире, полутвердом жире, хлопковом масле, арахисовом масле.

Производные жирной кислоты, содержащие нервоновую кислоту, присутствуют в природных источниках, например маслах из семян Cardamine gracea, Heliphila longifola, Thlaspi perfoliatum, Tropaeolum speciosum, Lunaria biennis, Lunaria annua и Malania oleifera; грибках Neocallismastix frontalis, Erysiphe graminis и Sphaerotheca humuli; бактериях Pseudomonas atlantica; дрожжах Saccharomyces cerevisiae и морской диатомовой водоросли Nitzschia cylindrus.

Производные жирной кислоты, содержащие ДГК и/или АРК, присутствуют в природных источниках, таких как, например, яйцо, водоросли, гриб или рыбий жир, водоросли и в растениях.

Масла, содержащие производные жирной кислоты, которые содержат ДГК и/или АРК и обычно другие полиненасыщенные жирные кислоты (ПННЖК), в частности ЭПК (эйкозапентаеновую кислоту), могут иметь различное происхождение. Предпочтительно, производные жирной кислоты, содержащие ДГК, представлены в форме рыбьего жира, содержащего производные жирной кислоты, которые содержат ДГК и/или АРК. Разновидности рыбьего жира обычно содержат 5 мас.% или, предпочтительнее, 10 мас.% или более производных жирной кислоты, которые содержат ДГК и/или АРК. В целом также доступны масла, содержащие значительные количества производных жирной кислоты, содержащих ДГК и/или АРК, полученные из водорослей или микроорганизмов. Например, можно применять масла, собранные из водорослей, которые содержат 10 мас.% или более, например 20 мас.% или более производных жирной кислоты.

Если питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит производные жирной кислоты, содержащие АРК и ДГК. Указанные ингредиенты, например, могут содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количествах, дающих в результате массовое соотношение ДГК:АРК в диапазоне от 4:1 до 1:4, например от 3:1 до 1:3, например от 2:1 до 1:2, например от 1,5:1 до 1:1,5, в частности от 1,1:1 до 1:1,1.

Также может быть полезно, если композиция согласно настоящему изобретению содержит смесь производных жирной кислоты, при этом смесь является такой, чтобы массовое соотношение ненасыщенных жирных кислот к насыщенным жирным кислотам и/или жирнокислотным остаткам в композиции согласно настоящему изобретению было в пределах диапазона от 1:1 до 1:2; от 1:1,2 до 1:1,9, от 1:1,25 до 1:1,5; от 1:3 до 1:4.

Кроме того, если в композиции согласно настоящему изобретению содержатся высокие количества производных жирной кислоты, которые содержат ДГК и/или АРК, может быть особенно полезным, если будет повышенным общее количество производных жирной кислоты, которые содержат насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты, в частности C20/24. Такие насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты могут быть важным компонентом миелина, обеспечивающим его обвертывание и облачение вокруг аксонов. Массовое соотношение ДГК и/или АК к таким ненасыщенным длинным жирным кислотам в композиции согласно настоящему изобретению может лежать, например, в пределах диапазона от 1:1 до 1:10; от 1:2 до 1:9, от 1: 3 до 1:4,5, от 1:3,5 до 1:4,5.

Может быть особенно полезным, если композиция согласно настоящему изобретению дополнительно содержит один или более из следующих ингредиентов: витамины, и/или минералы, и/или фосфолипиды, и/или холин.

Если композиция согласно настоящему изобретению содержит производное жирной кислоты, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, и один или более из этих ингредиентов, она может иметь улучшенный эффект в том, что касается стимуляции, поддержания и/или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, и/или межнейронных связей головного мозга, и/или когнитивных способностей, и/или интеллектуальных способностей, и/или способностей к обучению, и/или когнитивной функции у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта. Это может быть связано, например, с тем, что указанные ингредиенты оказывают эффект на миелинизацию de novo в одних и тех же и/или различных сопряженных зонах головного мозга. Улучшенный эффект может быть синергетическим.

Используемый в настоящем документе термин «витамин» относится к любому витамину. Неограничивающие примеры витаминов включают витамин A, витамин B1, витамин B2, витамин B6, витамин K, витамин C, витамин D, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, фолиевую кислоту, витамин B12 и их комбинации.

Особенно эффективными витаминами могут быть фолиевая кислота, витамин B12 и витамин B6, в частности фолиевая кислота и витамин B12, в частности фолиевая кислота.

Витамин может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве от 0,001% до 99,999% композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит витамин B12 и/или фолиевую кислоту.

Фолиевая кислота может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве, составляющем от 0,001% до 99,999% композиции.

В частности, фолиевая кислота может содержаться в количестве выше 50 мкг/100 г сухой композиции, конкретнее от 50 мкг до 500 мкг/100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит фолиевую кислоту в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 50 мкг, выше 65 мкг, выше 70 мкг, выше 100 мкг, выше 110 мкг, выше 160 мкг, в диапазоне от 50 до 500 мкг, в диапазоне от 50 до 400 мкг, в диапазоне от 70 до 170 мкг, в диапазоне от 110 до 500 мкг, в диапазоне от 110 до 400 мкг, в диапазоне от 110 до 400 мкг, в диапазоне от 110 до 350 мкг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такое количество фолиевой кислоты, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 400 мкг.

Фолиевая кислота может быть включена в питательные композиции согласно настоящему изобретению сама по себе или в форме ее физиологически приемлемой соли (фолата) или их смесей.

Витамин В12 может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве, составляющем от 0,001% до 99,999% композиции.

В частности, витамин B12 может содержаться в композиции в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 0,01 мкг, в частности выше 0,04 мкг, в частности выше 0,05 мкг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит витамин B12 в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 0,01 мкг, выше 0,5 мкг, выше 0,7, выше 5, в диапазоне от 0,1 до 10 мкг, от 0,4 до 5 мкг, от 0,5 до 2 мкг, от 1 до 1,5 мкг, от 4 до 8,5 мкг, от 5 до 8 мкг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такое количество витамина B12, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 7,6 мкг/100 г сухой композиции (77,6 мкг/кг сухой композиции).

Витамин B12 может быть включен в питательные композиции согласно настоящему изобретению сам по себе, или в форме его физиологически приемлемой соли, или в виде любого источника, содержащего витамин B12. В частности, витамин B12 может быть включен в композицию в его чистой форме, в виде цианокобаламина, гидроксокобаламина и любой их комбинации.

Композиция, содержащая витамин, в частности фолиевую кислоту и/или витамин B12, может быть особенно эффективна в поддержании, стимуляции или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга в одной или более из следующих зон головного мозга: мозжечок, зрительная зона коры, двигательная и соматосенсорная зона коры. Эти зоны головного мозга ассоциированы с двигательной функцией (в том числе координацией и выполнением движения), зрительной функцией и психомоторной функцией.

Используемый в настоящем документе термин «минеральное вещество» относится к любому минеральному веществу. Неограничивающие примеры минеральных веществ включают железо, цинк, кальций, фосфор, медь, магний, йод, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром и их комбинации. Минеральные вещества обычно добавлены в форме солей.

Особенно эффективными минеральными веществами могут быть железо, цинк, кальций, фосфор, медь и магний, в частности железо.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит железо, и/или цинк, и/или кальций, и/или фосфор, и/или медь, и/или магний, в частности железо и цинк, конкретнее железо.

В одном из вариантов осуществления питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит железо. Железо может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве, составляющем до 99,999% композиции.

В частности, железо может содержаться в композиции в количестве выше 5 мг/100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит железо в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 4 мг, выше 9 мг, в диапазоне от 5 до 40 мг, в диапазоне от 9 до 40 мг, в диапазоне от 5 до 20 мг, в диапазоне от 9 до 20 мг, в диапазоне от 5 до 15 мг, в диапазоне от 9 до 15 мг, в диапазоне от 3,5 до 7 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

Железо может быть включено в композиции согласно настоящему изобретению в форме одной физиологически приемлемой соли, такой как, например, лимоннокислое железо, фосфорнокислое железо, пирофосфорнокислое железо, аскорбат железа, карбонат железа, цитрат железа, фумарат железа, глюконат железа, лактат железа, сульфат железа или их смеси.

Железо может быть включено в композицию согласно настоящему изобретению в форме физиологически приемлемого комплекса железа (такого как, например, соль железа-натрия ЭДТА) или смеси с ним.

Fe2+ является более биодоступным, и поэтому может быть более предпочтительно, если железо добавлено в композицию в форме соли или комплекса железа, например перечисленных выше в настоящем документе солей железа.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такие уровни железа, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 40 мг.

В одном из вариантов осуществления питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит цинк. Цинк может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве, составляющем до 99,999% композиции.

В частности, цинк может содержаться в композиции в количестве выше 0,08 мг, выше 0,3 мг, выше 0,5 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит цинк в количестве, выбранном из группы, состоящей из: в диапазоне от 0,5 до 8 мг, от 2 до 5,5 мг, от 2,5 до 4,5 мг, от 3 до 4 мг, от 4 до 7,5 мг, от 6 до 7,5 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такие уровни цинка, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 302,4 мг/день, или не превышала 245 мг/день, или не превышала 166 мг/день, или не превышала 98,9 мг/день, или не превышала 95,6 мг/день.

Цинк может быть включен в композиции согласно настоящему изобретению в форме физиологически приемлемой соли и/или в виде любого источника, содержащего цинк, конкретнее Zn2+, такой как, например: нитрат цинка, сульфат цинка, глюконат цинка, ацетат цинка или их смеси, или в форме физиологически приемлемого комплекса цинка (такого как, например, пикколинат цинка) или их смесей.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит медь. Медь может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве до 99,999% композиции.

В частности, медь может содержаться в композиции в количестве выше 10 мкг, выше 40 мкг, выше 60 мкг, где все значения массы приведены на 100 г сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит медь в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 100 мкг, в диапазоне от 100 до 850 мкг, от 180 до 650 мкг, от 200 до 400 мкг, от 210 до 300 мкг, от 210 до 240 мкг, от 450 до 850 мкг, от 800 до 840 мкг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такие уровни меди, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 1426 мкг/день или не превышала 488 мкг/день.

Медь может быть включена в композицию согласно настоящему изобретению сама по себе или в форме физиологически приемлемой соли и/или в виде любого источника, содержащего медь, конкретнее Cu2+. Например, медь может быть включена в композицию в виде сульфата меди, и/или глюконата меди, и/или карбоната меди, и/или цитрата меди, и/или комплекса лизина и меди.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит магний. Магний может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве до 99,999% композиции.

В частности, магний может содержаться в композиции в количестве выше 0,2 мг, выше 0,35 мг, выше 0,5 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит магний в количестве, выбранном из группы, состоящей из: в диапазоне от 0,35 до 90 мг, в диапазоне от 25 до 70 мг, от 30 до 65 мг, от 35 до 60 мг, от 40 до 50 мг, от 35 до 55 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такие уровни магния, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 110 мг/день или не превышала 65 мг/день.

Магний может быть включен в композицию согласно настоящему изобретению сам по себе или в форме физиологически приемлемой соли и/или в виде любого источника, содержащего магний, конкретнее Mg2+. Например, в форме карбоната магния, хлорида магния, оксида магния, сульфата магния, глюконата магния, гидроксида магния, магниевых солей лимонной кислоты, магниевых солей ортофосфорной кислоты.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит кальций. Кальций может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве до 99,999% композиции.

В частности, кальций может содержаться в композиции в количестве выше 0,84 мг, выше 2,52 мг, выше 4,62 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит кальций в количестве, выбранном из группы, состоящей из: в диапазоне от 84 до 760 мг, в диапазоне от 200 до 550 мг, в диапазоне от 250 до 450 мг, в диапазоне от 280 до 520, от 350 до 650 мг, от 400 до 600 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такие уровни кальция, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 482 мг/день или не превышала 477 мг/день.

Кальций может быть включен в композицию согласно настоящему изобретению сам по себе или в форме физиологически приемлемой соли и/или в виде любого источника, содержащего кальций, конкретнее Ca2+. Например, карбонат кальция, хлорид кальция, кальциевые соли лимонной кислоты, глюконат кальция, глицерофосфат кальция, лактат кальция, гидроксид кальция, кальциевые соли ортофосфорной кислоты.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит фосфор. Фосфор может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве до 99,999% композиции.

В частности, фосфор может содержаться в композиции в количестве выше 1,7 мг, выше 14,3 мг, выше 27,3 мг /100 г сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит фосфор в количестве, выбранном из группы, состоящей из: в диапазоне от 17 до 516 мг, в диапазоне от 129 до 400 мг, в диапазоне от 140 до 390 мг, в диапазоне от 150 до 370 мг, от 160 до 365 мг, в диапазоне от 270 до 350 мг, от 200 до 360 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такие уровни фосфора, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 863 мг/день или не превышала 787 мг/день.

Фосфор может быть включен в композицию согласно настоящему изобретению сам по себе или в форме физиологически приемлемой соли и/или в виде любого источника, содержащего фосфор, например фосфата кальция, вторичного кислого фосфата кальция.

Композиция, содержащая минеральное вещество, в частности одно или более из железа, цинка, меди, кальция, магния и фосфора, может быть особенно эффективна в поддержании, стимуляции или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга в одной или более из следующих зон головного мозга: мозжечка, зрительной зоны коры, двигательной и соматосенсорной зоны коры, мозолистого тела, лобной доли коры, белого вещества височной доли, внутренней капсулы, префронтальной коры, двигательной зоны коры головного мозга. Эти зоны головного мозга связаны с двигательной функцией (в том числе с координацией и выполнением движения), зрительной функцией, взаимодействием полушарий, исполнительными функциями, кратковременной памятью, решением задач, социально-эмоциональными функциями, речью, слуховой функцией, решением задач и/или кратковременной памятью.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит холин.

Термином «холин» обозначают соли четвертичного аммония, содержащие катион N,N,N-триметилэтаноламмония с показанной ниже структурой:

Холин

Противоион X^- может, в частности, представлять собой хлорид, гидроксид, цитрат, битартрат и их смеси.

Если не указано иное, в контексте настоящего изобретения термин «холин» следует понимать как обозначающий весь холин, присутствующий в питательных композициях согласно настоящему изобретению, в свободной форме (или в виде его соли).

Холин может содержаться в композиции согласно настоящему изобретению в количестве до 99,999% композиции.

В частности, холин может содержаться в композиции в количестве выше 30 мг/100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит холин в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 10 мг, выше 50 мг, выше 100 мг, выше 111 мг, выше 170 мг, в диапазоне от 30 до 1000 мг, в диапазоне от 30 до 700 мг, в диапазоне от 50 до 1000 мг, в диапазоне от 50 до 700 мг, в диапазоне от 50 до 500 мг, в диапазоне от 100 до 400 мг, в диапазоне от 170 мг до 300 мг, в диапазоне от 120 мг до 200 мг, где все значения массы приведены на 100 г сухой композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит такие уровни холина в свободной форме (или в виде его соли) или в виде производных от содержащих его структур, чтобы общая суточная норма потребления, получаемая из питательной композиции согласно настоящему изобретению, не превышала 1 г.

Холин может быть включен в композицию согласно настоящему изобретению сам по себе или в форме физиологически приемлемой соли, такой как, например, хлорид холина, цитрат холина, битартрат холина или их смеси.

Композиция, содержащая холин, может быть особенно эффективна в поддержании, стимуляции или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга в следующих зонах головного мозга: мозжечке, зрительной зоне коры, таламусе, теменной коре и лобной доле. Эти зоны головного мозга связаны с двигательной функцией (в том числе с координацией и выполнением движения), зрением, кратковременной памятью, и/или исполнительными функциями, и/или социально-эмоциональным ориентированием, и/или пространственным ориентированием.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит фосфолипид, его метаболический предшественник или метаболит.

Используемый в настоящем документе термин «фосфолипид» относится к любому фосфолипиду, и в частности соединению с формулой (I)

(I)

где:

R¹ представляет собой O;

X представляет собой NH или O;

R² представляет собой насыщенную или ненасыщенную, линейную или разветвленную C2-C44 ацильную группу;

R³ представляет собой заместитель с формулой (II) или формулой (III):

(II)

(III)

где R⁵ представляет собой насыщенную или ненасыщенную, линейную или разветвленную C2-C44 ацильную группу, и

R⁶ представляет собой насыщенную C2-C44 алкильную или алкенильную группу; и

R⁴ выбран из замещенной или незамещенной C5 или C6 циклической алкильной или алкенильной группы или —(CH2)n—R⁷, где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 4, в частности от 1 до 2, а R⁷ представляет собой —N(CH3)3+, NH3+ или заместитель с формулой (IV), и

(IV)

в частности, R⁴ представляет собой C6 циклическую алкильную или алкильную или алкенильную группу, замещенную одной или более гидроксигруппами, конкретнее R⁴ получена из инозитола (C6H12O6), и еще конкретнее миоинозитола, т.е. R⁴ представляет собой:

.

Используемый в настоящем документе термин «ациклический» относится к группе, которая не является циклической, т.е. не содержит замкнутую цепь атомов.

Неограничивающие примеры фосфолипидов включают фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и фосфатидилхолин.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фосфолипид выбран из группы, состоящей из: фосфатидилхолина, фосфатидилинозитола, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина и/или их комбинаций.

Фосфатидилинозитол представляет собой соединение с формулой (V)

(V)

где R⁸ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, и

R⁹ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R⁸ и R⁹ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенному или ненасыщенному C14-C44 жирнокислотным остаткам, и еще конкретнее R⁸ и R⁹ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенным или ненасыщенным C14-C24 жирнокислотным остаткам.

Конкретнее, R⁸ и R⁹ представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой представляют собой насыщенные или ненасыщенные C14-C24 жирнокислотные остатки, где жирные кислоты, из которых происходят жирнокислотные остатки, выбраны из группы, состоящей из: C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C20:0, C20:3, C20:4, C21:0, C22:0, C23:0, C24:0, C18:1n-9, C18:2n-6 и C24:1n-9. Еще конкретнее, C18:0, C18:1n-9, C18:2, C20:3 и C20:4.

Как будет понятно специалисту в данной области техники. Используемый в настоящем документе термин фосфатидилсерин относится к фосфатидил-L-серину.

Фосфатидилсерин представляет собой соединение с формулой (VI)

(VI)

где R¹⁰ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, и

R¹¹ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R¹⁰ и R¹¹ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенному или ненасыщенному C14-C44 жирнокислотным остаткам, и еще конкретнее R¹⁰ и R¹¹ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенным или ненасыщенным C14-C24 жирнокислотным остаткам.

Конкретнее, R¹⁰ и R¹¹ представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой представляют собой насыщенные или ненасыщенные C14-C24 жирнокислотные остатки, где жирные кислоты, из которых получают жирнокислотные остатки, выбраны из группы, состоящей из: C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C20:0, C20:3, C20:4, C21:0, C22:0, C23:0, C24:0, C18:1n-9, C18:2n-6 и C24:1n-9. Еще конкретнее, C18:0, C18:1n-9, C20:4 и C22:6.

Фосфатидилэтаноламин представляет собой соединение с формулой (VII)

(VII)

где R¹² представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, и

R¹³ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R¹² и R¹³ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенному или ненасыщенному C14-C44 жирнокислотным остаткам, и еще конкретнее R¹² и R¹³ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенному или ненасыщенному C14-C24 жирнокислотным остаткам.

Используемый в настоящем документе термин «сфингомиелин» относится к липидной молекуле или смеси липидных молекул, где сфингозиновый или сфинганиновый остов этерифицированы жирнокислотным остатком на аминогруппе (-NH2) посредством амидной связи, и где гидроксильная группа в положении 1 сфингозинового остова присоединена к фосфорилхолиновому фрагменту.

В частности, сфингомиелин представляет собой соединение с формулой (VIII) или смесь соединений с формулой (VIII)

(VIII)

где

R¹⁴ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу,

R¹⁵ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R¹⁴ представляет собой разветвленную или неразветвленную C13-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, которая вместе с соседней карбонильной группой соответствует насыщенному или ненасыщенному C14-C44 жирнокислотному остатку.

Неограничивающие примеры насыщенных или ненасыщенных C14-C44 жирных кислот, из которых может быть получен жирнокислотный остаток, включают: C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C20:0, C21:0, C22:0, C23:0, C24:1, C25:0, C28:1, C30:2, C30:1, C30:0, C32:3, C32:2, C32:1, C32:0, C33:1, C34:3, C34:2, C34:1, C34:0, C35:2, C35:0, C36:4, C36:3, C36:2, C36:1, C36:0, C37:1, C37:0, C38:4, C38:3, C38:1, C38:0, C39:1, C39:0, C40:2, C40:1, C40:0, C41:2, C41:1, C41:0, C42:47, C42:3, C42:2, C42:1, C42:0, C44:3, C44:1.

Еще конкретнее, R¹⁴ представляет собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, которая вместе с ее соседней карбонильной группой представляет собой насыщенный или ненасыщенный C14-C24 жирнокислотный остаток, где жирная кислота, из которой произошел жирнокислотный остаток, выбрана из группы, состоящей из: C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C20:0, C21:0, C22:0, C23:0, C24:0, C18:1n-9, C18:2n-6 и C24:1n-9.

Даже еще конкретнее, сфингомиелин представляет собой смесь соединений с формулой (VIII), где смесь является такой, чтобы общее число жирнокислотных остатков (R¹⁴ вместе с соседней карбонильной группой), содержащихся в смеси, представляли собой преимущественно насыщенные жирные кислоты, а наименее преобладающими были ненасыщенные жирные кислоты. Конкретнее, смесь будет такой, чтобы от 80% до 96% указанных жирнокислотных остатков в смеси представляли собой насыщенные жирные кислоты, в частности C14, C15, C16, C18, C20, C22, C23, C24 насыщенные жирные кислоты, конкретнее C16, C18, C20, C22 и C24.

Фосфатидилхолин представляет собой соединение с формулой (IX)

(IX)

где R¹⁶ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, и

R¹⁷ представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R¹⁶ и R¹⁷ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенному или ненасыщенному C14-C44 жирнокислотным остаткам, и еще конкретнее R¹⁶ и R¹⁷ независимо друг от друга представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой соответствуют насыщенному или ненасыщенному C14-C24 жирнокислотным остаткам.

Конкретнее, R¹⁶ и R¹⁷ представляют собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группы, которые вместе с их соседней карбонильной группой представляют собой насыщенный или ненасыщенный C14-C24 жирнокислотные остатки, где жирные кислоты, из которых получают жирнокислотные остатки, выбраны из группы, состоящей из: C14:0, C15:0, C16:0, C16:1, C18:0, C20:0, C20:1, C20:3, C20:4, C21:0, C22:0, C22:6, C23:0, C24:0, C18:1n-9, C18:2n-6 и C24:1n-9. Еще конкретнее C14:0, C16:0, C18:0, C18:1n-9, C18:2n-6, C20:1, C20:3, C20:4 и C22:6.

Фосфолипид, его метаболический предшественник и/или метаболит может содержаться в композиции в количестве до 99,999% композиции.

В частности, сфингомиелин, его метаболический предшественник и/или метаболит может содержаться в композиции в количестве до 99,999% композиции.

Конкретнее, композиция будет содержать сфингомиелин в количестве выше 200 мг/кг сухой массы композиции, конкретнее в диапазоне от 200 мг до 2,5 г/кг сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция содержит сфингомиелин в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 200 мг/кг, выше 300 мг/кг, в диапазоне от 200 мг до 2,5 г/кг, в диапазоне от 200 мг до 2 г/кг, в количестве в диапазоне от 300 мг до 1,5 г/кг или от 400 мг до 1 г/кг, в диапазоне от 200 до 850 мг/кг или от 300 до 820 мг/кг. При этом все значения массы приведены по сухой массе композиции.

В частности, фосфатидилхолин, его метаболический предшественник и/или метаболит может содержаться в композиции в количестве до 99,999% композиции.

Конкретнее, композиция будет содержать фосфатидилхолин в количестве выше 200 мг/кг сухой массы композиции, конкретнее в диапазоне от 200 мг до 2,5 г/кг сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция содержит фосфатидилхолин в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 200 мг/кг, выше 300 мг/кг, выше 400 мг/кг, в диапазоне от 200 мг до 2,5 г/кг, в диапазоне от 200 мг до 2 г/кг, в количестве в диапазоне от 300 мг до 1,5 г/кг или от 400 мг до 1 г/кг, от 500 мг до 1,3 г/кг. При этом все значения массы приведены по сухой массе композиции.

В частности, фосфатидилинозитол, его метаболический предшественник и/или метаболит может содержаться в композиции в количестве до 99,999% композиции.

Конкретнее, композиция будет содержать фосфатидилинозитол в количестве выше 500 мг/кг сухой массы композиции, конкретнее в диапазоне от 200 мг до 1,5 г/кг сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция содержит фосфатидилинозитол в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 200 мг/кг, выше 300 мг/кг, в диапазоне от 200 мг до 2,5 г/кг, в диапазоне от 200 мг до 2 г/кг, в количестве в диапазоне от 250 мг до 800 мг /кг, или от 400 мг до 1,5 г/кг, или от 400 до 800 мг/кг. При этом все значения массы приведены по сухой массе композиции.

В частности, фосфатидилсерин, его метаболический предшественник и/или метаболит может содержаться в композиции в количестве до 99,999% композиции.

Конкретнее, композиция будет содержать фосфатидилсерин в количестве выше 50 мг/кг сухой массы композиции, выше 200 мг/кг сухой массы композиции, конкретнее в диапазоне от 150 мг до 1,5 г/кг сухой массы композиции, от 200 мг до 1 г/кг сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция содержит фосфатидилсерин в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 150, выше 200 мг/кг, выше 300 мг/кг, в диапазоне от 200 мг до 2,5 г/кг, в диапазоне от 200 мг до 2 г/кг, в количестве в диапазоне от 250 мг до 1000 мг/кг или от 400 мг до 1 г/кг. При этом все значения массы приведены по сухой массе композиции.

В частности, фосфатидилэтаноламин, его метаболический предшественник и/или метаболит может содержаться в композиции в количестве до 99,999% композиции.

Конкретнее, композиция будет содержать фосфатидилэтаноламин в количестве выше 150 мг/кг сухой массы композиции, выше 200 мг/кг сухой массы композиции, конкретнее в диапазоне от 150 мг до 1,5 г/кг сухой массы композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция содержит фосфатидилэтаноламин в количестве, выбранном из группы, состоящей из: выше 170 мг/кг, выше 180 мг/кг, выше 200 мг/кг, в диапазоне от 200 мг до 2,5 г/кг, в диапазоне от 200 мг до 2 г/кг, в количестве в диапазоне от 250 мг до 800 мг /кг или от 200 мг до 1 г/кг. При этом все значения массы приведены по сухой массе композиции.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит фосфолипиды, в том числе фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и фосфатидилхолин, так чтобы общая концентрация не превышала 15,4 г/кг.

При применении метаболического предшественника и/или метаболита одного или более фосфолипидов в композиции вместо фосфолипида или в комбинации с ним указанные соединения можно применять в таких количествах, чтобы уровень фосфолипидов, физиологически доставляемых указанной композицией, соответствовал уровням, приведенным выше в настоящем документе. Определение соответствующих количеств хорошо известно специалисту в данной области техники.

Используемый в настоящем документе термин метаболический предшественник и/или метаболит одного или более фосфолипидов не включает холин.

Не имеющими ограничительного характера примерами метаболических предшественников и/или метаболита фосфолипидов, в частности сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилинозитола, фосфатидилсерина и/или фосфатидилэтаноламина, являются галактоцерамиды, глюкоцерамиды, сфингозин, сфингозин-1-фосфат, церамид, D-эритро-дигидроцерамид и церамид-1-фосфат и ганглиозиды.

Особенно эффективными фосфолипидами могут быть фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и/или сфингомиелин, в частности сфингомиелин.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фосфолипидом является фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, сфингомиелин и/или метаболический предшественник и/или метаболит любого из вышеперечисленных и/или комбинации любых из вышеперечисленных. В частности, фосфолипидом является сфингомиелин, его метаболический предшественник и/или метаболит.

В число особенно эффективных метаболических предшественников и/или метаболита фосфолипидов, в частности сфингомиелина, входят церамид, и ганглиозиды, и церамид-1-фосфат, и d-эритро-дигидроцерамид.

Термин «церамид» обозначает липидную молекулу, где сфингозиновый или сфинганиновый остов этерифицированы жирнокислотным остатком посредством амидной связи. Если в настоящем описании используют термин церамид, он может обозначать отдельный вид церамида, а также смесь отдельных видов церамида.

В частности, церамид представляет собой соединение с формулой (IXa) или смесь соединений с формулой (IXa)

(IXa)

где:

R^16a представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

R^17a представляет собой разветвленную или неразветвленную C2-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу.

Конкретнее, R^16a представляет собой разветвленную или неразветвленную C13-C43 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, которая вместе с соседней карбонильной группой соответствует насыщенному или ненасыщенному C14-C44 жирнокислотному остатку.

Неограничивающие примеры насыщенных или ненасыщенных C14-C44 жирных кислот, из которых может быть получен жирнокислотный остаток, включают: C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C20:0, C21:0, C22:0, C23:0, C24:1, C25:0, C28:1, C30:2, C30:1, C30:0, C32:3, C32:2, C32:1, C32:0, C33:1, C34:3, C34:2, C34:1, C34:0, C35:2, C35:0, C36:4, C36:3, C36:2, C36:1, C36:0, C37:1, C37:0, C38:4, C38:3, C38:1, C38:0, C39:1, C39:0, C40:2, C40:1, C40:0, C41:2, C41:1, C41:0, C42:47, C42:3, C42:2, C42:1, C42:0, C44:3, C44:1.

Еще конкретнее, R^16a представляет собой разветвленную или неразветвленную C13-C23 ациклическую алкильную или ациклическую алкенильную группу, которая вместе с ее соседней карбонильной группой соответствует насыщенному или ненасыщенному C14-C24 жирнокислотному остатку, где жирная кислота, из которой произошел жирнокислотный остаток, выбрана из группы, состоящей из: C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C20:0, C21:0, C22:0, C23:0, C24:0, C18:1n-9, C18:2n-6 и C24:1n-9, а конкретнее из группы, состоящей из C16:0, C18:0, C20:0, C22:0 и C24:0.

Еще конкретнее, церамид представляет собой смесь соединений с формулой (IXa), где смесь является такой, чтобы общее число жирнокислотных остатков (R^16a вместе с соседней карбонильной группой), содержащихся в смеси, представляли собой преимущественно насыщенные жирные кислоты, а наименее преобладающими были ненасыщенные жирные кислоты. Конкретнее, смесь будет такой, чтобы от 80% до 96% указанных жирнокислотных остатков в смеси представляли собой насыщенные жирные кислоты, в частности C14, C15, C16, C18, C20, C22, C23, C24 насыщенные жирные кислоты, конкретнее C16, C18, C20, C22 и C24.

Используемый в настоящем документе термин «ганглиозид» означает молекулу олигогликозилцерамидного липида, содержащую остаток церамида с формулой IXa, определение которой дано в настоящем документе. Если в настоящем описании используют термин ганглиозид, он может обозначать отдельный вид ганглиозида, а также смесь отдельных видов ганглиозида, содержащих остаток церамида формулы IXa, определение которой дано в настоящем документе.

Особенно эффективными ганглиозидами могут быть ганглиозиды по типу могосиалоганглиозидов-3 (GM3) и/или ганглиозиды по типу дисиалоганглиозидов 3 (GD3).

Церамид-1-фосфат и d-эритро-дигидроцерамид содержат остаток церамида с формулой IXa, определение которой дано в настоящем документе.

Ганглиозиды и/или церамиды, и/или церамид-1-фосфат и/или d-эритро-дигидроцерамид, могут содержаться в композиции в любом количестве.

Особенно эффективными могут быть концентрации в диапазоне 2-11,5 мг/100 г GD3 и/или GM3.

Сфингомиелин можно синтезировать из церамида и фосфатидилхолина, соответственно, может быть особенно предпочтительно, если церамид и/или один или более ганглиозид применяют в комбинации с фосфатидилхолином, его метаболическим предшественником или метаболитом.

Фосфолипид, его метаболические предшественники и/или метаболит, содержащиеся в композиции согласно настоящему изобретению, могут быть естественными, синтетическими или их смесью. В композиции согласно настоящему изобретению указанные метаболические предшественники и/или метаболит можно применять в их чистой форме или практически чистой форме. Альтернативно, их можно добавить в форме содержащего их источника.

В настоящем изобретении можно применять любой источник его метаболических предшественников и/или метаболита, подходящий для потребления субъектом, которому данная композиция предназначена для употребления.

В частности, фосфолипид, его метаболический предшественник или метаболит будет поступать из естественных источников, неограничивающие примеры которых включают яйца, сою, коровьи мозги и/или молоко млекопитающих или их экстракты. Неограничивающие примеры соевых источников включают пищевую добавку соевый лецитин; неограничивающие примеры молока млекопитающих включают коровье, верблюжье, овечье, козье молоко, в том числе обезжиренное молоко. Неограничивающие экстракты молока включают белковые экстракты, например сывороточный белок и казеин, мембраны жировых глобул молока (МЖГМ) и содержащие их экстракты.

Особенно пригодным источником фосфолипидов, их метаболического предшественника или метаболита, в частности сфингомиелина, который можно применять в настоящем изобретении, может быть концентрат сывороточного белка коровьего молока, обогащенный альфа-лактальбумином, и/или неочищенный альфа-лактальбумин, который был экстрагирован из сывороточного белка молока, в частности сывороточного белка коровьего молока.

Альфа-лактальбумин является высококачественным, легкоусваиваемым, например младенцами, сывороточным белком и является основным белком, который встречается в ГМ (грудном молоке). Благодаря высокому содержанию незаменимых аминокислот, особенно триптофана, альфа-лактальбумин и/или обогащенная альфа-лактальбумином фракция молока идеально подходят для применения в детских смесях с низким содержанием белка. Несмотря на то, что альфа-лактальбумин сам по себе является белком, неочищенные источники могут содержать сфингомиелин.

В одном из вариантов осуществления фосфолипид, его метаболический предшественник или метаболит, в частности сфингомиелин, применяют в форме концентрата сывороточного белка, обогащенного альфа-лактальбумином, или в виде альфа-лактальбумина.

В более конкретном варианте осуществления применяют обогащенный альфа-лактальбумином концентрат коровьего сывороточного белка или альфа-лактальбумин, имеющий содержание фосфолипидов, в частности содержание сфингомиелина, превышающее 500 мг/100 г, 900 мг/100 г, 1000 мг/100 г сухой массы композиции.

Другим особенно полезным источником фосфолипидов, их метаболического предшественника или метаболита может быть мембрана жировых глобул молока (далее в настоящем документе МЖГМ) или содержащие их экстракты, в частности МЖГМ, или содержащие их экстракты из коровьего молока. Особенно предпочтительным может быть, если МЖГМ или содержащие ее экстракты содержат по меньшей мере 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% фосфолипидов и/или по меньшей мере 0,1%, 0,2%, от 0,5% до 5%, от 0,8% до 3%, от 1% до 2%, 1,6%, 1,9%, 1,8% фосфатидилхолина, фосфатидилинозитола, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина и/или сфингомиелина. МЖГМ также может дополнительно содержать магний, фосфор и/или кальций, в частности в концентрациях в диапазоне от 0,05% до 2%, от 0,1% до 0,4%.

Композиция согласно настоящему изобретению, содержащая фосфолипид и/или его метаболический предшественник и/или метаболит, в частности сфингомиелин, фосфатидилхолин и/или фосфатидилинозитол, может быть особенно эффективна при поддержании, стимуляции или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга в одной или более из следующих зон головного мозга: мозжечок, зрительная зона коры, мозолистое тело, внутренняя капсула, лобная доля, теменная доля, височная доля, двигательная зона коры головного мозга, лобная доля коры. Эти зоны головного мозга связаны с одним или более из следующего: зрением, двигательной функцией (в том числе координацией и выполнением движения), взаимодействием полушарий, речевой функцией, слуховой функцией (в том числе прислушиванием и внимательностью), кратковременной памятью, исполнительными функциями, в том числе решением задач, социальным взаимодействием и поведенческим взаимодействием, пространственным ориентированием и речью.

Специалист в данной области техники может выявить соответствующие количества вышеупомянутых питательных веществ, их метаболических предшественников или метаболитов, исходя из природы, назначения, целевого субъекта и дозировки композиции, например, как много раз в день композиция должна употребляться субъектом. Как правило, эффективная доза будет зависеть от возраста, размера и состояния здоровья субъекта, от образа жизни субъекта, от количеств питательных веществ в композиции и, возможно, от пола субъекта. Дозировка композиции должна быть такой, чтобы композиция удовлетворяла потребности в калориях, питательных веществах и питательных микроэлементах для поддержания нормального роста и развития субъекта.

Эффективной дозой может быть любая доза, которая стимулирует, поддерживает или оптимизирует миелинизацию de novo, в частности траекторию миелинизации de novo, и/или структуру головного мозга, и/или межнейронные связи головного мозга, и/или интеллектуальные способности, и/или когнитивные способности, и/или способности к обучению, и/или когнитивное функционирование у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта.

Для детской смеси или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет специалист в данной области может за основу взять количества или соотношения раскрытых в настоящем документе соединений или питательных веществ, например производных жирной кислоты, исходя из тех количеств, которые содержатся в человеческом грудном молоке, вырабатываемом для младенца или ребенка в таком же возрасте, в частности у получающей полный набор питательных веществ матери.

Специалист в данной области техники без труда сможет определить эффективную дозу на основе изложенной в настоящем документе информации и доступных в области техники знаний.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит производное жирной кислоты, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновой кислоты, и/или стеариновой кислоты, и витамин, в частности B12 и/или фолиевую кислоту, и/или фосфолипид, в частности фосфатидилхолин, и/или фосфатидилсерин, и/или фосфатидилинозитол, и/или сфингомиелин, и/или метаболический предшественник или метаболит любого из вышеперечисленных, и/или минеральное вещество, в частности железо, и/или цинк, и/или кальций, и/или фосфор, и/или магний, и/или холин.

Особенно предпочтительными концентрациями/количествами указанных ингредиентов в указанной композиции могут быть сфингомиелин в количестве по меньшей мере 300 или 420 мг/кг, в частности более 800 мг/кг, и конкретнее более 900 мг/кг, фосфатидилхолин в количестве по меньшей мере 1000 мг/кг, фосфатидилсерин в количестве по меньшей мере 900 мг/кг, фосфатидилинозитол в количестве по меньшей мере 700 мг/кг, фолиевая кислота в количестве по меньшей мере 140 мг/кг, конкретнее по меньшей мере 160 мг/кг, витамин B12 в количестве по меньшей мере 2,34 мкг/100 г, в частности более 5 мкг/100 г, конкретнее 7 мкг/100 г, железо в количестве по меньшей мере 6 мг/100 г или по меньшей мере 8,6 мг/100 г, конкретнее 11,5 мг/100 г, еще конкретнее более 16 мг/кг, холин в количестве по меньшей мере 124 мг/кг, конкретнее 140 мг/кг, производное жирной кислоты, содержащее ДГК, в количестве по меньшей мере 89 мг/100 г, производное жирной кислоты, содержащее АК, в количестве по меньшей мере 89 мг/100 г или по меньшей мере 175 мг/100 г, цинк в количестве по меньшей мере 4 или по меньшей мере 4,7 мг/100 г, конкретнее 7 мг/100 г, кальций в количестве по меньшей мере 200 мг или по меньшей мере 500 мг/100 г, фосфор в количестве по меньшей мере 140 мг/100 г или по меньшей мере 350 мг/100 г, медь в количестве по меньшей мере 250 мкг/100 г или по меньшей мере 600 мкг/100 г, магний в количестве по меньшей мере 30 мг/100 г или по меньшей мере 50 мг/100 г. При этом все значения массы приведены по сухой массе композиции.

Концентрацию, находящуюся в пределах установленной допустимой погрешности для любой аналитической методики, применяемой для измерения концентрации одного или более из вышеупомянутых ингредиентов, следует рассматривать как попадающую в пределы изложенных в настоящем документе концентраций.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит производное жирной кислоты, содержащее ДГК и/или АРК, витамин B12 и/или фолиевую кислоту, сфингомиелин и/или их метаболический предшественник или метаболит, железо и холин.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит производное жирной кислоты, содержащее ДГК и/или АРК, витамин B12 и/или фолиевую кислоту, сфингомиелин и/или железо.

В более конкретном варианте осуществления композиция согласно настоящему изобретению содержит производное жирной кислоты, содержащее ДГК в концентрации 1023 мг/кг, АРК в концентрации 1023 мг/кг, витамин B12 в концентрации 54 мкг/кг, фолиевую кислоту в концентрации 1698 мкг/кг, сфингомиелин в концентрации 814 мг/кг и железо в концентрации 67 мг/кг.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть композицией любого типа, подходящей для непосредственного введения субъекту.

В частности, композиция будет представлять собой синтетическую питательную композицию.

Используемый в настоящем документе термин «питательная композиция» относится к синтетической композиции, которая снабжает питанием субъекта. Такую питательную композицию можно принимать энтерально, парентерально или внутривенно. В частности, композицию будут принимать энтерально, и конкретнее - перорально.

В одном из вариантов осуществления согласно настоящему изобретению указанная композиция будет представлять собой синтетическую питательную композицию, выбранную из группы, состоящей из: молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, детской смеси или композиции для младенцев, которая предназначена для добавления в человеческое грудное молоко (далее в настоящем документе «ГМ») или разведения в нем, например обогатителя ГМ, или продукта питания, предназначенного для употребления младенцем и/или ребенком либо отдельно, либо в комбинации с ГМ, например прикорма.

Композиции согласно настоящему изобретению также могут содержать любые другие ингредиенты или вспомогательные вещества, которые, как известно, можно использовать в этом типе рассматриваемой композиции, например в детской смеси.

Неограничивающие примеры таких ингредиентов включают: белки, аминокислоты, углеводы, олигосахариды, липиды, пребиотики или пробиотики, нуклеотиды, нуклеозиды, другие витамины, минеральные вещества и другие микроэлементы.

В одном типичном варианте осуществления настоящего изобретения композиция будет содержать источник белков, источник липидов и источник углеводов.

Например, такая композиция может содержать белок в диапазоне от приблизительно 2 до 6 г/100 ккал, липиды в диапазоне от приблизительно 1,5 до 3 г/100 ккал и/или углеводы в диапазоне от приблизительно 1,7 до 12 г/100 ккал.

Если композиция представляет собой жидкость, ее энергетическая плотность может составлять от 60 до 75 ккал/100 мл.

Если композиция представляет собой твердое вещество, ее энергетическая плотность может составлять от 60 до 75 ккал/100 мл.

Предполагается, что тип белка не имеет большого значения для настоящего изобретения. Тем не менее, в случае синтетических композиций для младенцев и/или детей, например детской смеси или молочных смесей для детей от 1 до 3 лет, указанный белок должен поддерживать рост младенца и/или ребенка таким образом, чтобы указанный младенец и/или ребенок мог придерживаться кривых роста, типичных для его генетического фона, массы при рождении и состояния здоровья.

Неограничивающие примеры белков включают: казеин, альфа-лактальбумин, молочную сыворотку, бета-лактоглобулин, белок сои, белок риса, белок кукурузы, белок овса, белок ячменя, белок пшеницы, белок ржи, белок гороха, яичный белок, белок семян подсолнечника, белок картофеля, белок рыбы, белок мяса, лактоферрин, сывороточный альбумин, иммуноглобулины и их комбинации.

Неограничивающие примеры аминокислот включают лейцин, треонин, тирозин, изолейцин, аргинин, аланин, гистидин, изолейцин, пролин, валин, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, L-серин, аргинин, лизин, метионин, фенилаланин, триптофан, аспарагин, аспарагиновую кислоту и их комбинации.

Не имеющие ограничительного характера примеры углеводов включают лактозу, сахарозу, мальтодекстрин, крахмал и их комбинации.

Неограничивающие примеры липидов включают: пальмовый олеин, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, масло канолы, рыбий жир, кокосовое масло, жир коровьего молока и их комбинации.

Особенно полезным может быть, если композиция будет содержать жир в количестве от 25 до 30 г/100 г сухой массы композиции.

Неограничивающие примеры незаменимых жирных кислот включают: линолевую кислоту (ЛК), α-линоленовую кислоту (AЛК). Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать ганглиозиды: моносиалоганглиозид-3 (GM3) и дисиалоганглиозиды 3 (GD3), и их комбинации.

Неограничивающие примеры пребиотиков включают: олигосахариды, необязательно содержащие фруктозу, галактозу, маннозу; пищевые волокна, в частности растворимые волокна, волокна сои; инулин и их комбинации. Предпочтительные пребиотики представляют собой фруктоолигосахариды (FOS), галактоолигосахариды (GOS), изомальтоолигосахариды (IMO), ксилоолигосахариды (XOS), арабиноксилоолигосахариды (AXOS), маннанолигосахариды (MOS), соевые олигосахариды, гликозилсахарозу (GS), лактосахарозу (LS), лактулозу (LA), палатинозаолигосахариды (PAO), мальтоолигосахариды, смолы и/или их гидролизаты, пектины и/или их гидролизаты и комбинации вышеперечисленного.

Дополнительные примеры олигосахаридов описаны в публикации Wrodnigg, T. M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38:827–828, а также в WO 2012/069416, которые включены в настоящий документ путем ссылки.

Неограничивающие примеры пробиотиков включают: Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Kluyveromyces, Saccharoymces, Candida, в частности выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus lactis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii или их смесей, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC3001 (ATCC BAA-999), Bifidobacterium longum NCC2705 (CNCM I-2618), Bifidobacterium longum NCC490 (CNCM I-2170), Bifidobacterium lactis NCC2818 (CNCM I-3446), Bifidobacterium breve strain A, Lactobacillus paracasei NCC2461 (CNCM I-2116), Lactobacillus johnsonii NCC533 (CNCM I-1225), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC53103), Lactobacillus rhamnosus NCC4007 (CGMCC 1.3724), Enterococcus faecium SF 68 (NCC2768; NCIMB10415) и их комбинаций.

Неограничивающие примеры нуклеотидов включают: цитидинмонофосфат (ЦМФ), уридинмонофосфат (УМФ), аденозинмонофосфат (АМФ), гуанозинмонофосфат (ГМФ) и их комбинации.

Другие подходящие и желательные ингредиенты питательных композиций, которые можно использовать в питательной композиции согласно настоящему изобретению, могут быть описаны в руководящих указаниях Кодекса пищевых международных стандартов Codex Alimentarius в отношении рассматриваемого типа питательной композиции, например детской смеси, обогатителя ГМ, смеси для прикармливаемых детей, продуктов питания, предназначенных для употребления младенцами, например прикорма.

В еще одном более конкретном варианте осуществления композиция согласно настоящему изобретению представляет собой детскую смесь с композицией, изложенной в примере 5 и, в частности, в таблице 10a.

Синтетическую питательную композицию, например детскую смесь, для применения в настоящем изобретении, можно получать любым подходящим образом. Например, детскую смесь можно получать путем смешивания вместе источника белков, источника углеводов и источника жиров в соответствующих пропорциях. В случае использования в смесь можно включать эмульгаторы. На данном этапе можно добавлять любые витамины и любые минеральные вещества, но обычно их добавляют позднее во избежание термического разложения. Перед перемешиванием можно растворять любые липофильные витамины, эмульгаторы и т.п. в источнике жира. Затем можно примешивать воду, предпочтительно воду, очищенную обратным осмосом, с образованием жидкой смеси. Затем жидкую смесь можно подвергать термической обработке для снижения бактериальных нагрузок. Например, жидкую смесь можно быстро нагревать до температуры в диапазоне от приблизительно 80°C до приблизительно 110°C в течение от приблизительно 5 секунд до приблизительно 5 минут. Это можно осуществлять путем нагнетания пара или с помощью теплообменника; например пластинчатого теплообменника. Затем жидкую смесь можно охлаждать до температуры от приблизительно 60°C до приблизительно 85°C; например, путем резкого охлаждения. После этого жидкую смесь можно гомогенизировать; например в две стадии: под давлением от приблизительно 7 МПа до приблизительно 40 МПа на первой стадии и от приблизительно 2 МПа до приблизительно 14 МПа на второй стадии. Затем гомогенизированную смесь можно дополнительно охладить для добавления любых термочувствительных компонентов, таких как витамины и минералы. На данном этапе для удобства стандартизируют рН и содержание твердых веществ в гомогенизированной смеси. Гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, такой как распылительная сушилка или сублимационная сушилка, и превращают в порошок. Влагосодержание порошка должно составлять менее приблизительно 5 мас.%. Если необходимо добавить пробиотик (-и), то его (их) можно культивировать в соответствии с любым подходящим способом и готовить для добавления к детской смеси путем, например, сушки сублимацией или сушки распылением. Альтернативно, бактериальные препараты можно приобретать у специализированных поставщиков, таких как Christian Hansen и Morinaga, уже в готовой подходящей форме для добавления в продукты питания, такие как детская смесь. Такие бактериальные препараты можно добавлять к порошковой детской смеси путем сухого смешивания.

Как очевидно из вышеприведенного раскрытия, композицию согласно настоящему изобретению можно применять для стимуляции, поддержания или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, и/или межнейронных связей головного мозга, и/или интеллектуальных способностей, и/или когнитивных способностей, и/или способностей к обучению, и/или когнитивного функционирования у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ стимуляции, поддержания или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, и/или межнейронных связей головного мозга, и/или интеллектуальных способностей, и/или когнитивных способностей, и/или способностей к обучению, и/или когнитивного функционирования у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта, при этом указанный способ включает кормление указанного субъекта композицией, содержащей производное жирной кислоты, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, определение которому дано в настоящем документе.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая производное жирной кислоты, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, определение которому дано в настоящем документе, для применения при производстве композиции для стимуляции, поддержания или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга, и/или межнейронных связей головного мозга, и/или интеллектуальных способностей, и/или когнитивных способностей, и/или способностей к обучению, и/или когнитивного функционирования у субъекта, в частности вскармливаемого смесью субъекта.

Особенно полезным может быть, если композицию согласно настоящему изобретению вводят младенцу возрастом 9 месяцев или менее, в частности возрастом 6 месяцев или менее, конкретнее возрастом 3 месяца или менее.

Не имеющими ограничительного характера примерами возраста 3 месяца или менее являются до 2 недель, до 1 месяца, до 2 месяцев, до 3 месяцев, 1-3 месяца.

Эффекты описываемой в настоящем документе композиции согласно настоящему изобретению могут иметь долгосрочные преимущества для здоровья. Деменция, например болезнь Альцгеймера, приводит к снижению когнитивной способности субъекта и к снижению исполнительных функций, например, думать и запоминать, а также к эмоциональным и речевым проблемам. Риск субъекта, страдающего деменцией, в частности болезнью Альцгеймера, связан с интеллектуальными способностями или интеллектом человека. Соответственно, при оптимизации интеллектуальных, когнитивных способностей и/или способностей к обучению у субъекта может быть уменьшен у субъекта риск развития деменции, в частности болезни Альцгеймера. Указанный долгосрочный эффект может проявиться лишь спустя годы, например, 40, 50, 60, 70, 80, 90 лет.

Кроме того, со структурой мозга связаны различные психиатрические и/или неврологические расстройства, например беспокойство, депрессия, аутизм и шизофрения. При стимуляции, поддержании или оптимизации миелинизации de novo, в частности траектории миелинизации de novo, и/или структуры головного мозга у субъекта можно предупредить развитие психиатрических и/или неврологических расстройств, например беспокойства, депрессии, аутизма и шизофрении, или уменьшить риск их развития, или уменьшить тяжесть указанного (указанных) состояния (состояний). Указанный эффект может проявиться лишь спустя годы, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 лет.

Если не указано иное, все приводимые в настоящем документе процентные значения приведены по массе.

В контексте настоящего изобретения термины «содержащий» или «содержит» не исключают других возможных элементов. Композиция согласно настоящему изобретению, включая многие варианты осуществления, описанные в настоящем документе, может содержать существенные элементы и ограничения настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, а также любые дополнительные или необязательные ингредиенты, компоненты или ограничения, описанные в настоящем документе, или иные в зависимости от потребностей, состоять или фактически состоять из них.

Как будет очевидно специалисту в данной области техники, те же преимущества, которые раскрыты в настоящем документе, можно получить при взятии производного жирной кислоты, в частности производного жирной кислоты, содержащего ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, непосредственно, а не в форме композиции. Соответственно, производное жирной кислоты, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, можно использовать непосредственно вместо композиции согласно настоящему изобретению в любом изложенном в настоящем документе способе или применении.

Как будет также очевидно специалисту в данной области техники, особенно полезным может быть, если указанное производное жирной кислоты, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислота, будут вводить, т.е. употреблять отдельно, последовательно и/или одновременно с одним или более из следующих ингредиентов: холином и/или витамином, в частности фолиевой кислотой и/или витамином B12, минеральным веществом, в частности железом, и/или цинком, и/или кальцием, и/или фосфором, и/или магнием, и/или медью, и/или фосфолипидом, в частности фосфатидилхолином, фосфатидилсерином, фосфатидилинозитолом и/или сфингомиелином.

Все детали настоящего изобретения в равной степени применимы к композиции, содержащей производное жирной кислоты, в частности производное жирной кислоты, содержащее ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту, и к непосредственному применению производного жирной кислоты, в частности производного жирной кислоты, содержащего ДГК, и/или АРК, и/или нервоновую кислоту, и/или стеариновую кислоту.

Следует понимать, что все признаки настоящего изобретения, раскрытые в настоящем документе, можно свободно комбинировать и что изменения и модификации можно вносить без отступления от объема настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения. Кроме того, если существуют известные эквиваленты конкретных признаков, такие эквиваленты включены так, как если бы они конкретно были упомянуты в данном описании.

Используемые в настоящем документе термины «в частности» или «конкретнее» не следует рассматривать как ограничительные, но следует интерпретировать как синонимы с терминами «например» или «в особенности».

Ниже представлен ряд не имеющих ограничительного характера примеров, которые иллюстрируют изобретение.

Экспериментальный раздел:

Способы, определения и материалы

МРТ (магнитно-резонансная томография): МРТ-сканы головного мозга младенцев и детей возрастом 0-5 лет получали с помощью методики визуализации белого вещества. С помощью данной методики получают количественный показатель, водную фракцию миелина (ВФМ), который является суррогатным маркером содержания миелина в головном мозге. При картировании в зависимости от времени на протяжении детства можно получить траектории миелинизации.

Композиция детской смеси: шесть детских смесей, которыми кормили младенцев, принимавших участие в исследовании, анализировали в отношении их композиции/уровня относящихся к миелину питательных веществ.

Питательные композиции были протестированы в стандартных, коммерчески доступных детских смесях различных брендов/поставщиков и были показаны различные уровни питательных веществ, которые в них содержались.

Когнитивные способности: стандартизованные по возрасту (T)-критерии крупной моторики, зрительного восприятия и речи (экспрессивной и рецептивной), полученные с помощью шкал раннего развития Мюллена, стандартизированного и валидированного измерительного инструмента раннего когнитивного развития для младенцев и детей возрастом 6 лет или младше.

Анализ питательных веществ

Питательные вещества в каждой из 6 композиций детской смеси показаны в таблице 1.

Таблица 1

Питательное вещество Ед. изм. Диапазон концентраций среди 6 детских смесей, включенных в анализ Альфа-лактальбумин г/100 г белка ND-1.01 Жир г/100 г 26,3 - 29,5 АК мг/100 г 94,2-180 ДГК мг/100 г 42,3-89,8 Железо мг/100 г 8,42-11,7 Кальций мг/100 г 397-566 Фосфор мг/100 г 234-358 Натрий мг/100 г 135-189 Калий мг/100 г 593–834 Медь мкг/100 г 471-834 Цинк мг/100 г 4,23-7,25 Магний мг/100 г 38,4-53,9 Магний мкг/100 г 60,6-140,3 Витамин B12 мкг/100 г 4,93-8,34 Фолиевая кислота мкг/100 г 98,8-306 Холин мг/100 г 35,7-170 Бета-лактоглобулим г/100 г ND - 4,21 Фосфатидилхолин мг/кг 397-1287 Фосфатидилинозитол мг/кг 266-788 Фосфатидилсерин мг/кг <LQ (144) - 977 Фосфатидилэтаноламин мг/кг <LQ (174) Сфингомиелин мг/кг <LQ(100) - 480

Клиническое исследование

Младенцы-участники

Младенцы, включенные в данное исследование, были взяты из более крупного лонгитюдного исследования нормального развития головного мозга и поведения: Оценка миелинизации и поведения на протяжении созревания, проведенная в Университете Брауна (BAMBAM). Для того чтобы сосредоточить внимание на нейротипическом развитии, специально в ходе набора и зачисления в исследование были исключены дети с известными потенциальными факторами риска развития расстройств обучения, неврологических или психиатрических расстройств. Вследствие этого исключали детей с in utero воздействием алкоголя или запрещенного вещества, преждевременно (<37 недель гестации) рожденных или рожденных в ходе многоплодных родов, с аномалиями плода при ультразвуковом исследовании, с осложненной беременностью (например, преэклампсией), APGAR-критериями <8, с поступлением в отделение интенсивной терапии новорожденных (NICU), неврологическим расстройством (например, травмой головы, эпилепсией), психиатрическими расстройствами или расстройствами развития у младенцев, родителей или родных братьев и сестер (в том числе в случае депрессии матери, при которой необходимо было медицинское вмешательство). Дополнительно задействовали непрерывные скрининги, такие как MCAT в отношении аутизма или CBCL в отношении проблем поведения, для исключения зачисленных в исследование детей с имеющими клиническое значение поведенческими особенностями или выраженными медицинскими состояниями (такими как расстройства аутического спектра).

От пациентов получали сочетания ретроспективных и перспективных данных посредством изучения подробной карты больного и интервьюирования родителей в отношении типа использованной детской смеси, процентного соотношения грудного кормления к кормлению смесью и длительности исключительно грудного кормления. Эту информацию обновляли при каждом визите в ходе исследования, который происходил примерно раз в 6 месяцев для детей младше 2 лет и раз в год для детей старшего возраста. Исходя из этой информации детей распределяли в одну из 2 групп: №1. Вскармливаемые исключительно смесью; и №2. Вскармливаемые исключительно грудным молоком в течение по меньшей мере 90 дней (3 месяца). Из анализа исключали детей, которых вскармливали комбинацией грудного молока и смеси в течение 3 месяцев. Младенцев в группе вскармливаемых исключительно смесью дополнительно разделяли на подгруппы по результатам родительских отчетов в отношении основной детской смеси, использованной на протяжении первых 3 месяцев. Основную смесь определяли как такую, которую давали 90% времени или дольше (в случае, если родители использовали альтернативный бренд, например, в отпуске).

С помощью этих критериев в группу №1 были отобраны 94 вскармливаемых исключительно смесью младенца и ребенка младшего возраста. В их число входили 13 детей, которые получали смесь №2; 28, которые получали смесь №5; 8, которые получали смесь №3; 39, которые получали смесь №4; 5, которые получали смесь №1, и 1, который получал смесь №6. Также отбирали выборку из 52 вскармливаемых исключительно грудным молоком младенцев и сопоставляли их с группой вскармливаемых преимущественно смесью в отношении среднего возраста, продолжительности беременности, массы при рождении, соотношения мужского:женского пола, соотношения этнической принадлежности, образования матери, размера семьи и количества языков, на которых разговаривают дома (помимо английского). Группировки для каждой смеси приведены в таблице 1a.

Таблица 1a. Разбивка данных для лонгитюдного анализа и анализа питательных композиций

Смесь 1 Смесь 2 Смесь 5 Смесь 3 Смесь 4 Смесь 6 На грудном вскармливании N_детей 5 13 28 8 39 1 52 N_{измерений} 11 27 56 14 64 3 106

Способы визуализации и анализ

Каждого младенца сканировали с помощью методики визуализации белого вещества mcDESPOT (multicomponent Driven Equilibrium Single Pulse Observation of T₁ and T₂ - многокомпонентное, с быстрым восстановлением, одноимпульсное наблюдение T1 и T2) согласно Deoni et al. (Magn. Reson. Med. 2008, 60:1372-1387), которая позволяет проводить количественную оценку водной фракции миелина (ВФМ), показателя содержания миелина, в каждой точке головного мозга. Всех младенцев сканировали в ходе естественного (т.е. неседативного) сна с помощью протоколов акустически заглушенной mcDESPOT-визуализации. Общее время визуализации варьировалось в диапазоне от 19 минут для самых маленьких малышей до 24 минут для более старших 4-летних детей.

Все данные получали на сканере Siemens 3T Tim Trio, оснащенном RF-матрицей с 12-канальной головкой. Для минимизации движения внутри сканера детей ограничивали при помощи детского мешка для вакуумной иммобилизации MedVac (CFI Medical Solutions, США) и подушками из пеноматериала. Шум сканера снижали путем уменьшения пиковых градиентных амплитуд и максимальных скоростей слежения с помощью шумоизолирующей внутренней вставки в проем сканере (Quiet Barrier HD Composite, UltraBarrier, США). Также использовали детские чехлы для ушей MiniMuff и электродинамические наушники (MR Confon, Германия). Детей постоянно отслеживали с помощью детской системы пульсоксиметрии и инфракрасной камеры. Все дети продолжали спать в ходе МРТ-сканирования, и в проанализированных данных отсутствуют артефакты движения.

После сопоставления изображений, удаления не относящихся к головному мозгу сигналов и коррекции неоднородностей основного и проходящего магнитного поля (B₀ и B₁) строили модель сигналов трех пулов (включающую миелин-ассоциированную воду, внутреннюю-внешнюю аксональную воду и пул не относящейся к обмену свободной воды) по данным mcDESPOT с получением воксельных карт ВФМ.

Карту каждого ребенка затем подвергали нелинейному сопоставлению со специфичным для исследования шаблоном. Маски белого вещества, соответствующие 5 двусторонним областям (лобного, височного, затылочного, теменного и мозжечкового белого вещества (БВ)), а также тела, колена и утолщения мозолистого тела, создавали на основе общих баз данных, отмечали на общем шаблоне и производили наложение на карту ВФМ каждого ребенка. Затем определяли средние значения для каждой области у каждого ребенка и использовали их для последующего связанного с развитием анализа и моделирования траектории.

Различия в развитии

Для изучения различий в развитии между вскармливаемыми грудным молоком и вскармливаемыми смесью младенцами, а также между младенцами, вскармливаемыми различными смесями, использовали подход построения нелинейных моделей со смешанными эффектами. Модифицированные модели роста Гомпертца строили для групп №1 и №2 и независимо для каждой подгруппы вскармливаемых различными смесями. Затем каждый из четырех параметров модели Гомпертца сравнивали у групп вскармливаемых грудным молоком и смесью с помощью непарного t-критерия и у 4 подгрупп вскармливаемых различными смесями с помощью дисперсионного анализа с последующим расчетом апостериорных критериев. Так и для определения, какие из вскармливаемых смесью групп различаются.

Когнитивные оценки и анализ

Наряду с МР-томографией у каждого ребенка оценивали общие когнитивные возможности и навыки в пределах 7 дней от сканирования с помощью шкал раннего развития Мюллен, MSEL (Mullen EM, 1995). MSEL позволяет производить широкую оценку поведенческого развития в сферах контроля мелкой и крупной моторики, рецептивной и экспрессивной речи и зрительного восприятия. Нормализованные по возрасту T-критерии из этих сфер можно объединить в три составных критерия: составной критерий раннего развития (ELC, включающий мелкую моторику, зрительное восприятие, экспрессивную и рецептивную речь); фактор невербального развития (NVDQ, включающий критерии мелкой моторики и зрительного восприятия); и фактор вербального развития (VDQ, включающий критерии экспрессивной и рецептивной речи).

Как и в случае с МРТ-данными по ВФМ, изучали потенциальные групповые средние различия по ELC, VDQ и NVDQ у вскармливаемых грудным молоком и смесью младенцев, а также в подгруппах, вскармливаемых различными смесями. Кроме сравнений средних значений исследовали лонгитюдные изменения в значениях этих трех составных критериях путем построения моделей смешанных эффектов с учетом линейного тренда.

Пример 1

Выявление факторов питания по результатам перекрестных анализов

Из описанной выше когорты детей возрастом до 5 лет, которых кормили различными детскими смесями во младенчестве, включали в большой корреляционный анализ для изучения взаимосвязи между питательной композицией смеси и миелинизацией головного мозга. 5 наиболее часто используемых смесей в данной когорте анализировали в отношении их питательной композиции. Строили отдельную общую линейную модель (ОЛМ), которая моделировала все подвергнутые количественной оценке питательные вещества и детский возраст.

Затем рассчитывали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между содержанием питательных веществ и значением содержания миелина (с поправкой на возраст ребенка) в каждом вокселе изображения или точке в головном мозге. Определяли значимость как p<0,05, скорректированную по ошибке 1-го типа с помощью кластерного подхода коррекции. Наличие ассоциации или тренда определяли при p<0,15. В изначальном анализе включение всех 22 питательных веществ, показанных в таблице 1, давало в результате модель с недостаточной мощностью. Для уменьшения в этой модели количества питательных компонентов исследовали корреляцию между питательными веществами. С помощью консервативного порога, равного 0,9, исключали питательные компоненты, которые имели высокую корреляцию друг с другом в различных смесях. Это давало конечную модель, которая включала железо, сфингомиелин, фолиевую кислоту, холин, ДГК, цинк и фосфатидилхолин.

P<0,05: железо, сфингомиелин, фолиевая кислота, холин, ДГК.

P<0,15: цинк и фосфатидилхолин.

Питательными компонентами, у которых была обнаружена высокая корреляция друг с другом, были следующие:

фолиевая кислота и витамин B12;

ДГК и АК;

Цинк, кальций, магний, медь и фосфор;

Фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол.

В случае ДГК, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, первичных и вторичных зонах двигательной коры головного мозга, внутренней капсуле, зрительной зоне коры, лобной доле коры. Результаты приведены на фиг. 1b.

В случае АК, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, внутренней капсуле, теменной доле, двигательной и сенсорной зоне коры, зрительной зоне коры, лобных отделах коры. Результаты приведены на фиг. 1c.

В случае фолиевой кислоты, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, двигательной зоне коры головного мозга, зрительной зоне коры. Результаты приведены на фиг. 1d.

В случае витамина B12, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, зонах двигательной и соматосенсорной коры. Результаты приведены на фиг. 1e

В случае железа, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, внутренней капсуле, зонах двигательной и соматосенсорной коры, мозолистом теле, лобной доле коры, белом веществе височной доли. Результаты приведены на фиг. 1f.

В случае цинка, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, внутренней капсуле, зонах двигательной и соматосенсорной коры, мозолистом теле, лобной доле коры, белом веществе височной доли. Результаты приведены на фиг. 1g.

В случае кальция, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, зонах двигательной и соматосенсорной коры, мозолистом теле, лобной доле коры, белом веществе височной доли. Результаты приведены на фиг. 1h.

В случае фосфора, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, зонах двигательной и соматосенсорной коры, префронтальной коре. Результаты приведены на фиг. 1i.

В случае магния, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, внутренней капсуле, мозолистом теле, лобной доле коры, двигательной зоне коры головного мозга. Результаты приведены на фиг. 1J.

В случае сфингомиелина, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, внутренней капсуле, лобной доле, теменной доле, височной доле. Результаты приведены на фиг. 1k.

В случае фосфатидилинозитола, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, двигательной зоне коры головного мозга, лобной доле коры. Результаты приведены на фиг. 1L.

В случае фосфатидилхолина, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, внутренней капсуле, лобной доле, теменной доле, височной доле. Результаты приведены на фиг. 1M.

В случае холина, ассоциацию с миелинизацией (водной фракцией миелина) наблюдали с течением времени в головном мозге, в частности в мозжечке, зрительной зоне коры, таламусе, теменной коре и лобной доле. Результаты приведены на фиг. 1n.

Пример 2

a) Траектория миелинизации всего головного мозга по результатам лонгитюдного исследования

Из доступных данных рассчитывали траектории лонгитюдного развития миелина (миелинизации de novo) с применением многократно снятых данных по ВФМ от детей, детские смеси для которых содержали различное количество ДГК (композиция таких смесей приведена ниже в таблице 2). Траектории рассчитывали с помощью лонгитюдного нелинейного подхода со смешанными эффектами. Строили модифицированные модели роста Гомпертца по данным от детей в каждой группе, вскармливаемых смесью. Результаты приведены на фиг. 1.

Таблица 2

(низкое содержание ДГК) (высокое содержание ДГК) Докозагексаеновая кислота (ДГК). 43,2 мг/100 г 89,8 мг/100 г

b) Средняя пространственная траектория миелинизации головного мозга по результатам лонгитюдного исследования

Из доступных данных рассчитывали среднюю пространственную траекторию лонгитюдного развития миелина (миелинизации de novo) с применением многократно снятых данных по ВФМ от детей, у которых детские смеси содержали различное количество ДГК и АА (композиция таких смесей приведена ниже в таблице 2а). Траектории рассчитывали с помощью лонгитюдного нелинейного подхода со смешанными эффектами и модифицированных моделей роста Гомпертца по данным от детей в каждой группе, вскармливаемых смесью. Результаты приведены на фиг. 1a.

Таблица 2a

(низкое содержание ДГК/АК) (высокое содержание ДГК/АК) Докозагексаеновая кислота (ДГК). 67,7 мг/100 г 81,5 мг/100 г Арахидоновая кислота (АК) 108 мг/100 г 172 мг/100 г

Пример 3

Поставщики и маточные растворы

Соединение Компания Кат. № CAS № Маточный Октановая кислота sigma O3907 12407-2 50 мM Нервоновая кислота Fluka 87117 50637-6 10 мM Стеариновая кислота Fluka 85679 57-114 10 мM Сфингомиелин sigma S0756 8518710-6 10 мM

Наполнители и дозы

Соединение Наполнитель/растворено в Доза 1 Доза 2 Доза 3 Октановая кислота ДМСО 10 мкМ 50 мкM 250 мкМ Нервоновая кислота ДМСО 10 нМ 100 нМ 1 мкМ Стеариновая кислота ДМСО 100 нМ 1 мкМ 10 мкМ Сфингомиелин Растворен в ETOH/разведено в ДМСО 10 нМ 100 нМ 1 мкМ

Композиции сред и способы культивирования

1) Полная нейробазальная среда

Нейробазальная среда (LIFE TECHNOLOGIES CORP, №21103-049)

50X добавка B27 (LIFE TECHNOLOGIES CORP, №12587-010)

2 мM L-глутамин (LIFE TECHNOLOGIES CORP, №25030-149)

1X пенициллин-стрептомицин (LIFE TECHNOLOGIES CORP, №15140-122)

2) Нейробазальная среда, дополненная факторами роста (GF)

Приведенная выше пропись со смесью GF

1 M Трис (MW 121,14, Fisher SCI BP152)

Гепарин (sigma H3149)

БСА (Sigma A7030)

Не содержащая ДНКаз, РНКаз, протеаз вода (Fisher SCI AC327390010)

EGF (GIBCO PHG0311)

флакон с bFGF (GIBCO PHG0021)

3) Нейробазальная среда без холина (Life technologies, разработанный отдельно состав без L-глутамина и без фенолового красного)

Примечание: полную и полную с GF получают так же, как и описано выше.

Создание библиотек клеток-предшественников нейронов (NPC):

отделение неокортекса мышей на E14

Необходимые реагенты:

ДФСБ(1X) + 10% пенициллин/стрептомицин

Нейробазальная среда/10% пенициллин/стрептомицин/10X Hepes

Процедура

Собирали мозги зародышей на E14 и помещали на ледяной ДФСБ(1X) + 10% пенициллин/стрептомицин, затем их иссекали с применением препаровальной лупы. От каждого зародыша одно полушарие головного мозга помещали в 2 мл нейробазальной среды/10% P/S (пенициллин/стрептомицин)/10X Hepes, а другое полушарие головного мозга помещали в другую пробирку.

Ткань из каждой пробирки была асептически и вручную разделяли на отдельные клетки, добавляли полную нейробазальную среду и центрифугировали при 130 g в течение 5 минут. Затем ткани ресуспендировали в полной нейробазальной среде с GF и помещали в чашку Corning размером 100 мм X 20 мм для культивирования в суспензии (№430591). Клетки дважды пересевали с соотношением 1:3, после чего их центрифугировали (130 g, 5 мин.), ресуспендировали в среде для заморозки (10% ДМСО и полная нейробазальная среда, без GF) и замораживали в жидком азоте (LN2).

Оттаивание клеток для скрининга состава

Флаконы забирали из LN2, быстро размораживали и переносили клетки, по каплям, в 15-мл коническую колбу. Добавляли 10 мл полной нейробазальной среды. Клетки переносили в чашку для культивирования в суспензии и помещали в инкубатор на 2 часа. Через 1,5 часа изучали клетки. Исходя из жизнеспособности и количества оценивали необходимое количество планшетов и нагревали соответствующее количество полной нейробазальной среды. Через 2 часа клетки помещали в 15-мл коническую пробирку и вращали при 130 g, 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в нейробазальной среде, полной с GF (3 мкл GF на каждые 10 мл среды). Затем клетки выращивали в течение ночи, а затем использовали в экспериментах.

Высевание клеток в 96-луночные планшеты только для подсчета нейросфер и диаметров

Corning Costar 3474, 96-луночный планшет с ультранизкой адгезией

Разделение и высевание клеток

Забирали 3-4 мл клеток из наклоненного планшета и добавляли в 15-мл коническую пробирку. Некоторую часть оставшейся среды использовали для промывки планшета. Всю остальную среду забирали и переносили в 15-мл коническую пробирку и вращали при 130 g в течение 5 минут. Удаляли всю среду. Клетки аккуратно ресуспендировали в 5 мл теплого ФСБ, снова вращали. Затем удаляли ФСБ и клетки аккуратно ресуспендировали в 500 мкл Accutase (раствор для отделения клеток Accutase™ Corning™, №25058CI). Затем клетки аккуратно пипетировали при помощи 1000 мкл наконечника для разрушения осадка, а затем их помещали в качающуюся водяную баню на 5-10 минут, после чего их интенсивно перемешивали путем вращения пробирки.

Среду готовили как описано ниже, все среды содержали GF:

Соединение Октановая кислота Контроль/
наполнитель Низкое содержание холина/
наполнитель 1% БСА Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние 1:5 окт:дец Нервоновая кислота Контроль/
наполнитель Низкое содержание холина/
наполнитель Средн. содержание холина/
наполнитель Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние Высокое содержа-ние Стеариновая кислота Контроль/
наполнитель Низкое содержание холина/
наполнитель Средн. содержание холина/
наполнитель Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние Высокое содержа-ние Сфингоми-елин Контроль/
наполнитель Низкое содержание холина/
наполнитель Средн. содержание холина/
наполнитель Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние Высокое содержа-ние

Контрольную среду и среду с соединением получали с помощью среды №2, и она содержала 29 мкM холина, среду с низким (5 мкM) и средним (70 мкM) содержанием холина получали с помощью среды №3.

Соединение Компания Кат. CAS № Маточный Наполнитель/
растворено Доза 1 Доза 2 Холина хлорид Sigma 26978 67-48-L 7 мM ФСБ 5 мкМ 70 мкМ

Среду АККУРАТНО пипетировали с помощью 1000-мкл наконечника, а затем 200-мкл наконечника для дополнительного диспергирования клеток.

Агломераты имели размеры не более ~3-5 клеток. Добавляли 5-10 мл теплой среды (GF) к разведенному ферменту. Добавляли 2 мл среды. Пипетировали с помощью 1000-мкл пипетки, затем добавляли 3-мл с помощью серологической пипетки. Перед высеванием клетки фильтровали через одобренный 40 мкм фильтр для клеточной культуры.

Забирали 1 мл для подсчета клеток. Клетки еще раз вращали. Удаляли среду из клеточного осадка. Добавляли 1 мл приготовленной среды (без GF). Клетки пипетировали 1000-мкл пипеткой. Осуществляли разведения клеток (24000 клеток/лунка) в 250 мкл соответствующей среды. Клетки ежедневно перемешивали путем вращения и выращивали в течение 2 дней.

Фиксация и окрашивание

1. Клетки фиксировали под вытяжкой. Для фиксации и последующего иммуногистохимического анализа забирали 100 мкл среды и добавляли 100 мкл 4% PЖК в 1X ФСБ для фиксации клеток при подсчете нейросфер вручную, затем клетки дважды промывали при помощи 1X ФСБ в течение 5 минут и оставляли в 1X ФСБ, оборачивали фольгой и оставляли на ночь при 4°C или производили окрашивание красителем Dapi. Удаляли 100 мкл ФСБ и добавляли в блок 100 мкл красящего раствора на основе антител (AB) (1% сыворотка козы, 1xФСБ и 0,1% Тритона X) при комнатной температуре на 1 час. Удаляли раствор для AB-окрашивания. Затем клетки красили при помощи красителя Dapi 1:5000 в растворе для AB-окрашивания, 100 мкл на лунку, затем клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте. Затем клетки промывали 2 раза в растворе для AB-окрашивания в течение пяти минут. Визуализацию производили с помощью устройства для визуализации GE Cytell или конфокального микроскопа LСМ 710, Zeiss и анализировали диаметры нейросфер при помощи программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здоровья).

Высевание клеток в 24-луночный планшет для анализов дифференцировки в монослое или включения EdU

Соединение Октановая кислота Контроль/
наполнитель Низкое содержание холина/
наполнитель Средн. содержание холина/
наполнитель Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние Высокое содержа-ние Нервоновая кислота Контроль/
наполнитель Низкое содержание холина/
наполнитель Средн. содержание холина/
наполнитель Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние Высокое содержа-ние Стеариновая кислота Контроль/
наполнитель Низкое содержание холина/
наполнитель Средн. содержание холина/
наполнитель Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние Высокое содержа-ние Сфингоми-елин Контроль/ наполнитель Низкое содержание холина/ наполнитель Средн. содержание холина/ наполнитель Низкое содержа-ние Среднее содержа-ние Высокое содержа-ние

Перед применением в описанном ниже анализе 24-луночные планшеты со стеклянным дном (Mat Tek P24G-1.0-13-F Case, 24-луночные планшеты со стеклянным дном) покрывали поли-L-орнитином (Sigma P4957) и фибронектином (Sigma F1141).

См. выше раздел «Разделение и высевание клеток».

Клетки высевали (10000 клеток на лунку) в полную среду с GF на 24 часа (500 мкл на лунку). После прикрепления клеток их переводили на среду с дефицитом холина, среду с другим соединением или соответствующую среду.

Анализ дифференцировки: количественное определение экспрессии маркеров нейронов, глии и NPC

Спустя 24 часа убеждались, что клетки прикрепились к планшету, затем аккуратно удаляли среду.

Добавляли 500 мкл среды с соединением, содержащей 2% Nu Serum (заменителя сыворотки) (добавка для ростовой среды Nu-Serum Corning™, №CB55004), контрольную среду, среду с низким содержанием холина и средним содержанием холина. Примечание: среда не содержала GF.

Контрольную среду и среду с соединением получали с помощью среды №2, и она содержала 29 мкM холина, среду с низким (5 мкM) и средним (70 мкM) содержанием холина получали с помощью среды №3.

Клетки культивировали в течение 9 дней в среде плюс 2% Nu Serum, среду заменяли раз в 2 дня. Для фиксации и последующего иммуногистохимического анализа среду удаляли, клетки один раз промывали посредством 1X ФСБ в течение 5 минут и фиксировали посредством 4% PЖК в 1X ФСБ в течение 15 минут при 4°C. Затем клетки дважды промывали посредством 1X ФСБ в течение 5 минут, оставляли в 1X ФСБ, оборачивали фольгой и оставляли на ночь при 4°C или же сразу производили окрашивание первичным антителом.

Окрашивание в отношении дифференцировки

Удаляли ФСБ и добавляли достаточное количество раствора для AB-окрашивания (1% сыворотки козы, 1x ФСБ и 0,1% Тритона X) для покрытия дна, блок выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Готовили разведения первичного антитела в соответствующем количестве раствора для AB-окрашивания, 250 мкл на лунку (антитела лишь незначительное время выдерживали на льду, 1:500 мышиного антитела к MAP2 или TUJ1 (маркер нейронов), 1:1000 антитела кролика к GFAP(маркер глии), 1:1000 антитела курицы к нестину-CFP (EGFP-антитело (маркер клеток-предшественников)). Удаляли раствор для AB-окрашивания и в каждую камеру добавляли раствор первичных антител. Клетки оборачивали фольгой и выдерживали в течение ночи при 4°C. Затем клетки один раз промывали посредством 400 мкл раствора для AB-окрашивания в течение 5 минут для удаления первичных антител. Готовили растворы вторичных антител (достаточное количество для 250 мкл каждой камеры) (козье антитело к антителам мыши с красителем alexa 488 в разведении 1:2000, к антителам кролика с красителем Cy3 (1:500), к антителам курицы с красителем alexa 647 1:500 и красителем Dapi 1:5000).

Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте и 2 раза промывали в растворе для AB-окрашивания в течение пяти минут. Затем их выдерживали при 4°C и визуализировали с помощью устройства для визуализации GE Cytell или конфокального микроскопа LСМ 710, Zeiss и анализировали при помощи программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здоровья).

Ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2), бета-тубулин III нейронов (TuJ1), глиофибриллярный кислый белок (GFAP) и нестин-CFP (EGFP-антитело).

Экспрессию каждого маркер измеряли на собранных изображениях (показатель интегральной плотности в ImageJ) и нормализовали к флуоресценции DAPI, отмечая все ядра (показатель интегральной плотности).

Октановую кислоту метили бета-тубулином III нейронов (TuJ1), последующие соединения метили ассоциированным с микротрубочками белком 2 (MAP2).

Анализ пролиферации NPC в монослойной культуре (включение EdU - маркера S-фазы)

Спустя 24 часа убеждались, что клетки прикрепились к планшету, затем аккуратно удаляли среду. Добавляли 500 мкл среды с соединением плюс GF. Клетки культивировали в течение 3 дней в соответствующей среде.

Контрольную среду и среду с соединением получали с помощью среды №2, и она содержала 29 мкM холина, среду с низким (5 мкM) и средним (70 мкM) содержанием холина получали с помощью среды №3.

Включение EDU измеряли с помощью набора для визуализации Click-iT® EdU Alexa Fluor® 555 (Life technologies, № c10338).

В конце 3-го дня добавляли EdU в каждую лунку в количестве 10 мкM на 30 минут перед фиксацией.

Для фиксации и последующего иммуногистохимического анализа среду удаляли, клетки один раз промывали 1X ФСБ в течение 5 минут и фиксировали посредством 4% PЖК в 1X ФСБ в течение 15 минут при 4°C, затем клетки дважды промывали 1X ФСБ в течение 5 минут, оставляли в 1X ФСБ, оборачивали фольгой и оставляли на ночь при 4 °C или продолжали окрашивание.

Удаляли ФСБ и добавляли достаточное количество раствора для AB-окрашивания (1% сыворотки козы, 1x ФСБ и 0,1% Тритона X) для покрытия дна, блок выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки окрашивали в отношении EDU. Клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки промывали посредством 1X ФСБ и красили красителем Dapi 1:5000 мкл в течение 15 минут. Клетки один раз промывали посредством 1X ФСБ, затем оставляли в ФСБ при 4°C или сразу же визуализировали с помощью устройства для визуализации GE Cytell (устройства для определения жизнеспособности клеток) или конфокального микроскопа LСМ 710, Zeiss (с анализом при помощи программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здоровья)).

Результаты представлены в таблицах 3-7 и на фиг. 2-5.

Таблица 3. Эффект нервоновой кислоты на плотность нейронов и плотность астроцитов

нейроны астроциты контроль 0,436189 0,642448 низкое содержание НК 0,467588 0,621784 среднее содержание НК 0,56563 0,721512 высокое содержание НК 0,539448 0,70279

Таблица 4. Эффект стеариновой кислоты на плотность нейронов и плотность астроцитов

нейроны астроциты контроль 0,44 0,64 низкое содержание SA 0,54 0,68 среднее содержание SA 0,66 0,81 высокое содержание SA 0,64 0,85

Таблица 5. Эффект октановой кислоты на плотность нейронов и плотность астроцитов

нейроны астроциты контроль 1,1 4,1 низкое содержание OA 1,2 3,7 среднее содержание OA 1,8 6,1 высокое содержание OA 1,7 7,9

Таблица 6. Эффект сфингомиелина на количество нейросфер

Сфингомиелин Контроль Низк. Средн. Высок. Усредненное (среднее) 103 94 121 219

Таблица 7. Эффект сфингомиелина на пролиферацию нейронов

DAPI контроль 262 низкое содержание СМ 280 среднее содержание СМ 314 высокое содержание СМ 305

Пример 4

Экспериментальная часть

Образцы

Ингредиент C2, концентрат сывороточного белка, обогащенный альфа-лактальбумином (ID в самплере: K2Q-00030; первая молочная смесь для младенцев, содержащая концентрат сывороточного белка, обогащенный альфа-лактальбумином (ID в самплере: K2Q-00032; коровье молоко (цельное молоко); человеческое грудное молоко (пул контроля качества из 6 отдельных образцов, собранных спустя 4 недели после рождения ребенка; Lee Biosolutions, Сант-Луис, Мичиган, США).

Экстракция фосфолипидов из молочных продуктов

Сухое молоко: Количество 1 г гомогенизированного порошка взвешивали в 50-мл стеклянной колбе и разводили в 20 мл чистой дистиллированной воды. Раствор подогревали при 40°C в течение 30 минут в водяной бане. Объем 500 мкл данного раствора помещали в 10-мл стеклянную пробирку.

Коровье молоко и человеческое молоко: Отбирали аликвоту в количестве 500 мкл гомогенизированной жидкости в 10-мл стеклянную пробирку.

Аналиты экстрагировали согласно ПП по количественному определению человеческого грудного молока с помощью СВЭЖХ-МС/МС (RDLS-MP-80138-Rev01) в трех повторностях с применением 9,5 мл смеси хлороформа/метанола (2+1). Вкратце, пробирки встряхивали и помещали в ультразвуковую баню при 40°C на 15 минут с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 2500 об/мин. В жидкую фазу добавляли объем 2 мл раствора хлорида калия (0,88%, мас./мас.), затем встряхивали и центрифугировали в течение 10 минут при 2500 об/мин. Нижнюю органическую фазу переносили в стеклянный сосуд, выпаривали досуха под небольшим потоком N₂ и ресуспендировали в 500 мкл хлороформа/метанола (9+1) перед инъекцией в систему ЖХ-МС.

Анализ фосфолипидов с помощью жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией (ЖХ-МС)

Анализы проводили на Q Exactive Plus Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), оснащенном ЖХ-системой для быстрого разделения Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000. Разделение проводили на HILIC-колонке (100 x 2,1 (внутр. диам.) мм; 1,7 мкм) с композицией подвижной фазы: (A) ацетат аммония 10 мM и (B) ацетонитрил. Объем инъекции устанавливали равным 10 мкл, а градиент начинали с 95% B до 70% B на протяжении 15 минут, поддерживали 1 минуту на уровне 70% B, возвращали в изначальные условия за 3 минуты и уравновешивали на 6 минут.

Устройство Q Exactive Plus Orbitrap оснащали зондом химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД), работающим в режиме детекции положительно заряженных ионов. Параметры ХИАД и МС были следующими: ток коронного разряда — 4,0 мкA, защитный газ и вспомогательный газ - соответственно 24 и 5 относительных единиц; температуры капилляра и испарителя - соответственно 320°C и 390°C, скорость потока продувочного газа составляла 0 произвольных единиц, а радиочастотный уровень ионопровода был равен 80. Целевое значение автоматического регулятора усиления (АРУ) выставляли на 1×10⁶ зарядов, а максимальное время инъекции на 100 мс с разрешением 35000 и 1 микроскан за полную МС. AGC выставляли на 1×10⁶ зарядов, а максимальное время инъекции 250 мс с разрешением 17500 с 1 микросканом в режиме информационно-независимой фрагментации. Перечень включения отобранных исходных ионов использовали с нормализованной энергией столкновения, составляющей 30%. Данные снимали в диапазоне масс 133-2000 Да в режиме регистрации профилей масс-спектральных пиков. Применяли калибровку с внешними стандартами масс. Системой управляли при помощи Xcalibur 3.0 (Thermo Fisher Scientific).

Разновидности СМ экстрагировали из общей смеси, полученной ионной хроматографией, с помощью точной массы. Исходные ионы соответствовали потере в источнике фосфатидилхолина в результате превращения в церамид. Использовали перечень включения для специфического разделения 57 региоизомеров СМ, основанный на исходных ионах, соответствующих m/z церамида с потерей воды [Cer-H₂O+H⁺], на основе базы данных LipidView и данных из литературы (Trenerry V.C., Akbaridoust G., Plozza T., Rochfort S., Wales W.J., Auldist M., Ajilouni S. Ultra-high-performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry characterisation of milk polar lipids from dairy cows fed different diets. Food Chemistry 2013, 141, 1451-1460; Godzien J., Ciborowski M., Martinez-Alcazar M.P., Samczuk P., Kretowski A., Barbas C. Rapid and reliable identification of phospholipids for untargeted metabolomics with LC-ESI-QTOF-MS/MS. Journal of Proteome Research 2015, 14, 3204-3216).

Анализ жирнокислотного метилового эфира (ЖКМЭ) с помощью газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД)

СМ-фракции собирали в диапазоне от 8,5 до 10 минут в стеклянные пробирки по 5 раз для каждого образца. После выпаривания растворителя под потоком N₂ проводили анализы ЖКМЭ в трех повторностях согласно ПП по количественному определению жирной кислоты в человеческом молоке с помощью газовой хроматографии (RDLS-MP-8980-00030-Rev01-FAME_Human milk fat 2012, Vers. 1.0).

Результат и обсуждение

Для разделения ФЛ на классы (т.е. фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилхолин (ФХ) и СМ) использовали жидкостную хроматографию, основанную на гидрофильном взаимодействии (HILIC). Число углеродов и ненасыщенных связей в отдельной разновидности СМ устанавливали по точной массе псевдомолекулярного иона, детектируемого в масс-спектрометре Orbitrap. Определяли относительное содержание разновидностей СМ для сравнения между ингредиентом, детской смесью, коровьим молоком и человеческим молоком.

Разновидности СМ в различных молочных продуктах

Было детектировано 45 разновидностей СМ в анализируемых образцах (таблица 8).

Таблица 8. Детектированные разновидности СМ (обозначены x) в образцах ингредиента, детской смеси, коровьего молока и человеческого молока. Разновидности СМ, которые были детектированы только в человеческом молоке, показаны жирным шрифтом.

СМ Ингре-диент Детская смесь Коровье молоко Челове-ческое молоко СМ Ингре-диент Детская смесь Коровье молоко Челове-ческое молоко СМ 24:1 X СМ 37:1 X X X X СМ 25:0 X X X X СМ 37:0 X X X X СМ 28:1 X X X X СМ 38:4 X СМ 28:0 X X X X СМ 38:3 X СМ 30:2 X X X X СМ 38:2 X X X X СМ 30:1 X X X X СМ 38:1 X X X X СМ 30:0 X X X X СМ 38:0 X X X X СМ 32:3 X X X X СМ 39:1 X X X X СМ 32:2 X X X X СМ 39:0 X X X X СМ 32:1 X X X X СМ 40:2 X X X X СМ 32:0 X X X X СМ 40:1 X X X X СМ 33:1 X X X X СМ 40:0 X X X X СМ 34:3 X X X X СМ 41:2 X X СМ 34:2 X X X X СМ 41:1 X X X X СМ 34:1 X X X X СМ 41:0 X X X X СМ 34:0 X X X X СМ 42:4 X СМ 35:2 X X X X СМ 42:3 X X СМ 35:0 X X X X СМ 42:2 X X X X СМ 36:4 X X X X СМ 42:1 X X X X СМ 36:3 X X X X СМ 42:0 X X X X СМ 36:2 X X X X СМ 44:3 X X СМ 36:1 X X X X СМ 44:1 X X X X СМ 36:0 X X X X

Разновидности СМ 24:1, СМ 38:4, СМ 38:3 и СМ 42:4 были обнаружены в человеческом молоке только в следовых уровнях.

Относительное содержание разновидностей СМ

Относительное содержание (%) СМ в различных молочных продуктах оценивали на основе площади пика, деленной на сумму площадей всех пиков, соответствующих разновидностям СМ на хроматограмме для каждого образца. На фигуре 6 продемонстрировано относительное содержание основных разновидностей СМ в ингредиенте, детской смеси, коровьем молоке и человеческом молоке.

Относительное содержание разновидностей СМ, присутствующих в ингредиенте и детской смеси, было сравнимо с таковой коровьего молока и слегка отличалось от человеческого молока, доля некоторых разновидностей (например, СМ 32:1, СМ 32:0, СМ 33:1; СМ 34:1, СМ 38:0, СМ 39:1, СМ 39:0 и СМ 41:1) была ниже в человеческом молоке, чем в ингредиенте, детской смеси и коровьем молоке. При этом СМ 36:2, СМ 36:1, СМ 36:0, СМ 37:1, СМ 38:2, СМ 38:1, СМ 40:1, СМ 42:2 и СМ 42:1 имели более высокое относительное содержание в человеческом молоке по сравнению с другими молочными продуктами.

Образец человеческого молока представлял собой пул контроля качества из 6 отдельных образцов, собранных через 4 недели после рождения ребенка или позже. Если учитывать, что содержание СМ в человеческом молоке варьирует в зависимости от рациона и времени лактации, этим можно частично объяснить наблюдаемые различия. Тем не менее, несмотря на различия в относительном содержании некоторых разновидностей СМ, >85% разновидностей СМ, которые были детектированы в человеческом молоке, также были выявлены в детской смеси и коровьем молоке.

Следует отметить, что для данного m/z, полученного из кривой МС, могут быть предложены различные комбинации ДЦР-ЖК (например, СМ 34:1 может соответствовать СМ d18:1/16:0, d18:0/16:1, d16:1/18:0 и т.д.). Поэтому был оценен ЖХ-профиль ЖК для сбора дополнительной информации о молекулярных структурах СМ среди различных молочных продуктов.

Жирнокислотный профиль во фракции СМ из различных молочных продуктов

Региоизомерную структуру СМ исследовали сначала путем фракционирования СМ, а затем путем анализа ЖК, присутствующих во фракциях ГХ-ПИД. Фракционирование СМ производили как описано выше для ЖХ-МС-анализа, но в этом случае элюат направляли в 5-мл стеклянную пробирку, вместо МС. Затем каждую фракцию подвергали процедуре метилирования перед последующим ГХ-анализом. Относительное содержание ЖК во фракции СМ представлено на фиг. 7.

Как показано на фиг. 7, фракция СМ содержала преимущественно насыщенные ЖК (т.е. миристиновую кислоту 14:0, пентадециловую кислоту 15:0, пальмитиновую кислоту 16:0, стеариновую кислоту 18:0, арахидиновую кислоту 20:0, бегеновую кислоту 22:0, трикозиловую кислоту 23:0 и лигноцериновую кислоту 24:0). Более высокую долю НЖК наблюдали во фракции СМ от всех молочных продуктов (таблица 9). Это согласуется со сведениями из литературы, в которой раскрыто высокое распределение НЖК с углеродной цепью более 18 во фракции СМ. Такое высокое количество НЖК отражает структурную роль СМ, а именно уменьшение текучести и поддержание жесткости мембраны жировых глобул молока.

Таблица 9. Процентное содержание НЖК, МННЖК и ПННЖК, детектируемое во фракции СМ из различных молочных продуктов.

ЖК Ингредиент Детская смесь Коровье молоко Человеческое молоко НЖК (%) 14:0-16:0; 18:0; 20:0-24:0 95,1 ± 2,6 92,8 ± 3,9 93,1 ± 8,4 87,9 ± 2,7 МННЖК, % 18:1n-9 2,5 ± 0,7 3,6 ± 0,9 5,3 ± 1,5 4,4 ± 1,9 24:1n-9 1,7 ± 0,3 1,9 ± 1,7 1,2 ± 0,1 5,9 ± 0,6 ПНЖК 18:2n-6 0,8 ± 0,4 1,7 ± 0,2 0,3 ± 0,4 1,7 ± 0,1

Мононенасыщенные ЖК (МННЖК) составляли приблизительно 4-11% ЖК во фракции СМ. Были детектированы 2 МННЖК: олеиновая кислота 18:1n-9 и нервоновая кислота 24:1n-9. Что интересно, 24:1n-9 была обнаружена в относительно высоком содержании в человеческом молоке в сравнении с другими молочными продуктами, и это согласуется со сведениями из литературы. С относительно более высоким содержанием в протестированной детской смеси и человеческом молоке в сравнении с другими продуктами была обнаружена единственная ПННЖК — линолевая кислота 18:2n-6. Наконец, омега-3 ПННЖК не были детектированы во фракции СМ. Это также соответствует данным, встречающимся в литературе, которые демонстрируют, что арахидоновая кислота (АК, 20:4n-6), эйкозапентаноиковая кислота (ЭПК, 20:5n-3) и докозагексаеновая кислота (ДГК, 22:6n-3) в основном присутствуют в ФЭ, ФИ и ФС.

Пример 5

Примеры синтетических питательных композиций (детских смесей) в соответствии с настоящим изобретением изложены в таблице 10 и таблице 10a

Таблица 10

Информация о питательных веществах питательные компоненты Ед. изм. на 100 г Энергетическая ценность кДж 2216 Белок г 11 Белок молочной сыворотки г 7,0 α-лактальбумин г 1,8 Казеин г 3,8 жир г 29 линолевая кислота мг 4160 α-Линоленовая кислота мг 336 АК мг 203 ДГК мг 143 Углеводы г 52,5 Пищевое волокно г 2,4 Растворимое пищевое волокно (в виде олигофруктозы) г 2,4 Таурин мг 38 L-карнитин мг 8,0 лютеин мкг 64 нуклеотиды мг 21 L-Tyr мг ≥407,4 L-Trp мг ≥176,9 Витамин А мкг ретинолового эквивалента 581 β-каротин мкг 120 Витамин D мкг 9,6 Витамин Е мг α-токоферилового эквивалента 5,9 Витамин K1 мкг 54 Витамин B1 мкг 800 Витамин B2 мкг 880 Витамин B6 мкг 440 Витамин B12 мкг 9,5 Ниацин мкг 4000 фолиевая кислота мкг 346 пантотеновая кислота мкг 2800 биотин мкг 16 Витамин C мг 72 холин мг 230 инозит мг 36 Кальций мг 288-588 Фосфор мг 160-336 Магний мг 36 Железо мг 13,1 Цинк мг 7,1 Марганец мкг 40 Медь мкг 266 Йод мкг 80 Натрий мг 128 Калий мг 520 Хлорид мг 346 Селен мкг 11 Сфингомиелин мг 93,8

Композиция также может содержать любые дополнительные ингредиенты, которые обычно встречаются в составах детской смеси.

Таблица 10a

Питательное вещество Единиц на литр Исследуемый состав Энергетическая ценность Ккал 662,0 Энергетическая ценность кДж 2768,5 Вода/влага г 902,6 Зола г 3,4 Белок Белок г 13,4 65% сыворотка г 8,7 в виде альфа-лактальбумина г 2,3 35% казеин г 4,7 Углеводы Доступные углеводы г 68,6 Углеводы г 73,6 из которых лактозы г 68,6 из которых сахаров г 68,6 Растворимое пищевое волокно (в виде олигофруктозы) г 5,0 Липиды Общее содержание жира г 36,0 Жирные кислоты, насыщенные г 14,0 Транс-жирные кислоты г 0,3 Сфингомиелин мг 105,0 Линолевая кислота мг 5200,0 Линоленовая кислота мг 420,5 соотношение линолевая:альфа-линоленовая кислота соотношение 12,4 АРК мг 132,0 ДГК мг 132,0 АРК/ДГК соотношение 1,0 Витамины Витамин A (ретинол) мкг 660,1 Бета-каротин мкг 150,0 Витамин D (холекальциферол) мкг D 12,0 Витамин E (ТЭ) мг 5,8 Витамин K мкг 53,6 Витамин B1 (тиамин) мг 0,8 Витамин В2 (рибофлавин) мг 0,9 Витамин B6 (пиридоксин) мг 0,6 Витамин B12 (цианокобаламин) мкг 7,0 Ниацин мг 5,0 Фолиевая кислота мкг 219,0 Пантотеновая кислота мг 3,5 Биотин мкг 18,0 Витамин C (аскорбиновая кислота) мг 80,0 Минеральные вещества и микроэлементы Кальций мг 336,7 Фосфор мг 190,0 Ca:P соотношение 1,8 Магний мг 45,0 Железо мг 8,6 Цинк мг 5,5 Марганец мкг 50,0 Медь мг 0,3 Йод мкг 90,0 Натрий мг 175,0 Калий мг 500,0 Хлорид мг 345,0 Селен мкг 13,5 Другие вещества Холин мг 160,0 Инозит мг 45,0 Таурин мг 37,6 L-карнитин мг 8,8 Лютеин мг 0,1 Нуклеотиды (всего) мг 20,8 ЦМФ мг 10,4 УМФ мг 4,0 АМФ мг 3,2 ГМФ мг 1,6 ИМФ мг 1,6

Пример 6

Совместное культивирование нейронов и OL

Нейроны / олигодендроциты культивировали как описано в работе Charles et al., 2000.

Беременных самок крыс спустя 17 дней гестации умерщвляли посредством смещения шейных позвонков (крысы линии Wistar) и из матки удаляли зародышей. Удаляли передние мозги и помещали их в ледяную среду Лейбовица (L15), содержащую 2% пенициллина-стрептомицина (ПС) и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Передние мозги разделяли посредством трипсинизации в течение 20 минут при 37°C (трипсин-ЭДТА 1X). Реакцию останавливали путем добавления модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM), содержащей ДНКазу I степени II (0,1 мг/мл) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС). Затем клетки механически разделяли 3 пассажами через 10-мл пипетку. Затем клетки центрифугировали при 180 x g в течение 10 минут при температуре 4°C на слое БСА (3,5%) в среде L15. Надосадочную жидкость отбрасывали и клетки из осадка ресуспендировали в DMEM, содержащей 10% ЭБС. Затем клетки центрифугировали при 515 x g в течение 10 минут при 4°C. Надосадочную жидкость отбрасывали и клетки из осадка ресуспендировали в культуральной среде, состоящей из нейробазальной среды, дополненной 2% B27, 2 мM L-глутамина (L-Glu), 2% раствора ФС, 1% ЭБС и 10 нг/мл тромбоцитарного фактора роста (PDGF-АА). Жизнеспособные клетки подсчитывали в цитометре Neubauer с помощью теста на вытеснение трипанового синего. Клетки высевали с плотностью 20000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-L-лизином и ламинином.

На следующий день после высевания (1-й день культивирования) клетки инкубировали с тестируемым соединением (выбранным из соединений, перечисленных в таблице 11) или эстрадиолом. Контрольные клетки не инкубировали с тестируемым соединением или эстрадиолом. Эстрадиол использовали в качестве положительного контроля. Эстрадиол известен как индуктор пролиферации OPC. Также был продемонстрирован положительный эффект эстрадиола на дифференцировку OL, поскольку он оказывает свой эффект на ранний процесс миелинизации. Также были опубликованы сведения о положительном эффекте эстрадиола на рост нейритов (обзор см. Alevaro et al., 2010).

Планшеты поддерживали при температуре 37°C в инкубаторе с контролируемой влажностью в атмосфере воздуха (95%)-CO2 (5%). Половину среды заменяли раз в два дня свежей средой с тестируемым соединением или с контрольным соединением. Тестируемые или контрольные соединения поддерживали в заданной концентрации в ходе проведения экспериментов. Соединения тестировали на 1 культуре (6 лунок на условия). Затем использовали клетки на 12-й, 18-й или 30-й день культивирования для измерения любого одного из пролиферации OPC, дифференцировки OPC в OL или раннего процесса миелинизации (обертывания миелином) или созревания OL (созревания миелина) и позднего процесса миелинизации (обертывания миелином).

Пролиферация OPC - измерение A2B5-положительных клеток и общей длины аксонов (НФ)

На 12-й день культивирования клетки фиксировали холодной смесью абсолютного этанола (95%) и чистой уксусной кислоты (5%) в течение 5 минут. Затем клетки пермеабилизировали и блокировали неспецифические сайты фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), содержащим 0,1% сапонина и 1% ЭБС, в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем клетки инкубировали с конъюгированными с красителем alexa fluor® 488 моноклональными антителами к A2B5, продуцируемыми у мыши, в разведении 1/200 в ФСБ, содержащем 1% ЭБС, 0,1% сапонина, в течение 2 ч при комнатной температуре и с антителами к НФ (фосфорилированному и нефосфорилированному нейрофиламенту 200), продуцируемыми у кролика, в разведении 1/500 в ФСБ, содержащем 1% ЭБС, 0,1% сапонина, в течение 2 ч при комнатной температуре. Данное антитело выявляли с помощью козьего антитела с красителем Alexa Fluor 568 к антителам кролика в разведении 1/400 в ФСБ с 1% ЭБС, 0,1% сапонина в течение 1 ч при комнатной температуре.

Оценивали общее количество OPC (количество A2B5-положительных клеток) (для оценки пролиферации), измеряли аксональную сеть (общую длину аксонов (НФ)) для оценки эффекта соединения на нейронную сеть (качество миелинизации непосредственно связано с качеством аксональной сети).

Дифференцировка OPC в OL и процесс миелинизации (обертывание миелином) - измерение количества и площади МАГ-положительных клеток, перекрывающее МАГ/НФ обертывание и общая длина аксонов (НФ)

На 18-й день культивирования клетки фиксировали холодной смесью абсолютного этанола (95%) и чистой уксусной кислоты (5%) в течение 5 минут. Затем клетки пермеабилизировали и блокировали неспецифические сайты фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), содержащим 0,1% сапонина и 1% ЭБС, в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к МАГ, продуцируемыми у мыши, в разведении 1/400 в ФСБ, содержащем 1% ЭБС, 0,1% сапонина, и с антителами к НФ (фосфорилированному и нефосфорилированному нейрофиламенту 200), продуцируемыми у кролика, в разведении 1/500 в ФСБ, содержащем 1% ЭБС, 0,1% сапонина, в течение 2 ч при комнатной температуре. Данные антитела выявляли с помощью козьего антитела с CF 488 A к антителам мыши в разведении 1/800 в ФСБ с 1% ЭБС, 0,1% сапонина и козьего антитела с Alexa Fluor 568 к антителам кролика в разведении 1/800 в ФСБ с 1% ЭБС, 0,1% сапонина в течение 1 ч при комнатной температуре.

Оценивали общее количество OL (количество и площадь МАГ-положительных клеток) (для оценки процесса дифференцировки), а также обертывание у OPC вокруг аксонов (перекрывающее МАГ/НФ обертывание) (процесс миелинизации). Измеряли аксональную сеть (общую длину аксонов (НФ)) для оценки эффекта соединений на нейронную сеть.

Созревание OL (созревание миелина) - измерение количества и площади ОБМ-положительных клеток, перекрывающее ОБМ/НФ обертывание и общая длина аксонов (НФ).

На 30-й день культивирования клетки фиксировали холодной смесью абсолютного этанола (95%) и чистой уксусной кислоты (5%) в течение 5 минут. Затем клетки пермеабилизировали и блокировали неспецифические сайты фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), содержащим 0,1% сапонина и 1% ЭБС, в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к ОБМ, продуцируемыми у мыши, в разведении 1/1000 в ФСБ, содержащем 1% ЭБС, 0,1% сапонина, и с антителами к НФ (фосфорилированному и нефосфорилированному нейрофиламенту 200), продуцируемыми у кролика, в разведении 1/500 в ФСБ, содержащем 1% ЭБС, 0,1% сапонина, в течение 2 ч при комнатной температуре. Данные антитела выявляли с помощью козьего антитела с CF 488 A к антителам мыши в разведении 1/800 в ФСБ с 1% ЭБС, 0,1% сапонина и козьего антитела с Alexa Fluor 568 к антителам кролика в разведении 1/400 в ФСБ с 1% ЭБС, 0,1% сапонина в течение 1 ч при комнатной температуре.

Оценивали общее количество OL (количество и площадь ОБМ-положительных клеток) (для оценки созревания OL), а также обертывание миелина вокруг аксона (перекрывающее ОБМ/НФ (обертывание)). Измеряли аксональную сеть (общую длину аксонов (НФ)) для оценки эффекта соединений на нейронную сеть.

Все измерения производили сразу после получения культуры (6 лунок на условия). Для каждого тестируемого условия делали 30 снимков (каждый снимок представлял некоторую область) на лунку и анализировали их с помощью ImageXpress (Molecular devices) с 20x увеличением, оснащенным светодиодной лампой (возбуждение 360/480/565 и испускание 460/535/620). Данные 30 снимков делали в автоматическом режиме, и они представляли 80% общей поверхности лунки с культурой.

Результаты выражали в виде совокупной средней длины в мкм нейритной сети или миелиновой оболочки, меченной по заданному маркеру (МАГ или ОБМ) на область. Измеряли площадь перекрытия между НФ и МАГ или ОБМ для оценки обертывания.

Для оценки популяции OPC, популяции МАГ-положительных клеток, популяции ОБМ-положительных клеток производили автоматический подсчет количества положительных клеток на снимок (=область). Результаты выражали в виде среднего количества положительных клеток на область.

Все изображения получали при одинаковых условиях.

Таблица 11

Планшет 1 (A2B5 / НФ) Контроль Эстрадиол (150 нM) ДГК (0,15 мкM) ДГК (1,5 мкM) Стеариновая кислота (50 мкM) Стеариновая кислота (5 мкM) Стеариновая кислота (0,5 мкM) B12 (100 нM) B12 (10 нM) B12 (1 нM) Фолиевая кислота (250 нM) Фолиевая кислота (50 нM) Фолиевая кислота (6 нM) Холин (20 мкM) Железо (1 мкM) Железо (0,1 мкM) Цинк (5 мкM) Цинк (0,5 мкM) Фосфор (5 мM) Фосфор (1 мM) Магний (25 мM) Медь (0,5 мкM) Фосфатидилхолин (100 мкМ) Фосфатидилинозитол (5 мкМ) Фосфатидилинозитол (50 мкМ) Фосфатидилсерин (5 мкМ) Фосфатидилсерин (10 мкМ) Фосфатидилсерин (100 мкМ) Сфингомиелин (5 мкМ) Сфингомиелин (25 мкМ) Церамид (экстракт из головного мозга):ДПФХ (1:4) Галактоцерамиды (C18:1/24:1)/(C18:1/18:0):ДПФХ (1:4) Глюкоцерамиды (C18:1/24:1)/(C18:1/18:0):ДПФХ (1:4) D-эритродигидроцерамид (C24:1/18:0)/(C18:0/18:1):ДПФХ (1:4) Церамид-1-фосфат (C18:1/24:0):ДПФХ (1:4) GM3:ДПФХ (1:4) GD3:ДПФХ (1:4)

Результаты представлены на фиг. 8–28.

Пример 7

Материалы и способы

1. Приготовление фидерного слоя: Отделение неонатальной коры и поддержание смешанных культур глиальных клеток

Свежеиссеченные мозги вносили в 37°C водяную баню на 3 минуты, затем кору измельчали посредством наконечника пипетки P1000 с получением небольших фрагментов. Добавляли 75 мкл папаинового раствора OPC на головной мозг, затем ткани инкубировали в водяной бане при 37°C в течение 20 минут. Затем в суспензию ткани добавляли смешанную культуру глиальных клеток для обеспечения инактивации папаинового раствора OPC.

Затем ткань растирали с помощью стерильной пастеровской пипетки, затем добавляли 4 мл среды для смешанной культуры глиальных клеток на головной мозг. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин (~300 g) в течение 5 минут, затем клетки ресуспендировали в теплой среде для смешанной культуры глиальных клеток и высевали в колбу с ПЛЛ-покрытием.

4 часа спустя после высевания производили полную замену среды для удаления основной части дебриса, образовавшегося в результате растирания, и стимуляции жизнеспособности культуры. Спустя 3 дня культивирования производили замену 2/3 среды и впоследствии среду больше не меняли. Затем клетки поддерживали в культуре до достижения конфлюентности.

2. Приготовление нейронов гиппокампа

Нейроны гиппокампа выделяли из зародышей (на Е18) крыс линии Sprague Dawley. Вкратце, после умерщвления животных выделяли головной мозг, мягкие оболочки головного мозга удаляли с медиальной ориентации полушарий головного мозга, затем иссекали гиппокамп и хранили его при 4°C до завершения процесса.

Затем ткань инкубировали с 2,5% трипсина в течение 15 минут в водяной бане при 37°C, затем аккуратно промывали и оставляли в культуральной среде. Разделение гиппокампов производили путем многократного пипетирования их внутрь и наружу с помощью функционализированной стерильной пастеровской пипетки. После механического разделения клетки высевали с требуемой плотностью в среду для высевания нейронов, давали им восстановиться в течение 4 часов, затем переносили в полную среду для культивирования нейронов.

3. Очистка OPC от смешанных культур глиальных клеток для создания совместных культур OL/гиппокампальных нейронов

На 9-й день смешанного культивирования глиальных клеток колбы встряхивали при 50 об/мин в течение 45 мин на орбитальном шейкере в инкубаторе для культивирования тканей при 5% CO2. Целью такого встряхивания было удалить любые слабо прикрепившиеся засоряющие клетки из монослоя.

Затем меняли среду и заменяли ее на 4 мл свежей среды для смешанной культуры глиальных клеток, дополненной 5 мкг/мл инсулина. Затем колбы помещали на шейкер, уравновешивали в течение примерно 3 часов, затем встряхивали в течение примерно 16 часов при 220 об/мин (в течение ночи).

На следующее утро собирали среду для культивирования глии, содержащую клетки микроглии и OPC, и предварительно перед высеиванием переносили на чашку Петри P100 (не подготовленную для культивирования) на 30 минут для очистки клеток OPC; клетки микроглии сразу начинали прикрепляться к чашке Петри, в то время как клетки OPC оставались в надосадочной среде.

Спустя 30 минут предварительной перед высеиванием стадии собирали среду и подсчитывали OL и высевали их на нейроны гиппокампа в конечном объеме 1 мл среды для OL.

Производили полную замену среды для OL (минус ЦНТФ), потом клетки поддерживали в культуре до достижения соответствующих экспериментальных периодов времени.

В ходе экспериментов по созреванию экспериментальная процедура была следующей:

a. выращивание OPC на фидерном слое астроцитов в течение 10 DIV (дней in vitro)

b. выделение OPC (0-й день)

c. введение соединений (3-й день)

d. количественная оценка созревания на 4-й, 7-й и 10-й день.

В ходе экспериментов по миелинизации экспериментальная процедура была следующей:

a. выращивание нейронов гиппокампа до полного созревания нейронной сети (14 DIV)

b. параллельное выращивание OPC на фидерном слое астроцитов в течение 10 DIV

c. выделение OPC и совместное культивирование с нейронами (14-й день)

d. введение соединений (15-й день)

e. количественная оценка миелинизации на 15-й (1 день после высевания совместной культуры, перед обработкой соединением), 18-й, 21/23-й и 28/29-й дни совместного культивирования.

4. Получение изображений

Все культуры в различные моменты времени эксперимента фиксировали в 4% параформальдегиде и 4% сахарозы при комнатной температуре (КТ) в течение 10 минут. Вносили первичные и вторичные антитела в ГДB-буфере (30 мM фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,2% желатина, 0,5% Тритона X-100 и 0,8 M NaCl) на 2 часа при комнатной температуре. Клетки красили соответствующим маркером (использованное первичное антитело: антитело к A2B5 (ABCAM, кат. № ab53521), крысиное антитело к ОБМ (BIO-RAD, кат. № aa82-87), маркерное антитело к олигодендроцитам O4 (R&D Systems, кат. № MAB1326), mAb к тубулину βIII (Promega, кат. № G7121; использованное вторичное антитело: конъюгированное с Alexa антитело к антителам крысы 555 (Life Tech A-21434), конъюгированное с Alexa антитело к антителам мыши 488 (Life Tech A-11009). После иммуноцитохимического окрашивания все изображения получали с помощью Array Scan XTI (ThermoScientific); объектив был 20x при биннинге 2x2. Для каждой лунки условия и повторности (три повторности) делали минимум 15 изображений.

Для анализа всех полученных изображений использовали программное обеспечение HCS Studio Cell Analysis Software, в частности приложение «Scan».

Папаиновый раствор OPC (составленный в MEM)

Папаиновый раствор: 1,54 мг/мл

L-цистеин: 360 мкг/мл

ДНКаза I: 60 мкг/мл

Среда для смешанной культуры глиальных клеток (составленная в DMEM)

ФСБ: 10%

Пенициллин/стрептомицин: (0,33% из маточного раствора) 33 единиц/мл пенициллина и 33 мкг/мл стрептомицина

GlutaMAX: 1%

Среда для OL

DMEM

100X OL-добавка

Бычий инсулин (из 1 мг/мл маточного раствора)

GlutaMAX

Холотрансферрин (из 33 мг/мл маточного раствора)

Добавка B27

ФСБ

ЦНТФ (из 50 нг/мкл маточного раствора)

Результаты представлены на фиг. 30–49.

Изобретение относится к питательным композициям для применения с целью предупреждения, снижения риска или смягчения неоптимальной траектории миелинизации de novo у субъекта, вскармливаемого смесью. Предложено применение синтетической питательной композиции, содержащей соединение жирной кислоты, представляющее собой моноацилглицерин, и/или диацилглицерин, и/или триацилглицерин, включающее докозагексаеновую кислоту (DHA) от 60 до 350 мг/100 г сухой массы композиции для предупреждения, снижения риска или смягчения неоптимальной траектории миелинизации de novo у субъекта, вскармливаемого смесью. При этом траектория миелинизации de novo является неоптимальной, когда расстояние между любыми эквивалентными и/или одинаковыми точками измерения младенческой траектории и траекторией, достигнутой у младенцев, которые находятся исключительно на грудном вскармливании в течение их первых (3) месяцев жизни, превышает 50%. Синтетическая питательная композиция содержит DHA от 60 до 350 мг/100 г, железо - по меньшей мере 5 мг/100 г, фолиевую кислоту - по меньшей мере 100 мкг/кг, витамин B12 -е по меньшей мере 5 мкг/100 г и сфингомиелин - по меньшей мере 300 мг/кг. При этом композиция представляет собой композицию, выбранную из группы, состоящей из: детской смеси, молока для прикорма, композиции для младенцев, которая предназначена для добавления или разведения грудным молоком человека, и пищевого продукта, предназначенного для потребления младенцем и/или ребенком либо отдельно, либо в сочетании с грудным молоком человека. Причем младенцем является младенец в возрасте до 12 месяцев, а ребенком является человек в возрасте от 1 до 18 лет и предпочтительно от 1 до 5 лет. Изобретение позволяет оптимизировать количество/степень миелинизации у субъекта. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 13 табл., 7 пр., 63 ил.

1. Применение синтетической питательной композиции, содержащей соединение жирной кислоты, для предупреждения, снижения риска или смягчения неоптимальной траектории миелинизации de novo у субъекта, вскармливаемого смесью, где соединение жирной кислоты представляет собой моноацилглицерин, и/или диацилглицерин, и/или триацилглицерин, содержащее докозагексаеновую кислоту, и где докозагексаеновая кислота содержится в композиции в количестве от 60 до 350 мг/100 г сухой массы композиции, и где траектория миелинизации de novo является неоптимальной, когда расстояние между любыми эквивалентными и/или одинаковыми точками измерения младенческой траектории и траекторией, достигнутой у младенцев, которые находятся исключительно на грудном вскармливании в течение их первых (3) месяцев жизни, превышает 50 %.

2. Применение по п. 1, где субъектом является человеческий младенец или ребенок, вскармливаемый смесью, где младенцу до 12 месяцев, а ребенку от 1 года до 18 лет, предпочтительно от 1 года до 5 лет.

3. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция дополнительно содержит один или более из следующих ингредиентов: витамин, минеральное вещество, холин, фосфолипид.

4. Применение по п. 3, где указанный витамин представляет собой фолиевую кислоту и/или витамин B12, указанное минеральное вещество выбрано из группы, состоящей из железа, цинка, кальция, магния, фосфора, меди и их комбинаций; и при этом указанный фосфолипид представляет собой соединение с формулой (I) или смесь соединений с формулой (I)

(I)

где:

R¹ представляет собой O;

X представляет собой NH или O;

R² представляет собой насыщенную или ненасыщенную, линейную или разветвленную C2-C44 ацильную группу;

R³ представляет собой заместитель с формулой (II) или формулой (III):

(II)

(III)

где R⁵ представляет собой насыщенную или ненасыщенную, линейную или разветвленную C2-C44 ацильную группу, и

R⁶ представляет собой насыщенную C2-C44 алкильную или алкенильную группу; и

R⁴ выбран из замещенной или незамещенной C5 или C6 циклической алкильной или алкенильной группы или

—(CH2)n—R⁷, где n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 4, в частности от 1 до 2, а R⁷ представляет собой —N(CH3)3+, NH3+ или заместитель с формулой (IV), и

(IV)

в частности, R⁴ представляет собой C6 циклическую алкильную или алкильную или алкенильную группу, замещенную одной или несколькими гидроксигруппами.

5. Применение по п. 4, где фосфолипид является сфингомиелином.

6. Применение по п. 4 или 5, когда в указанной композиции присутствует железо, то оно содержится в количестве выше 5 мг/100 г сухой массы композиции, а когда композиция содержит фолиевую кислоту, она содержится в количестве выше 100 мкг/100 г сухой массы композиции, а когда композиция содержит витамин B12, то он содержится в количестве выше 5 мкг/100 г сухой массы композиции, при этом когда в композиции содержится сфингомиелин, то он содержится в количестве выше 300 мг/кг сухой массы композиции.

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанная композиция представляет собой композицию, выбранную из группы, состоящей из: детской смеси, молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, композиции для младенцев, которая предназначена для добавления или разведения человеческим грудным молоком, и пищевого продукта, предназначенного для потребления младенцем и/или ребенком либо отдельно, либо в комбинации с человеческим грудным молоком, где младенцу до 12 месяцев, а ребенку от 1 года до 18 лет, предпочтительно от1 года до 5 лет.

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где человеческому младенцу больше чем 12 месяцев.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где траектория миелинизации de novo является неоптимальной, когда расстояние между любыми эквивалентными и/или одинаковыми точками измерения младенческой траектории и траекторией, достигнутой у младенцев, которые находятся исключительно на грудном вскармливании в течение их первых (3) месяцев жизни, превышает 20 %.

10. Синтетическая питательная композиция, содержащая соединение жирной кислоты, для предупреждения, снижения риска или смягчения неоптимальной траектории миелинизации de novo у субъекта, вскармливаемого смесью, которая содержит докозагексаеновую кислоту (DHA), и железо, и фолиевую кислоту, и витамин B12, и сфингомиелин, причем сфингомиелин присутствует в указанной композиции в количестве по меньшей мере 300 мг/кг, причем фолиевая кислота присутствует в указанной композиции в количестве по меньшей мере 100 мкг/кг, причем витамин B12 присутствует в указанной композиции в количестве по меньшей мере 5 мкг/100 г, причем железо присутствует в указанной композиции в количестве по меньшей мере 5 мг/100 г, причем соединение жирной кислоты, содержащее докозагексаеновую кислоту, присутствует в композиции в количестве от 60 до 350 мг/100 г, при этом соединение жирной кислоты представляет собой моноацилглицерин, и/или диацилглицерин, и/или триацилглицерин, в которой вся масса указана в расчете на сухую массу композиции, и где указанная композиция представляет собой композицию, выбранную из группы, состоящей из: детской смеси, молока для прикорма, композиции для младенцев, которая предназначена для добавления или разведения грудным молоком человека, и пищевого продукта, предназначенного для потребления младенцем и/или ребенком либо отдельно, либо в сочетании с грудным молоком человека, где младенцем является младенец в возрасте до 12 месяцев, а ребенком является человек в возрасте от 1 до 18 лет и предпочтительно от 1 до 5 лет.

11. Синтетическая питательная композиция по п. 10, которая содержит соединение жирной кислоты, содержащее DHA в концентрации 1023 мг/кг, витамин B12 в концентрации 54 мкг/кг, фолиевую кислоту в концентрации 1698 мкг/кг, сфингомиелин в концентрации 814 мг/кг и железо в концентрации 67 мг/кг, и дополнительно содержит соединение жирной кислоты, содержащее ARA в концентрации 1023 мг/кг, в котором указанное соединение жирной кислоты представляет собой моноацилглицерин, и/или диацилглицерин, и/или триацилглицерин.