Способ диагностики липогенного варианта отечного экзофтальма Российский патент 2022 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для диагностики клинической формы эндокринной офтальмопатии и выбора наиболее оптимального метода ее лечения.

Из 3 клинических форм эндокринной офтальмопатии подлежит глюкокортикоидной терапии, в первую очередь, отечный экзофтальм (в зарубежной литературе - орбитопатия Грейвса). Таргетными тканями являются прямые мыщцы глаза и орбитальная клетчатка. [Бровкина А.Ф., Стоюхина А.С. Классификация эндокринной офтальмопатии. Проблемы эндокринологии. - 2007. - Т. 52. - №5. - С. 11-14]. В основе механизма развития клинических симптомов эндокринной офтальмопатии лежит инфильтрация мягкотканного содержимого орбиты Т и В - лимфоцитами, макрофагами, тучными и плазматическими клетки с выработкой провоспалительных цитокинов, фибробластов и гликозоаминогликанов, способствующих увеличению экстраокулярных мыщц и орбитальной клетчатки в объеме с развитием экзофтальма. Исходом патологического процесса является фиброз всех тканей [Bahn R.S. Pathophysiology of Graves' ophthalmopathy: the cycle of disease. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88(5): 1939-1946.; Smith T.J. Pathogenesis of Graves' orbitopathy: A 2010 update. J Endocrinol Invest. 2010; 33(6): 414-421.]. С момента начала применения глюкокортикоидов появились сведения о существовании стероидоустойчивых форм отечного экзофтальма. Это была констатация факта, причина оставалась неизвестной [Бровкина А.Ф. Эндокринная офтальмопатия. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 176 с.]. Для доказательства использовали биоптат патологической ткани во время декомпрессивных операций на орбите и морфологически было доказано возможность преимущественного поражения орбитальной клетчатки у ряда больных, которые не отвечали на глюкокортикоидную терапию [Бровкина А.Ф., Аубакирова А.С, Яценко О.Ю., Мослехи Ш. Липогенный вариант отечного экзофтальма (клиника, лечение). Вестник офтальмологии. - 2008. - N 2. - С. 28-30; Бровкина А.Ф., Яценко О.Ю., Аубакирова А.С. Методика расчета объема орбитальной клетчатки, удаляемой при декомпрессивной операции у больных эндокринной офтальмопатией. Вестник офтальмологии. - 2009. - Т. 125, №3 - С. 24-27.]. Исследование больных отечным экзофтальмом с помощью компьютерной томографии орбит, создание программ для эхобиометрии позволили доказать существование липогенного варианта, как одной из форм отечного экзофтальма, для которого характерно увеличение объема орбитальной клетчатки. Таким образом, патоморфологические клеточные изменения орбитальной клетчатки и увеличение ее объема по данным компьютерной томографии орбит характерны для липогенного варианта отечного экзофтальма, не отвечающего на глюкокортикоидную терапию.

Работы последних лет, посвященные изучению эпигенетического механизма развития липогенного варианта отечного экзофтальма показали роль микроРНК в его формировании [Woeller С.F., Roztocil Е., Hammond С., Feldon S.Е. TSHR Signaling Stimulates Proliferation Through PI3K/Akt and Induction of miR-146a and miR-155 in Thyroid Eye Disease Orbital Fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2019; 60(13): 4336-4345]. Накопленные сведения о микроРНК свидетельствуют об их важной роли в развитии аутоиммунных заболеваний и ответе на глюкокортикоидную терапию. Показана роль микроРНК-146а и микроРНК-155, как многофункциональных маркеров аутоиммунного воспаления и возможного контроля за глюкокортикоидной терапией [Huffaker Т.В., Hu R., Runtsch М.С. Epistasis between microRNAs 155 and 146a during T cell-mediated antitumor immunity. Cell Rep. 2012; 2: 1697-1709; Jang S.Y., Park S.J., Chae M.K., Lee J.H., Lee E.J., Yoon J.S. Role of microRNA-146a in regulation of fibrosis in orbital fibroblasts from patients with Graves' orbitopathy. Br J Ophthalmol. 2018; 102: 407-414].

В качестве ближайшего аналога предложена специальная методика для изучения показателей плотности тканей орбиты. Обработку полученных данных осуществляли на рабочей станции компьютерного томографа с использованием программы Syngo Via фирмы Simens и на персональном компьютере с использованием программы 3D-DOCTOR. С помощью линейки, входящей в программное обеспечение, отмеряли 10 мм и затем проводили исследование вдоль отмеченной линии, что позволяло максимально снизить погрешность исследования. Данную методику применяли при исследовании ретробульбарной клетчатки. Анализу подвергались следующие характеристики орбитальной клетчатки: максимальная и минимальная плотность ткани, средняя плотность, интервал плотности (разница между максимальной и минимальной плотностью), количество пиков выше и ниже средней линии (середина интервала плотности). С целью получения контура исследуемого объекта (область расположения жировой клетчатки в орбите) проводили косо-перпендикулярное его сечение под углом 45'' (данный угол позволяет зафиксировать незначительные перепады плотности на границе исследуемого объекта). Объем клетчатки внутреннего хирургического пространства получали при вычитании из объема мышечной воронки объем экстраокулярных мыщц.

Объем орбитальной клетчатки у этих больных рассчитывали по формуле: Vкл = Vopб - Vгл.(oр.) - Vэом - Vзp.н - Vсл.ж., где Vкл - объем орбитальной клетчатки; Vэом - объем костной орбиты; Vгл(op) - объем орбитальной части глаза; Vэом - объем экстраокулярных мышц; Vзp.н - объем орбитального отрезка зрительного нерва; Vсл.ж - объем слезной железы [Бровкина А.Ф., Яценко О.Ю. Компьютерно-томографическая анатомия орбиты с позицииклинициста. Вестник офтальмологии. - 2008. - №1. - С. 11-14; Яценко О.Ю. Показатели соотношения объема костной орбиты и ее мягких тканей в норме и их роль в проведении дифференциальной диагностики клинических форм эндокринной офтальмопатии. Офтальмологические ведомости. - Том VI. - №4. - 2013. - с. 39-45].

К недостаткам ближайшего аналога следует отнести трудности в его выполнении (наличие специальной программы), чрезвычайную сложность расчета.

Предлагаемое изобретение решает задачу разработки нового способа диагностики липогенного варианта отечного экзофтальма.

Получаемый при этом технический результат данного способа заключается в уточнении степени экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 у больных эндокринной офтальмопатией с целью определения клинической формы данного заболевания и выбора наиболее оптимального метода лечения.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе диагностики липогенного варианта отечного экзофтальма, включающем определение степени экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 у больных эндокринной офтальмопатией предусмотрены следующие отличия: использование малоинвазивной методики для диагностики клинической формы эндокринной офтальмопатии.

Сущность предложенного способа заключается в следующем: пациентам эндокринной офтальмопатией проводят забор крови в количестве 4 мл из локтевой вены для определения степени экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155. Выделение тотальной РНК из плазмы крови и количественную оценку уровня экспрессии микроРНК проводят в соответствии с рекомендованным протоколом методом ПЦР в режиме реального времени. Экспрессию микроРНК нормализуют относительно экзогенного контроля cel-miR-39-3р и рассчитывают с использованием метода 2-ΔΔCt. Рассчитывают уровень экспрессии микроРНК и сопоставляют с контролем для каждого микроРНК. Изобретение позволяет уточнить клиническую форму липогенного варианта отечного экзофтальма с учетом эпигенетических факторов развития заболевания и определять персонализированное лечение.

Распределения уровней экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 у пациентов эндокринной офтальмопатии (n=20 пациентов) при сопоставлении с показателями в контрольных группах, n=28 человек (0,0135±0,025 для микроРНК-146а и 0,0388±0,037 для микроРНК-155) следующее: у пациентов миогенным и смешанным вариантом отечного экзофтальма уровень экспрессии микроРНК-146а составил 0,1036±0,121 (р<0.01) и микроРНК-155 - 0,0662±0,006 (р<0.01), липогенным вариантом отечного экзофтальма - 0,7812±0,247 (р<0.01) и 0,0994±0,043 (р<0.01), соответственно, эндокринной миопатией в стадии фиброза - 0,3579±0,229 (р<0.01) и 0,0896±0,043 (0.01<р<0.05).

В процессе исследования было показано, что уровень экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 увеличены в целом по группе больных ЭОП (соответственно в 21,8 и 1,71 раза). По литературе имеются сведения о значимой роли микроРНК-146а и микроРНК-155 в избыточной пролиферации фибробластов у больных эндокринной офтльмопатией. Более низкая экспрессия микроРНК у больных миогенным, смешанным вариантами отечного экзофтальма и эндокринной миопатией в сочетании с особенностями клинической картины свидетельствует о формировании фиброза в мягких тканях орбиты. Напротив, у больных липогенным варинтом отечного экзофтальма (7 человек) уровень экспрессии микроРНК значительно выше показателей больных отечного экофтальма миогенного, смешанного варинта и эндокринной миопатией. Торпидное, не прогрессирующее течение клинических симптомов, свидетельствующее об отсутствии фибротизации орбитальной клетчатки на фоне более высокой экспрессии микроРНК принимает участие в увеличении объема орбитальной клетчатки, что и является определяющим как в формировании клинических симптомов, так и формировании клинического процесса.

Таким образом, повышенный уровень экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 можно расценивать, как биомаркеры аутоиммунного воспаления в мягких тканях орбиты у больных эндокринной офтальмопатией. В то же время корреляция уровня экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 с клинической симптоматикой, монотонностью течения патологического процесса у больных липогенным вариантом отечного экзофтальма позволяет сделать вывод, что они, активизируя пролиферацию фибробластов, принимают участие в формировании объема орбитальной клетчатки и являются биомаркерами этой клинической формы отечного экзофтальма.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Клинический пример 1.

Пациент А., 56 лет. Диагноз - Липогенный вариант отечного экзофтальма? Пациент предъявляет жалобы на выпячивание обоих глаз. Из анамнеза известно, что болен в течение 5 лет, с того момента, как эндокринологом был поставлен диагноз Тиреотоксикоз. По месту жительства проводили глюкокортикоидную терапию метилпреднизолоном по схеме пульс-терапии. Суммарно получил 5,625 г глюкокортикоидов в течение 3 месяцев (!). После лечения отмечает эффект отсутствовал. Объективно: осевой экзофтальм, экзофтальмометрия OD=24 мм, OS=23 мм, подвижность глаз по сторонам в полном объеме, репозиция затруднена. По эхографии орбит и эхобиометрии, КТ орбит - равномерное утолщение прямых мыщц глаза (до 4,6 мм).

Пациент вошел в группу исследования больных эндокринной офтальмопатией, резистентных к глюкокортикоидной терапии. Пациенту проведен забор венозной крови с целью определения уровней экспресии микроРНК-146а и микроРНК-155.

Описание чертежей

Фиг. 1 - Распределение уровней экспрессии микроРНК-146а в зависимости от клинической формы ЭОП, резистентных к ГК в плазме крови

Фиг. 2 - Распределение уровней экспрессии микроРНК-155 в зависимости от клинической формы ЭОП, резистентных к ГК в плазме крови

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ диагностики липогенного варианта отечного экзофтальма, заключающийся в определении уровня экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 как биомаркеров. Способ позволяет более точно определить степень экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 у больных эндокринной офтальмопатией с целью определения клинической формы данного заболевания и выбора наиболее оптимального метода лечения. 2 ил., 1 пр.

Способ диагностики липогенного варианта отечного экзофтальма, заключающийся в определении уровня экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 как биомаркеров аутоиммунного воспалительного процесса, отличающийся тем, что используется малоинвазивный метод диагностики с персонализированным подходом, заключающийся в следующем: пациентам эндокринной офтальмопатией проводят забор крови в количестве 4 мл из локтевой вены для определения степени экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155; выделяют тотальную РНК из плазмы крови и проводят количественную оценку уровня экспрессии микроРНК в соответствии с рекомендованным протоколом методом ПЦР в режиме реального времени; экспрессию микроРНК нормализуют относительно экзогенного контроля cel-miR-39-3р и рассчитывают с использованием метода 2-ΔΔCt; рассчитывают уровень экспрессии микроРНК и сопоставляют с контролем для каждого микроРНК, где для микроРНК-146а показатель 0,0135±0,025, для микроРНК-155 показатель 0,0388±0,037; если уровень экспрессии микроРНК-146а составляет 0,1036±0,121 и микроРНК-155 - 0,0662±0,006, то у пациента можно диагностировать миогенный и смешанный вариант отечного экзофтальма; если уровень экспрессии микроРНК-146а составляет 0,7812±0,247 и микроРНК-155 - 0,0994±0,043, то у пациента можно диагностировать липогенный вариант отечного экзофтальма; если уровень экспрессии микроРНК-146а составляет 0,3579±0,229 и микроРНК-155 - 0,0896±0,043, то у пациента можно диагностировать эндокринную миопатию в стадии фиброза.