МИКРОРНК-19А/19В ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ, СВЯЗАННОГО С ПОТЕРЕЙ КОСТНОЙ МАССЫ ИЛИ СНИЖЕНИЕМ МЫШЕЧНОЙ ФУНКЦИИ Российский патент 2022 года по МПК A61K31/711 A61K38/29 A61P19/08 A61P19/10 

Изобретение относится к ингибиторам микроРНК-19a и -19b и их применению для лечения или предупреждения состояний или заболеваний, связанных с потерей костной массы, в частности, остеопороза и несовершенного остеогенеза (НО). Ингибиторы также пригодны для индуктирования анаболического действия на кость, либо по отдельности, либо при введении в сочетании с паратиреоидным гормоном или его рекомбинантным фрагментом. Изобретение дополнительно относится к ингибиторам микроРНК-19a и -19b и их применению для лечения или предупреждения состояний или заболеваний, связанных со снижением мышечной функции, в частности, мышечной дегенерации и мышечной атрофии. Ингибиторы также пригодны для стабилизации и/или укрепления мышечной функции. Кроме того, ингибиторы микроРНК-19a и -19b могут применяться для лечения или предупреждения связанного с раком разрушения кости или метастазирования в кость.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Остеопороз является наиболее распространенным заболеванием опорно-двигательной системы у женщин и мужчин, часто приводящим к остеопоротическим переломам. Указанные переломы часто увеличивают заболеваемость и смертность, особенно среди пожилых людей, и поэтому представляют собой серьезную медицинскую и социально-экономическую проблему. Хотя кость является высокодинамичной тканью, постоянно разрушающейся и восстанавливающейся на протяжении всей жизни путем резорбирующих кость остеокластов и формирующих кость остеобластов, указанные процессы тесно связаны и сбалансированы для поддержания постоянной костной массы. С возрастом резорбция кости увеличивается, а формирование кости снижается, что приводит к снижению костной массы и, в конечном итоге, к остеопорозу.

Известные антирезорбтивные препараты, такие как бисфосфонаты или RANKL-нейтрализующее антитело (Деносумаб ©), обеспечивают подходы к терапии остеопороза путем ингибирования активности остеокластов, предупреждая тем самым дальнейшую потерю костной массы. Напротив, введение рекомбинантного фрагмента паратиреоидного гормона (называемого в литературе ПТГ 1-34 или терипаратидом (Фортео ©/Форстео ©)) в настоящее время является единственной доступной остеоанаболической терапией. Однако терапия ПТГ требует ежедневных инъекций фрагмента ПТГ 1-34, и общая продолжительность терапии ограничена 24 месяцами из-за соображений безопасности. Соответственно, существует необходимость в дополнительных вариантах терапии, предотвращающих потерю костной массы и/или приводящих к увеличению костной массы и плотности кости.

МикроРНК представляют собой некодирующие РНК, которые могут блокировать экспрессию кодирующих белок генов. Обнаружено, что микроРНК кодируются в геноме многих организмов, в том числе млекопитающих и животных, не являющихся млекопитающими. МикроРНК способны связываться с 3'-нетранслируемой областью (3'-НТО) мРНК (матричной РНК) гена-мишени благодаря комплементарности ее оснований. В зависимости от комплементарности связывающей последовательности и вовлеченных белков микроРНК ингибируют трансляцию мРНК или вызывает разложение мРНК. Частичная комплементарность оснований между микроРНК и родственной мРНК обычно приводит к ингибированию трансляции мРНК, тогда как совершенная комплементарность оснований вызывает разложение мРНК.

МикроРНК обычно имеют длину от 18 до 24 нуклеотидов, и их получают путем поэтапного процессинга молекул-предшественников. МикроРНК транскрибируются с помощью полимеразы II или III либо из кодирующих генов, либо из интронов. Первичный транскрипт, полученный в результате транскрипции генов, называется первичной микроРНК (прай-микроРНК). Она имеет длину от 500 до 3000 нуклеотидов и несет 7-метилгуанозиновый кэп на 5'-конце и поли-A-хвост на 3'-конце. Прай-микроРНК подвергается процессингу ферментом РНКазой III Drosha и дцРНК-связывающим белком DGCR8 в ядре клетки в микроРНК-предшественник (пре-микроРНК) длиной от 70 до 80 нуклеотидов. Пре-микроРНК образует характерную структуру шпильки и экспортируется через нуклеиновые поры в цитоплазму, где она подвергается процессингу ферментом РНКазой III Dicer в дц-микроРНК длиной от 17 до 24 нуклеотидов. Dicer взаимодействует с белком, который специфически связывается с дц-микроРНК, чтобы раскрутить указанные дуплексы. Получающиеся в результате оц-микроРНК могут препятствовать экспрессии соответствующей мРНК-мишени.

Сообщалось, что несколько микроРНК участвуют в регуляции множества физиологических процессов и процессов развития. В последнее время микроРНК привлекли значительное внимание в качестве потенциальных терапевтических мишеней для лечения таких заболеваний, как гепатит C [1], хронический лимфоцитарный лейкоз [2], колоректальный рак [3], ожирение [4] или шизофрения [5].

Настоящее изобретение основано на осознании того, что микроРНК-19a и микроРНК-19b участвуют в регуляции формирования кости, и что ингибирование указанных микроРНК является высокоэффективным способом предупреждения или снижения потери костной массы. Соответственно, ингибирование указанных микроРНК пригодно для лечения таких заболеваний, как остеопороз, связанных с потерей костной массы. Ингибиторы микроРНК-19a и микроРНК-19b оказывают анаболическое действие и могут применяться по отдельности или в сочетании друг с другом. В предпочтительном варианте осуществления один или более ингибиторов микроРНК-19a и/или микроРНК-19b применяют в сочетании с паратиреоидным гормоном или его фрагментом, таким как ПТГ 1-34, для усиления анаболического действия на кость. Изобретение также демонстрирует, что микроРНК-19a и микроРНК-19b участвуют в регуляции регенерации мышц и, в частности, в предупреждении снижения мышечной массы, силы и/или работоспособности. Как показано в приведенных ниже примерах, ингибирование указанных микроРНК эффективно для предупреждения потери мышечной функции в различных условиях. Следовательно, ингибирование указанных микроРНК также пригодно для лечения таких заболеваний, как мышечная дистрофия, мышечная атрофия, саркопения или кахексия, такой как раковая кахексия. Изобретение дополнительно демонстрирует, что ингибиторы микроРНК-19a и микроРНК-19b могут применяться для предупреждения или лечения вызванного раком разрушения кости и метастазов в кости, в частности, метастазирования рака молочной железы в кость.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов изобретение обеспечивает ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК-19b для применения в способе лечения заболевания, связанного с потерей костной массы. Заболевание, связанное с патологической степенью потери костной массы, может представлять собой, например, заболевание, характеризующееся аномальной резорбцией кости и/или формированием кости в условиях высокого метаболизма костной ткани. Ниже в настоящем документе показано, что ингибирование микроРНК-19а и/или микроРНК-19b приводит к сильному анаболическому действию на кость, что демонстрирует пригодность ингибиторов микроРНК-19а и/или микроРНК-19b для лечения заболеваний и состояний, сопровождающихся патологическим уровнем потери костной массы. Такие заболевания и состояния включают, в частности, остеопороз и несовершенный остеогенез (ОИ). Таким образом, в предпочтительном аспекте заболевание и состояние, подлежащие лечению ингибиторами микроРНК-19a и/или микроРНК-19b, представляет собой остеопороз. В контексте настоящего документа термин «остеопороз» включает все формы остеопороза, такие как первичный, вторичный и постменопаузальный остеопороз. Также включены остеопороз, вызванный дефицитом половых стероидов, и остеопороз, вызванный глюкокортикоидами. Ингибиторы также будут пригодны для лечения состояний, при которых необходимо анаболическое действие на кость. Например, временное применение ингибиторов у пациентов с переломами костей может помочь естественному процессу заживления путем индуктирования костной массы. В предпочтительном аспекте ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК-19b применяют по отдельности, то есть без какого-либо другого активного ингредиента. В еще одном предпочтительном аспекте ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК-19b применяют в сочетании с паратиреоидным гормоном или его фрагментом, таким как ПТГ 1-34. Ингибитор микроРНК-19а и/или микроРНК-19b эффективно усиливает анаболическое действие на кость, оказываемое ПТГ 1-34.

В еще одном аспекте изобретение обеспечивает ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК-19b для применения в способе лечения заболевания, связанного с потерей мышечной массы или функции. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибирование экспрессии микроРНК-19а и/или микроРНК-19b значительно увеличивает или восстанавливает мышечную функцию. Следовательно, ингибиторы микроРНК-19а и/или микроРНК-19b также подходят для терапевтического применения при лечении таких заболеваний, как мышечная дистрофия или мышечная атрофия. В предпочтительном аспекте ингибиторы микроРНК-19а и/или микроРНК-19b применяют для лечения мышечной дистрофии, саркопении, кахексии, такой как раковая кахексия, или мышечной атрофии. В еще одном предпочтительном аспекте ингибиторы микроРНК-19a и/или микроРНК-19b применяют для лечения потери мышечной функции, связанной с остеопорозом, такой как остеопороз, вызванный дефицитом половых стероидов, или остеопороз, вызванный глюкокортикоидами. В еще одном предпочтительном аспекте ингибиторы микроРНК-19а и/или микроРНК-19b применяют для лечения потери мышечной функции, связанной с метастазированием рака молочной железы в кость. В еще одном предпочтительном аспекте ингибиторы микроРНК-19a и/или микроРНК-19b применяют для лечения потери мышечной функции, связанной с несовершенным остеогенезом (НО). В еще одном предпочтительном аспекте ингибиторы микроРНК-19a и/или микроРНК-19b применяют для лечения потери мышечной функции, связанной с мышечной дистрофией, в частности, наследственной мышечной дистрофией из-за мутации гена дистрофина, например типа Дюшенна или типа Беккера-Кинера.

В другом аспекте изобретение обеспечивает ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК-19b для применения в способе предупреждения или лечения связанного с раком разрушения кости. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что ингибиторы микроРНК-19а и/или микроРНК-19b эффективно ингибируют пролиферацию разрушающих кость клеток метастатического рака молочной железы MDA-MB-231. Соответственно, ингибиторы микроРНК-19а и/или микроРНК-19b могут применяться для терапевтического лечения или предупреждения связанного с раком остеолиза, лечения или предупреждения метастазирования в кость, такого как метастазы в кость, вызванные раком молочной железы.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение обеспечивает ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК-19b для применения в способе лечения несовершенного остеогенеза (НО). Несовершенный остеогенез, также известный как болезнь «хрустального человека», представляет собой редкое генетическое заболевание, поражающее кости, вызываемое одной или несколькими мутациями в гене, кодирующем коллаген I типа. Было выявлено несколько мутаций и подтипов, вызывающих НО. У людей с НО могут происходить переломы костей практически без телесных повреждений. НО может варьироваться от очень тяжелой до легкой степени. Индивидуумы с наиболее тяжелым типом НО могут умереть при рождении. Выжившие люди с тяжелым НО могут иметь искривленные руки и ноги, очень низкий рост и быть неспособны ходить. Люди с самой легкой формой НО могут иногда ломать кости и иметь нормальный рост и продолжительность жизни. Переломы могут происходить в любой кости, но чаще всего происходят на руках и ногах. В настоящее время стандарт лечения тяжелых форм НО включает применение бисфосфонатов и хирургическое вмешательство для установки штифтов в кости с целью их укрепления. Антирезорбтивное лечение бисфосфонатами направлено на уменьшение остеокласт-зависимой резорбции кости. За счет уменьшения резорбции достигается более высокая костная масса. Хотя качество кости остается низким, более высокая костная масса значительно снижает риск перелома. Кроме того, было показано, что костеобразующие агенты эффективны для дополнительного увеличения костной массы и в настоящее время изучаются в клинических исследованиях. Поскольку было показано, что ингибиторы микроРНК-19а и/или микроРНК-19b улучшают формирование кости и костную массу при различных условиях, они подойдут для лечения НО.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Известно, что микроРНК-19a и/или -19b экспрессируются из полицистронного кластера miR-17~92, содержащего микроРНК 17, 18, 19a, 20a, 19b-1 и 192. Некоторые из этих микроРНК ранее были связаны с раком у людей.

В изобретении предложено применение ингибиторов микроРНК-19a и/или -19b для лечения заболеваний, связанных либо с потерей костной массы, либо со снижением мышечной функции. Хотя изобретение не ограничено в этом отношении, предпочтительно, чтобы субъект, пораженный заболеваниями или состоянием, представлял собой человека. Предпочтительно возраст субъекта составляет по меньшей мере 30 лет, предпочтительно по меньшей мере 40 лет, по меньшей мере 45 лет, по меньшей мере 50 лет, по меньшей мере 55 лет, по меньшей мере 60 лет или по меньшей мере 65 лет.

В целом, может быть использована молекула любого типа, взаимодействующая с микроРНК-19a и/или микроРНК-19b, или их пре-микроРНК, снижая или блокируя экспрессию или функцию любой из этих микроРНК или их соответствующих пре-микроРНК. Предпочтительно, чтобы используемые в настоящем документе ингибиторы представляли собой молекулы нуклеиновой кислоты, такие как молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их производные, модифицированные, как поясняется ниже. Особенно предпочтительно, чтобы ингибиторы представляли собой олигонуклеотиды ДНК или РНК, содержащие или состоящие из последовательности, позволяющей им гибридизоваться с их родственными микроРНК, то есть микроРНК-19а и/или микроРНК-19b, с образованием дуплекса, предупреждающего связывание микроРНК с их мРНК-мишенью. Специалистам в данной области техники известны другие способы ингибирования микроРНК-19а и/или микроРНК-19b, или их пре-микроРНК, и такие способы включают микроРНК-губки, анти-микроРНК на основе лентивирусного вектора (miRZip) и ингибиторы Tough Decoy.

В контексте настоящего документа термин «олигонуклеотид» относится к олигомеру или полимеру нуклеотидных мономеров. Согласно изобретению олигонуклеотид может иметь любую длину, но предпочтительно он будет иметь длину от 8 до 50 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 40 нуклеотидов, от 12 до 30 нуклеотидов, от 15 до 25 нуклеотидов и наиболее предпочтительно от 18 до 24 нуклеотидов. Например, олигонуклеотид может иметь длину 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 или 50 нуклеотидов. Для некоторых областей применения олигонуклеотид также может содержать более 50 нуклеотидов, например 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов. Олигонуклеотид может представлять собой одноцепочечную, двухцепочечную или частично двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты. Способы получения олигонуклеотидов широко известны и включают химический синтез или способы на основе ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Олигонуклеотид предпочтительно будет состоять из нуклеотидных мономеров, связанных фосфодиэфирными мостиками. Однако также можно использовать олигомеры или полимеры, в которых сахарофосфатный остов заменен функционально схожими структурами, например, пептидным остовом или фосфорамидным, тиофосфатным, метилфосфонатным или дитиофосфатным остовом. В некоторых случаях эти модификации приводят к повышенной устойчивости олигонуклеотида к ферментативному разложению нуклеазами после введения субъекту, подлежащему лечению.

Кроме того, изобретение также охватывает олигонуклеотиды, имеющие один или более модифицированных остатков сахара. Например, одна или более гидроксильных групп могут быть заменены галогенами или алифатическими группами, или они могут быть функционализированы простыми эфирами, аминами или подобными структурами. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит один или более сахаров, в которых 2'-гидроксил был модифицирован путем добавления метильной (OMe) или метоксиэтильной (MOE) группы. Эти модификации сахара обеспечивают более высокую стабильность и устойчивость к ферментативному разложению.

Олигонуклеотид согласно изобретению также может содержать модифицированные основания наряду с природными основаниями аденином, гуанином, тимином, цитозином и урацилом, или вместо них. Указанные модифицированные основания включают, например, 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метиладенин, 6-метилгуанин, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 2-тиоцитозин, 5-галоурацил, 5-галоцитозин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 6-азоурацил, 6-азоцитозин, 6-азотимин, 5-урацил, 4-тиоурацил, 8-тиоалкиладенин, 8-гидроксиладенины, 8-тиоладенин, тиоалкилгуанин, 8-гидроксилгуанин, 8-тиолгуанин, 7-метилгуанин, 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 3-деазагуанин и/или 3-деазааденин.

Помимо вышеизложенного олигонуклеотид согласно изобретению также может содержать одну или более модификаций на его 3'- и/или 5'-конце. Например, один или оба конца могут быть связаны с защитными группами, чтобы сделать олигонуклеотид менее подверженным ферментативному разложению нуклеазами.

Предпочтительно ингибиторы микроРНК-19a и/или микроРНК-19b являются по существу комплементарными микроРНК-19a и/или микроРНК-19b. Последовательность ингибиторов анти-микроРНК-19a (5'-TGCATAGATTTGCAC-3') и анти-микроРНК-19b (5'-TGCATGGATTTGCAC-3') представлена в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно. Последовательности микроРНК-19a и микроРНК-19b приведены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. Олигонуклеотид по существу комплементарен любой из этих последовательностей, если он обладает по меньшей мере 70 % идентичностью последовательности на протяжении по меньшей мере 10, 12, 14, 16, 18 или 20 нуклеотидов. Предпочтительно олигонуклеотид обладает по меньшей мере 70 % идентичностью последовательности на протяжении 20 нуклеотидов. Предпочтительно идентичность последовательности составляет по меньшей мере 80 %, по меньшей мере 90 % или по меньшей мере 95 %. Особенно предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был полностью комплементарным на протяжении по меньшей мере 10, 12, 14, 16, 18 или 20 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления область комплементарности будет иметь менее 5 несовпадений, например, 4, 3, 2 или 1 несовпадение.

В особенно предпочтительном аспекте ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК представляет собой ДНК, содержащую

(а) последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(b) комплемент последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(c) вариант любой из последовательностей (a) или (b), идентичный им по меньшей мере на 70 % и который может создавать гибрид с микроРНК-19a и/или микроРНК-19b.

Описанные выше ингибиторы предпочтительно вводят в виде фармацевтической композиции. Таким образом, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим (а) ингибитор микроРНК-19a и/или микроРНК-19b, такой как нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты, и (b) фармацевтически приемлемый носитель. Как описано выше, ингибитор предпочтительно будет представлять собой молекулу ДНК или РНК. В одном из аспектов фармацевтическая композиция предпочтительно предназначена для применения в способе лечения заболевания, связанного с потерей костной массы. В еще одном аспекте фармацевтическая композиция предпочтительно предназначена для применения в способе лечения заболевания, связанного с потерей мышечной функции.

Приготовление фармацевтических композиций, содержащих ингибиторы на основе нуклеиновых кислот, хорошо известно специалистам в области фармацевтики. Обычно такие композиции готовят в форме для инъекций либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий. Фармацевтически активный ингибитор может быть смешан с эксципиентами, совместимыми с ингибиторами при применении у людей. Фармацевтические композиции согласно изобретению обычно содержат физиологически приемлемый носитель вместе с растворенными или диспергированными в нем молекулами ингибитора микроРНК в качестве активного ингредиента.

Фармацевтически приемлемые носители включают, например, воду, физиологический раствор, растворы Рингера или раствор декстрозы. Дополнительные подходящие носители для композиций, содержащих ингибиторы микроРНК, описаны в стандартных учебниках, например, в «Remington's Pharmaceutical Sciences», Mack Pub. Co., New Jersey (1991). В дополнение к носителю фармацевтическая композиция согласно изобретению может также содержать смачивающие агенты, буферные агенты, стабилизаторы, красители, консерванты и тому подобное в любой концентрации, при условии, что эти соединения не влияют на ингибирующую активность ингибиторов микроРНК согласно изобретению.

Для доставки ингибиторов микроРНК в место, требующее лечения, возможны различные способы введения. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена, например, для парентерального введения. Парентеральное введение включает внутривенное, внутрикожное, внутриартериальное, подкожное, местное, чресслизистое, чрескожное или ректальное введение. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления фармацевтическая композиция приготовлена для инъекции или инфузии.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекций, обычно включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Кроме того, композиция должна быть стабильной в обычных условиях производства и хранения. Для поддержания стерильности фармацевтическая композиция обычно включает консерванты, такие как парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал и тому подобное, для подавления роста микроорганизмов в продукте. Для внутривенного или внутриартериального введения подходящие носители могут включать физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Носитель также может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и тому подобное) и их подходящие смеси. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена включением в композицию агента, замедляющего абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина. Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем включения ингибиторов микроРНК в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним или более из вышеупомянутых ингредиентов с последующей стерильной фильтрацией. Аналогично, дисперсии готовят путем включения ингибиторов микроРНК в стерильный носитель, содержащий дисперсионную среду и необязательно другие ингредиенты, как указано выше. Стерильные растворы также могут быть получены путем обеспечения ингибиторов микроРНК в форме стерильного порошка способами, известными в данной области техники, такими как вакуумная сушка или лиофилизация, и восстановлением порошка стерильной жидкостью с получением готового раствора для инъекции. В качестве альтернативы, фармацевтическая композиция согласно изобретению также может быть введена путем непрерывной инфузии.

Введение фармацевтической композиции также может быть достигнуто путем трансмукозальной или трансдермальной доставки. Для трансмукозального или трансдермального введения фармацевтическая композиция, содержащая ингибиторы микроРНК согласно изобретению, будет содержать вещества, обеспечивающие проникновение, подходящие для проникновения через кожный барьер или барьер слизистой. Такие вещества, обеспечивающие проникновение, известны из уровня техники и включают, например, для трансмукозального введения - детергенты, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Трансмукозальное введение может быть осуществлено посредством применения назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения входят в состав мазей, бальзамов, гелей или кремов, как общеизвестно из уровня техники. Трансдермальные композиции могут быть введены, например, с помощью пластырей или микроигл. Предпочтительно соединения готовят в форме суппозиториев с обычными основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды для ректальной доставки.

В одном из вариантов осуществления ингибиторы микроРНК объединяют с носителями, которые будут защищать ингибиторы от выведения из организма, такими как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно применять поддающиеся биологическому разложению, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления составов с контролируемым высвобождением хорошо известны в данной области техники. Кроме того, могут быть получены композиции с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, имеющие вид формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты и тому подобное.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, связанного с патологическим уровнем потери костной массы, такого как остеопороз и НО, включающему введение терапевтически эффективного количества ингибитора микроРНК-19a и/или микроРНК-19b, или фармацевтической композиции, как определено выше, содержащей такой(ие) ингибитор(ы). В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, связанного с потерей мышечной функции, такого как мышечная дистрофия, саркопения, кахексия, такая как раковая кахексия, или мышечная атрофия, включающему введение терапевтически эффективного количества ингибитора микроРНК-19a и/или микроРНК-19b, или фармацевтической композиции, как определено выше, содержащей такой(ие) ингибитор(ы).

Терапевтически эффективное количество ингибиторов микроРНК обычно представляет собой количество, которое при введении является достаточным для эффективного блокирования или снижения экспрессии микроРНК-19а и/или микроРНК-19b, или их соответствующих прай- или пре-микроРНК. В целом, для целей изобретения может быть использована молекула любого типа, которая препятствует экспрессии микроРНК-19а и/или микроРНК-19b.

Специалистам в данной области будет ясно, что количество ингибитора, подлежащее введению пациенту, будет зависеть от нескольких факторов, таких как возраст и масса тела пациента, а также природа и тяжесть симптомов, подлежащих лечению. Количество ингибитора, оказывающее желаемое терапевтическое действие, может быть определено в случае каждого отдельного пациента с использованием рутинных экспериментов. Как правило, дозировка ингибитора микроРНК на массу тела варьируется от приблизительно 0,1 мг на кг массы тела пациента до приблизительно 50 мг на кг массы тела пациента, и более предпочтительно от приблизительно 0,5 мг на кг массы тела пациента до приблизительно 20 мг на кг массы тела пациента, и еще более предпочтительно от 1 мг на кг массы тела пациента до приблизительно 10 мг на кг массы тела пациента. Схема введения может включать одно или более введений ингибитора в сутки.

Например, лечение может продолжаться в течение по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 5 недель, по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере 7 недель, по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 9 недель, по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 11 недель или по меньшей мере 12 недель. Для некоторых показаний лечение может продолжаться в течение по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев или по меньшей мере 18 месяцев. Период лечения будет определяться практикующим врачом с учетом нескольких факторов, таких как природа и тяжесть симптомов, подлежащих лечению, способ введения и тому подобное.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показано увеличение костной массы in vivo путем ингибирования микроРНК-19a/b. (а): диаграмма Венна, демонстрирующая снижение микроРНК при лечении мышей ПТГ или антителом к склеростину, соответственно. (b): экспрессия микроРНК-19a и микроРНК-19b в костях мышей, получавших ПТГ или Scl-Ab. (c): экспрессия микроРНК-19a и микроРНК-19b в остеобластах черепа, стимулированных in vitro с помощью ПТГ или Wnt3a. (d): дифференцировка остеобластов черепа, трансфицированных рандомизированным контрольным ингибитором микроРНК (ранд.), ингибиторами (анти-микроРНК) микроРНК-19a или микроРНК-19b, или комбинацией анти-микроРНК-19a и -19b (19a/b), оцененная по окрашиванию на активность щелочной фосфатазы. (e): окрашивание по Фон Косса проксимального отдела большеберцовой кости и двойное флуоресцентное мечение формирования кости (вставки). (f): гистоморфометрический анализ проксимального отдела большеберцовой кости. (g): окрашивание по Фон Косса четвертого поясничного позвонка тех же животных, что и в (e)-(f). (h): ОК/ОТ (объем кости/объем ткани) четвертого поясничного позвонка тех же животных, что и в (e)-(f). Средние значения ± СКО. *p менее 0,05, **p менее 0,01, ***p менее 0,001 по сравнению с носителем, #p менее 0,05, ###p менее 0,001 по сравнению с рандомизированным контролем. (i)-(k): сканирование с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) дистального отдела бедренной кости (i, j) и поперечные срезы средней трети бедренной кости (k) тех же животных, что и в (e), после прекращения лечения. (l): количественная оценка анализа микро-КТ дистального отдела бедренной кости тех же животных, что и в (e). Средние значения ± СКО. *р менее 0,05 по сравнению с рандомизированным контролем. Сокращения: ОК/ОТ, объем кости/объем ткани; ПМ/ПК, поверхность минерализации/поверхность кости; СФК/ПК, скорость формирования костей/поверхность кости; САМ - скорость аппозиции минералов; ПО/ПК, поверхность остеоидов/поверхность кости; ПОб/ПК, поверхность остеобластов/поверхность кости; КОб/ПК, количество остеобластов/поверхность кости; ЭП/ПК, эрозированная поверхность/поверхность кости; ПОк/ПК, поверхность остеокластов/поверхность кости; КОк/ПК, количество остеокластов/поверхность кости; ТГ - толщина губчатого вещества; РГ, разобщенность губчатого вещества; ТЧ - трабекулярное число; ИМС, индекс модельной структуры.

На фиг. 2 показано, что ингибирование микроРНК-19a и микроРНК-19b усиливает анаболическое действие на кость при лечении иПТГ (интактным ПТГ) и восстанавливает костную массу в мышиной модели остеопороза. (а): окрашивание по Фон Косса и (b): гистоморфометрический анализ проксимального отдела большеберцовых костей 12-недельных самцов мышей генотипа Dmp1-Cre^-; Tgif1^fl/fl после лечения прерывистым введением ПТГ и/или еженедельными инъекциями анти-микроРНК-19a/b в течение четырех недель. Сокращения см. в условных обозначениях к фиг. 1. На масштабной линейке показан 1 мм. (c): изменение отношения ОК/ОТ с течением времени для большеберцовых костей самок мышей, у которых был вызван остеопороз с помощью овариэктомии (ОВЭ) за 21 день до начала еженедельного лечения анти-микроРНК-19a/b. (d)-(f), сканы микро-КТ дистального отдела бедренных костей (d, e) и поперечных срезов средней трети бедренных костей (f) тех же животных, что и в (с), после прекращения лечения. (g)-(i), микро-КТ-анализ ОК/ОТ губчатого вещества бедренных костей (g), большеберцовых костей (h) и четвертых поясничных позвонков (i) через 70 дней после овариэктомии. (j) модель действия микроРНК-19a/b. Средние значения ± СКО. *р менее 0,05, ***р менее 0,001 по сравнению с ранд, носителем; ##p менее 0,01 по сравнению с анти-микроРНК-19a/b, носителем; §§§p менее 0,001 по сравнению с ранд., иПТГ. *р менее 0,05 по сравнению с имитацией операции; ранд. #p менее 0,05, ##p менее 0,01 по сравнению с ОВЭ; ранд.

На фиг. 3 показано действие анти-микроРНК-19a/b на вызванную овариэктомией потерю мышечной функции у мышей. (а): гистологический анализ передней большеберцовой мышцы от мышей-самцов дикого типа C56Bl/6, которым инъецировали меченые FAM рандомизированные или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотиды. Стрелки указывают на центральные ядра. (b): сократительная способность ex vivo длинного разгибателя пальцев (EDL) у самок мышей C57Bl/6J, подвергнутых овариэктомии или имитации операции, после введения рандомизированных (ранд.) или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов. (c): сократительная способность ex vivo камбаловидной мышцы у самок мышей C57Bl/6J, подвергнутых овариэктомии или имитации операции, после введения ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов. (d): усталость ex vivo длинного разгибателя пальцев у самок мышей C57Bl/6J, подвергнутых овариэктомии или имитации операции, после введения ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов. (e): усталость ex vivo камбаловидной мышцы у самок мышей C57Bl/6J, подвергнутых овариэктомии или имитации операции, после введения ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов. *р менее 0,05 по сравнению с ОВЭ; ранд.

На фиг. 4 показано действие анти-микроРНК-19a/b на рост клеток рака молочной железы MDA-MB-231, метастазировавшего в кость, in vitro. (а): пролиферация клеток MDA-MB-231, трансфицированных ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидами. (b): пролиферация клеток MDA-MB-231, трансфицированных ранд. или микроРНК-19a/b олигонуклеотидами. **р менее 0,01 по сравнению с ранд.

На фиг. 5 показано, что ингибирование микроРНК-19a и микроРНК-19b уменьшает метастазы рака молочной железы в кости и восстанавливает вызванную раком молочной железы потерю костной массы и мышечной функции. (а) количественное определение сигнала биолюминесценции у мышей с опухолями, получавших рандомизированные (ранд., квадратики) или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотиды (треугольники) в течение четырех недель. (b) анализ с помощью микро-КТ проксимального отдела большеберцовой кости у мышей, не имеющих опухолей (контроль), и у мышей с метастазами в кости после лечения ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидами. (c) сократительная способность ex vivo камбаловидной мышцы у мышей, не имеющих опухолей (контроль), и у мышей с опухолями после введения ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов. (d) усталость ex vivo камбаловидной мышцы у мышей, не имеющих опухолей (контроль), и у мышей с опухолями, которым вводили ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотиды. Средние значения ± СКО. *р менее 0,05 по сравнению с мышами, не имеющими опухолей.

На фиг. 6 показано действие анти-микроРНК-19a/b на вызванную глюкокортикоидами потерю костной массы и мышечной функции у мышей. (а) масса жировой ткани у мышей после лечения плацебо или глюкокортикоидами (преднизолоном) и доставки скремблированных (ранд.) или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов, измеренные с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA). (b) масса тела, измеренная с помощью DXA. (c)-(e) анализ с помощью DXA минеральной плотности кости у мышей после лечения плацебо или преднизолоном и доставки ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов во всем теле (c), бедренных костях (d) и позвоночнике (e). (f)-(h) вес икроножной мышцы во влажном состоянии (f), четырехглавой мышцы (g) и передней большеберцовой мышцы (h) у мышей, получавших плацебо или преднизолон и ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотиды. (i) сила мышц in vivo, определенная после 2 недель лечения плацебо или преднизолоном и ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидами, с использованием теста силы захвата передними конечностями в вертикальном положении. (j) функциональный мышечный тест in vivo (сила плантарной флексии) у мышей, получавших плацебо или преднизолон и ранд. или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотиды. Средние значения ± СКО. ^*P менее 0,05 по сравнению с мышами, получавшими соответствующее плацебо, ^#P менее 0,05 по сравнению с мышами, получавшими преднизолон и ранд.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Анализ экспрессии микроРНК in vivo

Чтобы идентифицировать микроРНК, которые регулируются в ответ на анаболический стимул кости, авторы вводили 8-недельным мышам рекомбинантный фрагмент человеческого паратиреоидного гормона (ПТГ 1-34) или антитело к склеростину (Scl-Ab). В частности, самцам мышей дикого типа инъецируют носитель, 100 мкг/кг ПТГ 1-34 (Bachem) или 100 мкг/кг Scl-Ab. Через 4 часа общую РНК, включая малые РНК, выделяли из костей мышей с использованием тризола (Invitrogen) в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем. Для анализа экспрессии синтезируют кДНК (комплементарную ДНК) из 1 мкг общей РНК с использованием набора для синтеза кДНК ProtoScript First Strand (NEBioLabs). Количественную ПЦР в реальном времени (РТ-кПЦР) проводят с помощью системы обнаружения CFX96 (BioRad) с использованием SYBR Green Master Mix (BioRad). После нормализации к мРНК TATA-связывающего белка (Tbp) рассчитывают относительные уровни экспрессии и кратную индукцию каждого гена-мишени с использованием сравнительного метода CT (ΔΔCT). Малые РНК выделяют из различных тканей мышей с помощью тризола. Набор QuantimiR (SBI System Biosciences) используют для добавления полиА-хвоста к малым РНК для синтеза кДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Относительную экспрессию микроРНК определяют с помощью SYBR Green Detection (BioRad) с использованием универсального обратного праймера и специфического прямого праймера, разработанного для каждой интересующей микроРНК. Экспрессию U6 используют в качестве внутреннего контроля, а относительную экспрессию микроРНК рассчитывают с использованием метода ΔΔCT.

Результаты: Лечение мышей ПТГ или Scl-Ab снижало экспрессию 35 или 129 микроРНК в кости, соответственно. Было обнаружено, что экспрессия 22 микроРНК подавлялась при обоих вариантах лечения (фиг. 1a). Среди микроРНК, экспрессия которых повсеместно подавлялась, были идентифицированы микроРНК-19a и микроРНК-19b. Прямая количественная оценка экспрессии микроРНК-19a/b в кости подтвердила их негативную регуляцию ПТГ и Scl-Ab (фиг. 1b).

Пример 2. Анализ экспрессии микроРНК in vitro

Для исследования действия стимуляции остеобластов черепа ПТГ 1-34 и Wnt3a был проведен анализ in vitro. Остеобласты черепа выделяют у мышей 2-3-дневного возраста и размножают в α-MEM, содержащей 10 % FBS и P/S. Остеобласты стимулируют носителем, ПТГ 1-34 (100 мкМ) или Wnt3a (100 нг/мл) в течение 4 часов, и малые РНК выделяют из клеток с использованием набора miRNEasy (Qiagen). После синтеза кДНК экспрессию микроРНК-19a и микроРНК-19b анализируют с помощью РТ-кПЦР. Экспрессию U6 используют в качестве внутреннего контроля, а относительную экспрессию микроРНК рассчитывают с использованием метода ΔΔCT.

Результаты: как стимуляция ПТГ 1-34, так и Wnt3a вызывают снижение экспрессии микроРНК-19a/b в остеобластах черепа (фиг. 1c).

Пример 3. Анализ дифференцировки остеобластов in vitro

Чтобы проверить, можно ли влиять на дифференцировку остеобластов черепа путем вмешательства в экспрессию микроРНК-19a/b, клетки трансфицируют олигонуклеотидами, сконструированными для связывания и ингибирования эндогенной микроРНК-19a (анти-микроРНК-19a: 6-FAM/TGCATAGATTTGCAC) и микроРНК-19b (анти-микроРНК-19b: 6-FAM/TGCATGGATTTGCAC). Эти синтетические олигонуклеотиды содержат тиофосфатные связи в остове для оптимального использования в функциональных исследованиях, а также обладают оптимизированными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами и минимальной токсичностью. Кроме того, 5'-метка флуоресцеина FAM позволяет контролировать эффективность трансфекции in vitro и доставку в ткани in vivo. Клетки трансфицируют анти-микроРНК-19a/b (50 нМ), используя систему электропорации Neon (Invitrogen). Дифференцировку остеобластов индуцируют, добавляя в α-MEM 0,2 мМ L-аскорбиновой кислоты и 10 мМ β-глицерофосфата (оба от Millipore). Дифференцировку остеобластов определяют по окрашиванию щелочной фосфатазы (ALP) после фиксации клеток в 4 % нейтрально забуференном растворе формальдегида. Для окрашивания ALP клетки инкубируют с нафтолом AS-MX/Fast Blue (оба от Sigma-Aldrich) в растворе трис-HCl в течение 15 минут при комнатной температуре.

Результаты: было обнаружено, что дифференцировка остеобластов черепа усиливалась за счет трансфекции ингибиторами против микроРНК-19a и микроРНК-19b синергетическим образом (фиг. 1d).

Пример 4. Анализ костей у мышей, получавших анти-микроРНК-19a/b

Чтобы проверить, может ли лечение комбинацией ингибиторов против микроРНК-19a и микроРНК-19b (анти-микроРНК-19a/b) оказывать анаболическое действие на кость in vivo, 8-недельных мышей лечили в течение 28 дней с помощью еженедельных внутривенных (в/в) инъекций анти-микроРНК-19a/b, а затем определяют костную массу. За 7 и 2 дня до умерщвления мышам вводят кальцеин (40 мг/кг) и демоциклин (20 мг/кг, Sigma-Aldrich) соответственно. Большеберцовые кости и тела четвертых поясничных позвонков (L4) собирают и фиксируют в 3,7 % забуференном PBS формальдегиде. Для гистоморфометрического анализа бельшеберцовые кости и L4 погружают в метилметакрилат и толуидиновый синий. Проводят окрашивания по Фон Косса и тартрат-устойчивой кислой фосфатазы (TRAP) проводят с использованием сагиттальных срезов 4 мкм. Количественные гистоморфометрические измерения кости выполняют в соответствии со стандартизированными протоколами (стандарты ASBMR) [6] с использованием системы OsteoMeasure (OsteoMetrics). Для трехмерного анализа свойств трубчатой кости и тела позвонка используют микрокомпьютерную томографию (микро-КТ). Тела четвертых поясничных позвонков (L4) мышей анализируют с использованием микрокомпьютерной томографии высокого разрешения с фиксированным размером изотропного вокселя 10 мкм (максимальное напряжение 70 кВ при X мкА и времени интеграции 400 мс; Viva80 micro-CT; Scanco Medical AG). Этот порог был подтвержден путем ручной оценки 10 отдельных томографических срезов из четырех образцов на группу для выделения минерализованной ткани и сохранения ее морфологии при исключении неминерализованных тканей. Все анализы проводят на костной ткани, извлеченной в цифровой форме, с использованием методов подсчета расстояний в трехмерном пространстве (Scanco Medical AG).

Результаты: лечение анти-микроРНК-19a/b увеличило массу губчатого вещества проксимального отдела большеберцовой кости. Гистоморфометрический анализ показал, что обработка анти-микроРНК-19a/b активировала перестройку костной ткани путем усиления параметров остеобластов и остеокластов с улучшенным формированием кости, что привело к общему увеличению костной массы (фиг. 1e и 1f). Анаболическое действие на кость при лечении анти-микроРНК-19a/b было подтверждено на телах позвонков L4 (фиг. 1g и 1h) и на дистальном отделе бедренной кости с использованием микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) (фиг. 1i - 1l).

Пример 5. Совместное лечение ингибиторами микроРНК-19a/b и прерывистым введением ПТГ (1-34)

Поскольку и ПТГ, и анти-микроРНК-19a/b увеличивают костную массу, было оценено совместное лечение. Рекомбинантный фрагмент человеческого паратиреоидного гормона (ПТГ 1-34; 100 мкг/кг массы тела, Biochem) или носитель вводят внутрибрюшинно пять раз в неделю в течение трех недель 8-недельным самцам мышей. Анти-микроРНК-19a/b или контроль ранд. вводят раз в неделю в качестве совместного лечения.

Результаты: анти-микроРНК-19a/b усиливают обусловленное ПТГ увеличение костной массы в большеберцовых костях самцов мышей (фиг. 2a и 2b).

Пример 6. Ингибиторы микроРНК-19a/b на модели остеопороза

Поскольку снижение костной массы является отличительной чертой остеопороза, было проверено, может ли увеличение костной массы путем введения анти-микроРНК-19a/b также быть полезным при лечении остеопороза у женщин. Для этого 8-недельных самок мышей подвергают овариэктомии, чтобы лишить их половых стероидов, что приводило к серьезной потере массы губчатого вещества в большеберцовой кости. Чтобы имитировать клиническую ситуацию, лечение анти-микроРНК-19a/b начинают после того, как остеопороз полностью развился, через 21 день после овариэктомии путем еженедельных инъекций анти-микроРНК-19a/b или рандомизированного контроля.

Результаты: эта терапия предотвратила дополнительную потерю костной массы через 14 дней после первого введения лекарственных средств, таким образом уменьшая потерю костной массы в этой модели остеопороза. Количественное определение массы губчатого вещества дистального отдела бедренной кости, проксимального отдела большеберцовой кости и тел позвонков L4 после прекращения лечения подтвердило, что лечение анти-микроРНК-19a/b оказывает защитное действие против потери костной массы при остеопорозе.

Пример 7. Гистологический анализ мышц

Было проанализировано действие анти-микроРНК-19a/b на вызванную овариэктомией потерю мышечной функции. Гистологический анализ проводят посредством инъекции меченых FAM рандомизированных или анти-микроРНК-19a/b олигонуклеотидов раз в неделю (10 мг/кг, в/в) в течение 4 недель 8-недельным самцам мышей C56Bl/6 дикого типа. Через неделю после последней обработки мышей умерщвляют и собирают мышцы (переднюю большеберцовую мышцу). Мышцы погружают в соединение с оптимальной температурой резания (OCT) до получения срезов в замороженном состоянии с помощью криостата. Срезы тканей окрашивают растворами Шифф-иодной кислоты (PAS) и гематоксилина.

Результаты: в стационарном состоянии ядра расположены на краю мышечных волокон. Нельзя не отметить, что в обработанных анти-микроРНК-19a/b мышечных волокнах наблюдалось смещение ядер от периферии к центральному положению (фиг. 3А), что свидетельствует об активной спонтанной перестройке мышечной ткани в ответ на ингибирование микроРНК-19a/b.

Пример 8. Функциональный анализ мышц

Для исследования влияния результатов, полученных в примере 7, на функцию мышц, проводят функциональные тесты ex vivo с использованием свежесобранных мышц (длинного разгибателя пальцев и камбаловидной мышцы). 8-недельных самок мышей C57Bl/6J подвергают овариэктомии или имитируют операцию и через три недели обрабатывают рандомизированным контролем (ранд.) или анти-микроРНК-19a/b (10 мг/кг, в/в) раз в неделю в течение семи недель. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляют и анализируют сократительную способность ex vivo длинного разгибателя пальцев (EDL) и камбаловидной мышцы с использованием специального устройства, предназначенного для измерения свойств мышц мыши in situ, ex vivo и in vivo (Aurora Scientific). Для этого EDL и камбаловидную мышцу отсекают от задней конечности, к сухожилиям мышц привязывают стальные крючки и устанавливают мышцы между датчиком силы. Стимулируют сокращение мышц с помощью сверхмаксимального раздражителя между двумя электродами. Для исследований на усталость длинный разгибатель пальцев и камбаловидную мышцу стимулируют с частотой 70 Гц в течение 50 повторов и регистрируют максимальную тетаническую силу. Данные собирают и анализируют с использованием программ динамического мышечного контроля/сбора данных (DMC) и анализа данных динамического мышечного контроля (DMA) (Aurora Scientific).

Результаты: функциональные тесты показали, что овариэктомия значительно снижала силу (фиг. 3b и 3c) и упругость (фиг. 3d и 3e) длинного разгибателя пальцев и камбаловидной мышцы. Анти-микроРНК-19a/b (10 мг/кг, в/в, раз в неделю в течение семи недель) восстанавливают как силу, так и упругость до уровня контроля имитацией (фиг. 3b-3e). Это убедительно указывает на то, что антагонистическое воздействие на микроРНК-19a/b защищает от вызванной овариэктомией потери мышечной функции. Эти результаты показывают, что микроРНК-19a/b является новой мишенью в лечении сниженной мышечной функции.

Пример 9. Рост клеток рака молочной железы, метастазировавшего в кость

Приведенные выше результаты подтверждают мнение о том, что антагонистическое воздействие на микроРНК-19a/b является остеозащитным. Поэтому было проверено, может ли обработка анти-микроРНК-19a/b ослабить активность разрушающих кость клеток рака молочной железы MDA-MB-231. Чтобы проверить эту гипотезу, клетки рака молочной железы MDA-MB-231 трансфицируют нуклеотидами анти-микроРНК-19a/b, miR-19a/b или соответствующими ранд. контролями. Клетки выращивают в течение 4 дней in vitro, и пролиферацию клеток определяют с помощью MTS-теста каждый день до окончания эксперимента.

Результаты: обработка разрушающих кость клеток рака молочной железы MDA-MB-231 нуклеотидами анти-микроРНК-19a/b значительно снижала пролиферацию раковых клеток к 3 и 4 дню, тогда как доставка нуклеотидов микроРНК-19a/b повышала пролиферацию раковых клеток в эти же моменты времени по сравнению с контролем. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что ингибирование эндогенной микроРНК-19a/b в клетках рака молочной железы MDA-MB-231 может препятствовать способности к разрушению кости в контексте заболевания метастатическим раком молочной железы.

Пример 10. Лечение метастатического заболевания костей

Было проверено, может ли лечение анти-микроРНК-19a/b ослабить активность разрушающих кость клеток рака молочной железы MDA-MB-231 и защитить от вызванного раком молочной железы остеолитического заболевания in vivo. Клетку рака молочной железы MDA-MB-231, стабильно экспрессирующую ген люциферазы, инъецируют в левый желудочек 8-недельных самок мышей с иммунодефицитом SCID. Микрометастазы были обнаружены через две недели после инъекции клеток рака молочной железы с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI), и мышей случайным образом распределяют в две группы лечения. Одна группа получала рандомизированный олигонуклеотид (ранд.; 10 мг/кг), а другая группа получала анти-микроРНК-19a/b (10 мг/кг) внутривенно (в/в) раз в неделю в течение четырех недель. Опухолевую нагрузку измеряли еженедельно с помощью BLI. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляют и анализируют сократительную способность камбаловидной мышцы ex vivo с использованием специального устройства, предназначенного для измерения свойств мышц мыши in situ, ex vivo и in vivo (Aurora Scientific). Для этого камбаловидную мышцу отсекают от задней конечности, к сухожилиям мышц привязывают крючки и устанавливают мышцы между датчиком силы. Стимулируют сокращение мышц с помощью сверхмаксимального раздражителя между двумя электродами. Для исследований на усталость камбаловидную мышцу стимулируют с частотой 70 Гц в течение 50 повторов и регистрируют максимальную тетаническую силу. Данные собирают и анализируют с использованием программ динамического мышечного контроля/сбора данных (DMC) и анализа данных динамического мышечного контроля (DMA) (Aurora Scientific). Для трехмерного анализа трубчатой кости используют микрокомпьютерную томографию (микро-КТ). Трубчатые кости мышей анализируют с использованием микрокомпьютерной томографии высокого разрешения с фиксированным размером изотропного вокселя 10 мкм (максимальное напряжение 70 кВ при X мкА и времени интеграции 400 мс; Viva80 micro-CT; Scanco Medical AG). Этот порог был подтвержден путем ручной оценки 10 отдельных томографических срезов из четырех образцов на группу для выделения минерализованной ткани и сохранения ее морфологии при исключении неминерализованных тканей. Все анализы проводят на костной ткани, извлеченной в цифровой форме, с использованием методов подсчета расстояний в трехмерном пространстве (Scanco Medical AG).

Результаты: визуализация BLI показала значительное снижение роста опухолей в костях мышей, получавших анти-микроРНК-19a/b, по сравнению с контрольными мышами, получавшими ранд. (фиг. 5a). Рак молочной железы вызывал значительную потерю костной массы у мышей, получавших ранд., что предотвращалось еженедельным лечением анти-микроРНК-19a/b (фиг. 5b). Функциональные мышечные тесты показали, что анти-микроРНК-19a/b (10 мг/кг, в/в, раз в неделю в течение четырех недель) восстанавливают вызванную раком потерю как силы, так и выносливости камбаловидной мышцы (фиг. 5c и 5d). Это убедительно указывает на то, что антагонистическое воздействие на микроРНК-19a/b снижает метастатическую нагрузку на кость и защищает от вызванной раком молочной железы потери костной массы и мышечной функции.

Пример 11. Лечение остеопороза, вызванного глюкокортикоидами

Для исследования того, участвует ли анти-микроРНК-19a/b в вызванном глюкокортикоидами остеопорозе, пеллеты плацебо или преднизолона (2,1 мг/кг/сут) подкожно имплантируют 4-месячным самкам мышей C57Bl/6J. За один день до имплантации пеллет и затем раз в неделю мыши получают рандомизированный контроль (ранд.) или анти-микроРНК-19a/b (10 мг/кг, в/в). Минеральную плотность кости (МПК) и массу жировой ткани в организме измеряют до и после 4 недель лечения с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA, Piximus). Силу мышц in vivo определяли через 2 недели лечения с помощью теста силы захвата передними конечностями в вертикальном положении. Функциональные мышечные тесты in vivo (сила плантарной флексии) выполняют с использованием специального устройства, предназначенного для измерения свойств мышц мыши in vivo (Aurora Scientific). Максимальную силу сокращения мышц нормируют к массе тела. Через 4 недели лечения мышей умерщвляют и измеряют вес икроножной, четырехглавой и передней большеберцовой (TA) мышц во влажном состоянии.

Результаты: измерение с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии выявило увеличение массы жировой ткани при лечении глюкокортикоидами (преднизолоном), что было предотвращено еженедельной доставкой анти-микроРНК-19a/b (фиг. 6a). Никаких изменений в общей массе тела не наблюдалось (фиг. 6b). Кроме того, МПК была значительно снижена в бедренных костях и в позвоночнике мышей, получавших преднизолон (фиг. 6c-e). Мыши, получавшие анти-микроРНК-19a/b, были защищены от вызванной глюкокортикоидами потери МПК (фиг. 6c-e). Хотя глюкокортикоиды снижают мышечную массу у мышей, получавших как ранд., так и анти-микроРНК-19a/b, масса икроножной, четырехглавой и передней большеберцовой мышц была значительно выше у мышей, получавших анти-микроРНК-19a/b по сравнению с контрольными мышами, получавшими ранд. (фиг. 6f-h). Важно отметить, что лечение анти-микроРНК-19a/b предотвращало вызванную глюкокортикоидами потерю мышечной функции, определяемую с помощью тестов силы захвата и плантарной флексии (фиг. 6i, j).

Источники информации

1. Janssen, H.L.A. et al., Treatment of HCV Infection by Targeting MicroRNA, N. Engl. J. Med. 368, 1685-1694 (2013).

2. Musilova K. & Mraz M., MicroRNAs in B cell lymphomas: How a complex biology gets more complex", Leukemia, 2015 29 (5), 1004-17 (2015).

3. Nielsen B.S., et al., High levels of microRNA-21 in the stroma of colorectal cancers predict short disease-free survival in stage II colon cancer patients, Clin Exp Metastasis 28 (1): 27-38 (2010).

4. Romao J.M. et al., MicroRNA regulation in mammalian adipogenesis, Exp. Biol. Med. 236 (9), 997-1004 (2011).

5. Hommers L.G. et al., Heterogeneity and Individuality: microRNAs in Mental Disorders, J Neural Transm. 122 (1): 79-97 (2015).

6. Parfitt, A.M. et al., Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J. Bone Miner. Res. 2, 595-610 (1987).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

SEQ ID NO: 1 - 5'-TGCATAGATTTGCAC-3' (анти-микроРНК-19a)

SEQ ID NO: 2 - 5'-TGCATGGATTTGCAC-3' (анти-микроРНК -19b)

SEQ ID NO: 3 - 5'-UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA-3'(микроРНК-19a)

SEQ ID NO: 4 - 5'-UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA-3'(микроРНК -19b)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, связанного с потерей костной массы. Также раскрыт способ лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, связанного со снижением мышечной функции, а также к способу лечения или предупреждения связанного с раком разрушения кости. Изобретение эффективно для лечения остеопороза, несовершенного остеогенеза, мышечной атрофии, саркопении и кахексии. 12 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 пр.

1. Способ лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, связанного с потерей костной массы, включающий введение ингибитора микроРНК-19а и/или микроРНК-19b, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой остеопороз или несовершенный остеогенез (НО).

2. Способ лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, связанного со снижением мышечной функции, включающий введение ингибитора микроРНК-19а и/или микроРНК-19b, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой мышечную атрофию, саркопению или кахексию.

3. Способ лечения или предупреждения связанного с раком разрушения кости, включающий введение ингибитора микроРНК-19а и/или микроРНК-19b.

4. Способ по п. 3, где указанное связанное с раком разрушение кости вызвано метастазированием в кость.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанный ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, или аналог нуклеиновой кислоты.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанный ингибитор вводят путем внутривенного, подкожного, трансдермального или трансмукозального введения.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанный ингибитор содержит последовательность ДНК или РНК, связывающуюся с или снижающую экспрессию микроРНК-19а и/или микроРНК-19b.

8. Способ по п. 7, где указанный ингибитор представляет собой ДНК, содержащую

(а) последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(b) комплемент последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(c) вариант любой из последовательностей (a) или (b), идентичный им по меньшей мере на 80 % и который может гибридизоваться с микроРНК-19a и/или микроРНК-19b.

9. Способ лечения заболевания или патологического состояния, связанного с потерей костной массы, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей (a) ингибитор микроРНК-19а и/или микроРНК-19b и (b) фармацевтически приемлемый носитель, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой остеопороз или несовершенный остеогенез (НО).

10. Способ лечения заболевания или патологического состояния, связанного со снижением мышечной функции, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей (a) ингибитор микроРНК-19а и/или микроРНК-19b и (b) фармацевтически приемлемый носитель, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой мышечную атрофию, саркопению или кахексию.

11. Способ лечения связанного с раком разрушения кости, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей (a) ингибитор микроРНК-19а и/или микроРНК-19b и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

12. Способ по любому из пп. 9-11, где указанный ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту или аналог нуклеиновой кислоты.

13. Способ по любому из пп. 9-12, где указанный ингибитор представляет собой ДНК или РНК.

14. Способ по любому из пп. 9-13, где указанный ингибитор вводят путем инфузии или инъекции.

15. Способ по любому из пп. 9-14, где указанный ингибитор содержит последовательность ДНК или РНК, связывающуюся с и ингибирующую или снижающую экспрессию микроРНК-19а и/или микроРНК-19b.

16. Способ по любому из пп. 9-15, где указанный ингибитор представляет собой ДНК, содержащую

(а) последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(b) комплемент последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(c) вариант любой из последовательностей (a) или (b), идентичный им по меньшей мере на 70 % и который может гибридизоваться с микроРНК-19a и/или микроРНК-19b.

17. Применение ингибитора микроРНК-19а и/или микроРНК-19b для лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, связанного с потерей костной массы, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой остеопороз или несовершенный остеогенез (НО).

18. Применение ингибитора микроРНК-19а и/или микроРНК-19b для лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, связанного со снижением мышечной функции, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой мышечную атрофию, саркопению или кахексию.

19. Применение ингибитора микроРНК-19а и/или микроРНК-19b для лечения или предупреждения связанного с раком разрушения кости.

20. Применение по п. 19, где указанное связанное с раком разрушение кости вызвано метастазированием в кость.

21. Применение по любому из пп. 17-20, где указанный ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, или аналог нуклеиновой кислоты.

22. Применение по любому из пп. 17-21, где указанный ингибитор содержится в композиции, пригодной для внутривенного, подкожного, трансдермального или трансмукозального введения.

23. Применение по любому из пп. 17-22, где указанный ингибитор содержит последовательность ДНК или РНК, связывающуюся с или снижающую экспрессию микроРНК-19а и/или микроРНК-19b.

24. Применение по п. 23, где указанный ингибитор представляет собой ДНК, содержащую

(а) последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(b) комплемент последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(c) вариант любой из последовательностей (a) или (b), идентичный им по меньшей мере на 80 % и который может гибридизоваться с микроРНК-19a и/или микроРНК-19b.

25. Применение фармацевтической композиции, содержащей (a) ингибитор микроРНК-19а и/или микроРНК-19b и (b) фармацевтически приемлемый носитель, для лечения заболевания или патологического состояния, связанного с потерей костной массы, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой остеопороз или несовершенный остеогенез (НО).

26. Применение фармацевтической композиции, содержащей (a) ингибитор микроРНК-19а и/или микроРНК-19b и (b) фармацевтически приемлемый носитель, для лечения заболевания или патологического состояния, связанного со снижением мышечной функции, где указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой мышечную атрофию, саркопению или кахексию.

27. Применение фармацевтической композиции, содержащей (a) ингибитор микроРНК-19а и/или микроРНК-19b и (b) фармацевтически приемлемый носитель, для лечения связанного с раком разрушения кости.

28. Применение по любому из пп. 25-27, где указанный ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту или аналог нуклеиновой кислоты.

29. Применение по любому из пп. 25-28, где указанный ингибитор представляет собой ДНК или РНК.

30. Применение по любому из пп. 25-29, где указанный ингибитор содержится в композиции, пригодной для инфузии или инъекции.

31. Применение по любому из пп. 25-30, где указанный ингибитор содержит последовательность ДНК или РНК, связывающуюся с и ингибирующую или снижающую экспрессию микроРНК-19а и/или микроРНК-19b.

32. Применение по любому из пп. 25-31, где указанный ингибитор представляет собой ДНК, содержащую

(а) последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(b) комплемент последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или

(c) вариант любой из последовательностей (a) или (b), идентичный им по меньшей мере на 70 % и который может гибридизоваться с микроРНК-19a и/или микроРНК-19b.