Способ геноидентификации Bovine leukemia virus Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Изобретение относится к молекулярно-генетическим методам исследований в лабораторной диагностике и мониторинге возбудителя лейкоза крупного рогатого скота, и представляет собой способ геноидентификации Bovine leukemia virus (аббр. BLV) с совмещенной техникой полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).

Сфера применения изобретения: генотипическая идентификация вируса лейкоза крупного рогатого скота (аббр. ВЛКРС или ВБЛ - вирус бычьего лейкоза) в системе противолейкозных мероприятий в ветеринарии, перерабатывающей и пищевой промышленности.

Молекулярно-генетические методы исследования позволяют оценить генетическое многообразие BLV, и являются наиболее информативными подходами к его геноидентификации, как при использовании филогенетического анализа секвенируемых нуклеотидных последовательностей ДНК провируса, так и ПЦР-ПДРФ-анализа в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя. А проводимый молекулярный мониторинг инфицированности стад крупного рогатого скота генотипами BLV способен прояснить экологию возбудителя с объективным контролем эпизоотического процесса и перспективой эффективного искоренения инфекции.

Современная филогенетическая классификация BLV представлена одиннадцатью генотипами, первые семь из которых описали аргентинские ученые в 2009 г. (S.M. Rodriguez et al., 2009), восьмой генотип - исследователи из России (А.Ю. Шаева и др., 2011, 2012; P.P. Вафин и др., 2013), Хорватии ( et al., 2013) и коллаборация европейских ученых ( et al., 2013) в 2011-2013 гг.; девятый генотип - группа аргентинских, чилийских и японских ученых в 2016 г. (М. Polat et al., 2016); десятый генотип - группа исследователей из Таиланда и Южной Кореи в том же году (Е. Lee et al., 2016), и одиннадцатый генотип - китайские исследователи в 2019 г. (С.Yu et al., 2019).

Из уровня техники известна стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV, позволявшая на момент ее совершенствования идентифицировать 10 генотипов изучаемого вирусного патогена диагностически значимой интерпретацией генерируемых 57 генотип-ассоциированных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей (I.M. Donnik et al., 2019).

Цель изобретения - разработать способ геноидентификации Bovine leukemia virus с совмещенной техникой ПЦР-ПДРФ-анализа в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя и с учетом пополняемых знаний о генетическом многообразии 11 известных генотипов BLV.

Нами разработана актуализированная стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV, согласуемая с его филогенетической классификацией, обеспечивающая идентификацию всех открытых на сегодняшний день 11 генотипов вирусного патогена интерпретацией генерируемых 58 генотип-ассоциированных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей с присвоенными идентификаторами.

Условия проведения геноидентификации Bovine leukemia virus.

Выделение ДНК из цельной консервированной крови и молока крупного рогатого скота осуществлено коммерческим набором «ДНК-сорб С-М» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора МЗ РФ).

При постановке nested ПЦР с экстрагированными образцами провирусной ДНК BLV использованы «внешние» («env5032» и «env5608») и «внутренние» («env5099» и «env5521») праймеры (таблица 1), инициирующие на завершающем этапе реакции наработку фрагмента env-гена возбудителя длиной 444 bp.

Соответствующие эндонуклеазы рестрикции, использованные при ПЦР-ПДРФ-генотипировании BLV, согласуемой с его филогенетической классификацией, указаны в таблице 2.

При ПЦР-ПДРФ-моделировании применена программа NEBcutter v.2.0.

Для детекции полученных результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа применен горизонтальный электрофорез в 2,5% агарозном геле с буфером ТВЕ (рН 8,0), содержащим бромистый этидий, с последующим рассмотрением электрофореграмм в УФ-трансиллюминаторе (λ=310 нм). Размеры генерируемых фрагментов ДНК были оценены сопоставлением со стандартными маркерами молекулярного веса ДНК (ООО «СибЭнзим»).

Секвенирование продуктов ПЦР-амплификации локуса env-гена выявляемых изолятов провируса BLV проведено на генетическом каппилярном анализаторе (секвенаторе) «ABI PRISM 3100» («Applied Biosystems», США) с применением «внутренних» олигонуклеотидных праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных. Выравнивание секвенированных последовательностей локуса env-гена изолятов провируса BLV с соответствующими нуклеотидными последовательностями референсных изолятов BLV, ранее депонированных в GenBank, осуществлено с использованием программ BLAST и MEGA-4 с последующим филогенетическим анализом.

Таким образом, в результате верификации разработанного способа геноидентификации Bovine leukemia virus с актуализированной стратегией ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV, согласуемой с его филогенетической классификацией, получен технический результат, выраженный в способности идентифицировать все открытые на сегодняшний день 11 генотипов вирусного патогена интерпретацией генерируемых 58 генотип-ассоциированных комбинаций ПЦР-ПДРФ-профилей с присвоенными идентификаторами (фиг. 1, фиг. 2.).

При этом расчетные данные для верификация предложенного способа ПЦР-ПДРФ были получены также исходя из анализа выравнивания и рестрикционного картирования последовательностей ДНК локуса env-гена референсных изолятов известных генотипов BLV с последующим in silico моделированием рестриктограмм по 5 эндонуклеазам рестрикции: PvuII, SspI, HphI (изошизомер AsuHPI), HaeIII, BstYI (изошизомер BstX2I).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones // J. Gen. Virol. - 2009. - V. 90. - N. 11. - P. 2788-2797. DOI: 10.1099/vir.0.011791-0.

2. Шаева, А.Ю. Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики Татарстан / А.Ю. Шаева, P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, Б.В. Камалов, A.M. Алимов, М.Ш. Тагиров // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2011. - Т. 208. - С. 330-337.

3. Шаева, А.Ю. Идентификация нового генотипа ВЛКРС / А.Ю. Шаева, З.Р. Гараева, P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, A.M. Алимов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2012. - Т. 211. - С. 192-197.

4. Вафин, P.P. Выявление нового (8-го) генотипа ВЛКРС в различных регионах мира / P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, А.Ю. Шаева, З.Р. Закирова, Л.И. Зайнуллин, С.В. Тюлькин, И.Р. Абдулина, A.M. Алимов // Фундаментальные исследования. - 2013. - №10 (часть 7). - С. 1467-1471.

5. Identification of a new genotype of bovine leukemia virus / N. Lemo, // Arch. Virol. - 2012. - V. 157. - N. 7. - P. 1281-1290. DOI: 10.1007/s00705-012-1300-4

6. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impact on phylogeny / M. Pluta, M. Olech, I. Donnik, M. Petropavlovskiy, A. Gerilovych, I. Vinogradova, B. Choudhury, // PLoS One. - 2013. - V. 8. -N. 3. - P. e58705. DOI: 10.1371/journal.pone.0058705.

7. Polat, M. A new genotype of bovine leukemia virus in South America identified by NGS-based whole genome sequencing and molecular evolutionary genetic analysis / M. Polat, S.N. Takeshima, K. Hosomichi, J. Kim, T. Miyasaka, K. Yamada, M. Arainga, T. Murakami, Y. Matsumoto, V. de la Barra Diaz, C.J. Panei, E.T. Kanemaki, M. Onuma, G. Giovambattista, Y. Aida // Retro virology. - 2016. - V. 13. - N. 4. DOI: 10.1186/s12977-016-0239-z.

8. Lee, E. Molecular epidemiological and serological studies of bovine leukemia virus (BLV) infection in Thailand cattle / E. Lee E, E.J. Kim, J. Ratthanophart, R. Vitoonpong, B.H. Kim, IS. Cho, J.Y. Song, K.K. Lee, Y.K. Shin // Infect. Genet. Evol. - 2016. - V. 41. - N. 245-254. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.04.010.

9. Yu, C. Genotyping bovine leukemia virus in dairy cattle of Heilongjiang, northeastern China / C. Yu, X, Wang, Y. Zhou, Y. Wang, X. Zhang, Y. Zheng // BMC Vet. Res. - 2019. - V. 15. - N. 179. DOI: 10.1186/s12917-019-1863-3.

10. Donnik, I.M. Genetic identification of bovine leukaemia virus / I.M. Donnik, R.R. Vafin, A.G. Galstyan, A.S. Krivonogova, A.Y. Shaeva, Kh.Kh. Gilmanov, R.G. Karimova, S.V. Tyulkin, // Foods and Raw Materials. - 2018. - V. 6. - N. 2. - P. 314-324. DOI: 10.21603/2308-4057-2018-2-314-324.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Пояснение к Фиг. 1.

Актуализированная стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с его филогенетической классификацией

Примечания:

Г - генотип. К - комбинация. ID - идентификатор.

Пояснение к фиг. 2.

Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ-профилей 1-го генотипа BLV, интерпретированных актуализированной стратегией генотипирования.

Обозначения:

1, 7) ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp (СибЭнзим). 2-6) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса BLV «N-1» (Г1, К1, ID1.1): 2) PvuII-ПДРФ (444 bp); 3) SspI-ПДРФ (399/45 bp); 4) HphI-ПДРФ (224/220 bp); 5) HaeIII-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 bp); 6) BstYI-ПДРФ (198/128/118 bp). 8-12) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса BLV «N-4» (Г1, К4, ID1.4): 8) PvuII-ПДРФ (444 bp); 9) SspI-ПДРФ (399/45 bp); 10) HphI-ПДРФ (224/220 bp); 11) HaeIII-ПДРФ (198/94/87/32/27.6 bp); 12) BstYI-ПДРФ (246/198 bp). Примечания:

Г - генотип. К - комбинация. ID - идентификатор.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к молекулярно-генетическим методам исследований в лабораторной диагностике и мониторинге возбудителя лейкоза крупного рогатого скота. Представлен способ геноидентификации Bovine leukemia virus (аббр. BLV) с совмещенной техникой полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). В способе используют стратегию ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV. Стратегия основана на филогенетическом анализе env-гена возбудителя. В nested ПЦР используют специфические «внешние» TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA и AACAACAACCTCTGGGAAGGGT и «внутренние» CCCACAAGGGCGGCGCCGGTT и GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG праймеры, и соответствующие эндонуклеазы рестрикции - PvuII-ПДРФ, SspI-ПДРФ, AsuHPI-ПДРФ, HaeIII-ПДРФ и BstX21-ПДРФ. ПДРФ-протокол состоит из 5 последовательных шагов, инициирующих на завершающем этапе реакции наработку фрагмента env-гена возбудителя. Генотип определяют исходя из анализа выравнивания и рестрикционного картирования последовательностей ДНК локуса env-гена референсных изолятов известных генотипов BLV с последующим in silico моделированием рестриктограмм по 5 эндонуклеазам рестрикции: PvuII, SspI, HphI (изошизомер AsuHPI), HaeIII, BstYI (изошизомер BstX2I). Изобретение обеспечивает идентификацию 11 генотипов вирусного патогена. 2 табл., 2 ил.

Способ геноидентификации Bovine leukemia virus с совмещенной техникой полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, отличающийся тем, что используется стратегия ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV, основанная на филогенетическом анализе env-гена возбудителя, которая обеспечивает идентификацию 11 генотипов вирусного патогена за счет использования в nested ПЦР подобранных специфических «внешних» TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA и AACAACAACCTCTGGGAAGGGT и «внутренних» CCCACAAGGGCGGCGCCGGTT и GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG праймеров и соответствующих эндонуклеаз рестрикции - PvuII-ПДРФ, SspI-ПДРФ, AsuHPI-ПДРФ, HaeIII-ПДРФ и BstX21-ПДРФ, использованных в ПДРФ-протоколе, состоящем из 5 последовательных шагов, инициирующих на завершающем этапе реакции наработку фрагмента env-гена возбудителя, генотип определяют исходя из анализа выравнивания и рестрикционного картирования последовательностей ДНК локуса env-гена референсных изолятов известных генотипов BLV с последующим in silico моделированием рестриктограмм по 5 эндонуклеазам рестрикции: PvuII, SspI, HphI (изошизомер AsuHPI), HaeIII, BstYI (изошизомер BstX2I).