Способ детекции S-генотипа Mycobacterium tuberculosis Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/689 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к S-генотипу Mycobacterium tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis complex включает семь филогенетических линий, адаптированных к человеку (основными из которых являются линии 1-4), и несколько линий, адаптированных к различным диким и домашним животным (Gagneux, 2018). На территории России и стран бывшего СССР распространены L2 (или Восточно-Азиатская линия) и L4 (или Евро-Американская линия) (Фиг. 1)

Филогенетическая линия 4 (или Евро-Американская) распространена в большинстве регионов мира, ее уникальным маркером является 7-нуклеотидная деления в гене pks 15/1 при этом входящие в нее отдельные генотипы генетически достаточно далеки друг от друга и отличаются филогеографически (Stucki et al., 2016). Изначально генотипы линии 4 были выявлены на основании классических методов генотипирования, в основном сполиготипирования (Sola et al., 2001а; Brudey et al., 2006) или MIRU-VNTR-типирования (Kovalev et al., 2005) хотя применение полногеномного секвенирования в последние 10 лет позволило описать новые генотипы в рамках L4 (Malm et al., 2017; Mokrousov et al. 2017). Названия генетических семейств основаны как правило на географическом принципе, исходя из региона происхождения штаммов. Некоторые генетические семейства отличает глобальное или почти глобальное распространение и/или особые патогенетические признаки и следовательно интенсивные исследования, например генотипы LAM, Ural, Haarlem. Генетическое семейство S, названное так по причине его первого описания в штаммах из Сицилии (Sola et al., 2001b), достаточно распространено, но было изучено в меньшей степени. В России, впервые генотип S был описан в исследовании в Якутии в 2013 году (Zhdanova et al., 2013). Филогенетический анализ штаммов генотипа S, циркулирующих на территории Якутии показал, что наиболее близки с якутским штаммами штаммы генотипа S из Канады (Zhdanova et al., 2013: Жданова и др.. 2016). Якутские штаммы S характеризовались множественной лекарственной устойчивостью, кластеризовались на основании MIRU-VNTR типирования и несли мутацию устойчивости к канамицину в гене eis (Zhdanova et al., 2013). Была подчеркнута необходимость мониторинга циркуляции якутского варианта генотипа S и внедрения метода его детекции в схемы диагностики и персонализированного лечения больных. Более того, миграционные потоки за пределы Якутии несут риск более широкого распространения МЛУ штаммов генотипа S.

Таким образом, выявление штаммов S-генотипа Mycobacterium tuberculosis является актуальной задачей российского здравоохранения.

Известно определение штаммов данного генотипа с использованием ряда молекулярных подходов:

(1) Сполиготипирование дает характерный профиль для штаммов S с маркерными делениями сигналов 9 и 10, наряду с делецией сигналов 33-36, характерной для всей Линии 4 (Demay et al.). Но при этом есть сомнительные производные профили с крупными блоками делетированных сигналов по которым невозможно судить о генотипе штамма (Valcheva et al., 2010) (Фиг. 2).

(2) M1RU-VNTR кластеризация с референтными профилями штаммов S, представленными в базе данных MIRU-VNTRplus (Allix-Béguec et al., 2008). Однако этот подход требует типирования 24 локусов VNTR что трудоемко.

(3) Кластеризация с референтными штаммами S на полногеномном дереве (Stucki et al), что однако требует полногеномного секвенирования и биоинформатического анализа, что трудоемко и дорого.

(4) Определение мутации Rν0557 457 C>G как маркера генотипа S который был валидирован на выборке штаммов из разных регионов мира (Homolka et al., 2012).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции S-генотипа Mycobacterium tuberculosis.

Ранее описанная мутация-маркер генотипа S в гене Rν0557 в позиции 457 c>G (Homolka et al., 2012) создает сайт распознавания для эндонуклеазы рестрикции FnuDII CGCG. Для детекции данной мутации нами были сконструированы праймеры и разработан способ детекции с использованием полимеразной цепной реакции с последующей обработкой рестриктазой FnuDII и разделением продуктов рестрикции в агарозном геле (метод ПЦР-ПДРФ [полимеразная цепная реакция - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов]) (Фиг. 3).

Поставленная задача достигается выявлением наличия нуклеотидной замены в гене Rν0557 в позиции 457 с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 557Fw GTTTCGCGTCCAGCTACGGC и 557Rv ACCGGTGTACTCGCGGAATGC с последующей обработкой продукта ПЦР (150 пн) эндонуклеазой рестрикции FnuDII и электрофорезом продуктов рестрикции в агарозном геле, при этом в случае мутации Rv0557 457 C>G, специфической для S-генотипа, фрагменты рестрикции длиной 64 и 67 пн (визуально в геле видны как один яркий фрагмент длиной ~65 пн), а в случае дикого аллеля Rv0557 457-С наиболее крупный фрагмент будет длиной 131 пн и судят о принадлежности штамма к любому другому генотипу М. tuberculosis.

Техническим результатом от использования заявленного изобретения является: 1. быстрота (меньше одного дня от момента выделения ДНК); 2. простая и однозначная интерпретация результатов; 3. возможность анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к S-генотипу Mycobacterium tuberculosis с диагностической целью и при популяционных исследованиях; 4. возможность выявления контаминации и микс-инфекции.

Таким образом два варианта рестриктов легко различимы при электрофорезе в агарозном геле даже при небольшом времени электрофореза и малой длине геля, что удобно практически (Фиг. 4).

Изобретение поясняется чертежами, где Фиг. 1. Схема эволюции Mycobacterium tuberculosis complex, отдельно отмечен генотип S, входящий в филогенетическую линию 4 (Euro-American linage или Lineage 4). Адаптировано из Gagneux S. 2018. Nat Rev Microbiol.

Фиг. 2. Предковые сполиготипы генетических семейств S (SIT34) и LAM (SIT42), и неопределяемые. Маркерные делении сигналов показаны красным (S) и синим (LAM).

Фиг. 3 - Фрагмент гена Rν0557 с мутацией специфической для S-генотипа М. tuberculosis. Зеленым и жирным выделена позиция Rν0557-457C в которой мутация C>G приводит к созданию дополнительного сайта рестрикции FnuDII (CGCG). Желтым показаны постоянные сайты рестрикции FnuDII Синим показаны праймеры.

Фиг. 4 - Электрофорез в агарозном геле. ПЦР-ПДРФ детекция замены Rv0557 457 C>G. Дорожки 1-2 - штаммы с мутацией в данной позиции (генотип S), для которых характерна маркерная полоса (показана пунктирной стрелкой), состоящая из фрагментов длиной 64 пн и 67 пн; дорожки 3-5 - штаммы с аллелем дикого типа, длина характеристического фрагмента 131 пн (показан сплошной стрелкой). М - маркер молекулярных весов 50 bp ladder Amersham. п.н. - пар нуклеотидов.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. (1993): суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ x1 и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмоний бромида. Полученный клеточный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ x1.

Были использованы следующие сконструированные нами праймеры для проведения реакции ПЦР: 557Fw GTTTCGCGTCCAGCTACGGC и 557Rv ACCGGTGTACTCGCGGAATGC (Фиг. 3). Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл) содержащей 1,5 mM MgCl₂, 1 U Taq ДНК полимеразы, 200 μМ каждого из дНТФ, праймеры (по 15 пмоль каждый). ПЦР проводят в термоциклере при следующем температурном режиме: 95°С, 4 мин, 40 циклов 95°С, 40 с; 64°С, 30 с, 72°С, 20 с и финальная элонгация 72°С, 5 мин. Наличие продукта ПЦР длиной 150 пн оценивают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, окрашивают этидиумбромидом и визуализируют на УФ-трансиллюминаторе. Маркер молекулярный весов - 50 bp ladder или 100 bp ladder (Amersham) или аналогичный.

Далее продукт ПЦР обрабатывают рестриктазой FnuDII (или ее изошизомером, например, Bsh1236I) следующим образом. Рестрикцию проводят в микропробирке, помещенной в термоциклер или на водяную баню течение 3 часов при температуре 37°С в объеме 10 микролитров (5 мкл продукта ПЦР, 0,2 мкл рестриктазы [10 ед/мкл], и 1 мкл 10х буфера для данной рестриктазы). Продукты рестрикции разделяют электрофорезом в 2% агарозном геле (стандартная агароза, например, агароза SYS-Q0009-0.1 (Helicon, Москва) и высокоразрешающая агароза MetaPhor™, в соотношении 1:1), окрашивают этидиумбромидом и визуализируют на УФ-трансиллюминаторе. Маркер молекулярный весов - 50 bp ladder или 100 bp ladder (Amersham/GE Healthcare) или аналогичный.

Оценка результатов. В случае аллеля дикого типа наблюдается основной фрагмент FnuDII-рестрикции 131 пн, а при мутации Rν0557-457C>G (специфической для S-генотипа) наблюдают наличие маркерной полосы, состоящей из фрагментов длиной 64 пн и 67 пн, (Фиг. 4).

Способ был оптимизирован на штамме с известной последовательностью гена Rν0557 для которого были ранее получены данные полногеномного секвенирования (штамм 6806 из коллекции ДНК НИИЭМ им. Пастера, предковый сполиготип SIT34 генотипа S). Далее способ был апробирован на коллекциях ДНК клинических изолятов M. tuberculosis представляющих страны с различными популяциями возбудителя и различной долей штаммов генотипа S, что показано на примерах ниже. Все изоляты были ранее генотипированы методом мультилокусного VNTR-анализа и сполиготипирования, позволяющим точно определить принадлежность штамма к тому или иному VNTR-кластеру в том числе к генотипу S.

Примеры применения разработанного способа детекции генотипа S M.

Пример 1. Выявление генотипа S у изолятов М. tuberculosis в коллекции ДНК микобактерий туберкулеза из Якутии (российский регион с заметным присутствием штаммов генотипа S) разработанным методом ПЦР-ПДРФ.

В исследование были включены образцы ДНК микобактерий из Якутии (n=121). ДНК были генотипированы по 24 локусам MIRU-VNTR с последующим сравнением с онлайн-базой данных MIRU-VNTRplus.org для отнесения штаммов к VNTR-генотипам. Также штаммы были сполиготипированы, с последующим сравнением с ресурсом SITVIT2.

Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР-ПДРФ для выявления штаммов S. В качестве контрольных использовали ДНК штамма H37Rv (аллель дикого типа) и ДНК секвенированного штамма 6806, выделенного в Санкт-Петербурге (предковый сполиготип SIT34 генотипа S). Всего было выявлено 24 штамма с генотипом S и все они, на основании разработанного нами метода ПЦР-ПДРФ, были отнесены к генотипу S т.к. имели мутацию Rν0557-457C>G, также эти штаммы имели сполиготип SIT1253 и были отнесены к генотипу S на основании сравнения с базой данных SITV1T2.

Пример 2. Выявление генотипа S у изолятов M. tuberculosis в коллекции ДНК микобактерий туберкулеза из Болгарии (европейского региона с заметным присутствием штаммов S, а также штаммов с «сомнительными» профилями сполиготипирования).

В исследование были включены образцы ДНК микобактерий из Болгарии (n=113). ДНК были генотипированы по 24 локусам MIRU-VNTR с последующим сравнением с онлайн-базой данных MIRU-VNTRplus.org для отнесения штаммов к VNTR-генотипам. Также штаммы были сполиготипированы, с последующим сравнением с ресурсом SITVIT2.

Применение разработанного метода ПЦР-ПДРФ подтвердило генотип S у 5 штаммов сполиготипа SIT34, отнесенных к S-генотипу на основании VNTR-кластеризации и сполиготипирования (профиль сполиготипирования SIT34 - Фиг. 2). Также применение метода ПЦР-ПДРФ позволило корректно отнести штаммы с сполигопрофилями SIT4 (3 штамма) и SIT125 (25 штаммов) (см Фиг. 2) к генотипу S, что также согласовывалось с их VNTR-кластеризацией.

Пример 3. Выявление генотипа S у изолятов M. tuberculosis в коллекции ДНК микобактерий туберкулеза из Центральной и Восточной Азии (Казахстан, Китай, Вьетнам, Япония), региона с незначительной циркуляцией штаммов Евро-Американской линии.

В исследование были включены образцы ДНК микобактерий из Восточной Азии (Китай, Вьетнам, Япония) (n=145). ДНК были генотипированы по 24 локусам MIRU-VNTR с последующим сравнением с онлайн-базой данных MIRU-VNTRplus.org для отнесения штаммов к VNTR-генотипам. Также штаммы были сполиготипированы, с последующим сравнением с ресурсом SITVIT2.

Применение разработанного метода ПЦР-ПДРФ не выявило генотип S у изученных штаммов, что согласовывалось и с результатами генотипирования.

Литература

Allix-Béguec С, Harmsen D, Weniger Т, Supply Р, Niemann S. Evaluation and user-strategy of MIRU-VNTRplus, a multifunctional database for online analysis of genotyping data and phylogenetic identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol 2008, 46(8):2692-2699

Brudey K, Driscoll JR, Rigouts L, Prodinger WM, Gori A, Al-Hajoj SA, Allix C, Aristimuño L, Arora.J. Baumanis V, et al. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. BMC Microbiol. 2006;6:23. doi: 10.1186/1471-2180-6-23.

Demay C, Liens B, Burguiére T, Hill V, Couvin D, Millet J, Mokrousov I, Sola C, Zozio T, Rastogi N. SITVITWEB- - a publicly available international multimarker database for studying Mycobacterium tuberculosis genetic diversity and molecular epidemiology. Infect Genet Evol. 2012;12:755-66. doi: 10.1016/j.meegid.2012.02.004.

Gagneux S. Ecology and evolution of Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 2018;16:202-213. doi:10.1038/nrmicro.2018.8.

Homolka S, Projahn M. Feuerriegel S. Ubben T, Diet R, Nübel U, Niemann S. High resolution discrimination of clinical Mycobacterium tuberculosis complex strains based on single nucleotide polymorphisms. PLoS One. 2012;7:e39855.

Kovalev SY, Kamaev EY, Kravchenko MA, Kurepina NE, Skorniakov SN. Genetic analysis of mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping. Int J Tuberc Lung Dis. 2005 Jul;9(7):746-52.

Malm S, Linguissi LS, Tekwu EM, Vouvoungui JC, Kohl ТА, Beckert P, Sidibe A, Rusch-Gerdes S, Madzou-Laboum IK, Kwedi S, Penlap Beng V, Frank M, Ntoumi F, Niemann S. New Mycobacterium tuberculosis Complex Sublineage, Brazzaville, Congo. Emerg Infect Dis. 2017 Mar; 23(3):423-429.

Mokrousov I, Shitikov E, Skiba Y, Kolchenko S, Chernyaeva E, Vyazovaya A. Emerging peak on the phylogeographic landscape of Mycobacterium tuberculosis in West Asia: Definitely smoke, likely fire. Mol Phylogenet Evol. 2017 Nov; 116:202-212.

Sola C, Filliol I, Legrand E, Mokrousov I, Rastogi N. Mycobacterium tuberculosis phylogeny reconstruction based on combined numerical analysis with IS 1081, IS6110, VNTR, and DR-based spoligotyping suggests the existence of two new phylogeographical clades. J Mol Evol. 2001a; 53:680-689.

Sola C, Ferdinand S, Mammina C, Nastasi A, Rastogi N. Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis in Sicily based on spoligotyping and variable number of tandem DNA repeats and comparison with a spoligotyping database for population-based analysis. J Clin Microbiol. 2001b Apr;39(4):1559-65. doi: 10.1128/JCM.39.4.1559-1565.2001.

Stucki D, Brites D, Jeljeli L, et al. Mycobacterium tuberculosis lineage 4 comprises globally distributed and geographically restricted sublineages. Nat Genet. 2016;48:1535-1543.

Valcheva V, Mokrousov I, Panaiotov S, Bachiiska E, Zozio T, Sola C, Markova N, Rastogi N. Bulgarian specificity and controversial phylogeography of Mycobacterium tuberculosis spoligotype ST 125_BGR. FEMS Immunol Med Microbiol. 2010 Jun l;59(l):90-9.

Zhdanova S, Heysell SK, Ogarkov O, Boyarinova G, Alexeeva G, Pholwat S, Zorkaltseva E, Houpt ER, Savilov E. Primary multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in 2 regions, Eastern Siberia, Russian Federation. Emerg Infect Dis. 2013 Oct;19(10):1649-52. doi: 10.3201/eidl910.121108.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии. Предложен способ детекции S-генотипа Mycobacterium tuberculosis. Согласно способау выявляют наличие нуклеотидной замены в гене Rν0557 в позиции 457C>G с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 557Fw GTTTCGCGTCCAGCTACGGC и 557Rv ACCGGTGTACTCGCGGAATGC с последующей обработкой продукта ПЦР эндонуклеазой рестрикции FnuDII и электрофорезом продуктов рестрикции в агарозном геле. В случае мутации Rv0557 в позиции 457C>G, специфической для S-генотипа Mycobacterium tuberculosis, наблюдают наличие маркерной полосы, состоящей из фрагментов длиной 64 пн и 67 пн, а при наличии фрагмента рестрикции длиной 131 пн судят о принадлежности штамма к любому другому генотипу М. tuberculosis. Способ позволяет проводить лабораторную диагностику штаммов возбудителя туберкулеза, относящихся к S-генотипу Mycobacterium tuberculosis. 4 ил., 3 пр.

Способ детекции S-генотипа Mycobacterium tuberculosis, отличающийся тем, что выявляют наличие нуклеотидной замены в гене Rν0557 в позиции 457C>G с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 557Fw GTTTCGCGTCCAGCTACGGC и 557Rv ACCGGTGTACTCGCGGAATGC с последующей обработкой продукта ПЦР эндонуклеазой рестрикции FnuDII и электрофорезом продуктов рестрикции в агарозном геле, при этом в случае мутации Rv0557 в позиции 457C>G, специфической для S-генотипа Mycobacterium tuberculosis, наблюдают наличие маркерной полосы, состоящей из фрагментов длиной 64 пн и 67 пн, а при наличии фрагмента рестрикции длиной 131 пн судят о принадлежности штамма к любому другому генотипу М. tuberculosis.