СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области генотипирования КРС, а именно к тонированию генотипа крупного рогатого скота по аллелям BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9 гена BoLA DRB3 главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II с целью выявления животных, предрасположенных к персистентному лимфоцитозу.

Молекулы МНС класса II располагаются в основном на клетках, имеющих отношение к иммунным ответам. Вероятно, содержащие вирусные частицы клетки связываются с гликопротеинами MHC класса II на поверхности антиген-представляющих клеток и благодаря этому активируют Т-лимфоциты, уничтожающие комплекс (вирус-содержащая клетка + антиген-представляющая клетка) (1).

На основе длительных наблюдений, проведенных в различных странах на многотысячном поголовье крупного рогатого скота, было выявлено более частое проявление лейкоза в потомстве одних и тех же быков, что подтверждает наследственный характер заболевания лейкозом.

Гены МНС класса II крупного рогатого скота экспрессируются с различной интенсивностью. Уровень экспрессии гена BoLA DRB 3 - один из самых высоких (5).

М.J.Т. Van Eijk, J.A. Stewart-Haynes, J.E. Beever (1992); Г.Е.Сулимова, И.Г.Удина, Г.О.Шайхаев, И.А.Захаров (1995); М. Zanotti et al. (1996); С.П.Павленко (2000); И. Г. Удина и др. (2000) отмечают связь между определенными аллелями гена BoLA DRB 3 главного комплекса гистосовместимости и восприимчивостью к лейкозу.

Наиболее близким к предлагаемому является способ идентификации аллелей гена BoLA DRB 3 (6), заключающийся в амплификации экзона 2 гена BoLA DRB 3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн), проведении анализа рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз RsaI, Hae III, BstYI. Для разных аллельных вариантов гена характерно образование после рестрикции продуктов амплификации наборов рестриктных фрагментов (ДНК-паттернов) (табл.1).

Сопоставление ДНК-паттернов, полученных с использованием указанных выше рестриктаз, позволяет идентифицировать 30 аллелей гена BoLA DRB 3 (табл.2).

Таблица 1
ДНК-паттерны и соответствующие им фрагменты рестрикцииRsaI-паттерныBstYI-паттерныHaeIII-паттерныНазваниеВеличина фрагментов рестрикции, пнНазваниеВеличина фрагментов рестрикции, пнНазваниеВеличина фрагментов рестрикции, пна78, 54, 50, 39, 33, 30a199, 85а167, 65, 52b111, 54, 50, 39, 30b284b219, 65с111, 93, 50, 30с196, 85с167, 65, 49d143, 111, 30d97, 87d190, 65, 29е141, 51, 50, 39е112, 87, 85е167, 117f141, 54, 50, 39f281f167, 65, 48g141, 104, 39    h111, 69, 54, 50    i180, 54, 50    j78, 93, 63, 50    k156, 78, 50    u234, 50    m111, 104, 69    n180, 104    o284    p111, 51, 50, 39, 30    q141, 90, 50    r111, 90, 50, 30    s141, 93, 50    t78, 69, 54, 50, 33    u153, 78, 50    

Таблица 2
Таблица определения аллелей гена BoLA DRB 3 на основе данных рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз RsaI, Hae III, BstYI и их связь с устойчивостью к лейкозуПЦР-ПДРФ аллели BoLA DRB3Название ДНК-паттерновОтношение к лейкозу*RsaIBstY IHae III1aaaН2bbaН3bbbН4сaaН5rссН6daaН7eссН8faaЧ9fdaН10fbaН11geaP12haaН13hbaН14hbbН15ibaН16jbdЧ17kbbН18lbfН19sbbН20lbbН21lbeН22mbaЧ23nbaР24nbbЧ25oaaН26oabН27obfН28obbР29pссН30qссН*Примечание: Статус аллелей по отношению к лейкозу: аллели, обуславливающие чувствительность (Ч), устойчивость (Р) и нейтральные (Н), влияние которых на восприимчивость или устойчивость к лейкозу не было отмечено.

Допустим, при рестрикции ПЦР-продукта эндонуклеазой RsaI образуются фрагменты 141, 104 и 39 пн (по табл.1 находим, что это RsaI-паттерн g); эндонуклеазой BstYI - 112, 87, 85 пн (BstYI-паттерн е); эндонуклеазой HaeIII - 167, 65, 52 (HaeIII-паттерн а). Затем по табл.2 определяем, какой аллели соответствует комбинация установленных ДНК-паттернов.

Комбинация RsaI-паттерна g, BstYI-паттерна е и HaeIII-паттерна а соответствует 11 аллели гена BoLA DRB 3. Как видно из табл.2, эта аллель определяет устойчивость к лейкозу.

Очевидным недостатком подобного анализа является сложность диффреренцировки аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9 (например, RsaI-паттерн е отличается от RsaI-паттерна f длиной одного фрагмента на 3 пн; BstYI-патерн а от BstYI-паттерна с - на 3 пн), а это имеет принципиальное значение, так как аллель BoLA DRB 3* 8 обуславливает предрасположенность к лейкозу, а аллели BoLA DRB З* 7 и BoLA DRB 3*9 в такой связи не отмечены. При применении подхода, описанного выше, возможен достаточно высокий процент неверно интерпретированных генотипов, особенно учитывая то, что частота встречаемости аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9 достигает в некоторых популяциях 20%.

Задача изобретения - повышение точности определения генотипа крупного рогатого скота путем дифференциации аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9.

Задача решается тем, что в способе определения генотипа КРС, включающем проведение полимеразной цепной реакции для амплификации участка гена BoLA DRB 3, анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции, помимо эндонуклеаз RsaI, HaeIII, BstYI дополнительно используется эндонуклеаза Bst 2U I при дифференциации аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9.

Способ осуществляется следующим образом. Амплифицируется экзон 2 гена BoLA DRB 3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн), а затем проводится анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз RsaI, Hae III, BstYI. Если при рестрикции по RsaI выявляются фрагменты 141, 54-51, 39 пн, амплификат необходимо обработать также рестриктазой Bst 2U I. В этом случае аллельный вариант BoLA DRB 3*7 образует фрагменты 24, 57, 89 и 111 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*8 - 24, 80 и 180 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*9 - 24, 57 и 203 пн. Таким образом можно безошибочно дифференцировать аллели BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB3*9 (табл.3).

Таблица 3АллельКонтроль*Предлагаемый способBoLA DRB 3Величина фрагментов после рестрикции по RsaI, пнВеличина фрагментов после рестрикции по Bst 2U I., пнBoLA DRB 3*7141, 51, 50, 39111, 89, 57, 24BoLA DRB 3*8141, 54, 50, 39180, 80, 24BoLA DRB 3*9141, 54, 50, 39203, 57, 24*B качестве контроля использовался способ по прототипу (6).

¹⁾ Нуклеотидная последовательность аллели BoLA DRB 3*7 следующая:

Таким образом, в предлагаемом способе величина фрагментов после рестрикции позволяет безошибочно дифференцировать аллели BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB3*9 при определении генотипа крупного рогатого скота.

Источники информации

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1987. - 1050 с.

2. Павленко С.П. Изменение экспрессии антигенов системы BoLA в различных возрастных группах здорового и больного лейкозом КРС // Сб.: Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозами с.-х. животных и птиц / Екатеринбург. - 2000. - С.86-94.

3. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О, Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена Bola-DRB 3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу // Генетика. - 1995. - №.9. - С.1294-1299.

4. Удина И. Г. и др. Использование ДНК-технологий для оценки наследственной устойчивости к заболеванию лейкозом // Тез. докл.II международной научн. конф.: Биотехнология в животноводстве и ветеринарии. - М., 2000. - С.219-220.

5. Groenen М.А.М. et al. The nucleotide sequence of bovine MHC class II DQB and DRB genes // Immunogenetics. - 1990. - №31. - P.37.

6. Van Eijk М. J. Т., Stewart-Haynes J. A., Lewin H. A. Extensive polymorphism of the BoLA DRB3 gene distinguished PCR-RFLP // Anim. Genet. - 1992. - 23. - 483.

7. Xu A., Van Eijk V.J.Т., Park Ch. Polymorphism in BoLA - DRB3 Exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus // J. of Immunology. - 1993. - V.151. - №12. - P.6977-6985.

8. Zanotti M. et al. Association of BoLA class II haplotypes with subclinical progression of bovine leukaemia virus infection in Holstein - Friesian cattle // Anim. Genet. - 1996. - 27. - P.337-341.

Изобретение относится к области генотипирования КРС, а именно к типированию генотипа крупного рогатого скота по аллелям гена BoLA DRB 3 главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II с целью выявления животных, предрасположенных к персистентному лимфоцитозу. Способ осуществляется следующим образом. Амплифицируется экзон 2 гена BoLA DRB 3 (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн), а затем проводится анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз Rsa I, Hae III, BstYI. Если при рестрикции по Rsa I выявляются фрагменты 141, 54-51, 39 пн, амплификат необходимо обработать также рестриктазой Bst 2U I. В этом случае аллельный вариант BoLA DRB 3*7 образует фрагменты 24, 57, 89 и 111 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*8 - 24, 80 и 180 пн; аллельный вариант BoLA DRB 3*9 - 24, 57 и 203 пн. Таким образом, можно безошибочно дифференцировать аллели BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8 и BoLA DRB 3*9. Изобретение позволяет выявлять животных с аллелем BoLA DRB 3*8, которые чувствительны к лейкозу. Изобретение может быть использовано в животноводстве. 3 табл.

Способ дифференциации аллелей гена BoLA DRB 3 крупного рогатого скота, включающий проведение полимеразной цепной реакции для амплификации участка гена BoLA DRB 3, анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции с использованием эндонуклеазы, отличающийся тем, что при дифференциации аллелей дополнительно использован фрагмент Bst 2UI, расщепляющий амплификат с аллели BoLA DRB 3*7 на фрагменты 111, 89, 57, 24 пн; с аллели BoLA DRB 3*8 - на 180, 80, 24 пн; с аллели BoLA DRB 3*9 - на 203, 57, 27 пн, по которым проводят дифференциацию аллелей BoLA DRB 3*7, BoLA DRB 3*8, BoLA DRB 3*9, что позволяет выявить животных, чувствительных к лейкозу, с аллелью BoLA DRB 3*8, имеющую длины рестрикционных фрагментов - 180, 80, 24 пн.