ФТОРСОДЕРЖАЩИЕ ПИРАЗОЛИЛТИОСЕМИКАРБАЗОНЫ С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2022 года по МПК C07D231/18 A61K31/415 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Предлагаемое техническое решение относится к органической химии, конкретно, к новым индивидуальным соединениям класса пиразолилтиосемикарбазонов, проявляющим противоопухолевую активность в отношении культуры клеток карциномы легкого и эпидермоидной карциномы гортани человека.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Одной из важнейших проблем современной химиотерапии злокачественных образований является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток [SzumilakM.,Wiktorowska-Owczarek A., Stanczak A. Hybriddrugs – a strategy for over coming anticancer drug resistance? // Molecules. 2021, 26, 2601]. Исходя из этого, поиск веществ, обладающих высоким цитотоксическим действием по сравнению с известными и широко применяемыми препаратами в этой области, является актуальной задачей.

На протяжении нескольких десятилетий тиосемикарбазоны общей формулы 1 являются объектами пристального внимания благодаря доступным методам синтеза и разнообразным видам их биологической активности [Prajapati N.P.,Patel H.D. Novel thiosemicarbazone derivatives and their metal complexes: Recent development // Synth. Commun. 2019, 49(21),2767–2804]. Данный класс соединений проявляет широкий спектр действия против ряда заболеваний, в том числе демонстрируя противогрибковую, противодиабетическую, противоопухолевую, гербицидную, антиоксидантную и противовоспалительную активности.

Ряд замещенных ди-2-пиридилкетонтиосемикарбазонов и 2-бензоилпиридитиосемикарбазонов представляет перспективность с точки зрения дальнейшего применения в медицинской практике благодаря выраженной и селективной активности против рака легких человека [Richardson, D.R.; Lovejoy, D.B. Preparation of dipyridylthiosemicarbazone compound suseful in the treatment of cancer // Патент (2012), WO 2012079128 A1 20120621; Warner, J.C.; Gladding, J.A.; Cheruku, S.R. Preparation of dipyridylthiosemicarbazones as anticancer agents // Патент (2017), WO 2017058748 A1 20170406; Richardson, D. R.; Lovejoy, D. B. Thiosemicarbazone compounds and use in the treatment of cancer // Патент (2015), US 8927580 B2 20150106].Отмечается увеличение терапевтического эффекта от комбинированного использования тиосемикарбазонов с их производными меди (II) [Lovejoy, D. B.; Sharp, D. M.; Seebacher, N.; Obeidy, P.; Prichard, T.; Stefani, C.; Basha, M.T.; Sharpe, P.C.; Jansson, P.J.; Kalinowski, D.S.; et al. Novel second-generation di-2-pyridylketone thiosemicarbazones show synergism with standard chemotherapeutics and demonstrate potent activity against lung cancer xenografts after oral and intravenous administration in vivo // J. Med. Chem.2012, 55(16), 7230–7244]

Не менее популярным подходом при поиске биологически активных веществ является синтез веществ, содержащих пиразольное кольцо [MykhailiukP. K. Fluorinated pyrazoles: from synthesis to applications // Chem. Rev. 2021, 121(3), 1670–1715]. Помимо пиразольного и тиосемикарбазонного фрагмента, важным инструментом при улучшении фармакофорных свойств молекул является введение атомов фтора, что повышает мембранную проницаемость, метаболическую стабильность и т.д. [Müller, K., Faeh, C., Diederich, F. Fluorine in Pharmaceuticals: Looking beyond intuition // Science 2007, 317, 1881– 1886; Hagmann, W. K. Themanyroles for fluorine in medicinal chemistry // J. Med. Chem. 2008, 51, 4359–4369].

При этом исследования веществ в ряду тиосемикарбазонов на основе кетонов и альдегидов, содержащих пиразольный и фторсодержащий заместители, немногочисленны [Wang, J.; Gong, G. Q.; Zhou, Y.; Lee, W.-J.; Buchanan, C. M.; Denny, W. A.; Rewcastle, G. W.; Kendall, J. D.; Dickson, J. M. J.; Flanagan, J. U.;et. al. High-throughput screening campaigns against a PI3Ka isoform bearing the H1047R mutation identified potential inhibitors with novel scaffolds // ActaPharmacol.Sin. 2018, 39(11), 1816–1822; Pahontu, E.; Julea, F.; Rosu, T.; Purcarea, V.; Chumakov, Y.; Petrenco, P.; Gulea, A. Antibacterial, antifungal and in vitro antileukaemia activity of metal complexes with thiosemicarbazones // J. Cell. Mol. Med. 2015, 19(4), 865–878; Bazhin, D. N.; Kudyakova, Y. S.; Onoprienko, A.Ya.; Slepukhin, P. A.; Burgart, Y. V.; Saloutin, V. I. Synthesis and tuberculostatic activity of functionalized pyrazoles derived from (trifluoromethyl)pyrazole containing a hydrazone group // Chem. Heterocyclic Comp.2017, 53(12), 1324–1329].

Наиболее близкими к нашему изобретению являются трифторметилсодержащие пиразолилтиосемикарбазоны, полученные из 4,4-диметокси-1-(трифторметил)пентан-1,3-дионаталития в несколько стадий синтеза согласно общей Cхеме 1 [Bazhin, D. N.; Kudyakova, Y. S.; Onoprienko, A. Ya.; Slepukhin, P. A.; Burgart, Y. V.; Saloutin, V. I. Synthesis and tuberculostatic activity of functionalized pyrazoles derived from (trifluoromethyl)pyrazole containing a hydrazone group // Chem. HeterocyclicComp. 2017, 53(12), 1324–1329].Суммарный выход тиосемикарбазонов 4a-в в результате трех стадийного процесса составил 41-43 %.

Ранее предложен одностадийный способ получения 1-[(5-(трифторметил)-1Н-пиразол-3-ил]этанонов 5, что открывает возможности для синтеза разнообразных производных с использованием реакций конденсации по карбонильной группе (Схема 2) [Кудякова Ю. С., Эдилова Ю. О., Оноприенко А. Я., Бургарт Я. В., Салоутин В. И., Бажин Д. Н. Способ получения 1-[5-(перфторалкил)-1Н-пиразол-3-ил]этанонов// Патент №RU 2741549 C1].

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является получение ряда фторсодержащих пиразолилтиосемикарбазонов, в том числе ранее неописанных, с высоким суммарным выходом, проявляющих противоопухолевую активность.

Задача решается путем синтеза пиразолилтиосемикарбазонов 4г-ж, который осуществляют следующим образом: смесь в эквимолярных количествах 1-[(5-(трифторметил)-1Н-пиразол-3-ил]этанона7и соответствующего тиосемикарбазида в этаноле кипятят при 76-78°С в течение 3-5 ч (Схема 3). После чего реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют воды, осадок отфильтровывают. Суммарный выход тиосемикарбазонов 4г-ж в результате двухстадийного процесса составил 82-87 %.Структуры соединений подтверждены спектральными методами исследования (ЯМР и ИК спектроскопии), чистота продуктов согласуется с данными элементного анализа. Соединения 4г-ж получены и охарактеризованы впервые.

Анализ целевых соединений проводят с использованием ЯМР-спектроскопии (Спектры ЯМР ¹H, ¹⁹F регистрировались на спектрометрах BrukerDRX-400 (400 МГц),BrukerAVANCEIII-500 (500 МГц), внутренние стандарты ТМС и C₆F₆), газовой хроматографии/масс-спектрометрии (газовый хроматограф-масс-спектрометр Agilent GC 7890А MS 5975С Inert XL EI/CI с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором) и элементного анализа на автоматическом анализаторе Perkin-Elmer РЕ-2400.

Пример 1

Синтез N-(2,4-дифторфенил)-2-{1-[3-(трифторметил)-1Н-пиразол-5-ил]этилиден}гид-разинкарботиоамида (4г)

К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1Н-пиразол-3-ил]этанона5 в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 1.016 г (5 ммоль) N-(2,4-дифторфенил)-гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили при 76-78°С в течение 5 ч, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения 4г составил 1.597 г (88 %).

Белый порошок, т.пл. 209-210°C.

Спектр ЯМР¹H (500 МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:2.35 (с, 3H, CH₃), 7.15 (м, 1Н), 7.23 (с, 1H), 7.39 (м, 1H), 7.49 (м, 1H), 10.11 (с, 1H, NH), 11.19 (с, 1Н, NH), 14.05 (с, 1Н, NH_pyr).

Спектр ЯМР¹⁹F (470МГц, ДМСО-d₆/C₆F₆), δ, м.д.:47.19 (д.д., J = 17 Гц, J = 9 Гц, 1F, C-F_Ar), 51.38 (м, 1F, C-F_Ar), 102.13 (с, 3F, CF₃).

Спектр ЯМР¹³C (125МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:14.2, 104.4 (д.д., J = 27Гц, J = 25Гц), 104.5, 111.2 (д.д., J = 22Гц, J = 3Гц), 121.5 (кв, J =268 Гц), 123.4 (д.д., J = 12 Гц, J = 4 Гц), 131.8 (д., J = 10 Гц), 138.2, 141.6 (кв, J =37Гц), 142.7, 157.6 (д.д., J = 250 Гц, J = 13 Гц), 160.7 (д.д., J = 246 Гц, J = 12Гц), 178.9.

Элементный анализ для C₁₃H₁₀F₅N₅S (363.31).

Найдено(%): С,42.84; H, 2.65; N, 19.13.

Вычислено(%): С,42.98; H, 2.77; N,19.28.

Пример 2

Синтез2-{1-[3-(трифторметил)-1H-пиразол-5-ил]этилиден}-N-(м-фторфенил)гидра-зинкарботиоамида (4д).

К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1Н-пиразол-3-ил]этанона5 в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 0.926 г (5 ммоль) N-(м-фторфенил)гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили при 76-78°С в течение 4 ч, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения 4д составил 1.484 г (86 %).

Белый порошок, т.пл. 208-209°C.

Спектр ЯМР¹H (500 МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:2.36 (с, 3H, CH₃), 7.10 (м, 1Н), 7.24 (м, 1H), 7.38 (м, 1H), 7.45 (м, 1H), 7.54 (м, 1H), 10.34 (с, 1H, NH), 11.05 (с, 1Н, NH), 14.22 (с, 1Н, NH_pyr).

Спектр ЯМР¹⁹F (470 МГц, ДМСО-d₆/C₆F₆), δ, м.д.: 49.51 (д.д.д., J = 11Гц, J = 9 Гц, J = 7Гц, 1F, C-F_Ar), 102.15 (с, 3F, CF₃).

Спектр ЯМР¹³C (125МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:14.4, 104.7, 112.4 (д., J = 21Гц), 113.0 (д., J = 24Гц),121.5 (кв, J =268 Гц), 121.9, 129.7 (д., J = 9Гц), 138.4, 140.5 (д., J =11Гц), 141.6 (д., J=37Гц), 142.6, 161.6 (кв., J = 242Гц), 176.9.

Элементный анализ для C₁₃H₁₁F₄N₅S (345.32).

Найдено(%): С,45.04; H,3.11; N,20.04.

Вычислено(%): С,45.22; H,3.21; N,20.28.

Пример 3

Синтез N-(м-трифторметилфенил)-2-{1-[3-(трифторметил)-1H-пиразол-5-ил]эти-лиден}гидразинкарботиоамида (4е).

К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1Н-пиразол-3-ил]этанона 5 в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 1.266 г (5 ммоль) N-(м-трифторметилфенил)гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили при 76-78°С в течение 5 ч, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения 4е составил 1.818 г (92 %).

Белый порошок, т.пл. 192-193°C.

Спектр ЯМР¹H (500 МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:2.38 (с, 3H, CH₃),7.25 (с, 1H, Ar),7.60-7.68 (м, 2H, Ar),7.90-7.91 (м, 1Н, Ar), 7.98 (c, 1Н, Ar), 10.46 (с,1H, NH),11.16 (с, 1Н, NH), 14.22 (с, 1Н, NH_pyr).

Спектр ЯМР¹⁹F (470МГц, ДМСО-d₆/C₆F₆), δ, м.д.: 101.4 (с, 3F, CF₃), 102.15 (с, 3F, CF₃).

Спектр ЯМР¹³C (125МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:14.9, 104.7, 121.5 (кв, J =268 Гц), 122.1 (д.д., J = 7, 4 Гц), 122.3 (д.д., J = 8, 4 Гц), 124.0 (кв, J =272Гц), 129.0 (кв, J =31Гц), 129.4, 130.0, 139.6, 139.5, 141.6 (кв, J =37Гц), 142.6, 176.9.

Элементный анализ для C₁₄H₁₁F₆N₅S (341.36).

Найдено (%): С,42.41; H,2.69; N,17.57.

Вычислено (%): С,42.54; H,2.80; N,17.72.

Пример 4

Синтез2-{1-[3-(трифторметил)-1H-пиразол-5-ил]этилиден}-N-(п-фторфенил)гидра-зинкарботиоамида (4ж).

К раствору 0.89 г (5 ммоль) 1-[(5-(трифторметил)-1Н-пиразол-3-ил]этанона5 в 15 мл 95%-ного этанола добавляли 0.926 г (5 ммоль) N-(п-фторфенил)гидразинкарботиоамида, 0.1 мл соляной кислоты, кипятили 4 часа, добавляли 50 мл воды, осадок отфильтровывали, сушили. Выход соединения 4ж составил 1.571 г (91 %).

Белый порошок, т.пл. 211-212°C.

Спектр ЯМР¹H (500 МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:2.35 (с, 3H, CH₃),7.23 (с, 1H, Ar),7.24-7.27 (м, 2H, Ar),7.50-7.53 (м, 2Н, Ar), 10.31 (с,1H, NH),10.98 (с, 1Н, NH), 14.18 (с, 1Н, NH_pyr).

Спектр ЯМР¹⁹F (470МГц, ДМСО-d₆/C₆F₆), δ, м.д.: 46.09 (м, 1F, C-F_Ar), 102.17 (с, 3F, CF₃).

Спектр ЯМР¹³C (125МГц, ДМСО-d₆), δ, м.д.:14.3, 104.5, 115.0 (д., J = 22 Гц), 121.5 (кв, J =268 Гц), 128.5 (д., J = 8 Гц),135.1 (д., J = 8Гц), 138.0, 141.6 (кв., J =37Гц), 142.7 (д., J =243Гц), 177.5.

Элементный анализ для C₁₃H₁₁F₄N₅S (345.32).

Найдено (%): С,45.06; H,3.09; N,20.07.

Вычислено (%): С,45.22; H,3.21; N,20.28.

Пример 5

Исследование цитотоксичности заявляемых тиосемикарбазонов.

Культура клеток А549, карцинома легкого человека. Получена из коллекции клеточных культур лаборатории клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева».

Культура клеток Hep-2, эпидермоидная карцинома гортани человека. Получена из коллекции клеточных культур лаборатории клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева».

Состав ростовой среды: среда D-МЕМ (Биолот), ципрофлоксацин (2 мкг/мл), глутамин, (300 мкг/мл).

Цитотоксичность соединений на культурах клеток А549 и Hep-2 была определена с помощью МТТ-теста (микротетразолиевый тест).Растворы исследуемых соединений в концентрациях от 1000 до 16 мкг/мл (с использованием двукратного шага при разведении) вносили в объеме 100 мкл в 96ЛП на культуру клеток и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С и 5% СО₂. Далее клетки промывали раствором PBS и вносили раствор метилтетразолиум бромида на поддерживающей среде в концентрации 0,5 мкг/мл, после чего инкубировали в течение 1,5 часов при температуре 37°С и 5% СО₂. По окончании срока инкубации раствор МТТ удаляли, растворяли осадок в 96%-м этиловом спирте и определяли оптическую плотность раствора при длине волны 535 нм на планшетном ридере WallacPerkinElmer [Aletvan Tonder, Annie MJoubert, A Duncan Cromarty//Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide (MTT) assay when compared to three commonly used cellenumeration assays.BMCResearch Notes-2015. DOI 10.1186/s13104-015-1000-8]. На основании полученных данных с помощью программного обеспечения GraphPadPrizm 5.0 была определена ЦТД₅₀ (концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток)[GraphPadCurveFittingGuide [Электронный ресурс] - URL: https://www.graphpad.com/guides/prism/7/curve-fitting/index.htm?reg_dr_inhibit_variable.htm (дата обращения 23.12.2020)]. В качестве контроля использовали клетки, к которым вносили культуральную среду.

Оценку цитотоксичности проводили на культурах клеток А549 и Hep-2 через 24 часа инкубации клеток монослоя с тестируемыми образцами с помощью МТТ-теста с использованием планшетного анализатора Victor2 Wallac (PerkinElmer). Итоговые результаты определения цитотоксичности соединений in vitro представлены в таблице 1. В качестве референтных соединений использованы лекарственные средства: доксорубицин и камптотецин.

В ряду соединений 4а-в, в котором тиосемикарбазонный фрагмент не содержит атомов фтора, только продукт 4а проявляет активность, сопоставимую с камптотецином (табл. 1). Из данных таблицы 1 следует, что цитотоксическое действие соединений 4д, 4ж сравнимо с доксорубицином и превосходит камптотецин. Тогда как соединение 4е проявляет высокую цитотоксическую активность как в отношении культуры клеток А549 (карцинома легкого человека), так и в отношении культуры клеток Hep-2 (эпидермоидная карцинома гортани человека).

Таким образом, введение атомов фтора в арилтиосемикарбазонный фрагмент ряда веществ 4 является определяющим фактором для повышения их цитотоксического действия, в частности, наиболее активное соединение 4е содержит трифторметильную группу в мета-положении ароматического кольца.

Цитотоксичность исследуемых соединений свидетельствует об их перспективности для проведения дальнейших разработок противоопухолевых лекарственных средств.

Изобретение относится к соединениям класса пиразолилтиосемикарбазонов, а именно 2-{1-[3-(трифторметил)-1Н-пиразол-5-ил]этилиден}-N-арилгидразинкарботиоамидам общей формулы I. Технический результат – соединения пиразолилсемикарбазонов, обладающие противоопухолевой активностью в отношении культуры карциномы легкого и эпидермоидной карциномы гортани человека. 1 табл., 5 пр.

2-{1-[3-(Трифторметил)-1Н-пиразол-5-ил]этилиден}-N-арилгидразинкарботиоамиды общей формулы I, обладающие противоопухолевой активностью: