Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК вирусов SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 семейства Coronaviridae методом петлевой изотермальной амплификации (LAMP) Российский патент 2022 года по МПК C12N15/00 C12Q1/68 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной генетике и медицине, а именно к способу выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 методом петлевой изотермальной амплификации (LAMP). Изобретение может быть использовано для выявления указанных представителей семейства Coronaviridae для клинической лабораторной диагностики коронавирусной инфекции или для научно-исследовательских целей. Способ включает описание структуры синтетических олигонуклеотидов, а также их использования для диагностики РНК указанных возбудителей респираторных заболеваний.

Уровень техники

Коронавирусы – РНК-содержащие вирусы, размером от 80 до 120 нм. Геном вирусной РНК имеет размер от 27 до 32 т.п.н., кэпирован, полиаденилирован и заключен в спиральный нуклеокапсид, который окружён белковой мембраной и липосодержащей внешней оболочкой. На основании ранних серологических и более поздних геномных исследований представители Coronavirinae делятся на четыре рода: α-, β-, γ- и δ-коронавирусы. Четыре типа вируса (A, B, C и D) относятся к роду β-коронавирусов. Из семи известных человеческих коронавирусов (HCoV) HCoV-229E и HCoV-NL63 относятся к роду α-коронавирусов, тогда как HCoV-OC43 и HCoV-HKU1 относятся к типу A, SARS-CoV и SARS-CoV 2 – типу B и MERS-CoV – к типу C рода β-коронавирусов. Геном коронавируса заключен в несегментированной РНК размером от 27 до 32 тысяч пар оснований. Геномная РНК, имеет 5’-кэп и поли-(А)-хвост на 3’-конце; содержит несколько открытых рамок считывания (ORF). Гены расположены в следующем порядке: 5'-репликаза-S-E-M-N-3' с многочисленными небольшими ORF (вспомогательные белки). Представители коронавирусов являются возбудителями респираторных заболеваний разной степени тяжести, отдельные случаи заболевания могут привести к летальному исходу.

В настоящее время для выявления коронавирусной инфекции используются разнообразные методы и подходы: выявление РНК вирусов с помощью полимеразной цепной реакции и других технологий, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, выявление антигенов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунохроматографического анализа (ИХА), а также выявление специфических антител IgM и IgG с помощью технологий ИФА и ИХА. Среди этих методов особое место занимает метод LAMP – универсальный метод, характеризующийся высокой чувствительностью (10–20 копий РНК), скоростью (время проведения анализа составляет около 30 минут, без учета пробоподготовки), относительно низкой себестоимостью. Метод LAMP позволяет использовать различные способы детекции продуктов амплификации и использовать флуоресцентные (интеркалирующие флуоресцентные красители, модифицированные олигонуклеотиды) или колориметрические красители, позволяющих визуально по реакционной смеси детектировать продукты амплификации. При этом выбор способа детекции может зависеть от материально-технической базы лаборатории, проводящей анализы.

Известны способы выявления коронавирусов SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 (например, патент RU2734300, https://yandex.ru/patents/doc/RU2734300C1_20201014; Nascimentoetal., 2020, Trendsin MERS-CoV, SARS-CoV, and SARS-CoV-2 (COVID-19) DiagnosisStrategies: A Patent Review. Systematic Review; https://doi.org/10.3389/fpubh.2020.563095), однако в данных подходах используются другие технологии, характеризующиеся более длительным временем проведения исследования.

Наиболее близкими по сущности к изобретению являются способы, описанные в публикациях: Bektasetal., AccessibleLAMP-EnabledRapidTest (ALERT) forDetectingSARS-CoV-2 // Viruses. 2021 (https://doi.org/10.3390/v13050742); Anastasiou et al., Fast Detection of SARS-CoV-2 RNA Directly from Respiratory Samples Using a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Test // Viruses. 2021 (https://doi.org/10.3390/v13050801); Aoki et al., Colorimetric RT-LAMP SARS-CoV-2 diagnostic sensitivity relies on color interpretation and viral load // Scientific Reports (https://doi.org/10.1038/s41598-021-88506-y) и др., которые также основываются на использовании технологии LAMP, однако предназначены только для выявления РНК новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка дизайна олигонуклеотидов для дифференциации РНК вирусов SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 методом петлевой изотермальной амплификации (LAMP), предполагающих использование флуоресцентной и колориметрической детекции продуктов амплификации.

Техническим результатом изобретения является получение структур олигонуклеотидов: внешних прямых (F3), внешнего обратного (B3), внутренних прямых (FIP), внутренних обратных (BIP), петлевых прямых (LF) и петлевых обратных (LB) праймеров.

Поставленная техническая проблема решается выбором консервативных видоспецифичных фрагментов геномной РНК для обратной транскрипции и последующей амплификации LAMP. Мишени для выявления РНК коронавирусов:

SARS-CoV-2: фрагмент гена N;

SARS-CoV: фрагмент гена N;

MERS-CoV: фрагмент гена E;

HCoV-229E: фрагмент гена E;

HCoV-NL63: фрагмент гена N;

HCoV-OC43: фрагмент гена RdRp;

HCoV-HKU1: фрагмент гена RdRp.

Поставленная техническая проблема решается дизайном структуры олигонуклеотидов из следующих критериев:

- температура инкубации в LAMP – 65°C;

- минимальное количество шпилек, гомо- и гетеродимеров.

Для выявления вирусов проведён дизайн олигонуклеотидов:

- для выявления SARS-CoV-2: LCV2-F3 (SEQ ID NO: 1), LCV2-FIP2 (SEQ ID NO: 2), LCV2-BIP2 (SEQ ID NO: 3), LCV2-B3-2 (SEQ ID NO: 4);

- для выявления SARS-CoV:LCV1-F3-1 (SEQ ID NO: 5), LCV1-FIP-1 (SEQ ID NO: 6), LCV1-BIP-2 (SEQ ID NO: 7), LCV1-B3-1 (SEQ ID NO: 8);

- для выявления MERS-CoV: LMS-F3 (SEQ ID NO: 9), LMS-FIP-1 (SEQ ID NO: 10), LMS-BIP-2 (SEQ ID NO: 11), LMS-B3-1 (SEQ ID NO: 12);

- для выявления HCoV-229E: CoV229-F3 (SEQ ID NO: 13), CoV229-FIP1 (SEQ ID NO: 14), CoV229-BIP1 (SEQ ID NO: 15), CoV229-B3-alt1 (SEQ ID NO: 16), CoV229-Blc (SEQ ID NO: 17)

- для выявления HCoV-NL63: CoVNL63-F3 (SEQ ID NO: 18), CoVNL63-FIP2 (SEQ ID NO: 19), CoVNL63-BIP1 (SEQ ID NO: 20), CoVNL63-B3 (SEQ ID NO: 21), CoVNL63-Flc-alt1 (SEQ ID NO: 22), CoVNL63-Blc (SEQ ID NO: 23);

- для выявления HCoV-OC43: L43-F3 (SEQ ID NO: 24), L43-FIP-1 (SEQ ID NO: 25), L43-BIP-1 (SEQ ID NO: 26), L43-B3 (SEQ ID NO: 27);

- для выявления HCoV-HKU1: LHKU-F3-2 (SEQ ID NO: 28), LHKU-FIP-2 (SEQ ID NO: 29), LHKU-BIP-1 (SEQ ID NO: 30), LHKU-B3-1 (SEQ ID NO: 31).

Поставленная техническая проблема решается разработкой состава реакционной смеси для обеспечения работоспособности систем олигонуклеотидов реакций LAMP при использовании разных систем детекции.

Состав реакции для флуоресцентной детекции: буфер (0,2 мMTris-HCl, 0,1 мM (NH₄)₂SO₄, 0,15 MKCl, 0,1% Tween 20, pH 8,8), дезоксинуклеотидтрифосфаты – 1,4 мМ, ревертаза 200 ед., Mg₂SO₄– 8 мМ, LAMP FluorescentDye(NEB) – 0,2х, полимераза Bst 3.0 – 8 ед., олигонуклеотиды FIPи BIP – 1,6 мкМ, F3 и B3 – 0,2 мкМ, LF и LB (в случае наличия) – 0,4 мкМ. Реакция проводится в объёме 25 мкл, включая 5 мкл матрицы РНК. Производится термостатирование при температуре 65°C в течение 30 минут; о положительном прохождении реакции судят по росту уровня флуоресценции по каналу FAM.

Состав реакции для колориметрической детекции: буфер (0,1 мM (NH₄)₂SO₄, 0,15 MKCl, 0,1% Tween 20, pH 8,8), дезоксинуклеотидтрифосфаты – 1,4 мМ, ревертаза 200 ед., Mg₂SO₄– 8 мМ, краситель крезоловый красный– 0,1 мМ, полимераза Bst 3.0 – 8 ед., олигонуклеотиды FIP и BIP – 1,6 мкМ, F3 и B3 – 0,2 мкМ, LF и LB (в случае наличия) – 0,4 мкМ (pH раствора: 8,8). Реакция проводится в объёме 25 мкл, включая 5 мкл матрицы РНК. О положительном прохождении реакции судят по изменению цвета реакционной смеси с красного на жёлтый.

Поставленная техническая проблема решается разработкой положительных контрольных образцов. Положительные контрольные образцы необходимы для контроля прохождения реакции:

SARS-CoV-2: SEQIDNO: 32;

SARS-CoV: SEQ ID NO:33;

MERS-CoV: SEQ ID NO:34;

HCoV-229E: SEQ ID NO:35;

HCoV-NL63: SEQ ID NO:36;

HCoV-OC43: SEQ ID NO:37;

HCoV-HKU1: SEQ ID NO:38.

Изобретение имеет ряд преимуществ по сравнению с близкими по сущности аналогами, поскольку производится одновременное выявление 7 видов коронавирусов в образце с течение 25 минут (не считая времени пробоподготовки).

Осуществление изобретения

Пример 1. Флуоресцентная детекция

У пациента произведен мазок из носоглотки, помещен в 500 мкл физиологического раствора. Из 100 мкл физиологического раствора произведено выделения нуклеиновых кислот. Приготовлены реакционные смеси для всех 7-ми видов коронавирусов, с составом: буфер (0,1 mM (NH₄)₂SO₄, 0,15 MKCl, 0,1% Tween 20, pH 8,8), дезоксинуклеотидтрифосфаты – 1,4 мМ, ревертаза 200 ед., Mg₂SO₄ – 8 мМ, краситель крезоловый красный – 0,1 мМ, полимераза Bst 3.0 – 8 ед., олигонуклеотиды FIP и BIP – 1,6 мкМ, F3 и B3 – 0,2 мкМ, LF и LB (в случае наличия) – 0,4 мкМ (pH раствора: 8,8). Реакции проводились в объёме 25 мкл. С каждой реакционной смесью проводилось 3 реакции: с выделенной матрицей РНК, с положительным контрольным образцом (соответствующей плазмидой в концентрации 10 000 000 копий/мл) и отрицательным контрольным образцом (деионизованная вода).

Производилось термостатирование при температуре 65°C в течение 25 минут в амплификаторе QuantStudio с детекцией по каналу FAM каждую минуту. В пробирке с олигонуклеотидами для выявления SARS-CoV-2 с 10-й минуты инкубации наблюдался рост уровня флуоресценции, во всех других пробирках рост уровня флуоресценции не наблюдался. Со всеми другими смесями рост уровня флуоресценции наблюдается только в пробирках с положительными контрольными образцами. На основании полученных результатов был получен вывод о нахождении РНК SARS-CoV-2 в исследуемом образце пациента.

Пример 2. Колориметрическая детекция

У пациента произведен мазок из носоглотки, помещен в 500 мкл физиологического раствора. Из 100 мкл физиологического раствора произведено выделения нуклеиновых кислот. Приготовлены реакционные смеси для всех 7-ми видов коронавирусов, с составом: буфер (0,2 мMTris-HCl, 0,1 мM (NH₄)₂SO₄, 0,15 MKCl, 0,1% Tween 20, pH 8,8), дезоксинуклеотидтрифосфаты – 1,4 мМ, ревертаза 200 ед., Mg₂SO₄– 8 мМ, LAMP FluorescentDye(NEB) – 0,2х, полимераза Bst 3.0 – 8 ед., олигонуклеотиды FIP и BIP – 1,6 мкМ, F3 и B3 – 0,2 мкМ, LF и LB (в случае наличия) – 0,4 мкМ. Реакции проводились в объёме 25 мкл. С каждой реакционной смесью проводилось 3 реакции: с выделенной матрицей РНК, с положительным контрольным образцом (соответствующей плазмидой в концентрации 10 000 000 копий/мл) и отрицательным контрольным образцом (деионизованная вода).

Производилось термостатирование при температуре 65°C в течение 25 минут в амплификаторе QuantStudio. По истечении времени инкубации производилась детекция цвета пробирок реакционных смесей. Цвет с красного на жёлтый был изменен только в пробирках с положительными контрольными образцами и в пробирке с РНК пациента в смеси для выявления SARS-CoV-2. На основании полученных результатов был получен вывод о нахождении РНК SARS-CoV-2 в исследуемом образце пациента.

--->

Перечень последовательностей

<110> Общество с ограниченной ответственностью «БиоТехГен»

<120> Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК вирусов SARS-

CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1

семейства Coronaviridae методом петлевой изотермальной амплификации (LAMP)

<160> 1

<210> 1

<211> 23

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV-2

<400>TGAATAAGCATATTGACGCATAC

<210> 2

<211> 43

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV-2

<400>AGGCTTGAGTTTCATCAGCCTTCACAGAGCCTAAAAAGGACAA

<210> 3

<211> 40

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV-2

<400>CTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCCAGCACTGCTCATGGATT

<210> 4

<211> 20

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV-2

<400>CATGAGTTTAGGCCTGAGTT

<210> 5

<211> 24

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV

<400>AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTGA

<210> 6

<211> 35

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV

<400>ATGTCAGCCGCAGGAAGAACCTTTGCCGCAGAGAC

<210> 7

<211> 42

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV

<400>AACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCATCTGCCTTGTGTGGTC

<210> 8

<211> 20

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV

<400>GCGAAAACGTTTACATAGCC

<210> 9

<211> 21

<212>DNA

<223> для выявления РНК MERS-CoV

<400>CAAGAACGAATAGGGTTGTTC

<210> 10

<211> 47

<212>DNA

<223> для выявления РНК MERS-CoV

<400>CTAGTAGCCGTAAGGAAAGCCATATTCATTTTTACCGTAGTATGTGC

<210> 11

<211> 47

<212>DNA

<223> для выявления РНК MERS-CoV

<400>GTGCAATGTATGACAGGCTTCAATGGAATTTTACATAGACTGAACGT

<210> 12

<211> 18

<212>DNA

<223> для выявления РНК MERS-CoV

<400>CACTCGTCAGGTGGTAGA

<210> 13

<211> 21

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-229E

<400>GTTCCTTAAGCTAGTGGATGA

<210> 14

<211> 45

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-229E

<400>ACATATGGCAAGTGAAACAAAGCTTGTGGTGCTTATAGTGATACT

<210> 15

<211> 49

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-229E

<400>AATAGAACAGTTTATGGCCCCATTAAATCAATAACTCGTTTAGGGAAAG

<210> 16

<211> 21

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-229E

<400>AATTCTTCAAATGGGTGACAA

<210> 17

<211> 29

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-229E

<400>ATTTACCAATCATATATGCACATAGACCC

<210> 18

<211> 22

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-NL63

<400>CTTCCACTCCTAAGAAACCTAA

<210> 19

<211> 42

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-NL63

<400>TGATTAAAATCACGAGGACCAAAGCAACCTCGTTGGAAGCGT

<210> 20

<211> 43

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-NL63

<400>CAGAATGGTGTTGATGCCAAAGGTCAGTGCTAACCTCACTATC

<210> 21

<211> 24

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-NL63

<400>TTCTTATTATCCTTAGCTACAAGC

<210> 22

<211> 26

<212>DNA, символ «+» - LNA-нуклеотид

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-NL63

<400>CT+GAATAACATTTTCCTCTC+TGGTAG

<210> 23

<211> 25

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-NL63

<400>CTGAATTGATTCCTAATCAGGCTGC

<210> 24

<211> 21

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-OC43

<400>CTGTACTTATGGGTTGGGATT

<210> 25

<211> 40

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-OC43

<400>TATCGCTTTGCGAACAACATGTAGTGTGATCGTGCTATGC

<210> 26

<211> 45

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-OC43

<400>GGTTTTATCGACTTGCGAATGAATGACATAATAACAGCCACCACA

<210> 27

<211> 18

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-OC43

<400>ACTACTAGTGCCACCAGG

<210> 28

<211> 21

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-HKU1

<400>GGACGATATGTTACGTCATCT

<210> 29

<211> 44

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-HKU1

<400>ATGTTTGCGGGCCAAAACTAAGGATTATCCTAAATGTGATCGTG

<210> 30

<211> 46

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-HKU1

<400>GTGATAGATTTTATCGCCTTGCGAAGGCTTAACATAATAGCAACCG

<210> 31

<211> 18

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-HKU1

<400>TCACCACTGCTAGTACCA

<210> 32

<211> 344

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV-2

<400>AAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAA

AGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCA

GATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAACTCATGCAGA

CCACACAAGGCAGATGGGCTATATAAACGTTTTCGCTTTTCCGTTTACGATATATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGA

ATTCTCGTAACTACATAGCACAAGTAGATGTAGTTAACTTT

<210> 33

<211> 352

<212>DNA

<223> для выявления РНК SARS-CoV

<400>ACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAA

AGAAAAAGACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCT

GACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCATAAACACT

CATGATGACCACACAAGGCAGATGGGCTATGTAAACGTTTTCGCAATTCCGTTTACGATACATAGTCTACTCTTGTG

CAGAATGAATTCTCGTAACTAAACAGCACAAGTAGGTTTAGTTAACTTT

<210> 34

<211> 400

<212>DNA

<223> для выявления РНК MERS

<400>TTCGTGCCTGCAACGCGCGATTCAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCGCTTATCGTTTAAGCAGCT

CTGCGCTACTATGGGTCCCGTGTAGAGGCTAATCCATTAGTCTCTCTTTGGACATATGGAAAACGAACTATGTTACC

CTTTGTCCAAGAACGAATAGGGTTGTTCATAGTAAACTTTTTCATTTTTACCGTAGTATGTGCTATAACACTCTTGG

TGTGTATGGCTTTCCTTACGGCTACTAGATTATGTGTGCAATGTATGACAGGCTTCAATACCCTGTTAGTTCAGCCC

GCATTATACTTGTATAATACTGGACGTTCAGTCTATGTAAAATTCCAGGATAGTAAACCCCCTCTACCACCTGACGA

GTGGGTTTAACGAACTCCTT

<210> 35

<211> 302

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-229E

<400>TAAGATGTTCCTTAAGCTAGTGGATGATCATGCTTTGATTGTTAATGTACTACTCTGGTGTGTGGTGCTTAT

AGTGATACTACTAGTGTGTATTACAATAATTAAACTAATTAAGCTTTGTTTCACTTGCCATATGTTTTGTAATAGAA

CAGTTTATGGCCCCATTAAAAATGTGTACCATATTTACCAATCATATATGCACATAGACCCTTTCCCTAAACGAGTT

ATTGATTTCTAAACTAAACGACAATGTCAAACGACAATTGTACGGGTGACATTGTCACCCATTTGAAGAATTGGAA

<210> 36

<211> 400

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-NL63

<400>ACTTAGGTTTTGATAACCAGTCGAAGTCACCTAGTTCTTCTGGTACTTCCACTCCTAAGAAACCTAATAAGC

CTCTTTCTCAACCCAGGGCTGATAAGCCTTCTCAGTTGAAGAAACCTCGTTGGAAGCGTGTTCCTACCAGAGAGGAA

AATGTTATTCAGTGCTTTGGTCCTCGTGATTTTAATCACAATATGGGGGATTCAGATCTTGTTCAGAATGGTGTTGA

TGCCAAAGGTTTTCCACAGCTTGCTGAATTGATTCCTAATCAGGCTGCGTTATTCTTTGATAGTGAGGTTAGCACTG

ATGAAGTGGGTGATAATGTTCAGATTACCTACACCTACAAAATGCTTGTAGCTAAGGATAATAAGAACCTTCCTAAG

TTCATTGAGCAGATTAGTGC

<210> 37

<211> 335

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-OC43

<400>AAATTTTATGGTGGCTGGGATGATATGTTACGCCGCCTTATTAAAGATGTTGACAATCCTGTACTTATGGGT

TGGGATTATCCTAAGTGTGATCGTGCTATGCCAAACCTACTACGTATTGTTAGTAGTTTGGTATTAGCCCGAAAACA

TGAGACATGTTGTTCGCAAAGCGATAGGTTTTATCGACTTGCGAATGAATGCGCACAAGTTTTGAGTGAAATTGTTA

TGTGTGGTGGCTGTTATTATGTTAAGCCTGGTGGCACTAGTAGTGGTGATGCAACTACTGCTTTTGCTAATTCAGTC

TTTAACATATGTCAAGCTGTTTCAGCCAATGT

<210> 38

<211> 335

<212>DNA

<223> для выявления РНК HCoV-HKU1

<400>AAATTTTATGGTGGTTGGGACGATATGTTACGTCATCTTATAAAGGATGTTGACAACCCTGTTCTTATGGGT

TGGGATTATCCTAAATGTGATCGTGCTATGCCAAATATTTTGCGTATTGTTAGTAGTTTAGTTTTGGCCCGCAAACA

TGAATTTTGTTGTTCACATGGTGATAGATTTTATCGCCTTGCGAATGAATGTGCTCAAGTTTTGAGTGAAATAGTTA

TGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTGGTGGTACTAGCAGTGGTGATGCAACTACTGCTTTTGCTAATTCTGTT

TTTAATATATGTCAGGCTGTTACTGCTAATGT

<---

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной генетике и медицине. Описан набор для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 методом петлевой изотермальной амплификации (LAMP). Изобретение может быть использовано для выявления указанных представителей семейства Coronaviridae для клинической лабораторной диагностики коронавирусной инфекции или для научно-исследовательских целей. 2 пр.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК вирусов SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 семейства Coronaviridae методом петлевой изотермальной амплификации (LAMP), включающий олигонуклеотиды с SEQ ID NO: 1 – SEQ ID NO: 38:

SEQ ID NO: 1 Нуклеотидная последовательность LCV2-F3

TGAATAAGCATATTGACGCATAC

SEQ ID NO: 2 Нуклеотидная последовательность LCV2-FIP2

AGGCTTGAGTTTCATCAGCCTTCACAGAGCCTAAAAAGGACAA

SEQ ID NO: 3 Нуклеотидная последовательность LCV2-BIP2

CTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCCAGCACTGCTCATGGATT

SEQ ID NO: 4 Нуклеотидная последовательность LCV2-B3-2

CATGAGTTTAGGCCTGAGTT

SEQ ID NO: 5 Нуклеотидная последовательность LCV1-F3-1

AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTGA

SEQ ID NO: 6 Нуклеотидная последовательность LCV1-FIP-1

ATGTCAGCCGCAGGAAGAACCTTTGCCGCAGAGAC

SEQ ID NO: 7 Нуклеотидная последовательность LCV1-BIP-2

AACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCATCTGCCTTGTGTGGTC

SEQ ID NO: 8 Нуклеотидная последовательность LCV1-B3-1

GCGAAAACGTTTACATAGCC

SEQ ID NO: 9 Нуклеотидная последовательность LMS-F3

CAAGAACGAATAGGGTTGTTC

SEQ ID NO: 10 Нуклеотидная последовательность LMS-FIP-1

CTAGTAGCCGTAAGGAAAGCCATATTCATTTTTACCGTAGTATGTGC

SEQ ID NO: 11 Нуклеотидная последовательность LMS-BIP-2

GTGCAATGTATGACAGGCTTCAATGGAATTTTACATAGACTGAACGT

SEQ ID NO: 12 Нуклеотидная последовательность LMS-B3-1

CACTCGTCAGGTGGTAGA

SEQ ID NO: 13 Нуклеотидная последовательность CoV229-F3

GTTCCTTAAGCTAGTGGATGA

SEQ ID NO: 14 Нуклеотидная последовательность CoV229-FIP1

ACATATGGCAAGTGAAACAAAGCTTGTGGTGCTTATAGTGATACT

SEQ ID NO: 15 Нуклеотидная последовательность CoV229-BIP1

AATAGAACAGTTTATGGCCCCATTAAATCAATAACTCGTTTAGGGAAAG

SEQ ID NO: 16 Нуклеотидная последовательность CoV229-B3-alt1

AATTCTTCAAATGGGTGACAA

SEQ ID NO: 17 Нуклеотидная последовательность CoV229-Blc

ATTTACCAATCATATATGCACATAGACCC

SEQ ID NO: 18 Нуклеотидная последовательность CoVNL63-F3

CTTCCACTCCTAAGAAACCTAA

SEQ ID NO: 19 Нуклеотидная последовательность CoVNL63-FIP2

TGATTAAAATCACGAGGACCAAAGCAACCTCGTTGGAAGCGT

SEQ ID NO: 20 Нуклеотидная последовательность CoVNL63-BIP1

CAGAATGGTGTTGATGCCAAAGGTCAGTGCTAACCTCACTATC

SEQ ID NO: 21 Нуклеотидная последовательность CoVNL63-B3

TTCTTATTATCCTTAGCTACAAGC

SEQ ID NO: 22 Нуклеотидная последовательность CoVNL63-Flc-alt1

CT+GAATAACATTTTCCTCTC+TGGTAG

Символ «+» означает модифицированный LNA (защелкнутый) нуклеотид.

SEQ ID NO: 23 Нуклеотидная последовательность CoVNL63-Blc

CTGAATTGATTCCTAATCAGGCTGC

SEQ ID NO: 24 Нуклеотидная последовательность L43-F3

CTGTACTTATGGGTTGGGATT

SEQ ID NO: 25 Нуклеотидная последовательность L43-FIP-1

TATCGCTTTGCGAACAACATGTAGTGTGATCGTGCTATGC

SEQ ID NO: 26 Нуклеотидная последовательность L43-BIP-1

GGTTTTATCGACTTGCGAATGAATGACATAATAACAGCCACCACA

SEQ ID NO: 27 Нуклеотидная последовательность L43-B3 ACTACTAGTGCCACCAGG

SEQ ID NO: 28 Нуклеотидная последовательность LHKU-F3-2

GGACGATATGTTACGTCATCT

SEQ ID NO: 29 Нуклеотидная последовательность LHKU-FIP-2

ATGTTTGCGGGCCAAAACTAAGGATTATCCTAAATGTGATCGTG

SEQ ID NO: 30 Нуклеотидная последовательность LHKU-BIP-1

GTGATAGATTTTATCGCCTTGCGAAGGCTTAACATAATAGCAACCG

SEQ ID NO: 31 Нуклеотидная последовательность LHKU-B3-1

TCACCACTGCTAGTACCA

SEQ ID NO: 32 Нуклеотидная последовательность pNCV2-POS

AAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAACTCATGCAGACCACACAAGGCAGATGGGCTATATAAACGTTTTCGCTTTTCCGTTTACGATATATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGAATTCTCGTAACTACATAGCACAAGTAGATGTAGTTAACTTT

SEQ ID NO: 33 Нуклеотидная последовательность pNCV1-POS

ACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAGACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCATAAACACTCATGATGACCACACAAGGCAGATGGGCTATGTAAACGTTTTCGCAATTCCGTTTACGATACATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGAATTCTCGTAACTAAACAGCACAAGTAGGTTTAGTTAACTTT

SEQ ID NO: 34 Нуклеотидная последовательность pMR-E-POS

TTCGTGCCTGCAACGCGCGATTCAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCGCTTATCGTTTAAGCAGCTCTGCGCTACTATGGGTCCCGTGTAGAGGCTAATCCATTAGTCTCTCTTTGGACATATGGAAAACGAACTATGTTACCCTTTGTCCAAGAACGAATAGGGTTGTTCATAGTAAACTTTTTCATTTTTACCGTAGTATGTGCTATAACACTCTTGGTGTGTATGGCTTTCCTTACGGCTACTAGATTATGTGTGCAATGTATGACAGGCTTCAATACCCTGTTAGTTCAGCCCGCATTATACTTGTATAATACTGGACGTTCAGTCTATGTAAAATTCCAGGATAGTAAACCCCCTCTACCACCTGACGAGTGGGTTTAACGAACTCCTT

SEQ ID NO: 35 Нуклеотидная последовательность pCoV229-POS-alt

TAAGATGTTCCTTAAGCTAGTGGATGATCATGCTTTGATTGTTAATGTACTACTCTGGTGTGTGGTGCTTATAGTGATACTACTAGTGTGTATTACAATAATTAAACTAATTAAGCTTTGTTTCACTTGCCATATGTTTTGTAATAGAACAGTTTATGGCCCCATTAAAAATGTGTACCATATTTACCAATCATATATGCACATAGACCCTTTCCCTAAACGAGTTATTGATTTCTAAACTAAACGACAATGTCAAACGACAATTGTACGGGTGACATTGTCACCCATTTGAAGAATTGGAA

SEQ ID NO: 36 Нуклеотидная последовательность pCoVNL63-POS

ACTTAGGTTTTGATAACCAGTCGAAGTCACCTAGTTCTTCTGGTACTTCCACTCCTAAGAAACCTAATAAGCCTCTTTCTCAACCCAGGGCTGATAAGCCTTCTCAGTTGAAGAAACCTCGTTGGAAGCGTGTTCCTACCAGAGAGGAAAATGTTATTCAGTGCTTTGGTCCTCGTGATTTTAATCACAATATGGGGGATTCAGATCTTGTTCAGAATGGTGTTGATGCCAAAGGTTTTCCACAGCTTGCTGAATTGATTCCTAATCAGGCTGCGTTATTCTTTGATAGTGAGGTTAGCACTGATGAAGTGGGTGATAATGTTCAGATTACCTACACCTACAAAATGCTTGTAGCTAAGGATAATAAGAACCTTCCTAAGTTCATTGAGCAGATTAGTGC

SEQ ID NO: 37 Нуклеотидная последовательность pCoV-OC-POS

AAATTTTATGGTGGCTGGGATGATATGTTACGCCGCCTTATTAAAGATGTTGACAATCCTGTACTTATGGGTTGGGATTATCCTAAGTGTGATCGTGCTATGCCAAACCTACTACGTATTGTTAGTAGTTTGGTATTAGCCCGAAAACATGAGACATGTTGTTCGCAAAGCGATAGGTTTTATCGACTTGCGAATGAATGCGCACAAGTTTTGAGTGAAATTGTTATGTGTGGTGGCTGTTATTATGTTAAGCCTGGTGGCACTAGTAGTGGTGATGCAACTACTGCTTTTGCTAATTCAGTCTTTAACATATGTCAAGCTGTTTCAGCCAATGT

SEQ ID NO: 38 Нуклеотидная последовательность pCoV-HK-POS

AAATTTTATGGTGGTTGGGACGATATGTTACGTCATCTTATAAAGGATGTTGACAACCCTGTTCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATCGTGCTATGCCAAATATTTTGCGTATTGTTAGTAGTTTAGTTTTGGCCCGCAAACATGAATTTTGTTGTTCACATGGTGATAGATTTTATCGCCTTGCGAATGAATGTGCTCAAGTTTTGAGTGAAATAGTTATGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTGGTGGTACTAGCAGTGGTGATGCAACTACTGCTTTTGCTAATTCTGTTTTTAATATATGTCAGGCTGTTACTGCTAATGT