Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2 Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины и биологии и позволяет выявлять РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологических образцах человека и животных, а также в мазках и смывах, взятых из окружающей среды с применением метода ПЦР в реальном времени.

В настоящее время метод ПЦР в реальном времени рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для выявления коронавируса SARS-CoV-2 как в биологических образцах, так и в образцах, взятых из окружающей среды. Данный метод позволяет быстро детектировать РНК коронавируса с высокой специфичностью. На сайте ВОЗ представлена таблица с некоторыми известными последовательностями праймеров и зондов для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-per-panel-primer-probes.html

Однако использование отдельных последовательностей для выявления РНК вируса чревато ложноотрицательным результатом, так как вследствие эволюции РНК вируса постоянно изменяется. В результате изменения нуклеотидной последовательности в месте узнавания праймеров и/или зонда может не произойти специфического узнавания участка РНК вируса, выбранного для анализа, что может привести к ложноотрицательному результату. Кроме того, к ложноотрицательным результатам при анализе может приводить низкое содержание РНК вируса в образце. Таким образом, основной задачей при детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 является устранение ложноотрицательных результатов, вызванных мутациями в геноме вируса, а также повышение чувствительности реакции.

Одним из известных аналогов нашего изобретения является патент на изобретение RU2727054. Он описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР с использованием специфичных праймеров к генам orflab (1 локус, длина амплифицируемого фрагмента 158 п.н.) и N коронавируса SARS-CoV-2 (2 локуса, длина амплифицируемых фрагментов 203 и 250 п.н.). После проведения ПЦР продукты реакции разделяют в электрофорезе с маркером длины. По наличию и длине ампликонов способ позволяет выявлять и идентифицировать наличие вируса SARS-CoV-2 в биологическом материале. Достоинством этого способа является простота применения и отсутствие дорогостоящих приборов, необходимых для детекции результатов. К недостаткам относятся наличие в анализе дополнительной стадии (электрофоретическое разделение продуктов амплификации), что увеличивает время анализа и может служить потенциальным источником контаминации лаборатории продуктами амплификации.

Также известно изобретение RU2732608, которое описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР в реальном времени с использованием специфичных праймеров и флуоресцентно меченного зонда к гену orflab (позиции нуклеотидных остатков 5327-5518). К достоинствам метода следует отнести применение лиофильно высушенных компонентов реакции, что допускает возможность транспортировки набора реагентов без соблюдения требований «холодовой цепи» и наличие в составе набора положительного контрольного образца. К недостаткам следует отнести наличие в составе набора специфичных праймеров и зонда только к одному локусу на вирусной РНК, что может привести к ложноотрицательному результату при мутации в месте отжига специфичных праймеров или зонда.

Еще одним аналогом является изобретение RU2733665, которое описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР в реальном времени с использованием специфичных праймеров и флуоресцентно меченного зонда к гену N вируса SARS-CoV-2. Достоинство способа состоит в высокой специфичности именно к вирусу SARS-CoV-2, высокой чувствительности, отсутствию стадии электрофореза. Недостатком данного способа, как и в предыдущем, является наличие специфичных праймеров и зонда только к одному локусу на вирусной РНК, что может привести к ложноотрицательному результату при мутации в месте отжига специфичных праймеров или зонда.

Прототипом нашего изобретения следует считать патент на изобретение RU2720713. Он описывает способ выявления кДНК вируса SARS-CoV-2 при помощи метода ПЦР в реальном времени с использованием 6 пар специфичных праймеров. Достоинством данного метода является обеспечение универсальной информативности выявления РНК SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР за счет устранения риска получения ложноотрицательных результатов при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. Недостатком метода является то, что авторы, для увеличения надежности, выбрали для анализа высококонсервативные участка вируса, что может привести к ложноположительныму результату анализа при наличии в исследуемом образце РНК других коронавирусов человека и животных.

Выбранные нами последовательности праймеров и зондов с различными флуоресцентными метками позволяют использовать для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 несколько участков генома вируса, что увеличивает специфичность и чувствительность анализа, и, таким образом, позволяет решить поставленную задачу. В качестве контроля выделения РНК используются праймеры и зонд к человеческому гену GAPDH, представленные в перечне последовательностей нуклеотидов SEQ ID No 25-27. Последовательности праймеров и зондов, выбранных нами для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2, представлены в таблице 1 и в перечне последовательностей нуклеотидов SEQ ID No 1-27

Подобранные нами пары праймеров и зонды могут использоваться для проведения ПЦР в реальном времени как с кДНК, полученной ранее при проведении реакции обратной транскрипции (ОТ) на матрице РНК, выделенной из биологического образца, так и в совмещенной реакции ОТ-ПЦР в реальном времени. Во втором случае в одной пробирке совмещаются реакции ОТ и ПЦР в реальном времени, что значительно сокращает время анализа. Состав компонентов для проведения реакции приведен в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый набор включает в себя синтетические олигонуклеотиды, фланкирующие несколько выбранных нами участков на РНК коронавируса SARS-CoV-2 (праймеры), а также синтетические олигонуклеотиды, несущие в себе флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции одновременно (зонды). При узнавании праймерами и зондами соответствующего участка на кДНК, комплементарной РНК коронавируса SARS-CoV-2, происходит их связывание с ним, с последующим расщеплением зонда ферментом ДНК-полимеразой. При расщеплении зонда происходит усиление флуоресценции, что говорит о наличии в пробирке молекул-мишеней.

Примеры использования

Пример 1

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер ORF1_F(Seq ID NO 1), обратный праймер ORF1_R(Seq ID NO 2), флуоресцентный зонд ORF1_P(Seq ID NO 3), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам ROX и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 1 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров ORF1 (Seq ID NO 1-3), комплементарных гену ORFlab коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 16,47. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену ORF_lab коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,13. Поскольку величина Ct для гена ORFlab составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах ROX и Су5 со значением Ct<38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 2

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер ORF1.1_F(Seq ID NO 4), обратный праймер ORF1.1_R(Seq ID NO 5), флуоресцентный зонд ORF1.1_P(Seq ID NO 6), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам FAM и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 2 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров ORF1.1 (Seq ID NO 4-6), комплементарных гену ORF lab коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 17,52. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену ORF lab коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 29,72. Поскольку величина Ct для гена ORFlab составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах FAM и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 3

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер N1_F(Seq ID NO 7), обратный праймер N1_R(Seq ID NO 8), флуоресцентный зонд N1_P(Seq ID NO 9), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам R6G и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 3 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров N1 (Seq ID NO 7-9), комплементарных гену N коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,73. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену N коронавируса SARS-CoV-2.

Ct для этого гена составляет в данном случае 31,29. Поскольку величина Ct для гена N коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах R6G и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 4

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер N3 F (Seq ID NO 10), обратный праймер N3_R (Seq ID NO 11), флуоресцентный зонд N3_P (Seq ID NO 12), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам Су3 и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 4 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров N3 (Seq ID NO 10-12), комплементарных гену N коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,83. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену N коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,02. Поскольку величина Ct для гена N коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах Су3 и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 5

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер S1_F(Seq ID NO 13), обратный праймер S1_R(Seq ID NO 14), флуоресцентный зонд S1_P(Seq ID NO 15), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F(Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R(Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P(Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам FAM и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции)/

На фиг. 5 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров S1 (Seq ID NO 13-15), комплементарных гену S коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 20,16. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену S коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,26. Поскольку величина О для гена S коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах FAM и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 6

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер M1_F (Seq ID NO 16), обратный праймер M1_R(Seq ID NO 17), флуоресцентный зонд M1_P (Seq ID NO 18), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP F (Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP R (Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAPJP (Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам ROX и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 6 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров M1 (Seq ID NO 16-18), комплементарных гену М коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18, 17. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену М коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 30,63. Поскольку величина Ct для гена М коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах ROX и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 7

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер M2 F (Seq ID NO 19), обратный праймер M2_R (Seq ID NO 20), флуоресцентный зонд M2_P (Seq ID NO 21), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP F (Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP_R (Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P (Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам VIC и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 7 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров М2 (Seq ID NO 19-21), комплементарных гену М коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,39. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену М коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,23. Поскольку величина Ct для гена М коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах VIC и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

Пример 8

В пробирку, содержащую все необходимые компоненты для проведения реакции ОТ-ПЦР (5-кратный реакционный буфер, смесь ферментов РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) и Taq ДНК-полимераза, прямой праймер ORF7a_F (Seq ID NO 22), обратный праймер ORF7a_R (Seq ID NO 23), флуоресцентный зонд ORF7a_P (Seq ID NO 24), прямой праймер к гену GAPDH человека GAP_F (Seq ID NO 25), обратный праймер к гену GAPDH человека GAP R (Seq ID NO 26), флуоресцентный зонд к гену GAPDH человека GAP_P (Seq ID NO 27)) общим объемом 21 мкл, добавляется 4 мкл раствора РНК, выделенной из исследуемого биологического образца. В образцы с отрицательным контролем необходимо вместо РНК внести 4 мкл чистой воды (см. табл. 2). После внесения всех реактивов в пробирки необходимо немедленно помесить их в прибор для проведения ПЦР в реальном времени, имеющем возможность детекции флуоресценции по каналам Су3 и Су5 одновременно, и запустить следующую программу:

Программа для прибора

- 55°С - 20 мин (реакция обратной транскрипции)

- 95°С - 1 мин (активация Taq-полимеразы)

- Далее 45 циклов по следующей программе:

- 95°С - 20 сек (плавление ДНК)

- 58°С - 40 сек (отжиг праймеров, элонгация цепей ДНК, детекция флуоресценции).

На фиг. 8 представлен пример детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 при помощи набора праймеров ORF7a (Seq ID NO 22-24), комплементарных гену ORF7a коронавируса SARS-CoV-2. Цифрой 1 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая человеческому гену GAPDH, что свидетельствует о наличии в исследуемом образце РНК человека. Ct для этого гена составляет в данном случае 18,39. Цифрой 2 обозначена кривая накопления флуоресценции, соответствующая гену М коронавируса SARS-CoV-2. Ct для этого гена составляет в данном случае 31,95. Поскольку величина Ct для гена ORF7a коронавируса SARS-CoV-2 составляет <38, данный пример можно рассматривать в качестве успешного обнаружения РНК коронавируса SARS-CoV-2 в исследуемом биологическом образце.

Интерпретация результатов

Признаком обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 будет являться наличие флуоресценции в каналах Су3 и Су5 со значением Ct <38. Отсутствие флуоресценции в канале Су5 говорит о крайне низком количестве РНК в образце, и, следовательно, о невозможности его анализа. Наличие флуоресценции по какому-либо из каналов в образцах с отрицательным контролем, говорит о контаминации реакционной смеси нуклеиновыми кислотами и о необходимости переделать анализ.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской

академии наук (ИТЭБ РАН)

<120> Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2

<140> 2021102274

<141> 02.02.2021

<160> SEQ ID NO: 27

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 23

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

gctgctcttcaacctgaagaaga

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

tccatctctaattgaggttgaacct

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 26

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

rox-tggtcaacaagacggcagtgaggaca-bhq2

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

ggccaattctgctgtcaaat

<210> SEQ ID NO: 5

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

catcagtgcaagcagtttgt

<210> SEQ ID NO: 6

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

fam-cctgttgcactacgacagatg-bhq1

<210> SEQ ID NO: 7

<211> 18

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

ggccgcaaattgcacaat

<210> SEQ ID NO: 8

<211> 17

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

ccaatgcgcgacattcc

<210> SEQ ID NO: 9

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

r6g-cccccagcgcttcagcgttct-bhq1

<210> SEQ ID NO: 10

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

accccaaaatcagcgaaatg

<210> SEQ ID NO: 11

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

ttctggttactgccagttgaatctg

<210> SEQ ID NO: 12

<211> 24

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

cy3-accccgcattacgtttggtggacc-bhq2

<210> SEQ ID NO: 13

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

ttggtgcaggtatatgcgcta

<210> SEQ ID NO: 14

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

taattctcctcggcgggcacgtagt

<210> SEQ ID NO: 15

<211> 24

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

fam-actgaattttctgcaccaagtgac-bhq1

<210> SEQ ID NO: 16

<211> 22

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

ggcttgatgtggctcagctact

<210> SEQ ID NO: 17

<211> 21

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

tggattgaatgaccacatgga

<210> SEQ ID NO: 18

<211> 27

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

rox-cattgcttctttcagactgtttgcgcg-bhq2

<210> SEQ ID NO: 19

<211> 23

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

catgtggtcattcaatccagaaa

<210> SEQ ID NO: 20

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

ctagaagcggtctggtcagaatagt

<210> SEQ ID NO: 21

<211> 30

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 21

vic-taacattcttctcaacgtgccactccatgg-bhq1

<210> SEQ ID NO: 22

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 22

agaaccttgctcttctggaacatac

<210> SEQ ID NO: 23

<211> 25

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 23

gctaaagcaagtcagtgcaaatttg

<210> SEQ ID NO: 24

<211> 30

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 24

cy3-agggcaattcaccatttcatcctctagctg-bhq2

<210> SEQ ID NO: 25

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 25

gacagtcagccgcatcttct

<210> SEQ ID NO: 26

<211> 20

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 26

gcgcccaatacgaccaaatc

<210> SEQ ID NO: 27

<211> 23

<112> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 27

cy5-tcgccagccgagccacatcgctc-bhq2

<---

Изобретение относится к области медицины и биологии. Описан набор синтетических олигонуклеотидов, фланкирующих несколько выбранных участков на РНК коронавируса SARS-CoV2 (праймеры), а также синтетических олигонуклеотидов, несущих в себе флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции одновременно (зонды). При узнавании праймерами и зондами соответствующего участка на кДНК, комплементарной РНК коронавируса SARS-CoV2, происходит их связывание с ним, с последующим расщеплением зонда ферментом ДНК-полимеразой. При расщеплении зонда происходит усиление флуоресценции, что говорит о наличии в пробирке молекул-мишеней. Изобретение позволяет выявлять РНК коронавируса SARS-CoV2 в биологических образцах человека и животных, а также в мазках и смывах, взятых из окружающей среды с применением метода ПЦР в реальном времени. 2 табл., 8 пр., 6 ил.

Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для выявления коронавируса SARS-CoV-2, комплементарных к выбранным участкам на РНК коронавируса, соответствующих генам ORF1ab, М, N, S, ORF7a, и синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, комплементарных к выбранному участку гена человека GAPDH, где прямой (F), обратный (R) праймеры и зонды (Р) имеют последовательности: