Комплексный биопрепарат для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов, повышения продуктивности и способ получения этого биопрепарата Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 A01N63/20 C05F11/08 

Группа изобретений относится к сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии и может быть использована для повышения урожая сельскохозяйственных культур за счет оптимизации азотного, фосфорного питания, стимуляции роста растений и биозащиты их от грибных инфекций.

Одним из факторов получения высоких урожаев сельскохозяйственных культур является обеспечение растений такими необходимыми элементами как азот, фосфор, калий, магний и др., что достигается использованием минеральных и органических удобрений, в том числе и комплексных.

Длительное применение азотных и фосфорных минеральных удобрений приводит к закислению почв, а из-за высокой скорости растворения азота происходят потери действующего вещества до 50%. Недостатком калийных удобрений является содержание хлора. Органоминеральные удобрения экологичны, аккумулятивны, обладают регуляторным действием. Недостатками органоминеральных удобрений являются необходимость использования дорогостоящего оборудования, длительных технологических операций, использования трудноразлагаемых компонентов и компонентов, вызывающих засоление. При использовании в качестве органической составляющей отходов животноводства возникает необходимость их обеззараживания. Отсутствие животноводческих комплексов и деревообрабатывающих производств ограничивает использование данных удобрений.

Для повышения продуктивности растений используют инокуляцию семян активными штаммами ассоциативных и симбиотических азотфиксирующих бактерий (патент RU 2464308 С2, 27.05.2012; патент RU 2529958 С1, 10.10.2014; патент RU 2728641 С1, 30.07.2020; патент UA 126060 U, 11.06.2018; патент UA 100771 U, 10.08.2015), фосфатмобилизующих бактерий (патент RU 2676926 С1, 11.01.2019; патент UA 99010 U, 12.05.2015). В практике сельского хозяйства применяют инокуляцию микроорганизмами для стимуляции роста растений и защиты их от патогенов (патент RU 2121271 С1, 10.11.1998; патент RU 2650777 С1, 17.04.2018; патент RU 2302114 С1, 10.07.2007). К недостаткам штаммов и инокулянтов, приведенных в указанных патентах, можно отнести нестабильность действия, которую можно объяснить конкуренцией между интродуцируемым штаммом и микрофлорой, сформированной в агроценозах.

Известно, что в природных условиях микроорганизмы существуют в виде структурированных ассоциаций (Николаев, Ю.А., Плакунов, В.К. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология, 2007. - Т. 76. - №2. - С. 149-163). В сельскохозяйственной биотехнологии применяют ассоциации микроорганизмов для сбраживания силоса (патент RU 2268299 С2, 20.01.2006), переработки органических отходов сельского хозяйства (А.с. SU 1049537 А1, 23.10.1983), снижения эмиссии аммиака и/или метана в органических удобрениях или почвах (патент RU 2710059 С2, 24.12.2019), биоремидиации почвы (патент RU 272071 С2, 20.03.2006; патент RU 2509150 С2, 10.03.2014), защиты растений от патогенов и вредителей (патент RU 2626543 С2, 16.05.2017; патент RU 2313941 С2, 10.01.2008; патент UA 119652 U, 25.09.2017).

Известен микробный препарат на основе ассоциации аэробных спорообразующих бактерий Bacillus subtilis К4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 (патент RU 2314693 C2, 20.01.2008). Препарат имеет широкий спектр действия: повышение плодородия почвы, ее оздоровление, стимуляция роста растений. Вместе с тем, кроме ассоциации бактерий, препарат содержит наполнители (каолин, соевую муку), микроэлементы, витамины отдушку в виде гидролизата смеси хвойного экстракта и хлорофиллокаротиновой пасты. Последние компоненты готовят заранее по специальной технологии с использованием определенного оборудования, что усложняет технологический процесс получения препарата. Кроме того, препарат рекомендован для обработки почвы.

Известен биопрепарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и улучшения качества продукции, содержащий бактерии разных родов (патент RU 2322061 С2, 20.04.2008). Препарат состоит из смеси суспензий бактерий родов Agrobacterium, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Ervinia, Rhodopseudomonas. К существенным недостаткам такого препарат можно отнести сложность приготовления и применения. Для получения препарата каждый штамм выращивают на оптимальной для него среде (следовательно, требуется большой набор сред), что при значительных объемах производства затруднительно. Затем готовят суспензию путем смыва культур 9% раствором хлорида натрия, следующий этап - получение суспензии бактерий в защитной сахорожелатиновой среде в одинаковой для всех штаммов оптической площади и формирование ассоциации в заданном соотношении (в %). Изменение концентрации одного из штаммов может увеличить гормональную нагрузку на растение. Далее в зависимости от назначения препарат разводят в 1:200, 1:100 или 1:1000. Препарат может быть использован для осенней, весенней и летней обработок почвы, корневой и внекорневой подкормок в период вегетации растений, а также предпосевной обработки семян. Семена обрабатывают путем замачивания на 1-2 часа, что увеличивает время от обработки до посева.

Известен комплекс микробных препаратов (КМП), рекомендованный для повышения урожайности сельскохозяйственных культур, стимуляции роста и развития растений, повышения устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессовым факторам (Еговцева А.Ю., Мельничук Т.Н. Влияние предпосевной обработки семян комплексом микробных препаратов на микробоценоз ризосферы ячменя озимого // Биомика. - 2018. - Т. 10 (2). - С. 202-205; Баранская М.И., Чайковская Л.А., Немтинов В.И. Воздействие биоагентов микробных препаратов (Rhizobium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3, Paenibacillus polymyxa П) на семена Nigella damascena L. // Таврический вестник аграрной науки. - 2020. - №3 (23). - С. 18-25; Чайковская Л.А., Баранская М.И., Овсиенко О.Л., Клименко Н.Н. Влияние микробных препаратов на адаптивный потенциал озимой пшеницы при воздействии тяжелых металлов// Таврический вестник аграрной науки. - 2019. - №4 (20). - С. 123-132). КМП получают путем механического смешивания готовых препаратов Rhizobium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 и Paenibacillus polymyxa П в соотношении 1:1:1 с тщательным перемешиванием. Недостатком такого препарата является необходимость его использования сразу после приготовления смеси, нестабильность при длительном хранении, а также точная концентрация (при 100 мл на гектарную норму семян нужно по 33 мл препарата).

В основу предложенного изобретения поставлена задача получения стабильно эффективного комплексного биопрепарата путем совместного глубинного культивирования коллекционных штаммов бактерий, селекционированных по доминирующей функциональной направленности.

Технический результат изобретения - обеспечение потребности растений в макроэлементах минерального питания, стимуляция их роста, защита от фитопатогенной микробиоты и как следствие повышение продуктивности сельскохозяйственных культур.

Решение поставленной задачи достигается созданием комплексного биопрепарата для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов, повышения продуктивности на основе штаммов бактерий Agrobacterium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 и Paenibacillus polymyxa П13НК, получаемого их совместным культивированием, при котором коллекционные культуры штаммов пересевают на скошенный гороховый агар, через 2-3 суток делают смыв в жидкую питательную среду и культивируют в течение 48 часов, получая маточные культуры, после чего кукурузно-мелассную питательную среду засевают маточными культурами штаммов A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 одновременно в количестве по 1,5% каждого штамма от объема среды, после чего в 24-часовую культуру двух штаммов вносят маточную культуру штамма P. polymyxa П13НК (2% от объема культуры) и культивируют в течение 48 часов до получения титра 10⁹ КОЕ в 1 мл при температуре 28-30°С при скорости вращения качалки 170-220 об/мин. Титр Agrobacterium radiobacter 204 в биопрепарате составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ.

Биопрепарат разработан на основе коллекционных штаммов бактерий разной функциональной направленности (азотфиксаторующей, фосфатмобилизующей, ростстимулирующей и биопротекторной), благодаря чему достигается комплексное воздействие на рост и развитие сельскохозяйственных культур.

Штамм ризосферных азотфиксирующих бактерий Agrobacterium (Rhizobium) radiobacter 204 (А.с. 1621433, C05F 11/08, C12N 1/20, 15.09.1990) переводит азот в доступную растению форму, является основой микробиологического препарата, рекомендованного для предпосевной обработки семян с целью повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 (патент RU 2676926 C1; C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/01; 11.01.2019) обладает способностью продуцировать фитогормоны и трансформировать труднорастворимые минеральные фосфаты в усвояемые для растений формы. Штамм является основой микробиологического препарата, использующегося для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности.

Штамм Paenibacillus polymyxa П13НК - антагонист фитопатогенных микроскопических грибов, по эффективности не уступает химическим протравителям - фундазолу, максиму, байтану. Штамм депонирован 17.10.2019 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05221.

Таким образом, основными свойствами бактерий, составляющих комплексный биопрепарат являются: азотфиксация, фосфатмобилизация, фитостимуляция и контроль патогенных микромицетов.

Штаммы A. radiobacter 204, L. nimipressuralis CCM 32-3 и P. polymyxa П13НК не проявляют антагонизма друг к другу на агаризованных питательных средах, что было установлено методом перпендикулярных штрихов и блочков (Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. 6-е изд., перераб. и доп./ Н.С. Егоров. - М.: Изд-во ММГУ; Наука, 2004. - 528 с. - С. 156-157). В условиях совместного периодического культивирования трех штаммов отмечали доминирование P. polymyxa П13НК, в связи с чем были подобраны оптимальные концентрации бактерий и период их инокуляции в жидкую питательную среду. При одновременном засеве жидкой питательной среды отмечалось ускорение роста трех штаммов, при этом P. polymyxa П13НК доминировал, что было установлено как микроскопированием, так и по количеству КОЕ. Исследовали комбинации штаммов и их количественное соотношение при одновременном и раздельном во времени (через 12, 16, 20, 24 часа) засеве жидкой питательной среды. Установили, что оптимальным является способ глубинного культивирования, при котором одновременно засевается питательная среда штаммами A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 в соотношении 1:1 (по 1,5% от объема питательной среды). После 24 часов культивирования вносят P. polymyxa П13НК, в количестве, составляющем 2% от объема суточной бинарной культуры.

Комплексный препарат готовят следующим образом.

1. Для получения посевного материала коллекционные культуры штаммов пересевают на скошенный гороховый агар (каждую отдельно), через 2-3 суток делают смыв в жидкую питательную среду, после чего культивируют в течение 48 часов (маточная культура).

2. Кукурузно-мелассная (1:1) питательная среда засевается полученными указанным в п. 1 способом маточными культурами штаммов A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 одновременно в количестве по 1,5% каждого штамма от объема среды. Маточную культуру штамма P. polymyxa П13НК вносят в 24-часовую культуру двух штаммов (2% от объема культуры) и культивируют в течение 48 часов до получения титра 10⁹ КОЕ в 1 мл при температуре 28-30°С при скорости вращения качалки 170-220 об/мин.

При совместном культивировании трех штаммов в готовом препарате титр Agrobacterium radiobacter 204 составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ. Для определения титра каждой культуры бактерий при совместном культивировании использовали стрептомициновую метку (Метод общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхарда и др. - М.: Мир, 1984. - 472 с. - С. 29-31; Вернер Браун. Генетика бактерий. - М.: «Наука», 1968. - 446 с. - С. 134).

Бактерии сохраняют жизнеспособность и численное соотношение в течение 5 месяцев при температуре хранения до 15°С.

Препарат применяют для предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур из расчета 100 мл на 1 гектарную норму семян.

Пример 1. Исследовали динамику роста штаммов в условиях совместного периодического культивирования

Результаты кинетического описания роста бактерий, представленные в таблице 1, свидетельствуют об увеличении абсолютной скорости роста, количества клеточных делений и о сокращении продолжительности генераций клеток при совместном культивировании штаммов.

Пример 2. При разработке микробного препарата важным является не только получение жизнеспособных клеток, а и сохранение их функциональности.

Исследовали азотфиксирующую активность бактерий при моно- и совместном культивировании. Результаты исследований показали повышение азотфиксирующей активности штаммов в тройной (совместной) культуре (таблица 2).

Пример 3. В лабораторных условиях семена озимой пшеницы (тест-культура) обрабатывали разведенным в 10 и 100 раз комплексным биопрепаратом и раскладывали в чашки Петри по 25 семян в 5-кратном повторении. Количество биопрепарата и рабочих растворов соответствовало рекомендованным в производстве (100 мл препарата на гектарную норму семян; рабочий раствор составляет 1,8% от массы семян). Результаты проведенного опыта, свидетельствующие об улучшении посевных качеств семян, приведены в таблице 3.

Пример 4.

В лабораторных опытах исследовали влияние комплекса микробных препаратов на развитие проростков рыжика посевного (фиг. 1).

Результаты опыта показали, что инокуляция семян рыжика посевного стимулирует развитие проростка. Так, в варианте с применением комплексного биопрепарата установлено увеличение длины корешка в 1,8 раз и длины побега на 15% в сравнении с контролем.

Пример 5. В вегетационном опыте на субстратах вермикулит и чернозем южный под влиянием комплексного биопрепарата было отмечено увеличение всхожести семян Triticum aestivum L. На вермикулите всхожесть инокулированных семян составляла 93,3% при 66,7% в контрольном варианте, на черноземе южном - 73,3% при 33,3% - в контроле (фиг. 2).

По высоте инокулированные растения, выросшие на вермикулите, на 22,2% превышали контрольные, что свидетельствует о фитостимулирующем действии микробного препарата, полученного путем совместного культивирования.

Пример 6. Изучали влияние инокуляции комплексным биопрепаратом на численность диазотрофов и азотфиксирующую активность в ризоплане и ризосфере Triticum aestivum L.

По результатам микробиологического анализа на вермикулите численность диазотрофов в ризоплане Triticum aestivum L. составляла 4,7 млн КОЕ на 1 корень. В варианте с комплексным биопрепаратом зафиксирована азотфиксирующая активность 63,6±4,64 наномоль С₂Н₄/ час на 1 корень, что может свидетельствовать о синергизме биокомпонентов в препарате (таблица 4).

В почве ризосферы инокулированных растений численность диазотрофов и азотфиксирующая активность превышали контроль (без инокуляции) в 1,6 и 1,5 раза соответственно (таблица 5).

Пример 7. В условиях полевого опыта на черноземе обыкновенном по предшественнику черный пар исследовали влияние комплексного биопрепарата на биологическую активность в ризосфере и продуктивность озимой пшеницы. Показано повышение потенциальной азотфиксирующей активности и содержание подвижного фосфора в ризосфере озимой пшеницы (таблица 6), что является положительным фактом, особенно учитывая сокращение внесения доз минеральных удобрений под сельскохозяйственные культуры.

Инокуляция обеспечила увеличение зерновой продуктивности пшеницы на 8,2 ц/га (14,4%) к контролю (таблица 7).

Повышение зерновой продуктивности в сравнении с химическим протравителем свидетельствует как об оптимизации питания растений и стимуляции, так и о защите от болезнетворных организмов. В лабораторных условиях отмечено увеличение антифунгальной активности совместной культуры в 1,2 раза в сравнении с монопрепаратом на основе биопротекторного штамма Paenibacillus polymyxa П13НК. Было установлено, что применение комплексного биопрепарата повышает устойчивость растений озимой пшеницы к корневым гнилям, возбудителями которых являются микромицеты родов Fusarium, Bipolaris, Alternaria. Так, применение комплексного биопрепарата в посевах пшеницы способствовало снижению распространения корневых гнилей на 11,8% по сравнению с контролем (49,6%) и развития заболеваемости в 2,1 раза.

Выращивание пшеницы с применением комплексного биопрепарата экономически выгодно за счет снижения себестоимости полученной продукции. Этот прием экологичен.

Пример 8. Полученный комплексный микробный препарат испытывали в условиях полевых опытов в посевах риса. Установлено, что, что предпосевная обработка семян повышает продуктивность растений: увеличение количества метелок на 3,6%, количества семян в метелке - на 32,9%, урожая зерна риса - на 48,1% (таблица 9).

Пример 9. В условиях полевого опыта на черноземе южном исследовали влияние инокуляции семян комплексным микробным препаратом на продуктивность подсолнечника. Полученные результаты показывают, что комплексный биопрепарат обеспечивает повышение урожая гибридов подсолнечника на 13,6-14,7% (таблица 10).

Таким образом, разработан эффективный многокомпонентный микробный препарат на основе коллекционных штаммов азотфиксирующих, фосфатмобилизирующих бактерий и бактерий-антагонистов фитопатогенов. Разработан способ получения комплексного микробного препарата путем совместного культивирования трех штаммов, при котором титр Agrobacterium radiobacter 204 составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ.

Обработка биопрепаратом перед посевом повышает всхожесть семян, улучшает посевные свойства и зерновую продуктивность сельскохозяйственных культур. Установлено увеличение нитрогеназной активности и содержания подвижного фосфора в ризосфере растений в фазу цветения, что свидетельствует об активности почвенной микробиоты и обеспеченности элементами минерального питания растений. Применение комплексного биопрепарата повышает эффективность растительно-микробного взаимодействия в агрофитоценозах.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены комплексный биопрепарат для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов, повышения продуктивности и способ его получения, включающий совместное культивирование штаммов бактерий Agrobacterium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 и Paenibacillus polymyxa П13НК, при этом кукурузно-мелассную питательную среду засевают маточными культурами штаммов A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 одновременно в количестве по 1,5% каждого штамма от объема среды, после чего в 24-часовую культуру двух штаммов вносят маточную культуру штамма P. polymyxa П13НК (2% от объема культуры) и культивируют в течение 48 ч до получения титра 10⁹ КОЕ в 1 мл при 28-30°С при скорости вращения качалки 170-220 об/мин. Титр Agrobacterium radiobacter 204 в биопрепарате составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ. Изобретения обеспечивают повышение всхожести семян, улучшение посевных свойств и зерновую продуктивность сельскохозяйственных культур. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 10 табл., 9 пр.

1. Способ получения комплексного биопрепарата для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов и повышения продуктивности, включающий совместное культивирование штаммов бактерий Agrobacterium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 и Paenibacillus polymyxa П13НК, при этом коллекционные культуры штаммов пересевают на скошенный гороховый агар, через 2-3 суток делают смыв в жидкую питательную среду и культивируют в течение 48 ч, получая маточные культуры, после чего кукурузно-мелассную питательную среду засевают маточными культурами штаммов A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 одновременно в количестве по 1,5% каждого штамма от объема среды, после чего в 24-часовую культуру двух штаммов вносят маточную культуру штамма P. polymyxa П13НК (2% от объема культуры) и культивируют в течение 48 ч до получения титра 10⁹ КОЕ в 1 мл при температуре 28-30°С при скорости вращения качалки 170-220 об/мин.

2. Комплексный биопрепарат для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов и повышения продуктивности на основе штаммов бактерий Agrobacterium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 и Paenibacillus polymyxa П13НК, получаемый их совместным культивированием способом по п. 1, с общим титром 10⁹ КОЕ, в котором титр Agrobacterium radiobacter 204 составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ.