Полифункциональный биопрепарат на основе штамма ризобактерий Paenibacillus polymyxa с комплексом хозяйственно полезных свойств для защиты растений от фитопатогенов, повышения урожайности сельскохозяйственных культур, улучшения посевных качеств семян и стимуляции биологической активности ризосферы Российский патент 2025 года по МПК A01N63/25 A01N63/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии, растениеводству, а именно к промышленному культивированию штаммов бактерий, получению микробных препаратов, микробиологическим средствам контроля фитопатогенов и оптимизации минерального питания растений путем обработки семян перед закладкой на хранение, посевом в почву и растений по вегетации. Изобретение позволяет обеспечить биозащиту растений от грибных болезней, улучшить фосфорное, азотное и калийное питание, стимулировать рост растений, активировать микробиологические процессы в ризосфере и почве, что обеспечивает повышение урожайности сельскохозяйственных культур, сохранение плодородия почвы.

Защита сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных заболеваний остается актуальной проблемой растениеводства и земледелия. Широкое применение пестицидов привело к возникновению проблем накопления их остатков в почве, воздухе, воде и растениях. В результате происходит загрязнение продукции растениеводства и других отраслей сельского хозяйства с последующим поступлением вредных веществ в организм человека. Кроме того, сельскохозяйственная практика все чаще сталкивается с факторами снижения эффективности препаратов, вызванного возникновением форм фитопатогенных грибов и бактерий, устойчивых к фунгицидам. Вопрос защиты сельскохозяйственных культур от грибных болезней остается актуальным. В связи с этим возникает необходимость поиска альтернативных систем защиты растений от фитопатогенов. К таким эффективным системам можно отнести биометод, среди задач которого является поиск новых штаммов-антагонистов, ингибирующих развитие и ограничивающих распространение возбудителей болезней, и создание на их основе биопрепаратов антифунгального и антибактериального действия, способных вывести производство сельскохозяйственных культур на экологически и экономически более целесообразный уровень.

В современных микробных технологиях почвы, ризосферы и филлосферы перспективными являются ризосферные бактерии рода Paenibacillus, которые обладают широким спектром свойств, положительных для сельскохозяйственной практики: синтез экзополисахаридов и ряда внеклеточных ферментов (амилазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, липазы, пектиназы, оксигеназы, дегидрогеназы, лигнин-модифицирующие ферменты и мутаназы), гидролиз низкомолекулярных углеводов, продуцирование антибиотиков, азотфиксация, фосфатмобилизация и др. (Ха Т.З., Канарский А.В., Канарская З.А., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. Перспектива применения бактерий рода Paenibacillus в промышленной биотехнологии для получения биопрепаратов сельскохозяйственного назначения // Вестник Поволжского государственного технологического унивеpситета. Сер.: Лес. Экология. Природопользование. - 2020. - № 3 (47). - С. 74-84).

Известен штамм P. ehimensis IB 739 (RU 2460780 С1; МПК C12N 1/20, С12Р 19/04; опубл. 10.09.2012), способный продуцировать до 25 г/л экзополисахарида, рекомендованный для получения функциональных материалов широкого спектра применения в нефтедобывающей промышленности, который ранее был описан как штамм бактерий для получения препарата против грибковых заболеваний злаковых культур. Штамм бактерии P. polymyxa ВКМ В-3504Д - продуцент левана (RU 2740710 С1; МПК C12N 1/20, C12P 19/04, C12R 1/01; опубл. 20.01.2021) также рекомендован для получения функциональных материалов широкого спектра применения.

Известен штамм P. mucilaginosus ВКПМ В-12259 (RU 2626543 С2; МПК C12N 1/20, С05F11/08; опубл. 28.07.2017), который стимулирует рост растений, подавляет широкий спектр фитопатогенной микрофлоры, расщепляет фосфор и калий, однако не раскрыто свойство штамма фиксировать азот атмосферы. Оптимизация минерального питания растений биологизированными способами наряду с защитой от патогенов остается актуальной проблемой.

Важной задачей земледелия является ускорение гумификации послеуборочных растительных остатков путем внесения микроорганизмов, обладающих свойствами использовать целлюлозу в процессе метаболизма. Известно, что представители рода Bacillus обладают способностью разлагать целлюлозу (Robson L.M., Chambliss G.H. Characterization of the cellulolytic activityofa Bacillus isolate // ApplEnvironMicrobiol. - 1984. - V. 47, № 5. -P. 1039-1046).

Известна смесь бактериальных штаммов, обладающая целлюлозолитической и фунгицидной активностью (RU 2752903 С1; МПК C12N 1/20, A01N 63/20, C12R 1/07; опубл. 11.08.2021), которая включает штамм Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747. Штамм продуцирует целлюлазу и эндо-1,4-β-глюканазу, обладает фунгицидной и слабой амилазной и протеазной активностью. Вместе с тем недостаточно раскрыты комплексные свойства бактерий для растений и почвы.

Недостатком всех выше указанных патентов является недостаточное раскрытие или отсутствие сведений о способах культивирования штаммов, разработке микробных препаратов на их основе.

В основу предложенного изобретения поставлена задача получения конкурентоспособного и эффективного полифункционального биопрепарата на основе штамма Paenibacillus polymyxa с комплексом хозяйственно полезных свойств, имеющего антагонистическую активность к фитопатогенным грибам, обладающего азотфиксирующими и фосфатмобилизирующими свойствами, оказывающего стимулирующее действие на рост и развитие растений, а также на микробиологические процессы в ризосфере.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в защите растений от фитопатогенных микроорганизмов, повышении урожайности сельскохозяйственных культур, улучшении посевных качеств семян и повышении биологической активности ризосферы.

Поставленная задача решена путем создания полифункционального биопрепарата для защиты растений от фитопатогенов, повышения урожайности сельскохозяйственных культур, улучшения посевных качеств семян, стимуляции биологической активности ризосферы на основе штамма ризобактерий Paenibacillus рolуmуха П13НК с комплексом хозяйственно полезных свойств, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05221, с общим титром не менее 1,2 млрд клеток и титром спор не менее 570 млн в 1 мл.

Заявляемый биопрепарат получают на основе штамма ассоциативных бактерий Paenibacillus рolуmуха П13НК из Крымской коллекции микроорганизмов (ККМ, http://www.ckp-rf.ru/usu/507484/). Штамм был выделен из ризосферы гороха, выращенного на черноземе южном, идентифицирован по морфологическим, физиолого-биохимическим и генетическим признакам, депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения под регистрационным номером RCAM05221.

Клетки штамма подвижные палочки, крупные 0,8-2,5 мкм, спорообразующие с центрально-терминальным расположением спор. Грамположительные, факультативные анаэробы. Колонии на агаризованной питательной среде образуются на 2-3 сутки, диаметром до 3,5-4 мм, выпуклые, слизистые, блестящие. Хорошо растет на средах с органическим (МПА) и минеральным азотом (среда Козера). В качестве источника углерода бактерии P. рolуmуха П13НК используют широкий спектр простых и сложных углеводов, на сахарозе и глюкозе образуют обильную, стекающую слизь. Каталазоположительные, гидролизуют крахмал, расщепляют казеин, восстанавливают нитраты до нитритов. Газообразуют. Бактерии растут в температурных пределах 5-45°С, оптимум 22-28°С. Диапазон рН 5,5-8,5, оптимум рН - 7,0-7,2. Штамм является антагонистом широко распространённых фитопатогенных микромицетов, вызывающих заболевания растений. P. рolуmуха П13НК обладает азотфиксирующими, фосфатмобилизирующими и ростстимулирующими свойствами, продуцирует физиологически активные вещества (фитогормоны, антибиотики, экзополисахариды).

Штамм продуцирует экзополисахариды в количестве 122 мкг/мл, что было установлено в лабораторных условиях фенольно-серным методом [Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. К.: «Наукова думка», 1982. - 192 с.].

Авторами были раскрыты полезные для растений и почвы свойства штамма P. рolуmуха П13НК, которые ранее не исследовались или частично устанавливались при идентификации микроорганизма. В лабораторных опытах установлено, что данный штамм использует целлюлозосодержащие субстраты. В средах Виноградского и Гетченсона, рекомендованных для целлюлозолитических микроорганизмов, отмечен интенсивный рост штамма по всему столбику питательной среды с образованием обильной слизи и осадка (таблица 1).

Таблица 1 - Рост штамма P. рolуmуха П13НК на минеральных средах для целлюлозолитических микроорганизмов

Питательная среда Характеристика роста Наличие роста Образование слизи Мутность Осадок Виноградского +++ +++ +++ +++ Гетченсона +++ ++ ++ +++ Примечание: + - наличие признака. Количество + свидетельствует об интенсивности признака

В условиях периодического глубинного интенсивного культивирования на среде Омелянского, также используемой для роста целлюлозолитиков, в которой в проведенном опыте единственным источником углеводов являлась измельченная солома пшеницы в количестве 1% от объема среды, общий титр культуры и титр спор составляли соответственно 242,5 и 105 млн КОЕ в одном мл соответственно (таблица 2). Выход спор - 43%, что достаточно высокий показатель для данной культуры, при этом целлюлозолитическая активность, определенная по изменению массы соломы, составила 22,3%.

Таблица 2 - Рост P. рolуmуха П13НК при культивировании на среде с целлюлозосодержащим субстратом

Вариант опыта млн КОЕ в 1 мл Целлюлозолитическая активность, % Общий титр Титр спор Питательная среда Омелянского с соломой 1% от объема среды 242,5±22,13 105±7,16 22,3±1,95

Также в ходе научно-исследовательской работы было установлено, что штамм P. рolуmуха П13НК при глубинном культивировании в среде для силикатных бактерий набирает титр до 33,5 млн в 1 мл, а при росте на агаризованной среде такого же состава отмечена зона растворения алюмостликатов до 2 мм. Полученные данные характеризуют штамм как способный повышать биодоступность калия.

Таким образом, показано, что P. рolуmуха П13НК помимо уже известных свойств (антагонизм фитопатогенов, азотфиксация, фосфатмобилизация), является активным продуцентом экзополисахаридов, обладает целлюлозолитическими свойствами, и способен повышать биодоступность калия, что позволяет рекомендовать данный штамм для разработки биопрепарата широкого спектра действия на сельскохозяйственные культуры: защита от фитопатогенных микромицетов, оптимизация азотного, фосфорного и калийного питания, стимуляция развития проростков и роста растений, а так же в перспективе - для разложения растительных остатков в почве.

Разработку биопрепарата осуществляли путем подбора питательных сред для культивирования штамма с учетом хранения и размножения культуры на агаризованной среде, получения жидкой культуры первого порядка (маточного инокулюма) и второго порядка (готовый препарат/инокулянт сельскохозяйственных растений).

Для хранения и размножения P. рolуmуха П13НК исследовали рост культуры на агаризованных средах: гороховый отвар (ГО) с добавлением сахара, глюкозы, смеси углеводов, солей ((NH₄)₂SO₄, KH₂PO_4, K₂HPO₄, MgSO₄⋅7H₂O), мела (Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе (метод. рекомендации). - Л.: Б.и., 1991. - 60 с.); мясопептонный агар (МПА); среды Виноградского и Федорова для культивирования азотфиксирующих бактерий (Практикум по микробиологии /под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.). Визуально оценивали морфологию штриха, фазово-контрастным микрокопированием - морфологию клеток. В таблице 3 в качестве примера представлены среды максимально и минимально благоприятные для роста и хранения P. рolуmуха П13НК. По результатам исследований для хранения и размножения P. рolуmуха П13НК определена питательная среда следующего состава, %: отвар гороха - 10, сахароза (или сахар пищевой) - 1, глюкоза - 1, (NH₄)₂SO₄ - 0,1, KH₂PO₄˗K₂HPO₄ - по 0,05, MgSO₄ - 0,03, мел - 0,15. Через сутки штрих разрастается от центра к краю, умеренный, край ровный. Поверхность штриха гладкая, слизистая. Колонии белые выпуклые, слизистые, блестящие. Клетки подвижные крупные палочки с закругленными концами, сцепленные преимущественно по 2 и более. Через пять суток отмечен обильный рост бактерий, штрих выпуклый, слизистый край волнистый, газообразование. Отмечено спорообразование, выход спор единичный. Через 30 суток рост обильный, по всей поверхности скошенного агара. Выпуклый, слизистый (обильно), цвет штриха приобретает едва заметную коричневую окраску. Клетки подвижные крупные палочки.

Таблица 3 - Характеристика роста P. рolуmуха 13ПНК на агаризованных питательных средах

Период наблюдения 24 ч / 1 сут 5 сут 30 сут 1 2 1 2 1 2 ГО + смесь углеводов (сахароза+глюкоза) + соли ((NH₄)₂SO₄, KH₂PO_4, K₂HPO_4, MgSO₄) + мел Штрих разрастается от центра к краю, умеренный, край ровный. Поверхность штриха гладкая, слизистая. Колонии белые выпуклые, слизистые, блестящие Клетки подвижные крупные палочки с закругленными концами, сцепленные преимущественно по 2 и более. Обильный рост, штрих выпуклый, слизистый край волнистый. Газообразование. Отмечено спорообразование.
Выход спор единичный. Рост обильный,
по всей поверхности скошенного агара. Выпуклый, слизистый (обильно), цвет штриха приобретает едва заметную коричневую окраску. Клетки подвижные крупные палочки. МПА Рост слабый. Штрих плоский, желто-коричневого цвета с маслянистым блеском. Клетки подвижные крупные палочки с закругленными концами, сцепленные преимущественно по 2 и более. Рост слабый. Штрих плоский, желто-коричневого цвета с маслянистым блеском. Клетки подвижные крупные палочки с закругленными концами, сцепленные преимущественно по 2 и более. Рост слабый. Штрих плоский, желто-коричневого цвета с маслянистым блеском. Клетки малоподвижные. Отдельные спорообразующие клетки. Примечание: 1 - Характеристика штриха культуры на скошенном агаре; 2 - морфология клеток под микроскопом

Для получения биопрепарата были оптимизированы жидкие питательные среды и условия глубинного периодического культивирования P. рolуmуха П13НК. При разработке ориентировались на скорость роста бактерий, титр культуры, а также экономичность и доступность субстратов. Оптимизированная авторами среда на гороховом отваре среда состоит из следующих компонентов, г/л: гороховый отвар (10%) - 10,0; сахар пищевой - 10,0; меласса свекловичная (патока) - 10,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,0; KH₂PO₄ - 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄⋅7H₂O - 0,3; CaCO₃ - 1,0. Состав оптимизированной кукурузно-мелассной среды (КММ), г/л: свекловичная (патока) - 15,0; экстракт кукурузный - 15,0; KH₂PO₄ - 0,5; жмых льна масличного - 10,0. В таблице 4 представлены экспериментально установленные технологические параметры получения биопрепарата на основе P. рolуmуха П13НК. Питательная среда на гороховом отваре с частичной заменой сахарозы мелассой (1:1) обеспечивает высокую скорость роста бактерий в течение 24 часов культивирования, общий титр бактерий составляет 2,3 млрд КОЕ в 1 мл, что в три раза выше, чем в контрольной среде. В оптимизированной кукурузно-мелассной среде титр бактерий увеличился в 1,4 раза, выход спор составляет 50% от общего титра, динамическая вязкость культуры увеличилась на 25,2%.

Таблица 4 - Параметры роста P. рolуmуха П13НК при глубинном периодическом культивировании

Вариант,
питательная среда Титр бактерий,
млрд КОЕ в 1 мл Титр спор,
млн в 1 мл Вязкость,
Па⋅с Среда на гороховом отваре с сахарозой (контроль) 0,8±0,01 140±15 870±50 Кукурузно-мелассная среда
(контроль) 0,7 ±0,03 289±34 994±30 Среда на гороховом отваре с сахарозой и мелассой, оптимизированная 2,3±0,03 810±58 987±50 Кукурузно-мелассная оптимизировання 1,2± 0,04 570±33 1310±90

Использование углеводного субстрата мелассы в среде первого порядка обеспечивает адаптацию бактерий для культуры второго порядка и способствует сокращению времени культивирования. Повышение динамической вязкости биопрепарата за счет синтеза веществ полисахаридной природы оказывает стабилизирующее действие на сами бактерии и исключает применение дополнительных веществ, усиливающих адгезию бактерий при обработке семян и вегетативной части сельскохозяйственных культур. Установлены технологические параметры культивирования P. рolуmуха П13НК в оптимизированных питательных средах (таблица 5). Оптимальной для глубинного культивирования является температура 28°С.

Таблица 5 - Технологические параметры культивирования P. рolуmуха П13НК в оптимизированных средах для получения биопрепарата

Вариант, питательная среда Скорость вращения качалки, об/мин Время культивирования, час Гороховая среда с сахарозой и мелассой, модифицированная 150-180 20-24 Кукурузно-мелассная модифицированная 200-220 48-72

Таким образом, разработан биопрепарат на основе P. рolуmуха П13НК, изготовление которого состоит из последовательных технологических этапов, включая глубинное периодическое культивирование в оптимизированных жидких питательных средах. Для получения биопрепарата культуру P. рolуmуха П13НК, после длительного хранения в коллекции при температуре 4-8°С активируют путем пересева на гороховую агаризованную среду, приготовленную по прописи (табл. 3), инкубируют в термостате до накопления обильной биомассы (1-3 суток), которую используют для получения инокулюма (культуры первой расплодки) в жидкой оптимизированной питательной среде, приготовленной на основе горохового отвара. Культивируют в течение 20-24 часов, при скорости вращения качалки 150-180, температуре 28°С. Полученным инокулюмом засевают оптимизированную жидкую питательную среду, приготовленную на основе кукурузного экстракта, в количестве 2-3% от объема среды. Культивируют 48-72 часа. Скорость вращения качалки - 200-220 об/мин. Готовый препарат расфасовывают и в случае необходимости хранят при температуре 5-8°С в течение 6 месяцев.

Готовый препарат представляет собой вязкую жидкость светло-бурого цвета с общим титром не менее 1,2 млрд и титром спор не менее 570 млн в 1 мл препарата.

Способ применения. Для предпосевной обработки семян - приготовить водную суспензию (рабочий раствор) и нанести на семена. Норма расхода препарата - 0,1 л на гектарную норму семян; рабочего раствора - 1,8-3,0 % от массы семян в зависимости от сельскохозяйственной культуры. Для дражирования норма расхода препарата составляет 1-2% от массы семян. Препарат в смеси с любым сухим наполнителем наносят на семена методом накатывания. Норма расхода препарата для обработки вегетирующих растений - 1 л/га.

Свойства заявленного препарата подтверждены экспериментальными исследованиями в лабораторных, модельных и полевых опытах и отражены в нижеследующих примерах.

На фиг. 1 показана численность бактерий P. рolуmуха П13НК в ризоплане и ризосфере озимой пшеницы, семена которой инокулировали заявляемым биопрепаратом (лабораторный опыт), на фиг. 2 - обилие бактерий рода Azotobacter, как индикатор биологического состояния почвы, в ризосфере озимой пшеницы с применением заявляемого биопрепарата в зависимости от технологии выращивания (полевой опыт).

Пример 1. Одним из параметров эффективности микробиологических препаратов является способность штамма-продуцента конкурировать с естественной микробиотой, занимать (колонизировать) соответствующую эконишу - приживаться. Штамм P. рolуmуха П13НК - биоагент заявляемого биопрепарата конкурирует с эпифитной микробиотой корня пшеницы и микробоценозом ризосферы, то есть приживается, что подтверждено в условиях вегетационного опыта с растениями озимой пшеницы, семена которых в опытном варианте инокулировали антибиотикрезистентным штаммом, полученным по методике (Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта и др.; пер. с англ.: в 3 т. - М.: Мир, 1983. - Т. 2. - 1984. - С. 29-31) и через 30 суток вегетации микробиологическим посевом определяли количество бактерий (фиг. 1). Численность бактерий, учтенных на корнях, превышает контроль на 33,3%, в ризосфере - на 140%.

Пример 2. В лабораторных опытах исследовали влияние заявляемого препарата на эпифитную грибную и бактериальную микробиоту семян озимой пшеницы и ячменя. С обработанных биопрепаратом семян делали смыв, затем серию разведений с последующим высевом на МПА и Чапека-Докса для учета бактерий и микромицетов соответственно. Исследование проводили по общепринятым методикам (Мишустин Е.Н., Трисвятский Л.А. Микробы и зерно. - М.: Изд-во АН СССР, 1963. - С. 39-43). Установлено, что заявляемый биопрепарат угнетает развитие микромицетов на семенах озимой пшеницы и ячменя. Всхожесть семян была на уровне 90-98%. Снижение численности микромицетов на семенах пшеницы отмечено через два часа после бактеризации: в 4 раза (293%) в сравнении с контролем и на 23,3% в сравнении с химическим протравителем Максим (таблица 6). Через 7 суток численность микромицетов на бактеризованных семенах в 11,4 и 6 раз ниже, чем в контрольном варианте и варианте с протравителем соответственно, через 30 суток - ниже в 6,4 и 2,2 раза соответственно.

Таблица 6 - Влияние инокуляции на эпифитные микромицеты семян озимой пшеницы (тыс. КОЕ / 1 г семян, лабораторный опыт)

Вариант опыта Период исследований 2 ч 7 сут 30 сут Контроль 420,7±20,03 364,3±4,04 367,7±2,52 Биопрепарат 107,1±19,9 32,0±5,24 57,7±2,71 Максим (фунгицид) 132,1±14,23 209±11,22 129,7±2,7

Эффективность препарата на семенах ячменя проявилась через 7 суток, численность микромицетов была существенно ниже, чем в контрольных вариантах (таблица 7).

Таблица 7 - Влияние инокуляции на эпифитные микромицеты семян ячменя (тыс. КОЕ / 1 г семян, лабораторный опыт)

Вариант опыта Период исследований 2 ч 7 сут 30 сут Контроль 829,7±4,51 361,7±2,07 305,7±3,41 Биопрепарат 580,3±1,06 35,1±1,73 29,3±1,53 Максим (фунгицид) 327±3,00 295±2,31 169,7±0,56

Пример 3. Важным свойством биопрепарата, особенно фунгицидой направленности, является наличие стимулирующего эффекта и отсутствие фитотоксичности по отношению к растению. В условиях лабораторного опыта на озимой пшенице исследовали влияние заявляемого биопрепарата на длину проростков тест-культуры с целью установления ростстимулирующих или фитотоксичных свойств.

Биопрепарат наносили на семена в оптимальной норме (2%) и в 5 раз превышающей (10%) рабочим раствором. Полученные данные представлены в таблице 8. Анализ результатов свидетельствует о том, что обработка семян пшеницы 2% раствором (рекомендованная норма внесения) биопрапарата проявляет стимулирующее действие на рост проростков тест-культуры. Наибольшее стимулирование отмечено на 5-е и 7-е сутки: длина проростков озимой пшеницы превышала контрольный вариант соответственно на 34 и 48%. Обработка семян 10% раствором биопрепарата (5-кратная норма применения) также положительно влияет на развитие растений озимой пшеницы, но увеличение количества биопрепарата не является экономически оправданным приемом.

Таблица 8 - Влияние разных норм внесения биопрепарата на основе P. рolуmуха П13НК на длину проростков озимой пшеницы

Норма внесения препарата Период наблюдения, сут 3 5 7 10 мм к контролю, % мм к контролю, % мм к контролю, % мм к контролю, % Контроль 32 - 115 - 139 - 183 - 2% 35 +9 154 +34 206 +48 250 +37 10% 26 -19 140 +22 202 +45 219 +20

Пример 4. В условиях полевого опыта на черноземе южном тяжелосуглинковом сухой степи после черного пара с внесением стартовых доз минеральных удобрений (P₃₀K₃₀) по действующему веществу исследовали эффективность биопрепарата в посевах озимой пшеницы, выращенной по интенсивной и биологизированной технологиям.

Обработка семян перед посевом заявляемым препаратом обеспечила прибавку урожайности на 21,7% (1,07 т/га) по интенсивной агротехнологии (применение гербицидов, фунгицидов) и на 17,2% (0,73 т/га) - по биологизированной технологии (без использования средств защиты растений) (таблица 9).

Таблица 9 - Влияние биопрепарата на основе штамма P. рolуmуха П13НК на урожайность озимой пшеницы (полевой опыт)

Вариант опыта Агротехнология выращивания пшеницы Интенсивная Биологизированная Урожайность, т/га Прибавка Урожайность,
ц/га Прибавка т/га % ц/га % Контроль 4,94 - - 4,31 - - Биопрепарат 6,01 1,07 21,7 5,18 0,87 20,2 Витавакс 200 ФФ 5,39 0,45 4,5 4,76 0,45 10,4 НСР 05 0,21

В этом же опыте установлено, что при максимальной пораженности колосьев пшеницы озимой твердой головней - 3,3%, биопрепарат достаточно эффективен - поражение колосьев было на 70-80% ниже по сравнению с контрольным вариантом (таблица 10). Химический протравитель Витавакс 200 ФФ обеспечил полный контроль над базидиальными грибами рода Tilletia.

Таблица 10 - Пораженность озимой пшеницы болезнями в зависимости от технологии выращивания (полевой опыт)

Вариант
опыта Агротехнология выращивания пшеницы Интенсивная Биологизированная Пораженность колосьев, твердой головней, % Корневые гнили, % Пораженность колосьев, твердой головней, % Корневые гнили, % Распространение Развитие Распространение Развитие Контроль 2,5 40,5 16,2 3,1 49,7 18,7 Биопрепарат 1,0 34,2 8,7 1,3 40,0 10,2 Витавакс 200 ФФ 0,0 29,9 8,0 0,0 35,9 10,0 НСР₀₅ 0,01 0,04

Также показано, что заявляемый биопрепарат стимулирует развитие азотобактера (фиг. 2) и в большей степени в ризосфере пшеницы, выращенной по биологизированной технологии. Azotobacter существует как свободно, так и в ассоциации с растением, в том числе с пшеницей и является индикатором агрохимического состояния почвы.

Таким образом, установлено, что предпосевная обработка семян биопрепаратом на основе P. рolуmуха П13НК обеспечила повышение урожайности озимой пшеницы, стимуляцию азотобактера в ризосфере и контроль распространения фитопатогенных грибов на растениях.

Пример 5. Эффективность биопрепарата изучена в посевах ячменя в условиях полевого опыта на тёмно-каштановой почве с разными дозами минеральных удобрений. На неудобренном фоне применение биопрепарата перед посевом обеспечило прибавку урожайности зерна озимого ячменя 0,3 т/га (10%), которая была на уровне минеральных удобрений (N₃₀P₃₀K₃₀) и превышала вариант с протравителем Максим (таблица 11).

Таблица 11 - Влияние биопрепарата на основе штамма P. рolуmуха П13НК на урожайность ячменя (полевой опыт, темно-каштановая почва)

Вариант
опыта Дозы минеральных удобрений Прибавка урожайности, средняя по опыту, т/га Без удобрений P₃₀ N₃₀P₃₀K₃₀ N₆₀P₆₀K₆₀ Урожайность зерна (+ к контролю), т/га Контроль 2,9 3,1 3,2 3,9 - Биопрепарат 3,2 (+0,3) 3,7 (+0,6) 3,4 (+0,2) 3,9 (+0) 1,1 Максим 3,1 (+0,2) 3,3 (+0,2) 3,6 (+0,4) 3,8 (-0,1) 0,7 НСР ₀₅ 0,24

Пример 6. В полевом опыте на черноземе южном исследовали влияние биопрепарата на численность разных групп микроорганизмов в ризосфере ячменя, как одного из показателей биологической активности почвы.

В фазу цветения в ризосфере ячменя было установлено увеличение численности микроорганизмов исследуемых физиолого-трофических групп при посевной обработке семян патентуемым биопрепаратом. Численность аммонификаторов в 3,1 раза превышала контрольный вариант и почти в два раза - вариант с применением химического протравителя на фоне минеральных удобрений (таблица 12). Заявленный биопрепарат стимулирует развитие педотрофов в 1,4 и 2 раза в сравнении с контролем и вариантом с протравителем Витавакс.

Таблица 12 - Численность микроорганизмов разных эколого-трофических групп в ризосфере ячменя в фазу цветения (полевой опыт, темно-каштановая почва), млн КОЕ в 1 г абсолютно сухой почвы

Вариант опыта Олиготрофы Педотрофы Аммонификаторы Контроль 0,5±0,09 5,6±3,2 9,2+1,60 Биопрепарат 0,5±0,06 7,9±0,06 28,8+6,50 Витавакс 200ФФ + N₄₅P₄₅K 0,7±0,03 4,0±0,4 14,8+0,70

Анализ таблицы 13 показал увеличение численности спорообразующих бактерий в 1,6 и 1,5 раз в сравнении с контрольным и агрохимическим вариантами соответственно. Экологическая роль актинобактерий заключается чаще всего в разложении сложных устойчивых субстратов и характеризует глубину процессов минерализации органики. При применении биопрепарата их численность возросла в 8 и 1,6 раз в сравнении с контрольным и агрохимическим вариантами соответственно. Благоприятные условия в этом варианте складываются и для микромицетов.

Таблица 13 - Численность спорообразующих бактерий, актинобактерий и микромицетов в ризосфере ячменя в фазу цветения (полевой опыт, темно-каштановая почва), КОЕ в 1 г абсолютно сухой почвы

Вариант опыта Актинобактерии,
тыс. Микромицеты,
тыс. Спорообразующие бактерии, млн. Контроль 100±10,00 40±1,01 1,6±0,3 Биопрепарат 800±20,00 200±1,01 2,5±0,25 Витавакс 200ФФ + N₄₅P₄₅K 500± 9,00 8±0, 6 1,7±0,50

Пример 7. В условиях полевого опыта на черноземе южном малогумусном изучали влияние биопрепарата на урожайность и биологическую активность в ризосфере сорго зернового.

Эта культура чувствительна к внесению минеральных удобрений. Эффективность биопрепарата изучали по фону N₆₀P₆₀ при однократном (обработка семян), двукратном (обработка семян и вегетирующих растений в фазу кущения) и трехкратном (обработка семян и вегетирующих растений в фазы кущения и цветения) применении биопрепарата. Показано, что обработка семян биопрепаратом обеспечивает повышение урожайности зерна сорго на 11,2% (0,13 т/га) и 20,1% (0,31 т/га) соответственно на неудобренном фоне и N₆₀P₆₀ и превышала вариант с тебузан ультра-фунгицид, рекомендованный для защиты зерновых культур (таблица 14). Обработка вегетирующих растений в фазы кущения и цветения на неудобренном агрофоне обеспечила прибавку урожайности зерна на 25,9% (0,3 т/га) и 37,1% (0,43 т/га). На фоне N₆₀P₆₀ трехкратное применение биопрепарата не показало эффективности.

Таблица 14 - Влияние биопрепарата на урожайность сорго зернового (полевой опыт, чернозем южный малогумусный)

Вариант опыта
(Фактор А) Минеральный фон (Фактор В) Без удобрений N₆₀P₆₀ Урожайность зерна т/га Прибавка т/га Прибавка т/га % т/га % Однократная обработка Контроль 1,16 - - 1,54 Тебузан Ультра 1,24 0,08 6,9 1,62 0,08 5,1 Биопрепарат 1,29 0,13 11,2 1,85 0,31 20,1 Двукратная обработка Биопреппарат 1,46 0,3 25,9 2,10 0,56 36,4 Трехкратная обработка Биопрепарат 1,59 0,43 37,1 2,08 0,54 36,1 НСР₀₅ А=0,09; В= 0,07; АВ= 0,14

Установлено повышение содержания азота и протеина в зерне сорго в зависимости от кратности обработок (таблица 15).

Таблица 15 - Качество зерна зернового сорго при применении биопрепарата, % (полевой опыт, чернозем южный малогумусный, фон N₆₀P₆₀)

Вариант опыта N Р₂О₅ К₂О Протеин Крахмал Жир Клетчатка Контроль 1,76 0,89 0,58 11,6 67,5 3,0 2,3 Однократная обработка Биопрепарат 2,01 0,94 0,58 12,6 66,8 3,0 2,4 Двукратная обработка Биопрепарат 1,97 0,96 0,65 12,3 66,8 3,1 2,3 Трехкратная обработка Биопрепарат 2,01 0,92 0,55 12,6 66,9 3,0 2,5

Установлено положительное влияние бактеризации семян биопрепаратом на показатели биологической активности в ризосфере сорго. На неудобренном фоне численность диазотрофных бактерий в ризосфере растений с применением биопрепарата увеличилась в 1,5 раза в фазы кущения и цветения и в 3,2 раза - в фазу спелости зерна в сравнении с контролем (таблица 16). На фоне N₆₀P₆₀ численность диазотрофов была выше контрольного варианта в 3 раза - в фазы кущения и цветения и в 5,2 раза - в фазу спелости. Отмечено повышение эмиссии диоксида углерода, что может характеризовать активность микробиоты (таблица 17).

Таблица 16 - Численность диазотрофных микроорганизмов в ризосфере зернового сорго (полевой опыт, чернозем южный малогумусный)

Вариант опыта Фазы развития растений Кущения Цветения Полной спелости зерна Без удобрений Контроль 2,6±0,17 4,1±0,17 1,0±0,13 Биопрепарат 4,0±0,13 6,9±0,22 3,1±0,07 N₆₀P₆₀ Контроль 1,2±0,16 1,8±0,12 0,6±0,10 Биопрепарат 3,7±0,13 6,0±0,13 3,1±0,06

Таблица 17 - Эмиссия СО₂ в ризосфере зернового сорго, мг/г почвы в сутки (полевой опыт, чернозем южный малогумусный)

Вариант опыта Фазы развития растений Кущения Цветения Полной спелости зерна Без удобрений Контроль 0,9 1,7 0,9 Биопрепарат 1,6 2,4 1,7 N₆₀P₆₀ Контроль 0,7 1,3 0,5 Биопрепарат 1,4 1,9 1,3 НСР₀₅ 0,12 1,49 0,71

Пример 8. Одним из показателей эффективности биопрепарата является качество продукции растениеводства. Результаты исследований, представленные в таблице 18, свидетельствуют о том, что при применении заявляемого биопрепарата на основе штамма P. рolуmуха П13НК, плоды томатов и огурца, а также зерно ячменя и пшеницы, не содержат токсикантов.

Таблица 18 - Содержание тяжелых металлов и нитратов в овощной и зерновой продукции.

Продукция Содержание токсикантов, мг/кг Zn Ni Co Cu Pb NO₃^- Томаты 3,0±0,6 Н.в.^* Н.в. 1,5±0,30 Н.в. 25,0±5,0 Огурцы 1,5±0,3 Н.в. Н.в. 1,8±0,36 Н.в. 48,0±9,0 Пшеница (зерно) 0,2±0,04 Н.в. Н.в. 3,0±1,0 Н.в. «-«* Ячмень (зерно) 0,04±0,008 Н.в. Н.в. 5,0±1,00 Н.в «-« ПДК *
овощные/зерновые 10,0/50,0 - - 5,0/10,0 60/ Примечание: *н.в. - не выявлено; «-« - не исследовали; ПДК - предельно допустимая концентрация

Пример 9. Заявляемый биопрепарат положительно влияет на всхожесть дражированных семян овощных, пряно-ароматических и эфиромасличных культур при длительном хранении. На примере шалфея лекарственного показано стимулирующее действие биопрепарата, которое проявляется в повышении всхожести семян на 21% к контролю (таблица 19).

Таблица 19 - Полевая всхожесть семян шалфея лекарственного, дражированного за шесть месяцев до посева

Вариант опыта Полевая всхожесть, % К контролю, % Контроль 70,0 100 Биопрепарат 85,0 121,4

По данным вегетационного опыта в почвенной культуре применение биопрепарата стимулирует рост растения салата. Так, сухая надземная масса растений при применении биопрепарата увеличилась на 33-50% к контрольным растениям (таблица 20).

Таблица 20 - Влияние инокуляции биопрепаратом на урожай салата (вегетационный опыт, субстрат чернозем южный, теплица ОСХМ)

Вариант опыта Масса сухой надземной части одного растения г % к контролю Контроль
(без обработки) 0,06 100 Предпосевная инокуляция семян Биопрепарат 0,09 150,0 Дражирование перед посевом Биопрепарат 0,08 133,3 Дражирование за 7 месяцев до посева Биопрепарат 0,08 133,3 НСР ₀₅ 0,01 17,07

Пример 10. В полевых опытах на черноземе южном малогусусном исследовали влияние биопрепарата на бобово-ризобиальный симбиоз. В посевах сои биопрепарат на основе Paenibacillus рolуmуха П13НК повысил эффективность нитрагинизации семян (обработка семян бобовых культур препаратами на основе клубеньковых бактерий). Совместная обработка семян сои заявляемым биопрепаратом и микробным препаратом на основе штамма ризобий сои стимулировал полевую всхожесть семян. Урожайность зерна сои при применении биопрепарата была на 24,9% выше контроля и на 11,3% - варианта с нитрагинизацией (таблица 21). При использовании химического протравителя прибавка урожайности к абсолютному (сухому) контролю составила 13,2% и не превышала 1% в сравнении с нитрагинизацией.

Таблица 21 - Влияние биопрепарата на формирование симбиоза сои (полевой опыт, чернозем южный малогумусный)

Вариант опыта Полевая всхожесть семян, % Урожайность зерна сои, т/га Прибавка урожайности к сухому контролю т/га % Сухой контроль - 18,9 - - Нитрагинизация (штамм ризобий) 88,2 21,2 2,3 12,2 Нитрагинизация + Витавакс 200фф 91,1 21,4 2,5 13,2 Нитрагинизация+ Биопрепарат 94,1 23,6 4,7 24,9 НСР 05 1,01 0,80

Таким образом, показана эффективность предлагаемого полифункционального биопрепарата на основе штамма бактерий Paenibacillus рolуmуха П13НК в посевах зерновых, бобовых и овощных культур, который может быть рекомендован как для предпосевной, так и заблаговременной (дражирование) обработки семян с целью защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов, повышения урожайности сельскохозяйственных культур, улучшения посевных качеств семян, стимуляции биологической активности ризосферы.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Способ получения полифункционального биопрепарата для защиты растений от фитопатогенов, повышения урожайности сельскохозяйственных культур, улучшения посевных качеств семян, стимуляции биологической активности ризосферы на основе штамма ризобактерий Paenibacillus рolуmуха П13НК, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05221, характеризуется тем, что штамм P. рolуmуха П13НК после хранения в коллекции при температуре 4-8°С активируют путем пересева на гороховую агаризованную среду, инкубируют в термостате до накопления биомассы 1-3 суток, которую используют для получения инокулюма в жидкой питательной среде, состоящей из следующих компонентов, г/л: гороховый отвар 10% – 10,0; сахар пищевой – 10,0; меласса свекловичная – 10,0; (NH₄)₂SO₄ – 1,0; KH₂PO₄ – 0,5; K₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄⋅7H₂O – 0,3; CaCO₃ – 1,0, культивируют в течение 20-24 ч, при скорости вращения качалки 150-180 об/мин, температуре 28°С, полученным инокулюмом засевают жидкую питательную среду, приготовленную на основе кукурузного экстракта, следующего состава, г/л: свекловичная патока – 15,0; экстракт кукурузный – 15,0; KH₂PO₄ – 0,5; жмых льна масличного – 10,0, в количестве 2-3% от объема среды, культивируют 48-72 ч при скорости вращения качалки 200-220 об/мин, готовый препарат представляет собой вязкую жидкость светло-бурого цвета с общим титром не менее 1,2 млрд и титром спор не менее 570 млн в 1 мл препарата. Изобретение позволяет защитить растения от фитопатогенных микроорганизмов, повысить урожайность сельскохозяйственных культур, улучшить посевные качества семян и повысить биологическую активность ризосферы. 2 ил., 21 табл., 10 пр.

Способ получения полифункционального биопрепарата для защиты растений от фитопатогенов, повышения урожайности сельскохозяйственных культур, улучшения посевных качеств семян, стимуляции биологической активности ризосферы на основе штамма ризобактерий Paenibacillus рolуmуха П13НК, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05221, характеризующийся тем, что штамм P. рolуmуха П13НК после хранения в коллекции при температуре 4-8°С активируют путем пересева на гороховую агаризованную среду, инкубируют в термостате до накопления биомассы 1-3 суток, которую используют для получения инокулюма в жидкой питательной среде, состоящей из следующих компонентов, г/л: гороховый отвар 10% – 10,0; сахар пищевой – 10,0; меласса свекловичная – 10,0; (NH₄)₂SO₄ – 1,0; KH₂PO₄ – 0,5; K₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄⋅7H₂O – 0,3; CaCO₃ – 1,0, культивируют в течение 20-24 ч, при скорости вращения качалки 150-180 об/мин, температуре 28°С, полученным инокулюмом засевают жидкую питательную среду, приготовленную на основе кукурузного экстракта, следующего состава, г/л: свекловичная патока – 15,0; экстракт кукурузный – 15,0; KH₂PO₄ – 0,5; жмых льна масличного – 10,0, в количестве 2-3% от объема среды, культивируют 48-72 ч при скорости вращения качалки 200-220 об/мин, готовый препарат представляет собой вязкую жидкость светло-бурого цвета с общим титром не менее 1,2 млрд и титром спор не менее 570 млн в 1 мл препарата.